慢性炎症性关节疾病的诊断、分子分辨和治疗开发的方法

专利名称：慢性炎症性关节疾病的诊断、分子分辨和治疗开发的方法
前言本发明涉及慢性炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病的诊断、分子分辨和治疗开发的方法。这些方法在慢性关节疾病的分析和治疗开发上依据基因组资料(基因组学)、蛋白组资料(蛋白组学)和免疫学资料(免疫组学)。本发明依据对基因序列及其推导的mRNA和蛋白质的利用，和对所推导蛋白质的特异性抗体的利用，来特征鉴定炎症性类风湿和非炎症性类风湿关节疾病、自身免疫性疾病和传染病。从本研究开始可以对迄今未能解释的慢性炎症性关节疾病在病因学上得出重要的致病性原理，而且可构建这些关节疾病的分类、预后评价和治疗优化的解释性算法，并且可以获得对新的治疗策略和治疗目标的结论。
现有技术的回顾技术问题慢性炎症性关节疾病的病因学尚不清楚。类风湿性关节炎(RA，见下面实施例的缩写词表)是这类疾病的典型例子，该病的主要病程发生在因炎症而改变的滑膜，因此导致慢性关节损伤。所见的临床症象非常不均一，提示有几种类型的疾病都显示了破坏性滑膜炎的共同症状。这类疾病也必须作为系统性疾病来认识，其血液中可观察到多种变化，有时可导致严重的器质性病理表现。
讨论认为是由于炎症性级联反应失调而致，炎症反应过度活跃是主要的发病机制。因此，已报道的自身免疫反应提示特异性的体液和细胞介导免疫系统在发病过程中起着作用。然而，也讨论了其它机制如酶促组织破坏、细胞和组织增殖或再生，这些因素也可能在发病中起重要作用。
迄今还不能最终确定这些发病机制是否单独地和排它地起作用，也不知道哪些参数能够同时包括所有这些变化。由于对其病理生理了解得不充分，现有的许多治疗方法，其大部分实施方案只是遵循一条基本治疗观念集中于炎症过度这个共同特征上，因而当前的治疗目标是抑制炎症。所谓的基础治疗是进行免疫调节和缓解疾病，它们可能干预细胞代谢和细胞活动的基本机制(如甲氨喋呤、硫唑嘌呤)。然而对于关节疾病，这些治疗方法分子机制的综合性原理不完全了解。因此缺乏以不同和特异性方式实施一种基础疗法在各个病例中获得疗效的各自参数。
先前的方法目前依据以下临床常规标准来评价关节病患者已报告的疾病进展(既往病史)，临床症象(观察到关节有患病模式，有器质性表现)，炎症参数(血清电泳观察到非特异性炎症参数、沉降速率和C反应性蛋白)，自身免疫原参数(类风湿因子、抗核抗体和一些特异性自身抗体，如抗-Ro、抗-La、抗-UIRNP、抗-Sm、抗组蛋白、抗-Sc170、抗着丝粒、抗双链DNA、抗磷脂抗体)，基于HLA-标志(DR4、B27、DR3)的遗传素质(倾向性)，(关节)产生的影象(X线片中关节有破坏性变化)，借助实验室诊断学的常规参数(肝酶、肌酶、肾潴留值)充实器官诊断，以及(如果有利的话)其它超声学、放射学和核磁共振X线断层术等技术。这些只能得到关于疾病预后变化或具体预测基础疗法在个体病人中能否成功的非常有限的断言。而且，目前还没有为充分分类该最常见的关节炎病RA多种性表现设计出诊断标准。(1，见实施例后的参考文献)。特别是在该疾病早期诊断困难，不易确定。然而在该病持续一年后，大多数病人已患有不可逆转的关节损伤。从早期关节炎研究中知道，较早确诊并随后给予充分治疗会获得该病长期发展的根本改善。故评价临床症象外的整个分子特征的新方法和标准是极其需要的。
还有，监测治疗是否成功可通过上述诊断方法来完成。许多这些参数只是非常慢地发生变化，需要观察数周至数月才能得出所选疗法是否有效的结论。由于改善不充分和疾病发展常常需要改变治疗方案，采用目前的治疗方法一般不可能治愈此病。
实验方法为了改进RA的诊断已建立了许多实验性方法。
这些方法涉及对于关键性蛋白质的研究，这些关键性蛋白质1)维持或预防炎症从中心部位向外扩展；2)明确参与软骨和骨质的酶促自毁作用或抑制参与的酶；或3)能诱导再生和修复过程或抑制它们的拮抗剂。例如介导炎症的细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-)□和白介素(IL-)1□，它们的作用证明是必须的，因而已分别引入临床治疗方法中。虽然在常用方法不能充分发挥效果的许多病例中抑制TNF-□可改善RA，但这些阳性结果不能导致治愈此病。局部上，这种抑制如此强以致产生感染或甚至脓毒性并发症，然而仍不能实现对关节炎的完全控制。这提示TNF-□介导的炎症通路至少不是唯一的中心致病机制。除了所述的这两种细胞因子外，应研究关节炎发病中许多其它信号的作用。此外，治疗干预逐渐集中于细胞内相应的信号转导通路。
然而，基质金属蛋白酶和组织蛋白酶位于骨和软骨酶促自毁作用的中心。再生机制的调查正值这些研究的开始。
首先必须提到属于转化生长因子(TGF-)□家族的信号物质，它们的大部分成员在运动器官系统的发育中起着关键作用。对滑膜组织和软骨的初步研究显示该组生长因子的成员和形态发生素在成年人滑膜组织中也能产生。对炎症性关节疾病，我们自己的研究能显示这些因子的某一些显然相对减少。另外，关于骨形态发生蛋白(BMP-1)7还显示，细胞对发育中的关节软骨组织的入侵受到抑制(2)。
其它关节疾病中也发现了许多上述因子和酶，如骨关节病或活动性关节疾病，因此认为它们自身不构成具体的诊断参数。
实验研究也集中于RA中自身反应性T和B细胞的升高上，为此将RA归类为自身免疫病。这种分类可追述到所谓的类风湿因子(一种针对免疫球蛋白G的自身抗体)的发现。然而类风湿因子只出现在约2/3的RA病人中，而且存在于其它类风湿和非类风湿病中，甚至高达5％的健康人群(随年龄增长程度更高)中。类风湿因子的出现似乎是机体在某些病理状态下(如细菌性心内膜炎)的一种生理反应，对IgG有特异性的自身反应性B细胞似乎存在于大部人群中并可被不同机制所激活。然而术语“类风湿因子”因其只提供对RA的诊断和预后意义，故仍被保留。
然而，此同样的特征也可定性地用于几乎所有迄今所知的RA自身抗体抗体阳性的病人频率显然不到100％，而且对此病的部分特异性(诊断)也显然不到100％。就此病模式而言，所声称的RA临床不均一性的炎症强度和周期性特征与免疫失调的不均一性相符合。此种临床和免疫学不均一性也支持以下推测“类风湿关节炎”也许是不同疾病的统称。其典型例子是RF阳性和RF阴性(RF类风湿因子)RA之间的区别，对此，前者据称因较高破坏性潜力和系统性体液活性而具有更严重进程。术语“血清阴性”错误地暗示甚至缺乏自身抗体。然而，不能证实类风湿因子或其它已知的自身反应性的任何一种是产生RA或其假定亚型之一或恶化形式的病因。
自身抗体可用于其它类风湿自身免疫病，如系统性红斑狼疮(SLE)为主要成员的胶原性疾病的诊断性分类。这些自身抗体的主要致病性已经过长期和反复讨论。可肯定在此病周期性发作和随后形成免疫复合物及补体激活期间，与无序过度释放的自身抗原结合的高滴度自身抗体与器官损伤特别是肾损伤以及脉管炎特征相关联。然而尚没确定RA中自身反应性B和T细胞的作用，而是始终提到新的自身抗原为RA中自身反应性免疫应答的靶标。这些抗原中某一些的生化和抗原性特征已明确确定，然而对其余抗原只了解到几个参数。对这些自身抗体中的一些，曾认为有非常好的应用前景，因为B或/和T细胞应答反应看来对RA是高度特异性的。然而，当在其它自身免性疫病中也检测到相同的自身反应性时，对这些抗体的兴趣迅速消失。同时，发现RA有许多T细胞相关的自身反应性，但只有很少几种是RA特异性的。
热休克蛋白不久就怀疑RA是一种传染病。因此，研究了大多数细菌或病毒病例中异种抗原来源的多样性，以检测起着自身反应性触发剂作用的潜在性病原体。可能的RA诱导剂之一是结核分枝杆菌，因为它在动物模型中可诱生佐剂性关节炎，一种在某些方面类似于人RA的疾病。分枝杆菌的热休克蛋白65(mt-Hsp65)或该抗原的特异性T细胞也能诱生此实验性疾病。热休克蛋白支持天然蛋白质产生其正确的三维结构，从而产生三级和四级结构。mt-Hsp65与哺乳动物中必须的Hsp60同源。关于RA病人滑液中的mt-Hsp65特异性T细胞和抗体的报道提示，高度同源性的人Hsp60可能在RA病人中被识别为一种抗原，然而这些抗体不是RA特异性的，它们也出现在患赖特(Reiter)综合征、SLE和活动性结核病病人以及健康人中。
虽然对mt-Hsp65的反应性在RA中似乎不起主要作用，但人Hsp60在RA发病中可能是重要的。在其氨基酸序列中人Hsp60的11-12氨基酸区域与某些蛋白质如细胞角蛋白和Hsp90相同。因此可以想到针对这些蛋白质的自身反应性T细胞或抗体来源于天然存在但严格调节的Hsp60的反应性。
Dna J细菌应激蛋白Dna J与哺乳动物Hsp70同源，其氨基酸序列QKRRA以“共享表位”命名而较有名，赋予了对RA的易感性(3)。该表位也见于EB病毒(EBV)编码的蛋白质gp110中。Dna J是RA病例中自身反应性T细胞的靶子，但不存在于健康人中(4)。虽然仍不知道此共享表位以何种方式赋予对RA的易感性，但可想到的一种机制可能是从非MHC-蛋白质产生了该共享表位肽，然后在MHC类分子上提呈，因而诱导了对外来EBV-gp110和自身MHC类分子的免疫应答反应。
