治疗包括成瘾与抑郁症在内的与mGLU受体相关疾病的mGLU受体拮抗剂的制作方法

专利名称：治疗包括成瘾与抑郁症在内的与mGLU受体相关疾病的mGLU受体拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明总体而言涉及治疗与代谢型谷氨酸受体相关疾病的方法、更具体地涉及治疗与代谢型谷氨酸受体2、3及5相关疾病的方法。
背景信息谷氨酸受体在许多神经系统性、神经退行性、精神病性以及心理疾病中发挥作用，同时多种哺乳动物病状也与这些受体的异常活性相关。谷氨酸受体已被分为“离子通道型(ionotropic)”或“代谢型(metabotropic)”两类。离子通道型受体与位于神经元细胞膜上阳离子通道的开放直接偶联。代谢型受体属于G蛋白偶联受体家族，同时其与导致磷酸肌醇水解增强、磷脂酶D活化、cAMP形成增加或降低以及离子通道功能改变的系统相偶联。
根据氨基酸序列同源性、转导机制以及结合选择性，代谢型谷氨酸受体(mGluR)被分为三组组I、组II以及组III。组I包括代谢型谷氨酸受体1和5(mGluR1和mGluR5)，组II包括了代谢型谷氨酸受体2和3(mGluR2和mGluR3)，组III包括代谢型谷氨酸受体4、6、7和8(mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8)。每种类型mGluR均可发现数种亚型。例如，mGluR1的亚型包括mGluR1a、mGluR1b及mGluR1c。
只在最近，研究人员才开始阐明每组mGluR的生理作用。例如，组II的代谢型谷氨酸受体(mGluII)、包括mGlu2和mGlu3受体，为抑制性自身受体，其主要位于遍及哺乳动物脑部的谷氨酸能传入神经上，其于此处降低兴奋性谷氨酸传导(Cartmell和Schoepp，J Neurochem 75889-907，2000)。GABAB受体与mGluII受体有着相近的结构和功能同源性(Schoepp，J.Pharmacol.Exp.Ther.，29912-20，2001)，同时其也可负性调节谷氨酸传导。近来，mGluII及GABAB受体的激活也显示可降低腹被盖区(VTA)及伏隔核(accumbens nucleus，NAcc)中的兴奋性谷氨酸传导(Bonci等人，Eur.J.Neurosci.，92359-2369，1997；Xi等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，300162-171，2002；Erhardt等人，Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol.，365173-180，2002)，这提示这些受体可调节脑部奖赏环路的活性。因此，分别是mGluII和GABAB受体激动剂的LY314582和CGP44532显示可于未经药物处理的大鼠中提高颅内自我刺激(ICSS)奖赏的阈值(Macey等人，Neuropharmacology，40676-685，2001；Harrison等人，Psychopharmacology，16056-66，2002)，这证明mGluII和GABAB受体可负性调节脑部奖赏功能。
此外，不断有证据表明，在药物依赖的发展过程中，mGluII和GABAB受体功能增强。例如，延长吗啡、可卡因或安非他明治疗增强了位于VTA和NAcc中的mGluII和GABAB受体对谷氨酸传导的抑制性调节(Manzoni和Williams，J.Neurosci.，196629-6636，1999；Xi等人，Soc.Neurosci.，Abstr272596，2001；Giorgetti等人，Neuroscience，109585-595，2002)。
阐明组ImGluR生理作用的尝试提示，这些受体的激活可引起神经元的兴奋。有证据表明，此种兴奋是由于突触后mGluR的直接激活所致，不过其也同时提示发生了突触前mGluR的激活，导致神经递质释放增加(Baskys，Trends Pharmacol.Sci.1592，1992，Schoepp，Neurochem.Int.24439，1994，Pin等人，Neuropharmacology 341，1995.)。因此，有人已提出，组ImGluR拮抗剂可用于治疗神经系统疾病，如老年性痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、亨庭顿舞蹈病、疼痛、癫痫以及头部外伤。
