专利名称：用总状花升麻的提取物作为雌激素型的对器官有选择性而无趋子宫作用的药物的制作方法
技术领域：
本发明是涉及总状花升麻(Cimicifuga racemosa)的提取物和鸢尾黄素作为雌激素型的对器官有选择性的药物。
背景技术：
形成于卵巢的17-β-雌二醇(以后提到的雌二醇都是指生理学上的17-β-雌二醇)[以后同样也以E2表示]一般对该器官有促进增殖作用。除可以控制女性(月经)周期外，在其缺乏时，它对骨骼的新陈代谢有内环境稳定的影响，也防止血管内皮的动脉粥样斑块形成。
在绝经期，由于卵巢功能的停止，雌二醇的水平下降。这将减弱增殖的过程，对于下丘脑则将造成促性腺素释放激素(GnRH)脉冲发生器活动的增强。(促性腺激素释放激素脉冲发生器是位于下丘脑的定时器，它也是黄体生成素(LH)的定时器，定时脉冲式的，LH分泌和甾族化合物影响其分泌的量幅和频率。)对于更年期的妇女，其结果是被刺激的LH分泌将造成所谓的“热潮红(hot flush)”，即易发怒。
由于血液中雌二醇未达足够高的水平，破骨细胞的活动和骨骼组织破裂占优势地位，伴随骨骼破裂，折断危险的增高。同时，也有很长一段时间将经历血管系统中粥样斑块形成的危险和由此增加的梗塞形成的风险。
总状花升麻和射干的提取物两者都已知是普通药物，能用于减轻围绝经期及绝经后的功能紊乱。迄今为止，通过事实的验证，这两种植物药物的提取物除了对人类众多器官(特别是脑、卵巢、骨骼、血管系统)都有有益的作用外，还有雌性激素型作用。雌激素型作用作用于子宫、阴道、乳房组织和肝，其结果是不利的。然而，令人不快的是，至今这种原可用于在雌激素不足情况下对器官有选择性的预防或治疗的植物药物，在现有的技术水平下无法实现。
发明内容
本发明的目的就是以这种技术状况出发完成有雌激素型作用的植物药物，且其作用是器官选择性，对于子宫来说是没有或只有很小的作用。
本发明的一个目的，就是提供总状花升麻的提取物作为雌激素型的对器官有选择性而无子宫作用的药物的用途。
在体内和体外的实验中，惊人地发现含有机溶剂或含超临界CO2的鸢尾科(特别是射干)和总状花升麻提取物两者都可对于中枢神经系统、骨骼系统和血管系统器官选择性的作用，而不存在对子宫的作用-所谓的趋子宫作用。按发明使用这种提取物被适用于制备以定配方的药物，选择性治疗和/或预防骨质疏松症。
它们也适用于制备以定配方的药物，选择性治疗和/或预防心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化。
它们也适用于制备以定配方的药物，选择性治疗和/或预防围绝经期和绝经期后的精神植物性(psychovegetative)疾病(如热潮红)。
此外还发现，从射干中分离的鸢尾黄素组份与整个提取物基本呈现相同的作用。
鸢尾黄素除了射干，其他鸢尾科如德国鸢尾(Iris germanica)，鸢尾(I.illyrica)，(illrica)，和野鸢尾(I.dichotoma)中同样也发现了这种组份。
从分类学说，射干可以如下分类
对于生产提取物来说，这些植物的根茎、叶梗、叶和/或花瓣是较好的。
对于射干和其组份的基本植物化学描述可见于Ms.A.Nenninger(LMUMünchen，1997)的论文题为“射干一种TCM药用植物和其它Irisarten的植物化学和药理学调查(Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen vonBelamcanda sinensis，einer Arzneipflanze der TCM und anderer Irisarten)”。
本发明中的药物，即由总状花升麻和射干及其他鸢尾科制得的药物和以鸢尾黄素为基础的药物，首次可用作骨骼、心血管系统和大脑的全雌激素受体促效剂。