EBV编码的核抗原不久即怀疑EB病毒(EBV)引起了RA，虽然最近才可能在RA病人的滑液中检测到该病毒。针对EBV编码的核抗原(EBNA-1)的抗体显示与RA患者滑膜间皮细胞的p62蛋白质强烈反应。EBNA-1含有富含甘氨酸-丙氨酸的重复序列(IR-3)，其可为RA、SLE、全身性硬皮病(SSc)和传染性单核细胞增多症患者中的自身抗体所识别，但在健康个体中也以相当的频率出现。EBNA-1显示能与许多人体蛋白质发生交叉反应，通常是通过该IR-3序列。其中，基本的例子是p62和p542，后者主要为传染性单核细胞增多症病人的但也为RA病人的抗体所识别。由于p542与命名为“Raly”的小鼠hnRNP的序列高度相同性和与人hmRNPC2相似，最近被鉴定为hnRNP的71k组分。
Sa-抗原Filaggrin，瓜氨酸化的肽/蛋白质Sa-抗原(5)和filaggrin是最近发现的两种抗原，不存在于发炎的关节中，但因其引起RA特异性高免疫应答反应而引人注意。Sa-抗原是人脾脏和胎盘产生的一种50k蛋白质。Sa-特异性抗体出现于43％的RA病人，具有78％-99％疾病特异性。Filaggrin是一种42k蛋白质，负责交联中间性纤丝(特别是在细胞角蛋白中)并且存在于内皮中。Filaggrin特异性抗体显然与很早以前报道的“抗核周(间)隙因子”和所谓的抗角蛋白抗体相同。抗Filaggrin抗体所识别的该表位主要决定簇是瓜氨酸，一种翻译后修饰的精氨酸(6，7)。这些抗体的灵敏度在36％-91％之间，特异性在66％-100％之间，虽然filaggrin只存在于关节外，但在滑膜细胞中已同时成功地检测到瓜氨酸。
胶原IIII型胶原是关节软骨的主要成分，似乎易被接受为RA自身抗原，因此许多研究从事于这种胶原的特异性免疫应答反应。能与牛II型胶原反应的小鼠T细胞，对也出现在人II型胶原中的一个表位有特异性，该表位与患胶原诱生关节炎的小鼠的一个重要的T细胞表位重叠。II型胶原是一种胞外基质成分，其本身由更大的前胶原经加工而由相同的原胶原亚基形成三个螺旋。对胶原具有特异性的B细胞似乎以更显著的方式出现在RA病人的发炎关节中。II型胶原特异性T细胞见于RA病人和健康个体中。
胶原反应性在RA的口服抗原耐受性研究中引起了特别关注。动物模型中，可通过(自身免疫性)炎症腔室中存在的但其本身不一定参与炎症过程的抗原来诱导口服耐受性。如果口服给予这种抗原可使对所服食抗原具有特异性的T细胞显著地耐受，能通过抑制性细胞因子如IL-10和TGF-β在另一部位即发炎关节中，产生所谓的旁观者(Bystander)抑制。II型胶原特异性T细胞能下调RA中的炎症，然而三次安慰剂实验的口服耐受双盲研究，不能证明应用II型胶原时此病活动性有显著改善。类似结果也见于采用Hsp65的肽所作的临床研究(Subreum)。
软骨细胞抗原65(CH65)据报道软骨细胞膜是RA和关节病患者中自身反应性T细胞的靶子(8)，而正常供体的T细胞不显示这种反应。此外，70％RA病人的自身抗体能识别软骨细胞膜，这种抗原是软骨特异性的CH65，它与分枝杆菌Hsp65和某些细胞角蛋白有序列相似性。CH65有高比例的甘氨酸，此与Hsp相似但不相同。虽然与角蛋白的序列相似，但它们对角蛋白是完全非典型的。这种类似性引起了人/分枝杆菌Hsp和其它蛋白质之间有分子模拟的想法。然而CH65、细胞角蛋白或Hsp65特异性单克隆抗体之间未发现有交叉反应，只研究了T细胞对非纯化软骨细胞膜的反应性。
HC gp39只在小部分病人和对照人群中测到滑液中存在许多抗原。一个例子是人软骨糖蛋白(HC gp39)，一种由关节软骨细胞、滑膜细胞、分化晚期巨噬细胞和嗜中性白细胞分泌的重要产物。退行性关节病患者血清和滑液中的gP39水平比健康个体升高。后来显示其滴度的升高不仅见于骨关节病病例，也见于结肠直肠癌、酒精引起的肝硬化和乳腺癌病例中。gp39不仅在组织再生和胞外基质降解中起作用，还是RA自身反应性T细胞的靶子。因此，也测试了衍生自gp39序列的肽结合HLA-DR4(DRB1*0401)和刺激T细胞的能力。在18位RA病人中有8个和11位健康人中有3个测到gp39反应性T细胞。动物模型中，免疫Balb/c小鼠导致间歇性发作的慢性关节炎，但经鼻给予gp39能治愈。
类风湿因子RA中了解得最清楚同时无组织特异性但可能几乎普遍存在的自身抗原，是免疫球蛋白G(IgG)成为所谓的类风湿因子(RF)抗体的靶子。类风湿因子仍然是包括在美国类风湿学会标准(ACR-标准)中的唯一血清学参数。RF与RA的病理学关系仍有争论，因为RF也见于SLE、Sjgren综合证、心内膜炎和肝病病人中，甚至健康人中。RF-滴度并不与RA的临床或血清学活性或与关节破坏程度严格相关。
hnRNPA2-蛋白质(RA33)属于人的核内核糖核蛋白质(hnRNP)的A2-蛋白质是一种普遍存在的蛋白质，最初描述为RA33自身抗原。随后，显示了它与A2-组分的相同性和它与SLE、混合性胶原病(混合性结缔组织病，MCTD)和其它疾病病人血清的反应性。A2与许多代表细胞核中hnRNP的其它因子形成复合物而存在。不清楚A2的确切功能，虽然有人提出它有剪接人核内核糖核酸(hnRNA)的功能。因此，A2提供了两个RNA结合功能域和核输入/输出信号。RA和SLE病人的抗体针对RNA结合功能域之间的区域；而MCTD(混合结缔组织疾病)病人的抗体识别由两个RNA结合功能域组成的一个不连续性表位。尚不清楚免疫系统怎样接触A2。然而，从侏儒观点看，hnRNP是RA的优良候选抗原。迄今只可能推测在某些情况下A2可能到达细胞表面，如在炎症过程中细胞衰退时。
钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)钙蛋白酶抑制蛋白是一种遍在的胞质蛋白质，分子量72k，具有4个钙蛋白酶抑制功能域。钙蛋白酶(Calpain)包括一个半胱氨酸蛋白酶家族，该家族怀疑参与类风湿病的关节破坏。钙蛋白酶存在于胞质中，其激活受钙离子严格调节，并受钙蛋白质酶抑制蛋白的抑制。细胞激活后，钙蛋白酶抑制蛋白也出现于细胞外，因而可被抗体接触。RA、SLE、多肌炎/皮肌炎(PM/DM)、MCTD、活动性关节病和静脉血栓形成患者的自身抗体可识别钙蛋白酶抑制蛋白。在钙蛋白酶抑制蛋白缺陷大鼠的动物模型上不能诱导关节炎症状。RA和OA病人的发炎关节中存在有钙蛋白酶抑制蛋白、钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白特异性抗体，它们可能参与这些疾病的发病过程。
肌钙网蛋白(Calreticulin)肌钙网蛋白是一种内质网(ER)遍在性蛋白质，在某些情况下也出现在细胞核、胞质中和细胞表面。它构成了高度保守的Ca++结合蛋白质。肌钙网蛋白在许多不同的自身免疫病或炎症性疾病中，主要在SLE和盘尾丝虫病中，以及在RA中，是自身抗体的靶子。而且RA相关的单元型DR4Dw4/DR53能结合肌钙网蛋白衍生的肽。
BiP(重链结合蛋白)RA侏儒的另一种有希望的靶抗原是遍在性BiP(结合蛋白)，它最初被描述为重链结合蛋白，因为它能与免疫球蛋白的重链相互反应。BiP本身是ER常驻蛋白参与在正常情况下防止蛋白质输出的一种肽序列。同时已揭示BiP是一种所谓的分子伴侣蛋白，其作用是与大多数蛋白质相互反应，从而将蛋白质引入内质网(ER)进入分泌通路。除了这种基本的功能特性外，BiP在应激因素如重金属离子或影响细胞内钙离子水平或蛋白质生物合成完整性的物质的作用下过度表达。这些情况下甚至可在核中以及细胞表面检测到BiP。
BiP在66％的RA病人中是自身反应性抗体的靶子。其原先在RA中描述为p68，这些自身抗体的疾病特异性为99％，极高。该抗原是O-糖基化的，有人提出这种修饰可能具有调节功能，象许多其它蛋白质中的单体O-GlcNAc那样。这些蛋白质中，从O-GlcNAc转变成O-磷酸修饰与活化状态或细胞区室的变化有关。以类似方式，应激可诱导BiP从内质网转移到细胞核或细胞表面，可能是一种病理相关性转变。BiP存在于细胞表面是非常不一般的，可能起着报警信号或其它细胞和免疫系统细胞激活的作用。RA中这种激活可能发生于局部感染或炎症对组织的破坏。因细胞或组织损伤，BiP可能到达受损细胞表面成为自身反应性T细胞的靶子。这提示，这些BiP反应性T细胞也存在于天然情况下，此时调节性T细胞在诱导条件终止后下调了这些反应性T细胞。该调节性细胞是抗原特异性和HLA限制性的。因此HLA对调节性T细胞的限制显然不同于HLA对效应T细胞的限制，从而受到特异性抑制。在本文中，表位O-GlcNAc可能还具有重要作用，可以充分想象，该表位不仅是自身抗体应答的靶子，也是T细胞应答的靶子。