不过，关于同时拮抗属于不同组别的mGluR所可能实现的潜在治疗益处尚了解甚少。此外，关于是否mGluR拮抗剂可用于治疗如精神活性物质滥用(substance abuse)和抑郁症这些疾病尚几无所知。本发明致力于这些问题并进一步提供有关益处。
发明概述本发明提供了通过同时抑制属于至少两种不同组别的至少两种mGluR来治疗与代谢型谷氨酸受体(mGluR)相关疾病的方法。在一项实施方案中，提供了治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、mGluR3及mGluR5的拮抗剂。
在另一项实施方案中，本发明提供了治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2及mGluR5的拮抗剂，从而治疗此疾病。
在再一项实施方案中，本发明提供了治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR3、及mGluR5的拮抗剂，从而治疗此疾病。
在再一项实施方案中，本发明提供了治疗精神活性物质滥用的方法。一方面，依照此实施方案的方法包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、mGluR3及mGluR5的拮抗剂，其中的有效量足以于所述对象中减少、抑制或消除对所述物质的需求。
在再一项实施方案中，本发明还提供了治疗抑郁症的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、mGluR3和/或mGluR5的拮抗剂，从而治疗抑郁症。该抑郁症可为药物诱导或非药物诱导的抑郁症。
在另一项实施方案中，本发明提供了筛选药剂的方法，该药剂可提高mGluR2、mGluR3和/或mGluR5拮抗剂至少部分使非人类哺乳动物对象的颅内自我刺激(ICSS)阈值所反映的脑部奖赏功能的缺陷正常化的能力，该方法包括a)影响对象的ICSS阈值；b)向对象施用足量的已知抑制剂，以在单独或联合另一种抑制剂施用时至少部分使ICSS阈值正常化，其中该已知抑制剂为mGluR2、mGluR3及mGluR5中至少一种的拮抗剂。
c)向非人类哺乳动物对象施用有效量的试验药剂，其中该试验药剂为mGluR2、mGluR3及mGluR5中至少一种的已知或可疑拮抗剂；以及d)确定是否该试验药剂可提高已知抑制剂至少部分使ICSS阈值正常化的能力，从而鉴定可提高该已知抑制剂至少部分使ICSS阈值正常化的能力的药剂。
一方面，该方法包括与已知或怀疑为mGluR5拮抗剂的试验药剂同时施用mGluR2和/或mGluR3抑制剂，如LY341495。另一方面，该方法包括与已知或怀疑为mGluR2和/或mGluR3拮抗剂的试验药剂同时施用mGluR5抑制剂如MPEP。
附图简介

图1为大鼠脑部冠状切面的图形表示，其显示腹侧被盖区注射位点的组织学重建(根据1986年《Paxinos和Watson图集》，前囟点后方5.30-6.72mm)。黑色圆圈指示位于VTA内并纳入统计分析的注射尖位置。注射位点位于VTA外的大鼠的数据被排除在分析之外。
图2A-2B阐明了LY314582在经尼古丁处理大鼠和对照大鼠中对ICSS阈值和反应潜伏期的影响。图2A的数据以相对于基线阈值变化的平均(±SEM)百分数表示。图2B的数据以相对于基线反应潜伏期变化的平均(±SEM)百分数表示。**P＜0.01，不同于注射载体后的尼古丁处理大鼠。##P＜0.01，不同于注射以相同剂量LY314582后的对照大鼠。
图3A-3B阐明了腹侧被盖区内LY314582在经尼古丁处理的大鼠和对照大鼠中对ICSS阈值和反应潜伏期的影响。图3A的数据以相对于基线阈值变化的平均(±SEM)百分数表示。图3B的数据以相对于基线反应潜伏期变化的平均(±SEM)百分数表示。***P＜0.001，不同于载体注射后的尼古丁处理大鼠。##P＜0.01，#P＜0.05，不同于注射以相同剂量LY314582后的对照大鼠。