本发明更详尽的优势和特征可由实验数据及后面的图例描述图1总状花升麻有机相和水相的比较。一种典型雌激素受体-配体的结合测试的替换图。起始浓度为17.66mg/ml，按1∶2，1∶4，等稀释，直到1∶64；图2先加入LH血浆，2小时后，静脉注射射干提取物、E2和载体。射干提取物与E2对于降低被升高的血浆LH水平的作用相似；图3对于卵巢切除的大鼠进行7天的皮下处理后，总状花升麻和E2对子宫重量(图3a)和血液中LH水平的作用(图3b)；(平均值+SEM(均数的标准误差)，n＝8，*＝p＜0.05 vs.聚乙二醇化合物作为载体)；图3a)子宫重量；图3b)血液中的LH浓度；图4a)对于卵巢切除的大鼠进行7天的皮下处理后，总状花升麻和E2的作用；(平均值+SEM，n＝8，*＝p＜0.05vs.聚乙二醇化合物作为载体)下丘脑视叶前区域对E2-受体的mRNA的表达；图4b)对于卵巢切除的大鼠进行7天的皮下给药后，子宫内对于IGF1和C3的mRNA的表达；图4c)对于卵巢切除的大鼠进行7天的皮下给药后，对于其骨骼中胶原1(Coll1)和骨钙蛋白的mRNA的表达。
最佳实施方式关于总状花升麻和射干的雌激素作用的实验证明一系列不同复杂程度的实验系统过程的不同阶段来示范选择性雌激素的作用。
1.体外实验1.1对于总状花升麻的体外实验体外可由直接针对17-β-雌二醇(＝E2)的抗体来识别组合物中雌激素型结构。
总状花升麻的提取物由残留液中蒸发。由二氯甲烷和水间的相分布，浓缩了不同极性的物质。由猪子宫的雌激素受体蛋白的体外实验可测得两相组份的结合亲和力。猪子宫胞质的雌激素受体是由标准步骤分离得，用于配体的替换实验。
在此也发现了，雌激素型的结构如分离于总状花升麻的，在性质上是不亲水性的，而是亲油性的，因为它们可以借助有机溶剂的抽提而被提取。在有机萃取相中的该物质与抗体的结合能力较在水相中留下的物质强约10倍。
在雌二醇受体结合实验中这两相间差别就更大了。在无细胞制备中，与雌二醇结合的物质的相似性必须高到足以与雌二醇受体发生选择性的竞争性的相互作用。在这个实验系统中，相反有机相与受体有很强的结合能力，水相确无任何结合受体的活性。
结果显示于图1。
1.2对于射干的体外实验由其他研究可知，射干的提取物也有可由抗17-β-雌二醇的抗体识别并可和17-β-雌二醇受体(参看Nenninger loc.cit)结合的组份。然而，奇怪的是，本发明的发明者发现这些提取物对不同器官系统有不同的雌激素作用，特别是它们没有趋子宫作用。
2.体内实验对卵巢切除的大鼠雌激素作用证据虽然与受体E2的结合是非常选择性的，但并不能说下一步细胞内过程是被促进或是抑制的，亦即该物质是促效剂还是拮抗剂。这种特性只能在适合的细胞系统或完整的动物上测得。
卵巢切除的大鼠可作为更年期后的妇女模型，此时的妇女内分泌雌激素量降低。外部提供的17-β-雌二醇或有雌激素型作用的物质的结果是，产生对雌激素敏感的解剖形态学参数修复，如子宫重量的增加；角质细胞的产生，例如阴道上皮的空斑上皮细胞；或激素的变化，如受处理动物血液中LH水平的降低。
以下所有的实验都是以重量在240-280g之间的卵巢切除的Sprague-Dawley大鼠(＝ovx大鼠)进行的。
2.1射干的一次加药对于射干提取物的雌激素型作用的开始非常快。将载体、雌二醇和射干提取物一次静脉注射给药ovx大鼠刚完，在E2和射干作用下搏动都停止。随着药值的发展，与先前的值和用聚乙二醇化合物处理的对照动物相比，对血清中LH水平的抑制非常显著。聚乙二醇化合物是以聚乙氧基蓖化麻油衍生物为基础的乳化剂。
图2显示了实验结果。
注射了射干提取物六小时后，与对照组相比，动物子宫的内子宫VEGF、IGF1和C3的基因表达没有变化，而注射雌二醇的对于这三种雌激素调节蛋白的基因表达有了很显著的增加。任何这些处理对细胞色素C氧化酶(CCO)基因的组成型表达都无显著影响。
这些发现表明，射干的组份对下丘脑的雌激素接受结构的GnRH脉冲发生器有抑制作用，及由此产生的雌激素竞争作用。据此，脑垂体的LH的分泌被射干和雌二醇的组份显著的抑制了。与雌二醇相比，射干的组份没有趋子宫作用。雌二醇能显著地对VEGF、IGF1和C3的基因表达起向上的调节，而未被观察到射干有这种作用。
静脉注射射干提取物作用的急性实验实施例。