从滑液中分离得到的另一种蛋白质是p205抗原，然而其功能大大超过此区室，它是RA病人中自身反应性T细胞的靶子。也在p205滑膜中表达，可能构成了整个RA中具有最高T细胞刺激能力的抗原，部分达到T细胞的增殖速率，它获自滑液或甚至借助植物血凝素(PHA)而获得。p205抗原的功能尚不清楚，然而它含有一种11个氨基酸的序列，与IgG的恒定区CH2和CH3之间的区域(类风湿因子结合区域)的一段相同。p205的该区域是单克隆类风湿因子的结合区，也为自身反应性T细胞所识别。另外，当p205特异性T细胞受同源抗体刺激时，对分泌类风湿因子的B细胞有支持作用，这样必须假定，对于首次发现的这个具有T细胞反应性的抗原，还能支持IgG特异性B细胞的亲和力成熟。与此假定相反，迄今未能发现T细胞对完整IgG或IgG片段的反应性。有可能p205的这个氨基酸序列所构成的肽在体内IgG加工过程中不产生或不能充分产生。因此似乎有可能是对p205的自身反应性在RA中诱导产生了类风湿因子。
RA相关的自身反应性的这个概述显示，许多不同的自身抗原在RA过程中可成为免疫系统的靶子。这些自身抗原在其它类风湿和非类风湿疾病病人，甚至健康人中也不同程度地成为免疫系统的靶子。因此，必须声明，根据目前的知识，既非早期阶段也非其进程中，无自身反应性本身适合于改进RA的诊断或监测各种治疗过程。
本发明的特征本发明的目的是改进和支持慢性炎症性关节疾病的诊断和治疗。这个目的通过提供“慢性炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病的诊断、分子分辨和治疗开发的方法”来实现。这些方法描述如下。
高通量方法，如DNA阵列或蛋白质阵列技术能同时检测大量不同的参数(9)。可借助DNA阵列通过标记的RNA或cDNA样品的杂交在mRNA水平上，和通过含有选择的蛋白质特异性抗体的阵列在蛋白质水平上，分析基因表达(10)。而且，可利用含有选择的抗原阵列来评估免疫反应性(11)。
首先，必须确定与该病相关的并可用于评价的基因和蛋白质。
设计用于炎症性关节疾病诊断和治疗开发的本发明方法，基于如此明确选出的参数(表1和2)。采用本文给定的基因通过阵列方法作基因表达分析，为一种基本上新的诊断方法预作了准备。
对用于测定关节疾病中特异性mRNA表达模式的DNA阵列，表1给出了可整体利用的基因，以及编码表2所述蛋白质的所有基因。而且可利用表1列出的这些基因或单个基因的部分序列或选择这些基因/部分序列，以及编码表2所述蛋白质的这些基因或单个基因的部分序列/部分序列或选择这些基因/部分序列。
为了特征鉴定自身免疫反应性，可全盘利用表2所述的蛋白质，以及表1基因所编码的蛋白质，而且也可采用这些蛋白质的有限选择，这些蛋白质的选择部分(寡肽或多肽形式)或其修饰形式。在蛋白质水平上，还必须特别考虑翻译后修饰(如糖基化、磷酸化等)可能与风湿病之间的差别有关，可将这些蛋白质、部分蛋白质序列、修饰的蛋白质和修饰的部分蛋白质序列，分别或组合在一起施加在合适的载体基质上以测定病人的抗体对这些成分之一种或几种的反应性。结果获得了病人的反应性或无反应性概貌图。现有技术的诊断方法和本文提出的诊断方法之间的关键性区别是，现有技术的方法测定和分析各个病例中的一种自身反应性，而本发明是测定和分析多种自身反应性。本发明利用了以下出乎意料的发现即将几种自身反应性组合成一个或多个模式图(当单独考虑时它们不会产生)而得以区别，因为此方法可在100％病例中鉴别RA和非RA(即其他风湿性疾病和非风湿性疾病及健康状态)。分类成不同的概貌图可通过适当的算法来实现，最佳形式是通过自身学习(self-learning)算法，该算法还可能包括后面的发现。
为了测定蛋白质表达模式，已从蛋白质特异性抗体开发了阵列系统。通过标记样品蛋白质抽提物中的蛋白质，在特异性结合于该阵列中的相应抗体后，可定量测定这些蛋白质(10)。因此，本发明意义上的分子工具定义为一种阵列，该阵列由具有相当的蛋白质特异性结合能力的不同抗体或分子组成，设计用来测定从表1那些基因推导的所有蛋白质或选择的蛋白质，或测定表2的所有蛋白质或选择的蛋白质。
该诊断方法采用滑膜组织、滑液、血细胞、血清或血浆的活检样品作各种不同的阵列分析。该方法中可分析液体样品的体液自身反应性、血细胞或滑膜组织细胞中的细胞自身反应性。可分析所有上述样品的蛋白质表达，滑膜组织、滑液细胞或血细胞中mRNA水平的基因表达。
为了用DNA阵列分析，需提取组织或血液、滑液中细胞样品的RNA。制备供DNA阵列杂交的样品，采用标准的扩增程序(12)，标记衍生的cDNA或cRNA(12)。
表中所述基因通过其已知序列(见登录号GeneBank-http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供了产生各个基因特异性探针的基础。以特定的印制方法(14)加入制备的探针或在固相上以光刻法位点特异性合成(15，16)将这些探针组合在一个陈列中。
标记的样品在阵列上的杂交，通过位点和基因特异性结合提供了定量信号可将这些信号翻译成表达概貌/模式。将这些模式与已建立的评价方法包括组织学特征和分类相关连，再与不同的关节疾病如骨关节炎、牛皮癣相关性关节炎、反应性关节炎疾病以及其它(部分还是)非分化性关节炎疾病相比较，从而得以将病人按照各自的表达概貌分成不同的组。
本方法的新颖性为了确定该阵列分析用于关节疾病分类和评价的值得信任的参数，进行了广泛的比较研究。为此目的，研究了不同的关节疾病并选择了不同方法彼此部分互补的一种崭新组合。
分析了RA、骨关节病和健康关节的滑膜组织。为了进行基因表达的差异性分析，首先进行了“代表性差异分析”(17，18)。此技术的优点是包括了样品中存在的所有的RNA，即使不知道它们的序列。缺点是要对最强烈显示的表达差异作深入细致的选择。作为补充，我们还通过两种不同的DNA阵列杂交方法测定基因表达；一种是cDNA过滤阵列(19)，另一种是寡核苷酸显微阵列(美国专利号5445934，5744305，5700637和5945334以及欧洲专利号619321和373203)，这些基于当前知识的显微阵列使得能测定几乎所有的已知人类基，并进行这些基因中的每一种在组织样品之间的表达比较分析。最后，通过半定量聚合酶链反应(PCR，实时PCR)综合验证大样本中所选基因的差异性基因表达。
而且，对组织作组织学特征鉴定，按照组织学分类并与各自的差异性基因表达模式作比较。表1中的基因鉴定为不同的慢性关节疾病之间和与正常滑膜组织比较差异性表达的基因。因而，这些基因对于特征鉴定慢性关节疾病是重要的。
用于鉴定相关基因的该选择方法也具有新颖性。已鉴定基因的该表还显示，大多数基因是迄今与炎症性类风湿关节疾病无关的，还显示了诊断、病理生理研究和治疗慢性关节疾病的新的评价标准。
本发明的特征由权利要求各要素和说明书加以公开和详细说明，一种特征和几种特征以组合形式构成了优选的实施方案，本说明书申请对其进行法律保护。这些特征包括已知的各要素，即表1所述的基因或部分序列和表2所述的编码诸蛋白质的基因和部分序列，以及新的要素，即以利用明确选定的参数(表1和表2)为基础的新的工具-它们组合形成了本发明的方法，利用上述基因以阵列方法进行基因表达分析，从而产生了一种从根本上说是新的诊断炎症性关节疾病和治疗开发手段的方法。
本发明的方法是基于(显微)阵列杂交的高处理量方法和/或采用聚合酶链反应技术进行(半)定量的高处理量方法。
这些方法的其它特征是基于采用标记的病人样品和采用第二种不同标记的对照样品，用于与病人样品一起进行(显微)阵列比较性(红/绿)双杂交。也可以在不同阵列上分析这些样品，然后作比较。根据本发明，这些用于诊断目的的方法是依据利用-权利要求1到3所述诸基因序列推导的一种蛋白质或多肽，选择的一组蛋白质或多肽，或其全体；-表2所述的各个蛋白质，从所有蛋白质中选出的一组蛋白质；和-来自表1所述各个蛋白质、一组蛋白质或所有蛋白质的部分序列。
这些方法包括与表1推导的蛋白质序列相同的或与表2所述蛋白质序列相同的、或显示各自序列相同性至少80％的蛋白质或部分蛋白质序列。这些方法的其它特征基于采用-分析蛋白质表达的高处理量方法(高分辨率的二维蛋白质凝胶电泳，MADLI技术)；-蛋白质斑点技术(蛋白质阵列)领域中设计用来筛检自身抗体的高处理量方法，作为人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病的诊断工具；-蛋白质斑点技术(蛋白质阵列)领域中设计用来筛检自身反应性T细胞的非高处理量方法，作为人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病的诊断工具；和-蛋白质斑点技术领域中设计用来筛检自身反应性T细胞的非高处理量方法，作为人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病的诊断工具。
本发明的方法还基于采用-针对权利要求6至9所述的蛋白质或部分序列的特异性抗体；和-用于动物实验分析或动物炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病诊断的其它种系的各自同源性序列。