图4A-4B阐明了LY341495在经受自发尼古丁戒断大鼠中对提高ICSS阈值的影响。图4A的数据以经受尼古丁戒断大鼠中相对于基线阈值变化的平均(±SEM)百分数表示。图4B的数据以对照大鼠中相对于基线阈值变化的平均(±SEM)百分数表示。ICSS阈值和反应潜伏期于手术去除释放尼古丁(图3A)或载体(图3B)的渗透性迷你泵后12、18、24、36、48及72小时进行检测。在18小时时间点前30分钟，大鼠接受LY341495(1mg/kg)或载体的单次注射。***P＜0.001，不同于在18小时时间点前30分钟使用载体处理的经受尼古丁戒断大鼠。
图5阐明了NBQX在经尼古丁处理大鼠和对照大鼠中对ICSS阈值和反应潜伏期的影响。A的数据以相对于基线阈值变化的平均(±SEM)百分数表示。B的数据以相对于基线反应潜伏期变化的平均(±SEM)百分数表示。*P＜0.05、**P＜0.01，不同于经载体注射后的尼古丁处理大鼠。#P＜0.05，##P＜0.01，不同于使用相同剂量NBQX注射后的对照大鼠。
图6阐明了施用MPEP在大鼠中对尼古丁所维持和食物所维持的反应的影响。数据以基线反应的百分数表示(平均±SEM)。星号表示每一强化物与对照情况的显著差异(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图7A-7D阐明了使用不同剂量MPEP预处理后所获得的尼古丁剂量-反应曲线(平均±SEM)。此图中的图表描绘了使用0(图7A)、5(图7B)、10(图7C)和20(图7D)mg/kg MPEP预处理后所获得的尼古丁剂量-反应曲线。实心圆圈为来自盐水对照的结果(于所有4图板中重复同样数据)，空心方框为来自经MPEP处理试验对象的结果。星号(*)指示所用不同尼古丁剂量与盐水相比在R标准数值方面的显著差异(p＜0.05)。磅字符(#)指示每一MPEP剂量(5、10及20mg/kg)相比盐水预处理与自我施用0.048μg/注射尼古丁剂量的显著差异(p＜0.05)。
图8A-8B阐明了在DBA/2J小鼠中施用MPEP对静脉自我施用0.048μg/注射尼古丁的影响(平均±SEM)。图A(左图)描绘了MPEP预处理对自我施用此可靠的自我施用尼古丁剂量(0.048μg/注射尼古丁)的影响。图B(右图)显示在使用MPEP(0、5、10及20mg/kg)预处理后，当可获得0.048μg/注射尼古丁时的总自我注射尼古丁剂量。星号(*)指示与盐水预处理相比，使用每一MPEP剂量(5、10及20mg/kg)预处理后的显著差异(p＜0.05)。
图9A-9B阐明了施用MPEP在短接触机会(ShA)和长接触机会(LgA)大鼠中对可卡因反应的影响。图9A显示LgA大鼠中可卡因摄入逐步增加的发展过程，数据以原始值表示。图9B以基线反应百分数(平均±SEM)显示ShA和LgA大鼠中MPEP的作用。图C显示MPEP对可卡因自我施用的影响(数据以联合ShA和LgA大鼠的基线反应百分数表示(平均±SEM))。星号指示每一强化物与对照情况的显著差异(*P＜0.05，**P＜0.01)。
图10阐明了在累进比例强化程式下，MPEP对可卡因、尼古丁及食物所维持的反应的影响。数据以MPEP预处理后所获得的注射/食物颗粒的平均(±SEM)数表示(左轴)。右轴显示所达到的相应最终比例(即断点FR)。
图11阐明了施用MPEP对可卡因诱导的ICSS奖赏阈值降低幅度的影响(a)以及在同样程式下对反应潜伏期的影响(b)。数据以基线的百分数表示(平均±SEM)。*P＜0.05，***P＜0.001，与对照相比；#P＜0.05，与使用相同剂量MPEP进行相似处理但没有接受可卡因处理的大鼠相比。
图12阐明了施用MPEP对可卡因诱导的ICSS奖赏阈值降低持续期的影响(a)以及对反应潜伏期的影响(b)。数据以基线的百分数表示(平均±SEM)。***P＜0.001，与对照相比。
图13阐明了施用LY341495(0.1-5mg/kg)在大鼠中对尼古丁反应的影响。数据以基线反应的百分数表示(平均±SEM)。