实验前一天，对24只大鼠(即8只/组)乙醚麻醉下颈静脉导管插管。实验当天，每10分钟取一次血样共六次。当第六次样品取完后，迅速分别静脉注射62.5mg的射干提取物或10μg的17-β-雌二醇(E2)或1ml含5％聚乙二醇化合物的等渗压的NaCl，再每10分钟取血样，一次共两小时。在静脉加药的6小时后，将大鼠断头、采血、割除子宫、称重并在液氮下深度冰冻。
2.2鸢尾黄素酮的一次加药在单加药鸢尾黄素酮后，可测量到血液中LH水平受时间发展影响和雌二醇型免疫反应性。在E2放射免疫分析(E2-RIA)测定，20分钟后，动物血液中鸢尾黄素的浓度与100pg相当量的雌二醇相应。
鸢尾黄素酮触发LH迅速地减少。直到静脉注射与雌二醇精确相应的鸢尾黄素60分钟后，完成了LH的动力学减少，但减少并不进一步下去反而缓慢增加。
实施例参考Harms和Ojeda(Harms PG；Ojeda SR大鼠颈静脉慢性插导管的一种迅速且简单的操作.J.Appl.Physiol.(1974)36391-392)的技术，将导管置于在实验开始前24小时已乙醚麻醉的OVX大鼠的颈外静脉。将管的一端置于劲部的一个皮肤囊内。为了在采血样时不接触动物，用硅胶管将导管延长。导管和硅胶管都用含50IU/ml的肝素的林格溶液冲洗。
100μl的血样都是以10分钟为间隔从每个动物上采取的，以同样体积的林格/肝素溶液补充。在第六次的取样后，静脉注射1.0ml各自的测试溶液。测试溶液为2％的聚乙二醇化合物(＝载体溶液)，鸢尾黄素(7mg/ml载体)，17-β-雌二醇(10μ g/ml载体)。在接下的140分钟，每10分钟取一次血样。
将如上所得的血样置于放了10μl肝素-losung(5000IU/ml，liquemin)的0.5ml的Eppendorf反应管内，10000*g离心10分钟，然后将它们在-20℃贮存，直到放射免疫测定。
催乳素(Prolaktin)和LH的RIA都是以国家卫生研究所NIH(Bethesda，Maryland，USA)的抗血清、对照物、分离剂(iodisation)的制剂为基础。通过DPC(Bad Nauheim)的RIA可测得雌二醇和交叉反应的异黄酮的浓度。
2.3加药7天中射干提取物的作用在每天的皮下用药后的7天中，测定再次加药雌二醇、射干提取物和载体对于切除卵巢的大鼠的总重、子宫的重量、激素的水平以及子宫和骨骼的基因活性的作用。
用聚乙二醇化合物和射干处理的动物的平均体重没有区别，而E2处理的动物的体重则显著减轻了。同样用聚乙二醇化合物和射干处理的动物子宫的重量也没有显著的区别，而E2处理的动物的子宫的重量比原来的三倍还多。
LH的血清水平，在射干处理的动物上的降低是轻微的，但与聚乙二醇化合物对照相比，降低是有显著性的，而用雌二醇处理的减少更很显著的。
处理的一周后，在子宫的mRNA提取物中，雌二醇明显上升了VEGF的基因表达，到达对照值的149％。对于射干提取物，表达的提高是轻微的，无显著性的。对于细胞色素C氧化酶(＝CCO)的非雌激素调节的组成型基因则没有影响。
对股骨头提取物测定了胶原-1A1、骨钙蛋白、IGF1和TGFβ-mRNA的表达。与射干一样，雌二醇对这四种基因的表达都有显著的抑制而对组成型基因CCO没有影响。
在7天的处理后，雌二醇与射干的不同作用就很明显了。射干提取物通过抑制GnRH脉冲发生器和骨骼中的四种雌激素调节基因的表达对脑垂体的LH分泌有雌激素竞争性影响。形成对比的是，射干提取物对子宫无雌激素影响，即子宫的重量和雌激素调节的VEGF基因都没有受到影响。而雌二醇确造成了子宫的膨胀和VEGF的激活。
七天期内每天皮下注射作用的亚急性实验的实施例8只动物每测试组(共24只)每天在早上8:00-9:00分别皮下注射62.5mg的射干提取物和10μg的雌二醇或溶剂(5％聚乙二醇化合物，1ml)。在最后加药的6小时后，将大鼠断头，切除得每只大鼠的主动脉、子宫和左股骨头，清洗，在液氮下冰冻。
由血样测得了LH和雌二醇的免疫反应性。
2.4总状花升麻的反复加药尽早在卵巢切除术后的14天，动物通过每天一次早上皮下注射剂量为62.5mg的总状花升麻/大鼠或8μg的雌二醇/大鼠分别进行测试，共7天。这两种物质都溶解在5％的聚乙二醇化合物中，对照组动物只接受载体。