本发明的方法可用作检测以下遗传改变(突变)的诊断工具-权利要求1至3所述基因中的基因或调控序列(启动子、增强子、沉默子、结合其它调节因子的特定序列)中的遗传改变(突变)；-编码表2所述蛋白质的基因中的基因或调控序列(启动子、增强子、沉默子、结合其它调节因子的特殊序列)中的遗传改变(突变)。
此外，这些方法也适合于作为人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病的分子分辨工具，利用权利要求1至3所述的基因、DNA序列或推导的相应蛋白质或多肽和权利要求6至9所述的蛋白质和部分蛋白质序列或各自的编码基因序列。
本发明的方法还可作以下应用-采用权利要求1至3所述的基因、DNA序列或推导的相应蛋白质或肽，对人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病的治疗选择；-采用权利要求1至3所述的基因、DNA序列或推导的相应蛋白质或肽，人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤性疾病的进程/治疗效果的监测；-开发治疗观念的分子工具，包括直接或间接影响权利要求1至3所述基因或基因序列的表达；-开发治疗观念，包括直接或间接影响权利要求6至9所述诸蛋白质或部分蛋白质序列的表达；-开发治疗观念，包括直接或间接影响针对权利要求8至11所述诸蛋白质或部分蛋白质序列的自身反应性T细胞；-影响权利要求1至3所述基因序列推导的蛋白质的生物学作用；-影响权利要求1至3所述基因序列及其推导的蛋白质的直接分子调节通路/环路；-开发建立和利用解释算法的治疗观念，从而利用上述基因和序列以及它们的调节机制以认识或预计治疗观念、治疗效果、治疗优化或疾病预后；-利用权利要求1至3和6至9所述的基因、基因序列、基因或基因序列的调控、或利用蛋白质、蛋白质序列、融合蛋白质、或利用权利要求10至14所述抗体或自身反应性T细胞开发生物活性药物(生物制品)。
发现本发明要求保护的方法可用于-在医学诊断中分析血液样品或组织样品，-应用于按照实施例1的分析，和-应用于按照实施例2的治疗概念。
材料和方法病人和组织评估所有病人按RA(1)和OA(2)的ACR标准选择，将滑膜组织立即在含青霉素、链霉素各100U/ml的RPMI培养液(RPMI，常规细胞培养液、稀释的RPMI 1640；Moore GE等J.Am.Assoc.199，519～524，1967)中从手术室转运至实验室。制得滑膜后将样品立即冻存于液氮中。然后，存放在-80]直至使用。作为用于代表性差异分析(RDA)、Unigene滤膜阵列(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)和Affymetrix阵列杂交的样品，我们采用了正常供体(ND)，骨关节病(OA)和类风湿性关节炎(RA)的滑膜组织样品。
分离RNA将各样品制成匀浆以提取RNA用研钵和捣锤，同时用液氮冷却，将50mg以下的组织破碎成粉末，然后溶于含异硫氰酸胍的溶液(RLT-缓冲液，Qiagen，Hilden，Germany，www.qiagen.com/literature/hankboods/rna/rny96/1019545_PREHB_RNY96_prot2.pdf)中。较大量的组织块则用组织匀浆机(IKA-UItra-TurraxT25；Jahnke 8 Kunkel，Staufen)在冰冷的含异硫氰酸胍的溶液RLT-缓冲液，(Qiagen，Hilden，Germany)中破碎。用改良的Chomzaynski(21)酚-氯仿抽提法分离RNA，然后用QIAGEN的RNA试剂盒(见制造商的手册http//www.qiagen.com/literature/rnalit.asp#mini)立即从水相中分离出RNA。按制造商程序使用此试剂盒。以30-100微升无RNA酶的水洗脱RNA。
为控制质量，测定260nm处光密度(OD260)，测定OD260/OD280nm比值并作1％琼脂糖凝胶电泳。如需要，可在凝胶中或在第一次标准合成后在PCR中用甘油醛-3一磷酸脱氢酶(GAPDH)的内含子引物测定DNA污染。在这些特殊情况时，我们也用DNA酶消化，按照QIAGEN方案的说明书进行。
第一次链合成采用含有Invitrogen/Life Technologies(Karlsrube.Germany；http//www.invitrogen.com)的5X反应缓冲液的Superscript II逆转录酶(RT)进行cDNA合成。半定量PCR所用的RNA量为3-5微克，RDA为10-20微克，并在20微升最终体积中作阵列杂交。转录成为cDNA的反应混合物含有以下成分500纳克各个引物寡核苷酸(Oligo(dT)12-18，T7-Oligo(dT24))，50mM Tris(pH8.3)，75mMKCl，3mM Mgcl2，10mM二硫苏糖醇，脱氧核苷三磷酸(dNTP)与最终浓度为1mM的各核苷酸的混合物，40U的RNA酶抑制剂和20U的SuperscriptTMII RT。培育1.5小时，然后将样品加热至72□15分钟，灭活酶。
第二次链合成用移液器将下述成分加入cDNA90微升蒸馏水，30微升5X第二链缓冲液(500mM KCl，50mM醋酸氨，25mM MgCl2，0.75mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(□-NAD)和0.25mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，3微升10mM dNTP溶液，以及以下活性和量的酶溶液1微升大肠杆菌连接酶(10U/微升)，4微升DNA聚合酶I(10U/微升)和1微升RNA酶H(2U/微升)(Invitrogen/Life Technologies，Karlsruhe.Germany)。16□培育2小时，加入2微升T4DNA聚合酶(5U/微升)后再16□培育30分钟。
扣除杂交和RDA按RCR选择试剂盒(Clontech，Palo.Alto，USA；http//www.clontech.com/pcr-select/index.shtml)厂商的说明书进行RCR抑制性扣除杂交(SSH)(22)。用斑点园红假单胞菌的限制性酶RsaI消化双链cDNA。对于RDA，用肺炎双球菌的限制性酶DPNII(20U/100微升)切割双链cDNA(18)，然后，连接于衔接子引物(RBg112，RBg124)，再按公布的方案(17、18)扩增。通过在第二轮扣除中连接于另一衔接子寡核苷酸(JBg112和JBg124或NBg112和NBg124(18))进一步限制性消化后，获得测试者—扩增子。
杂交后将属于测试者的序列以PCR选择性扩增并积累在两方法的扣除产物中。
扣除样品的描述如此改进RDA程序使之有可能鉴定以较弱方式和以较显著方式表达RA、OA和正常组织供体样品中的基因。
在这个程序中1、从RA(测试者)中减去OA(驱动者)，以获得显示在RA组织中比在OA组织中更强表达的序列。
2、从ND(测试者)中减去RA(驱动者)，以获得显示在RA样品中比在ND样品中更弱表达的序列。
3、从OA(测试者)中减去ND(驱动者)，以获得显示在OA组织中比在ND组织中更强表达的序列。
执行扣除库克隆，序列确定和与数据库的比较将SSH样品的扣除产物克隆入pCRII载体(TA-克隆试剂盒Invitrogen，Heidelberg，Germany，http//www.invitrogen.com)中。将RDA的扣除产物克隆入事先已用淀粉液化杆菌的限制性酶BamHI切割、然后脱磷酸化并纯化的pBluescript KS+II载体(Stratagene，La Jolla，USA；http//www.stratagene.com/vectors/selectim/plasmid.htm)中。分离得到约150个克隆并用ABI 377测序仪(AppliedBiosystems，Weiterstadt，Germanyhttp//home.appliedbiosystems.com)测序。采用T7引物按厂商Dye Terminator Chemistry的程序进行序列测定。
去除载体序列后，用Genebank和NCBI数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列的比较分析。
显微阵列杂交采用了两种不同的芯片技术1)采用其上点样了UNIGENE库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGenel/)cDNA克隆的PCR产物的滤片。用Oligo(dT(12-18))第一次链合成后，于65□与33P-标记的cDNA样品进行杂交(23，24)。2)与Affymetrix(Affymetrix Inc.，Santa Clara，USA；www.affymetrix.com)的显微阵列(HU95A、HU95B、HU95C、HU95D和HU95E)进行杂交。这些阵列是其碱基序列衍生自总共12000个已知基因和24000个表达的序列标记(EST)的寡核苷酸阵列。标记样品的合成按厂商的技术手册(Affymetrix Inc，Santa Clara，USA)进行。