图14阐明了单独或与先前所示(参见上述图13)其自身对可卡因消耗无影响的MPEP剂量(1mg/kg)组合的LY341495(0.5mg/kg)在大鼠中对尼古丁反应的影响。数据以基线反应的百分数表示(平均±SEM)。
图15阐明了LY341495(1mg/kg)联合MPEP(1mg/kg)在大鼠中对尼古丁反应的影响。数据以基线反应的百分数表示(平均±SEM)。
图16阐明了LY341495(1mg/kg)以及LY341495和MPEP的药物组合(分别为1mg/kg和9mg/kg)对断点(即右侧y轴所描述的所达到的最高定比)以及对累进比例强化下所挣得的反映服药行为动机的尼古丁注射数目(左侧y轴上所示)的影响。MPEP加强了LY341495诱导的断点降低。数据以药物处理后所挣得的平均(±SEM)注射数目表示(左侧数轴)。右侧数轴显示所达到的相应最终比例(即断点)。
图17A-17B阐明了选择性5-羟色胺再摄取抑制剂帕罗西汀对脑部奖赏阈值(A)和反应潜伏期(B)的影响(平均±SEM)。
图18A-18B阐明了5-羟色胺1A受体拮抗剂p-MPPI以及p-MPPI+帕罗西汀的组合对脑部刺激奖赏阈值(A)和反应潜伏期(B)的影响(平均±SEM)。星号(*)指示统计学显著性线性趋势(p＜0.05)。
图19A-C阐明了长期施用安非他明对奖赏阈值(A)、反应潜伏期(B)以及体重(C)的影响(平均±SEM)。星号(*)指示与盐水暴露的对照动物的统计学显著差异(p＜0.05)。磅字符(#)指示每一药物组中与给药天1(在任何药物施用前；基线日)的统计学差异(p＜0.05)。十字(+)指示每一药物组中与给药天2的统计学显著差异。(％)指示每一药物组中与给药天3的统计学差异(p＜0.05)。实心方框代表来自盐水处理大鼠的数据。空心圆圈代表来自安非他明处理大鼠的数据。
图20A-F阐明了5-羟色胺能处理对安非他明戒断诱导的奖赏缺乏的影响。图20A-20C描述了使用各种不同处理措施进行急性处理的盐水暴露试验对象的阈值；为清楚起见，每一图中均示出了同样盐水暴露的载体处理对照组。图20D-20F描述了安非他明暴露试验对象的阈值；每一图中也示出了同样安非他明暴露的载体处理组。箭头指示施用急性药物处理的时间点。星号(*)指示药物组合和盐水处理组之间的统计学显著差异(p＜0.05)(三角)。磅字符(#)指示与盐水暴露的载体处理大鼠的显著差异(p＜0.05)(方框)。
图21阐明了安非他明戒断及5-羟色胺能处理对反应潜伏期的影响(平均±SEM)。箭头指示施用急性药物处理的时间点。星号(*)指示与载体对照组的统计学显著差异(p＜0.05)。方框代表来自载体处理大鼠的数据点(n＝22)。三角代表来自p-MPPI处理大鼠的数据(3mg/kg；n＝22)。实心圆圈代表来自帕罗西汀处理大鼠的数据(1.25mg/kg；n＝21)。空心圆圈代表来自使用帕罗西汀和p-MPPI处理大鼠的数据(n＝24)。
图22A-22D阐明了安非他明戒断和5-羟色胺能处理对体重的影响(平均±SEM)。箭头指示施用急性药物处理的时间点。星号(*)指示盐水暴露组和安非他明暴露组之间的统计学显著差异(p＜0.05)。磅字符(#)指示在每一药物组中与12小时时间点(在长期处理后及急性处理前)的统计学显著差异(p＜0.05)。实心方框代表盐水处理组，空心方框代表安非他明处理组。对于盐水处理组，图22A(载体处理)，n＝11；图22B[p-MPPI(3mg/kg)处理]，n＝10；图22C[帕罗西汀(1.25mg/kg)处理]，n＝10；以及图22D[p-MPPI(3mg/kg)和帕罗西汀(1.25mg/kg)处理]，n＝12。
图23阐明了使用抗抑郁药安非布他酮急性处理对脑部奖赏阈值的影响。与载体处理的动物相比，所检测的所有剂量(n＝8)的安非布他酮以及以剂量依赖形式直至40mg/kg的安非布他酮导致脑部奖赏阈值的降低，这指示脑部奖赏功能的增强。所有的条带代表平均值，竖线指示1SEM。*指示与载体处理动物有显著差异的组；P＜0.05。空心条带为载体；水平线条带为10mg/kg，左上右下线条带为20mg/kg；左下右上线条带为30mg/kg；交叉影线条带为40mg/kg；以及垂直线条带为60mg/kg。