在将大鼠断头后，为获得mRNA而制备脑、子宫和股骨。通过RIA可测得动物血液的LH浓度。通过半定量的逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)可测得上述确定器官的雌激素调节基因的表达。
用雌二醇处理的动物子宫的重量是用总状花升麻和载体处理的三倍还多，而后二者基本上它们的平均值没有区别。这就意味着总状花升麻的组份对动物的子宫没有影响。对于阴道也是一样，用总状花升麻和载体处理的动物的上皮组织没有角质化发生，而雌二醇处理的动物则情况相反。
LH的水平在用载体处理的动物上保持的相当高，而用雌二醇和总状花升麻处理的则被显著地降低了。
图3a)和图3b)显示了结果。
子宫重量(湿重)
血液的LH浓度
作为雌激素作用的另一标记，测定了雌激素诱导的蛋白质的mRNA的激活。用到的是子宫、骨骼(股骨)和下丘脑的视叶前区的组织。
在下丘脑中，总状花升麻和E2都刺激雌激素受体α的mRNA的表达(图4a)。对于骨组织来说也一样，总状花升麻的表现如一种雌激素，与雌二醇相似，减少了骨骼特异的胶原1和骨钙蛋白基因的mRNA的表达(图4b)。
与此形成对比的是，观察到总状花升麻对子宫的雌激素调节基因没有影响。只有雌二醇增加了IGF1的mRNA和补体因子C3(图4c)。
这些发现证明总状花升麻的组份选择性地作用于单个器官其提取物雌激素地作用于下丘脑(E2受体α的表达和LH的释放)和骨骼(由胶原1和骨钙蛋白的基因表达可证明)。但与雌二醇不同的是，因为在子宫的重量和IGF1和C3的基因表达上缺乏作用，总状花升麻确对子宫没有作用。
通过体外和体内的实验可确定，总状花升麻和射干的提取物有雌激素作用。但惊人的是，这些药物的提取物对中枢神经系统、骨骼和血管器官有选择性的作用，但对子宫则无作用，由此它们非常适用于雌激素缺乏的预防和治疗同时对子宫内膜没有负影响。
射干中的鸢尾黄素也有等同的效果。
因此这是首次使有雌激素型作用而无趋子宫作用的药物成为可用。
该类似的药物可用于治疗和/或预防心血管疾病(特别是动脉粥样硬化)、骨质疏松症和围绝经期和绝经期后的植物性的混乱(如热潮红)。
在应用的类型中，口腔、静脉和皮下的应用都是很好的。
权利要求
1.总状花升麻的提取物的用途，其特征在于，用于生产雌激素型的对器官有选择性的药物，该药物没有趋子宫作用或作用可忽略，但附带的条件是这种药物不用于减轻围绝经期和绝经期后疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该提取物用于生产已定剂型的药物，以选择性治疗和/或预防心血管疾病。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病是动脉粥样硬化。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该提取物用于生产已定剂型的药物，以选择性治疗和/或预防骨质疏松症。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该提取物用于生产已定剂型的药物，以选择性治疗和/或预防更年期疾病。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述更年期疾病是热潮红。
全文摘要
本发明是关于用鸢尾科和总状花升麻的提取物和鸢尾黄素作为一种雌激素型对器官有选择性的药物，来选择性治疗和/或预防心血管疾病，特别是动脉粥样硬化，骨质疏松和更年期疾病，例如预防或减轻热潮红。事实上没有观察到趋子宫作用。
文档编号A61K36/8965GK1509712SQ0314549
公开日2004年7月7日 申请日期1999年3月19日 优先权日1998年3月19日
发明者W·武特克, H·哈里, V·克里斯托夫, B·施彭格勒, M·波珀, W 武特克, 砀窭, 锼雇蟹 申请人:白奥诺里卡股份公司