用含有T7聚合酶结合位点的Oligo-dT24引物转录后合成了荧光标记样品。标记反应用T7 RNA聚合酶和生物素化dNTP按厂商程序进行(ENZO-Biochem，NewYork，USA；http//www.enzo.com/entrance.html在两种芯片分析中，使待测样品和参比样品分别与滤膜杂交。标准化后进行信号强度比较。
芯片结果的评价-判定矩阵标准化后，借助用于各自阵列的开发软件和按照Tukey’s Biweight方法(http//mathworld.wolfram.com/TukeysBiweight.html)测定各样品的强度值，进行信号强度的评价。
为了评价Unigene滤片阵列，在Berlin-Dahlem的Max-Planck分子遗传学研究所开发了算法(http//algorithms.molgen.mpg.de/)。就Affymetrix的芯片而言，MicroArraySuite 5.0软件(http//www.affymetrix.com/products/software/specific/mas.affx)包括采用厂商的标准参数或先决条件。
为了评价Affymetrix阵列，将靶子的强度设定为100，标准化系数设定为1，以使数据标准化。并计算出各样品的换算系数。比较性分析中包括了具有可比换算系数(系数＜4)的芯片。将基因检测的判定标准(判定P值)设为＜0.05。各阵列的比较性分析用Affymetrix的DMT 3.0软件进行(http//www.affymetrix.com/products/software/specific/dmt.affx。
精确匹配和精确与错配强度之间的差异用Wilcoxon检验(http//faculfy.vassar.edn/comry/wilcoxon.html)计算，并与判定标准截留值(γ值＜0.04)比较。在各芯片比较结果的说明中以对数形式标出变化的得分(Change-Call)(增加、数量级缯加、无变化、降低)和信号的对数比率(系数变化的一种衡量)。
判定标准对所有样品进行了各种比较性分析(每一样品与其它组ND、OA、RA的每一样品比较)。
就Unigene滤片杂交而言，4次比较至少有3次的信号差异＞2，故考虑判定信号的P值＜0.01。
Affymetrix阵列的程序如下在表达增加和降低的方向上将每一个RA样品与每一个OA样品比较。选出这些比较中80％显示“增加”或“降低”离差规律系数(regulation factor)＞2(信号的对数比率＞1)的基因作为候选基因，以U95A芯片为例，确定其选择标准为规律系数＞3。
半定量RCR从测定的序列区开始，我们选择具有类似退火温度和产物长度的引物。为了搜寻引物采用了DNASTAR引物选择软件(DNASTAR Inc.，Madison，USA；http//www.dnastar.com/)，在Gibco-Life Technologies(Karlsruhe，Germany)进行了引物合成。对于PCR产物的半定量测定，采用了实时PCR-System GeneAmp5700和Sybr-Green-PCR-Core试剂盒(Applied Biosystems，Weiterstedt，Germany；http//europe.appliedlbiosystems.com/)借助GAPDH特异性引物实时括增的结果，将所有样品的cDNA量置于同一等级，将GAPDH特异性产物作为内标进行了其它几种基因产物的定量测定。作为对照，扩增了作为第二管家基因的□-肌动蛋白并与所有样品作平行分析。
用滑膜样品作组织病理学评价。制备长6微米的冰冻切片，空气干燥并用丙醇和甲醇的1∶1混合液固定。按标准方法作苏木精染色并按组织病理学评价标准分类(25)。
免疫分析的方法和结果测定了T细胞和B细胞水平上的RA特异性自身反应模式，并以此鉴别该病与其它风湿性或非风湿性疾病。关于RA特异性免疫的知识对开发诊断工具有非常重要的意义，可早得多地和更有把握地识别关节炎疾病是RA或显示此关节炎病不是RA，这在当今是可能的。这得以在发生不可逆关节和骨损伤之前通过适当的药物控制RA。
为此目的，采用了蛋白组学技术，以高分辨二维电泳来产生建立特异性蛋白质模式。用免疫组学筛检已知和未知的自身反应性。通过测序和MALDI-TOF(26)鉴定具有有效灵敏度和特异性的蛋白质斑点，从而筛选同组中引起T细胞自身反应性的那些蛋白。
本发明已建立了RA完全特异性的自身反应性模式。在这个分析中，极其重要的是没有单一一种自身反应性表明此特异性，因此只能通过几种自身反应性的组合来达到。可以明确鉴别RA病人与其它风湿或非风湿病人的这类模式包括自身抗原瓜氨酸化肽(Cit)、IgG、BiP(重链结合蛋白)、钙蛋白酶抑制蛋白(Calp)、RA33(hnRNPA2)和肌钙网蛋白(Calr)。下表显示了这样的五种自身反应性(RF、Cit、BiP、RA33和Calp)的所有可能的组合及“阳性”和“阴性”两种可能情况。RA中只表达重点示出的模式(统计学相关性p＜0.01，Whitney U检验；http//faculty.vassar.edu/lowry/utest.html)。图1显示所有可能的组合对RA和对照组二者的灵敏度。该RA特异性模式以类似于表1的方式重点示出，主要包括各种参数的四倍和五倍阳性。这些自身反应性模式的组合只发生在RA中，特异性为54％。
针对IgG、Cit和BiP的三种自身反应性的独特RA表达模式(RF+Cit+BiP+和RF-Cit+BiP+)的总灵敏度为43％。针对IgG、Cit、BiP和RA33的四种自身反应性(RF+Cit+BiP+RA33+，RF+Cit+BiP-RA33+和RF+Cit+BiP+RA33-)的独特RA模式显示总灵敏度为40％。六种模式的分析灵敏度达到了60％。
根据第一个研究，这些模式也与早期RA病人相关。其它已作过特征鉴定的候选抗原包括Sa-抗原(5)，它可能由□-烯醇化酶和瓜氨酸化波形蛋白组成。
RA免疫反应的鉴定不仅有诊断意义，而且有病因相关性。当鉴定到这些T细胞自身反应性引起了早期RA时，看来有可能开发出显示特异性效果的治疗方案。
方案1对RF、瓜氨酸、BiP、钙蛋白酶抑制蛋白和RA33自身反应性的模式。
所示为对IgG(RF)、瓜氨酸、BiP、钙蛋白酶抑制蛋白和RA33自身反应性的所有32种可能的五种组合。像图1一样，RA特异性组合用颜色重点示出。
优点包括了复杂的分子模式，可通过数学计算式将这些模式分类成组和相宜的等级。可派生出的分类和与疾病持续时间、临床疾病活动性(疾病活性评分(Ref))、从C反应蛋白增高或沉降速率测得的炎症活动性、放射学上的关节损坏和药物的特殊影响相关的知识，使得从阵列分析中得出以下结论把临床症象归属于明确的诊断和得以在分子水平上分类的亚组、评价疾病的活动性和预计结局(预后评价)、展望不同的治疗形式、推荐合适的治疗方法(如用氨甲喋呤代替Leflunomide或联用柳氮磺胺吡啶和氨甲喋啶代替单用氨甲喋啶)，最后监测治疗效果。
在明确实施医学治疗之前和治疗期间采用这些方法，可确定所用基因的哪一些受到药物的影响。从而衡量该药物如何影响受到疾病典型方式改变的基因表达。从这点出发可得出结论哪一些疾病相关的分子改变不顾这种治疗而仍然有效发生。关于这些病理活性基因功能的知识原则上使我们能够阐明关节疾病的病理生理过程并导出新的治疗观念。
基因的组合表1
蛋白质的组合表2
现在通过实施例描述本发明，但实施例并不限制本发明。
实施例实施例1 临床诊断中的应用一位病人有4个月的关节症状，手指2个远端关节和一中部关节及右腕关节不对称肿胀和疼痛，清晨僵硬持续约30分钟，X光片显示脚趾一远端关节早期浸蚀性改变，C反应蛋白在正常范围内，沉降速率轻度升高，类风湿因子和HLA-DR4阴性。没有炎症性类风湿病家族史。
门诊随访时，以最少侵害性关节镜术分离得到右腕关节滑膜的活检样品。4个样品各重约10毫克。以福尔马林固定小块样品随后作组织学评价，其余样品置入RNA裂解缓冲液中，按标准方法破碎并抽提RNA。逆转录成cDNA后进行构成cDAN转录的体外转录为生物素标记的cRNA，将该cRNA片段化，然后与DNA阵列杂交。
由生产DNA阵列的商业公司如Affmetrix生产出该阵列。从表1序列和从编码表2蛋白质的基因序列推导出合适的寡核苷酸。这些寡核苷酸可与各自cRNA序列特异性杂交。合成这些序列的寡核苷酸，然后印制在阵列载体上，或在载体上用照相平板印刷方法直接合成。