图24阐明了抗抑郁药安非布他酮对尼古丁(0.25mg/kg)诱导的脑部奖赏功能增强的影响。施用安非布他酮(10和20mg/kg)导致脑部奖赏阈值降低(n＝10)。尼古丁处理导致奖赏阈值的相似降低。尼古丁的这种奖赏效应可为安非布他酮(5mg/kg)预处理完全抵消，而5mg/kg的安非布他酮在单独施用时对奖赏阈值没有作用。所有的条带代表平均值，竖线指示1SEM。*指示与相应载体状态有显著差异的阈值；P＜0.05。#指示与相应盐水共处理对照有显著差异的组；P＜0.05。左侧条带组来自盐水处理大鼠。右侧条带组来自尼古丁(0.25mg/kg)处理大鼠。空心条带为载体；左上右下线条带为5mg/kg；左下右上线条带为10mg/kg；交叉影线条带为20mg/kg。
图25阐明了尼古丁(3.16mg/kg游离碱/天，使用7天)连续输注对脑部奖赏阈值的影响。与使用盐水泵处理的动物(n＝38)相比，施用尼古丁(n＝38)导致脑部奖赏阈值的时间依赖性降低。其阈值降低峰效果出现于第3天。在第7天，阈值回归基线水平。所有的数据点代表平均值，竖线指示1SEM。插图曲线下面积分析清楚显示，使用尼古丁处理的动物经过7天的处理过程，具有显著较低的阈值。所有的条带代表平均值，竖线指示1SEM。*指示与盐水处理动物有显著差异的阈值；P＜0.05。空心条带和方框代表盐水处理的大鼠。实心条带和方框代表尼古丁处理的大鼠。
图26A-26B阐明了在长期施用尼古丁(3.16mg/kg/天，使用7天)或盐水戒断后，抗抑郁药安非布他酮对脑部奖赏阈值的影响。如图26A所示，在盐水预处理的动物中，与载体处理的试验对象(n＝12)相比，安非布他酮于所有剂量(10mg/kg，n＝8；20mg/kg，n＝8；40mg/kg，n＝10)下均导致脑部奖赏阈值降低。此阈值降低维持很短时间，在6小时后的下一个检测点时，所有动物均回归至基线阈值。所有的尼古丁预处理动物在戒断后12小时均显示阈值提高。与暴露于尼古丁的载体处理试验对象相比(n＝11)，在18小时时间点前进行安非布他酮处理于所有检测剂量(10mg/kg，n＝9；20mg/kg，n＝9；40mg/kg，n＝9)下均导致脑部奖赏阈值的降低。在使用较高安非布他酮剂量(40mg/kg)处理并事先经过尼古丁处理的动物中，此种阈值提高的逆转被显著延长；在24小时戒断时间点时(安非布他酮施用后6.5小时)，这些动物显示的阈值显著低于盐水处理的尼古丁戒断试验对象。所有的数据点代表平均值，竖线指示1SEM。*指示与相应载体处理动物有显著差异的组；P＜0.05。#指示与相应长期盐水预处理对照有显著差异的组；P＜0.05。空心方框指示载体；上箭头指示10mg/kg安非布他酮；下箭头指示20mg/kg安非布他酮；圆圈代表40mg/kg安非布他酮。图26B阐明曲线下面积分析也显示；在终止尼古丁施用后(即戒断)，使用尼古丁处理的动物的脑部奖赏阈值提高。此外，此分析清楚地表明，使用安非布他酮急性处理(40mg/kg)逆转了此种阈值提高。所有的条带代表平均值，竖线指示1SEM。*指示与相应载体处理动物有显著差异的组；P＜0.05。#指示与相应长期盐水预处理对照有显著差异的组；P＜0.05。空心条带为载体；左上右下线条带为10mg/kg；左下右上线条带为20mg/kg；交叉影线条带为40mg/kg。
图27A-B阐明了抗抑郁药安非布他酮对长期尼古丁处理(3.16mg/kg/天，使用6.75天)戒断后12小时身体体征的影响。如图27A所示，长期尼古丁施用戒断后6小时，总戒断体征的量有显著增加。与载体处理相比(n＝6)，在12小时戒断时间点前30分钟进行的安非布他酮处理导致体征表现的逆转(5mg/kg，n＝8；10mg/kg，n＝7；20mg/kg，n＝7；40mg/kg，n＝8；)。图27B阐明了安非布他酮对迷你泵移除后12小时戒断的各体征群的影响。所有的条带代表平均值，竖线指示1SEM。*指示与载体处理动物有显著差异的组；P＜0.05。#指示与基线(开始戒断后6小时)水平有显著差异的组；P＜0.05。空心条带代表载体；水平线条带代表5mg/kg安非布他酮；左上右下线条带代表10mg/kg；左下右上线条带代表20mg/kg；交叉影线条带代表40mg/kg。
发明详述本发明基于如下发现a)通过mGluR2和mGluR3拮抗剂(此文中也称为“mGlu2/3受体拮抗剂”阻断mGlu2和mGlu3受体、例如通过施用mGlu2/3受体拮抗剂LY341495，可减弱大鼠中尼古丁戒断的类抑郁状况；b)使用mGlu5受体拮抗剂如MPEP治疗可降低大鼠和小鼠中可卡因和尼古丁的消耗。
c)使用mGlu2和mGlu3受体拮抗剂如LY341495治疗可降低大鼠中尼古丁的消耗。
d)共同施用对可卡因或尼古丁自我施用没有影响的一定剂量的mGlu5受体拮抗剂如1mg/kg的MPEP，可增强mGlu2/3受体拮抗剂如LY341495(0.5mg/kg或1mg/kg)对尼古丁自我施用的抑制作用；以及e)单独施用时可降低可卡因或尼古丁自我施用的浓度的mGlu5受体拮抗剂、例如9mg/kg的MPEP，当与单独施用时可降低尼古丁自我施用的浓度的mGlu2/3受体拮抗剂如1mg/kg的LY341495组合时，在降低尼古丁自我施用方面较单独的任意一种药物更加有效。
基于这些发现，本发明提供了治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、mGluR3及mGluR5的拮抗剂，从而治疗该疾病。在另一项实施方案中，提供了治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2和mGluR5的拮抗剂，从而治疗该疾病。在再一项实施方案中，提供了治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR3和mGluR5的拮抗剂，从而治疗该疾病。在再一实施方案中，提供了治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2和mGluR3的拮抗剂以及一种调节mGluR5的拮抗剂，从而治疗该疾病。在再一实施方案中，提供了治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2和mGluR3的拮抗剂，从而治疗该疾病。由于mGluR1和mGluR5所已知的相似性(同属于组I)，故在本发明的任何方法中，均可使用mGluR1拮抗剂来代替mGluR5拮抗剂。
在本发明的某些实施方案中，通过向有需要的对象施用可充当所有三种受体抑制剂的拮抗剂，可以获得代谢型谷氨酸受体2、3及5的同时拮抗。作为替代选择，可以使用拮抗剂的组合来获得对受体2、3及5的抑制。例如，在本发明的某些方面，利用mGluR2和mGluR3的拮抗剂与mGluR5拮抗剂的组合施用以获得对mGluR2、3及5的抑制。例如，mGluR2和mGluR3拮抗剂LY341495与mGluR5拮抗剂MPEP的组合，便可施用于所述对象。
此外，本发明还提供了·一种组合，其包含(a)至少一种选自代谢型谷氨酸受体2拮抗剂和代谢型谷氨酸受体3拮抗剂的活性成份，和(b)至少一种代谢型谷氨酸受体5拮抗剂，并且任选含有至少一种药学可接受载体，用于同时、分别或相继使用、尤其是用于治疗成瘾性疾病或抑郁症，其中，这些活性成份于每种情况下均以游离形式或药学可接受盐的形式存在；·一种组合，其包含(a)至少一种对代谢型谷氨酸受体2和代谢型谷氨酸受体3显示拮抗活性的活性成份，和(b)至少一种代谢型谷氨酸受体5拮抗剂，并且任选含有至少一种药学可接受载体，用于同时、分别或相继使用、尤其是用于治疗成瘾性疾病或抑郁症，其中，这些活性成份于每种情况下均以游离形式或药学可接受盐的形式存在；·一种组合，其包含(a)至少一种代谢型谷氨酸受体2拮抗剂，和(b)至少一种对代谢型谷氨酸受体3和代谢型谷氨酸受体5显示拮抗活性的活性成份，并且任选含有至少一种药学可接受载体，用于同时、分别或相继使用、尤其是用于治疗成瘾性疾病或抑郁症，其中，这些活性成份于每种情况下均以游离形式或药学可接受盐的形式存在；以及·一种组合，其包含(a)至少一种代谢型谷氨酸受体3拮抗剂，和(b)至少一种对代谢型谷氨酸受体2和代谢型谷氨酸受体5显示拮抗活性的活性成份，并且任选含有至少一种药学可接受载体，用于同时、分别或相继使用、尤其是用于治疗成瘾性疾病或抑郁症，其中，这些活性成份于每种情况下均以游离形式或药学可接受盐的形式存在。