按照厂商说明书进行杂交，用扫描仪读取DNA阵列，用标准软件如Affymetrix的“Micro-Array Suite”将光信息翻译成表达信号。即获得了表1和表2所列基因RNA表达量或蛋白质的信号。从这种用于关节疾病诊断评估和开发治疗基因的选定开始，将临床和组织学特征已鉴定的组织样品进行分类，并在初步测试中，分类归并分析后以分等级方式彼此相关连。由于与临床发现有可比的相关性，这种分类具体依赖于疾病类型(关节病、反应性关节炎、类风湿关节炎、类风湿关节炎亚组)、疾病的活动性，预后和所用药物影响病理改变基因表达的可能性。将上述病人的信号数据与该数据库比较，从而有可能将其分配到这些组中的一组，可获得相应的临床相关性信息。这样，可获得各位病人的诊断、活动性、预后和治疗看法的证据。
实施例2 对于治疗评估的应用一位病人，患慢性关节炎症5年，诊断为类风湿关节炎，显示几个指关节中有进行性特异性X线改变、伴有几个指关节、左肘关节和右踝关节疼痛和肿胀，尽管最近作过基础治疗每周服用15毫克氨甲喋呤。走访时，以最小侵害性关节镜术分离得到左肘关节滑膜活检样品。将总重约30毫克的几份样品置入裂解缓冲液中，破碎，抽提RNA，以类似实施例1的方式制备样品。分析采用与实施例1同样的DNA芯片。杂交后，将杂交结果转为图片数据文件，再将结果翻译成各测试基因的信号信息，分配成明确的表达模式。在初步测试中测定这些模式，采用本说明书中表1和表2所确定的基因选择。依据已受到确定浓度所用药物影响的各种关节疾病分析样品表达模式的改变。给表达模式按等级分类，从而考虑与所用药物、所用剂量的关系。当将病人样品与这些已明确的表达模式比较时，将其分配到特定模式，与其相关的治疗效果信息有可能估计，所用在药物氨甲喋呤是否高剂量时有效，或是否有理由更换药物，该药物的活性状况能很好地影响个体病例的病理变化。
实施例3 RA中的自身反应性概貌在自身抗体产生方面RA不同于其它风湿性和炎症性疾病。因此，一种抗体反应性不能提供RA和非RA之间的区别。但几种自身反应性的不同模式却可能。因此，可获得救助性诊断以控制治疗进程和根据测定的RA特异性自身反应性概貌进行预防性检查。
在特异性抗体-抗原反应时，针对抗原更确切说针对表位的抗体被其互补位结合。表位定义为抗原与抗体(即与其互补位)特异性相互作用的区域。通常将一个表位理解为蛋白质的一段肽序列，此肽序肽包含约16-20个氨基酸，该序列可以是连续性(连续表位)或间断性(不连续表位)的。然而，抗体和抗原之间的特异性相互作用通常只需几个氨基酸，罕见情况时只需一个氨基酸即足够。同时已知甚至核酸也可起抗原作用。特别重要的是越来越归因于翻译后修饰，如磷酸化、酰化、糖基化、甲基化、脱亚氨基化等，因为这些修饰常具有调节功能，它们似乎特别令人感兴趣作为抗原的靶结构，特别是在病理情况下，对于某些RA相关的自身抗原，已证明特异性的翻译后修饰产生了自身抗体(识别)的表位，因此必须对此特别关注，在测试系统中识别这些结构。
表2所列蛋白质被描述为RA相关性自身抗原，然而这些单一组分的大多数对RA诊断关系不大或不明显，这同样适用于表1所列的mRNA水平上过度表达的基因，这些组分本身不适合于显著改进RA的诊断。事实证明，表1和表2所列大多数蛋白质实际上不能用于这一目的，只有少数几种蛋白质特性上估计与RA相关，例如蛋白质BiP(重链结合蛋白)就有效，它是RA中免疫反应的靶子。这里必须考虑翻译后糖基化修饰形式，因为这种修饰是一种表位组分，对于RA自身抗体的识别及RA自身抗体的区别都是必须的。而且，翻译后从精氨酸转为瓜氨酸，这种氨基酸被描述为RA相关自身抗体(识别)所必需的表位(6)。类似地，Sa抗原(5)、RA33抗原和钙蛋白酶抑制蛋白(的修饰)对RA的诊断有效是很重要的。
然而，这些组分本身不适合于明确RA诊断或甚至不适合监测治疗效果。本发明所述的新方法指RA的免疫状态。RA的免疫状态包括RA中存在的全部自身反应性抗体，也包括这些抗体所识别的全部自身抗原或自身表位。出乎意料发现，通过分析RA相关自身抗体的组合有可能第一次明确诊断RA这样的疾病，有可能第一次证明只有RA中才存在的自身抗体的不同模式。这些模式还包括本身看来对RA(诊断)不重要的那些自身抗原和自身反应性。甚至更令人惊奇的是，因为其它研究小组各自的首次测定并未导致这种发现，虽然强调说他们采用了八种不同人体自身免疫性疾病的最重要的自身抗原(11)。采用与另一风湿病系统性红斑狼疮(SLE)相关的自身抗原同样如此。显然，已发表的这些方法和本文所述方法之间存在着本质差异，一方面是根据分析的类型(多个随机变量)，另一方面是根据自身抗原的组成。只有足够数量的RA相关自身抗体才能够明确诊断。因此在其它应用中，全部RA相关自身抗体和自身抗原组成的信息与其它技术(蛋白质阵列技术(27)、数据处理)一起可用作RA诊断和分类的工具。甚至该领域的专家也不能通过类似的推论断定这种利用程度。可利用RA的免疫状态和只利用其几个部分来明确鉴别RA与其它疾病或健康状态。而且出乎意料的本发明的商业应用，只是由于最近可得到的或仍在开发的高处理量技术而成为可能。这具体指自身反应性的多参数分析，因为此时必须采用病人的微小尺寸样品进行多种平行分析。
为了产生自身反应性概貌图、合成和提供了表2所列诸成分的蛋白质或蛋白质部分序列及表1所列基因所编码的蛋白质和蛋白质部分序列，包括区别RA和非RA可能需要的翻译后修饰。可用分子生物学的任一已知方法或蛋白质化学的任一方法进行这种合成。另外，按照该领域的状况，部分人工(体外翻译)或人工合成方法适合于制备所述蛋白质或蛋白质部分序列。
蛋白质阵列/肽阵列(28)采用表2或表1的蛋白质或蛋白部分序列的全部或仅作为适合于临床症象免疫鉴别的一种选择，以产生一种适合于测定个体自身反应性的试验选项。这具体指选择瓜氨酸、BiP、p205、IgG、钙蛋白酶抑制蛋白、RA33、Sa抗原和钙网蛋白。为此目的，将这些蛋白分别加到载体基质上，其位置可以空间分辨。每种固定化的蛋白质、肽、修饰蛋白或修饰肽的位置和身份是已知的。显微格式可平行检测亚微升水平人血清中的几千种不同抗原和/或自身抗原(蛋白质/肽)，优化的选择是制备高密度滤片、高密度玻璃载体或以高密度方法产生的其它基质的蛋白质阵列，将这种基质以包被或非包被形式与蛋白质或蛋白质部分序列偶联。例如，可将蛋白质或蛋白质部分序列印制在衍生的或包被的/激活的玻璃载体上，或通过喷墨法以毛细方式施加，或用照相平板印刷面罩或数字显微反射仪在阵列上直接合成。除玻璃载体外也可使用膜和滤片、聚苯乙烯基质、纳米孔板和微粒(29)。
将蛋白质阵列与适当稀释的病人血清或病人关节渗出液一起培育。培育期间可能存在的抗一种或几种蛋白组分的特异性抗体可结合这些蛋白质抗原，然后洗涤去除残存的游离抗体和血清组分。将样品与第二抗体一起培育，适当的第二抗体能结合第一抗体从而表明已发生抗原-抗体反应，并引入适当的标记通过共价交联的荧光染料或共价交联的酶(能使前体底物产生颜色)得以显现和定量分析。然后再经洗涤除去残存的游离第二抗体。
悬浮阵列(30)悬浮阵列采用塑料颗粒作为基质，用上述蛋白质包被塑料颗粒。这可实施如下，即与特异性蛋白质交联的颗粒的光学特性与交联另一种蛋白质颗粒的光学特性不同。以类似方式与病人血清或其它体液一起培育进行免疫分析，通过与适当的第二抗体反应，直接或间接地产生进一步的光学(荧光)信号，在多色荧光激活细胞(FAC)扫描仪中进行分析。
时间分辨蛋白质阵列(31)将聚苯乙烯表面与表1和表2的不同蛋白质或蛋白质部分序列交联。将待分析的病人血清抗体用活化生物素酯生物素化，或也可采用对人抗体特异的生物素化第二抗体以避免生物素化效率不同所引起的病人之间的离差。然后将病人抗体与交联了蛋白质的聚苯乙烯表面一起培育，经后续洗涤，用交联了荧光铕复合物的链霉亲和素进行检测。洗涤和干燥后用激光激发的时间分辨固相荧光分析法进行评价。
数据模式和多因素分析尽可能完全地测定诸参数(如获得的对表1和表2所列蛋白质/自身抗原的自身反应性，如自身反应性RF/瓜氨酸/BiP/钙蛋白酶抑制蛋白/钙网蛋白/RA33)。分析中先剔除6个值缺失2个以上值的个体病例的数据模式。
解释该免疫检测系统对各病人和各种自身反应性所产生的阴性和阳性结果。另一种选择是将连续值(蛋白质阵列，ELISA)人工地(数学上)或用对照组相关的截断值(与适当的对照组，如年龄和性别相匹配的健康人对照或患另一种疾病的病人对照相比进行分析)分成阳性或阴性。用CLASSIFI程序系统(32)分析各数据模式并分类。
第一步，将各临床诊断类别的三矩阵特征输入第一参数分类光刻掩模(mask)，然后按照病人掩模和临床参比掩模之间的位码身份(识别码)的最高等级给每个病人分类。
第二步，消除那些对所有参比掩模显示三矩阵特征为“0”的数据栏，因为它们不能区别存在的疾病。