上述组合可以以组合制剂或药物组合物的形式应用。
另外，本发明还涉及以下方面一种治疗患有成瘾性疾病或抑郁症的温血动物的方法，其包括向该动物施用对成瘾性疾病或抑郁症联合治疗有效量的根据如上所定义的组合，在该组合中，化合物也可以以其药学可接受盐的形式存在；药物组合物，其包含对成瘾性疾病或抑郁症联合治疗有效量的如上所定义的药物组合以及至少一种药学可接受载体；如上所定义的组合在制备用于治疗成瘾性疾病或抑郁症的药物中的用途；以及商业包装，其包含如上所定义的组合以及其在治疗成瘾性疾病或抑郁症中用于同时、分别或相继使用的说明书。
本文中所使用的术语“组合制剂”，特别定义了一种“组分包(kit ofparts)”，意即如上所定义的第一或第二种活性成份可独立施用，或通过使用有着特定量成份的不同固定组合施用，即同时或于不同时间点施用。因而，组分包中的各组分可例如同时施用或按时间错开施用，即对于组分包中任意成份于不同的时间点及相同或不同的时间间隔施用。非常优选地，所选择的时间间隔应使得组合使用各组分对所治疗疾病的效果大于只使用任意一种活性成份所获得的效果。在组合制剂中所施用的活性成份1与活性成份2总量的比率可以变化，例如以满足待治疗患者亚群的需要或满足个别患者的需要，不同的需要由患者的年龄、性别、体重等所致。优选地，存在至少一种有益作用，例如相互增强第一和第二活性成份的作用、特别是协同作用、例如超过加和的作用，额外的有利作用、更小的副作用、以一种或两种第一和第二种活性成份的无效剂量获得联合治疗作用以及特别是第一和第二活性成份的强协同作用。
如上所定义的组合的药理学活性可以例如在本身已知的临床前试验中、例如类似于实施例所述试验加以证明。
如上所定义的组合的药理学活性也可以例如于临床试验中证明。此种临床试验优选为在成瘾性疾病或抑郁症患者中所进行的随机、双盲临床试验。此种试验可特别证明如上所定义组合的活性成份的协同作用。对成瘾性疾病或抑郁症的有益作用可直接通过这些试验的结果或通过所属技术领域的技术人员所已知的试验设计中的变化加以确定。
mGlu受体的拮抗剂和激动剂已于本领域中已知。下表及下文段落中提供了一些已知的拮抗剂和激动剂实例。激动剂包括非选择性激动剂1S，3R-ACPD；1S，3S-ACPD；L-CCG-1。拮抗剂包括广谱、非选择性拮抗剂如(s)-MCPG。应当理解，根据本发明的教导，实际上任何mGluR1、2、3和/或5拮抗剂均可用于本发明的方法。不过，本发明优选使用对mGluR1、mGluR2、mGluR3和/或mGluR5具有选择性的拮抗剂。mGluR2拮抗剂已于本领域中已知，其包括例如在此完全引入作为参考的美国专利No.6,407,094(Adam等人，(2002))中所公开的化合物及1-[(Z)-2-环庚氧基-2-(2，6-二氯-苯基)-乙烯基]-1H-[1，2，4]三唑(Kolczewski等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，2173-2176)。mGluR2和mGluR3两者的拮抗剂已于本领域中已知，其包括例如LY341495(Kingston等人，Neuropharm.1998，37，1-12)、LY366457(O′Neill M.F.等人，Neuropharmacology，45(5)565-74(2003))、(2S)-α-乙基谷氨酸(EGLU)(参见例如Neto，F.L.等人，Neurosci.Lett. 15；296(1)25-8(2000))以及(2S，4S)-氨基-4-(2，2-二苯乙基)戊二酸(Escribano，A.，等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，7；8(7)765-70(1998))。mGluR5的拮抗剂已于本领域中已知，其包括例如MPEP(2-甲基-6-(苯乙炔基)-吡啶)和MTEP(3-(2-甲基-噻唑-4-基乙炔基)-吡啶(Cosford，N.D.等人，J.Med.Chem.，46(2)204-6(2003))。