第三步，用CLASSIF1算法暂时性去除分类过程所有交换中单个参数或二参数的组合，然后重新分类设置的总数据。因其暂时性去除而影响分类结果的参数是提供信息的参数，因为显然不可丢失必须的信息。各参数的信息内容通过该算法间断性提供，操作后再引入，及暂时性抽出下一参数或下一对参数并以相似方式分析。进行间断性删除和再引入，直到单独或组合显示所有参数的信息内容。去除证明单独或与另一参数组合不能提供信息的参数，留下的能提供信息的参数序列构成了各临床预测类别的参比分类掩模第四步，通过将百分比截断值分类为10/90％，15/85％，20/80％，25/75％和30/70％优化该分类。然后选出显示最佳鉴别性能的一对。通常在10/90％和25/75％百分比对范围之间达到最佳分类结果。模糊矩阵(Confusion Matrix)中的阴性和阳性预测值提供了所用模式如何优良地鉴别参比样品和待测样品的信息。此外，对每位病例的数据模式作多因素分析。可将所有可能组合的不同参数相乘或相除，然后将5个数据栏按照RA参比组的平均值进行标准化，来获得五参数模式的多因素(分析)。确定其它病人组(如OA，reA，PsoA等)各参数的平均值。当各病人组的参数平均值比参比值(RA)高时用乘法，低时用除法，确定所有参数交换的多因素。
该多因素数据库包括已测定的RF/瓜氨酸/BiP/钙蛋白酶抑制蛋白/钙网蛋白/RA33的参数。通过CLASSIF1算法给26种多因素作了分类，将数据库各栏的所有数字转换成“-”(少于参比病人[RA]测定值分布的低百分率)、“0”(在高低百分率之间)或者“+”(大于高百分率)三矩阵特征。数据库各栏转换后，即在临床诊断和计算机分类之间设立了模糊矩阵。
该模糊矩阵的对角线值代表了参比样品的特异性和待测样品的灵敏度，在以后的迭代学习过程中可对其进一步优化。当所有样品已正确分类时，即该模糊矩阵的所有对角线值达到100％和非对角线区段值为0％时，就实现了最优分类。学习过程的作用是去除不能提供信息的参数，从而集聚了具有鉴别性能的参数。


图1RA33、RF、瓜氨酸、BiP和钙蛋白酶抑制蛋白的自身反应性模式说明对RA(类风湿关节炎、reA(反应性关节炎)、OA(骨关节炎)、PsoA(牛皮癣相关关节炎)等疾病的IgG(RF)、瓜氨酸、BiP、钙蛋白酶抑制蛋白、RA33和钙网蛋白的自身反应性的所有32种可能的组合。
缩写词名单ACR 美国风湿病学会BiP 结合蛋白，重链给合蛋白BSA 牛血清白蛋白CAlp 钙蛋白酶抑制蛋白Calr 钙网蛋白cDNA 互补DNA，DNA副本CH软骨细胞抗原Cit 瓜氨酸化肽CrP C反应蛋白DNA 脱氧核糖核酸DPNII 来自肺炎双球菌dNTP 脱氧核苷酸三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP的等摩尔混合物)dNTP 脱氧核苷酸三磷酸EBNA-1EB病毒核抗原-1EBV EB病毒ER内质网FACS 荧光激活细胞分拣仪GAPDH 甘油醛磷酸脱氢酶HC人软骨HCgp39人软骨糖蛋白39HLA-systemHLA-组织相容性抗原(人白细胞抗原)HLA-DR4 HLA特征，显示与类风湿关节炎相关性增加
hnRNP 异质性核糖核蛋白(RA33)Hsp 热休克蛋白Ig 免疫球蛋白IgG 免疫球蛋白GIL- 白介素IR-3内部重复区3MCTD混合性结缔组织病(混合性胶原病)MHC-主要组织相容性复合物MMP 基质金属蛋白质酶mRNA信使核糖核酸NAD 烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸NCBI全国生物技术信息中心ND 正常供体OA 骨关节病O-GlcNAcO-N-乙酰葡糖胺PCR 聚合酶链反应PHA 植物血凝素PM/DM 多肌炎/皮肌炎PsoA牛皮癣相关关节炎RA 类风湿关节炎RA-A47 关节炎相关抗原RA33hnRNP A2RDA 代表性差异分析ReA 反应性关节炎RF 类风湿因子RNA 核糖核酸RPMI商业上可获得的常规细胞培养基，稀释培养基RPMI1640(Moore，G.E等.；J Am.Assoc.199，519-524，1967)RsaI球杆红假单胞菌的DNA限制性内切酶RsaIRT 逆转录酶(RT)Sa-抗原 人脾脏和胎盘50k蛋白质SLE 系统性红斑狼仑SSH 抑制性扣除杂交TGF 转化生长因子UniGene是一种将GeneBank序列自动化分配成基因取向簇的UNIGENE非丰余系列的实验系统
YKL-39 人软骨相关蛋白参考文献1.Arnett，F.C.，S.M.Edwortyy，D.A.Blich.et al美国风湿协会1987年为类风湿关节炎修订的标准，Arthritis Rheum 31；315.1987。
2.Kaps，C.，C.Bramlage，H.Smolian，et al骨形态发生蛋白促进软骨分化并保护工程化人造软骨免遭纤维母细胞的入侵和破坏，Arthritis Rheum 46149，2002。
3.Roudier，J.，G..Rhodes，J.Peterson等EB病毒糖蛋白gp110，一种HLA DR4，HLADR1和类风湿关节炎之间的分子联系，Scand J Immunol 27；367，1988。
4.Albani，S.，E.C.Keystone，J.L.Nelson等自身免疫的阳性选择早期类风湿关节炎病人中对细菌dnaj抗原决定簇的异常免疫应答反应，Nat Med 1448，1995。
5.Despres，N.，G.Boire，F.J.Lopez-longo，and H.A.MenardSa抗原系统，一种类风湿关节炎特异性的新抗原抗体系统，J Rheumatol 211027，1994。
6.Schellekens，G.A.，B.A.de Jong，F.H.van den Hoogen，et al瓜氨酸是类风湿关节炎特异性自身抗体所识别的抗原簇的基本组分，J Clin Invest 101273，1998。
7.Girbal-Neuhauser，E.，J.J.Durieux，M.Arnaud等翻译后精氨酸残基脱亚胺基在前丝聚蛋白的不同部位上产生了类风湿关节炎抗丝聚蛋白自身抗体所靶向的表位，J Immunol 162585，1999。
8.Alsalameh，S.，J.Mollenhauer，N.Hain等对人关节软骨细胞的细胞免疫应答反应破坏性关节疾病中T细胞对软骨细胞和成纤维细胞膜的反应性，Arthritis Rheum331477，1990。
9.DeRisi，J.，L.Penland，P.O.Brown等运用cDNA显微阵列分析人癌症中的基因表达模式Nat Denet 14457，1996。
10.Haab，B.B.，M.J.Dunham，and P.O.Brawn用于高度平行检测和定量测定复杂溶液中特异性蛋白质和抗体的显微阵列，Genome Biol 2RESEARCH0004，2001。
11.Robinson，W.H.，C.DiGennaro，W.Hueber等用于自身抗体应答反应的多种特征鉴定的自身抗原显微阵列，Hat Med 8295，200212.Eberwire，J.采用固定化的Oligo(dT)-T7引导的cDNA产生的RNA扩增mRNA群，Biotechniques 20584，1996。
13.Cook，A.F.，E.Vuocolo and C.L.Brakel一系列生物素化寡核苷酸的合成和杂交，Nucleic Acids Res 164077，1998。
14.Okamoto，T.，T.Suzuki and N.Yamamoto用水泡喷雾技术共价结合DNA的显微阵列制作，Nat Biotechnol 18438，2000。
15.Fodor，S.P.，J.L.Read，M.C.Pirrung光指导的空间寻址平行化学合成，Sience，251767，1991。
16.Barone，A.D.，J.E.Beecher，P.A.Bury等高密度寡核苷酸探针阵列的照相平板印刷术，Nucleoside Nucleotides Nucleic Acids 20525，2001。
17.Hubank，M.，and D.G.Schatz用cDNA的代表性差异分析鉴定mRNA表达的差异，Nucleic Acids Res 225640，1994。
18.Listsyn，N.，and M.Wigler克隆两种复杂基因组之间的差异，Science259946，1993。
19.Bussow，K.，E.Nordhoff，C.Lubbert等用于高通量蛋白质表达筛选的人cDNA文库，Genomics 651，2000。
20.Altman，R.，G.Alarcon，D.Appelrouth，D.Bloch等风湿学分类标准和骨关节病芯片报告，Arthritis Rheum 34505，1991。
21.Chomczynski，P.，and N.Sacchi采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提RNA的一步方法，Anal Biochem 162156，1987。
22.Diatchenko，L.，Y.F.Lau，A.P.Campbell等抑制性扣除杂交一种产生差异性调节的或组织特异性cDNA探针和文库的方法，Proc Natl Acad Sci USA936025，1996。
23.Gress，T.M.，J.D.Hoheisel，G.G.Lennon等高密度cDNA文库阵列与全体组织cDNA池的杂交指印，Mamm Genome 3609，1992。
24.Lennon，G.G.，and H.Lehrach形成阵列的cDNA文库的杂交分析，TrendGenet 7314，1991。
25.Krenn，V.，A.Konig，F.Hensel等类风湿滑膜组织的类风湿因子(RF)阴性B细胞杂交瘤的分子分析受选出的高突变IgVH和低突变IgVL/λ基因抗原诱导的刺激证据，Clin Exp Immunol 115168，1999。
26.Leushner，JMALDITOF质谱一种基因组学和诊断学平台，Expert RevMol Diagn 111，2001。
27.MacBeath，G.和S.L.Schreiber印制蛋白质作为高处理量功能测定的显微阵列，Science 2891760，2000。
28.Walter，G.，K.Bussow，D.Cahill等用于基因表达和分子反应筛检的蛋白质阵列，Curr Opin Microbiol 3298，2000。
29.Spiro，A.，M.Lowe and D.Brown采用流式细胞仪多重鉴定和定量测定DNA序列的微珠方法，Appl Environ Microbiol 664258，2000。
30.Nolan，J.P.，and F.F.Mandy悬浮阵列技术基因和蛋白质分析的新工具，Cell Mol Biol(Noisy-le-grand)471241，2001。
31.Madersbacher，S.和P.Berger抗体和免疫试验，Methods2141，2000。
32.Valet，G.，M.Valet，D.Tschope等白细胞和血小板疾病采用CLASSIF1程序系统的标准化自学流式细胞列表模式数据分类，Ann N Y Acad Sci 677233，1993。
权利要求
1.人慢性炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤疾病的诊断、分子分辨和治疗开发的方法，其特征在于，利用表1所述的基因和编码表2所述蛋白质的基因中的单个基因、一组基因或全体基因的序列而实现这种方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括其序列与表1所述基因或与编码表2所述蛋白质的基因相同的基因序列，或具有蛋白质编码区中序列相同性至少80％的基因序列。
3.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于，该方法包括其序列与表1所述基因或与权利要求2所包括基因相同的序列区段或部分序列，或与所述基因各区段序列相同性至少80％的序列区段或部分序列。
4.如权利要求1至3项所述的方法，其特征在于，该方法采用了4.1高处理量的(显微)阵列杂交方法；4.2利用聚合酶链反应作(半)定量测定的高处理量方法。
5.如权利要求1至3项所述的方法，其特征在于，该方法利用标记的病人样品和第二种不同标记的对照样品，对照样品和病人的样品一起，与一(显微)阵列进行比较性双杂交(比较性红/绿杂交)。
6.如权利要求1至5项所述的用于诊断目的的方法，其特征在于，该方法采用了从权利要求1至3项所述的基因序列推导的一种、一组或全体蛋白质或多肽。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法采用了表2所述一种、一组或全体蛋白质。
8.如权利要求6和7所述的方法，其特征在于，该方法采用了表1所述一种、一组或全体蛋白质的部分序列。
9.如权利要求6至8项所述的方法，其特征在于，该方法包括其序列与表1推导的蛋白质或与表2所述蛋白质相同的，或各序列相同性至少80％的蛋白质或蛋白质部分序列。
10.如权利要求6至9项所述的方法，其特征在于，该方法采用了10.1分析蛋白质表达(高分辨二维蛋白质凝胶电泳，MALDI技术)的高处理量方法；10.2设计用于筛检自身抗体作为人炎症性关节炎或其它炎症性、传染性或肿瘤疾病诊断方法的蛋白质斑点(蛋白质阵列)技术的高处理量方法；10.3设计用于筛检自身反应性T细胞作为人炎症性关节炎或其它炎症性、传染性或肿瘤疾病诊断方法的蛋白质斑点(蛋白质阵列)技术的高处理量方法；10.4设计用于筛检自身反应性T细胞作为人炎症性关节炎或其它炎症性、传染性或肿瘤疾病诊断方法的蛋白质斑点(蛋白质阵列)技术的非高处理量方法。
11.如权利要求6至9项所述的方法，其特征在于，该方法采用了对权利要求6至9项所述蛋白质或其部分序列具有特异性的抗体。
12.如权利要求1至11项所述的方法，其特征在于，该方法在动物实验分析中或对动物炎症性关节炎疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤疾病的诊断中采用了其它种类动物的相应同源序列。
13.如权利要求6至11项所述的方法，可用作检测权利要求1至3项所述基因中，或这些基因的调控序列(启动子、增强子、沉默子、结合其它调节因子的特异性序列)中的遗传性改变(突变)的诊断方法。
14.如权利要求6至11项和13项所述的方法，可检测编码表2所述蛋白质的基因中，或这些基因的调控序列(启动子、增强子、沉默子、结合其它调节因子的特异性序列)中的遗传性改变(突变)。
15.如权利要求1至5项所述的方法，可用于人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤疾病的分子分辨，其特征在于，利用了权利要求1-3所述的基因或DNA序列，或权利要求6-9所述的蛋白质和蛋白质部分序列推导的各蛋白质或多肽，或它们的相应编码基因序列实现这些方法。
16.如权利要求1至5项所述的方法，可用于人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤疾病的治疗选择，其特征在于，这些方法采用了权利要求1-3所述的基因或DNA序列，或各自推导的蛋白质或肽。
17.如权利要求1至5项所述的方法，可用于监测人炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤疾病的进展/控制其治疗，其特征在于，这些方法采用了权利要求1-3所述的基因或DNA序列，或各自推导的蛋白质或肽。
18.如权利要求1至5项所述的方法，可用作开发治疗观念的分子工具，包括直接或间接影响权利要求1-3所述的基因或基因序列的表达。
19.如权利要求1-5和18项所述的方法，可用于开发治疗观念，包括直接或间接影响权利要求6-9所述的蛋白质或蛋白质部分序列的表达。
20.如权利要求1-5项和18-19项所述的方法，可用于开发治疗观念，包括直接或间接影响针对权利要求8-11所述的蛋白质或蛋白质部分序列的自身反应性T细胞。
21.如权利要求1-5项和18-20项所述的方法，可用于影响权利要求1-3所述基因序列推导的蛋白质的生物活性。
22.如权利要求1-5项和18-21项所述的方法，可用于影响权利要求1-3所述基因和各自推导的蛋白质参与的直接分子调节环路/通路。
23.如权利要求1-5项和18-22项所述的方法，可用于开发关于设计和利用所述基因和序列的解释算法和它们的调节机制的治疗观念，以认识或预测治疗观念、治疗效果、治疗优化或疾病预后。
24.如权利要求1-5项和18-22项所述的方法，可利用权利要求1-3和6-9项所述基因、基因序列、基因或基因序列的调控、蛋白质、蛋白质序列、融合蛋白，或利用权利要求10-14所述的抗体或自身反应性T细胞，来开发生物学活性药物(生物制品)。
25.作为一种分子工具的阵列，由具有可比蛋白质特异性结合行为的不同抗体或分子组成，用来检测从表1基因推导的所有蛋白质或一组蛋白质，或检测表2的所有蛋白质或一组蛋白质。
26.权利要求1至24所述的方法的用途26.1在医学诊断学中分析蛋白质样品或组织样品；26.2用于按照实施例1的分析；26.3用于按照实施例2的治疗观念。
全文摘要
本发明涉及慢性炎症性关节疾病和其它炎症性、传染性或肿瘤疾病的诊断、分子辨别和治疗药物开发的方法。根据本发明，可将基因组资料(基因组学)、蛋白组资料(蛋白组学)和免疫组资料(免疫组学)用于慢性关节炎疾病的分析和治疗开发。本发明基于利用基因序列及其衍生的mRNA和蛋白质，以及对这些衍生的蛋白质具有特异性的抗体，来特征鉴定炎症性和非炎症性风湿关节疾病、自身免疫病和传染病。可从进行的检查中得出迄今尚不清楚的慢性炎症性关节疾病的病因学重要致病性机理。而且可产生用于所述关节疾病分类、预后评价和治疗优化的解释算法，并可产生药物治疗和攻击部位的新策略。
文档编号A61K48/00GK1537173SQ02814978
公开日2004年10月13日 申请日期2002年5月30日 优先权日2001年5月30日
发明者T·霍普, U·昂杰特霍姆, S·布莱斯, T 霍普, 乘, 芴鼗裟 申请人:奥利金有限公司