mGluR1的拮抗剂包括例如3-甲基-氨基噻吩二羧酸(3-MATIDA)(Moroni，F.，Neuropharmacology，42(6)741-51(2002))。mGluR1和mGluR5的拮抗剂(组I拮抗剂)包括例如1-氨基二氢化茚-1，5-二羧酸(AIDA)(参见例如Renaud，J.等人，Epilepsia，43(11)1306-17(2002))、(3aS，6aS)-6a-萘-2-基甲基-5-亚甲基-六氢-环戊二烯并[c]呋喃-1-酮(BAY36-7620)(参见例如De Vry，J.等人，Eur.J.Pharmacol.5；428(2)203-14(2001))，以及环丁基甘氨酸(+/-)-2-氨基-2-(3-顺式和反式-羧基环丁基-3-(9-噻吨基)丙酸)(LY393053)(Chen，U.等人，Neuroscience，95(3)787-93(2000))。其他可用于本发明的mGluR拮抗剂包括WO99/08678中所公开的那些拮抗剂，其内容在此完全引入作为参考。
通过代码号、通用名或商品名所确定的活性成份的结构可获自现行版的标准提纲《Merck索引》，或者获自数据库，例如“Patents International”(例如IMS World Publication)。其相应内容在此引入作为参考。任何所属领域的技术人员均完全能够鉴别此活性成份，同时基于这些参考，同样能够制备并于标准试验模型中于体内和体外检测其药学适应症和性质。
mGluR激动剂和拮抗剂表
MPEP可依照WO99/02497中所述的化学方法进行制备，或可购自Tocris，Ballwin，MO。LY341495(2S-2-氨基-2-(1S，2S-2-羧基环丙烷-1-基)-3-(呫吨-9-基)丙酸)可购自Tocris(Ballwin，MO)。NBQX二钠(2，3-二氧代-6-硝基-1，2，3，4-四氢苯并(f)喹喔啉-7-磺酰胺二钠)可购自Tocris，Ballwin，MO。
如此文中所使用的拮抗剂的“有效量”为于对象中调节mGlu受体2、3、或5的正常活性的量。mGlu受体的“正常”活性代表未患mGluR相关疾病的细胞或对象内的活性水平，并且可使用该领域中已知的方法进行确定，这些方法中某些已于此文中公开。例如，LY341495可以以约0.1-50mg/kg的浓度施用，在某些方面可于0.1至5mg/kg施用。在本发明的一些方面，有效量的LY341495为至少0.5mg/kg，例如0.5mg/kg至约10mg/kg，或者0.5mg/kg至约5mg/kg。在本发明的某些方面，LY341495以约0.5mg/kg或1mg/kg的浓度施用。
在本发明的某些方面，MPEP以约0.01至25mg/kg体重的量施用。在某些方面，MPEP以等于或超过1mg/kg的浓度施用，例如约3至约20mg/kg。在其他方面，MPEP以约5至约15mg/kg的浓度施用。在其他方面，MPEP以约7至约12mg/kg施用、例如以9mg/kg施用。
在本发明的一个方面，两种或多种拮抗剂以亚有效量施用，在其之下，一种或多种拮抗剂可独立地有效治疗疾病。例如，mGluR5拮抗剂可以以亚有效量施用，同时mGluR2/mGluR3拮抗剂可以以有效量施用，反之亦然。如上所述，MPEP可以以1mg/kg或更低量施用，LY341495可以以有效浓度施用。例如，MPEP可以以0.1-3mg/kg施用，且LY341495可以以0.5-5mg/kg施用。在实施例3所说明的一方面中，MPEP以1mg/kg施用，且LY341495以0.5mg/kg施用。此外，本发明的其他特殊方面包括1mg/kg LY341495和1mg/kg MPEP的组合；以及1mg/kg LY341495和9mg/kgMPEP的组合。如实施例3中所阐明，当组合使用时，mGluR5拮抗剂可增强mGluR2/R3拮抗剂治疗成瘾性疾病如尼古丁成瘾的疗效。又如实施例3中所阐明，当组合使用时，mGluR2/R3拮抗剂可增强mGluR5拮抗剂治疗成瘾性疾病如尼古丁成瘾的疗效。应当理解，本发明为更精确地确定人体中的有效量的进一步人体试验提供了基础。实施例部分中用于啮齿动物试验的剂量为此文所示用于人类及其他哺乳动物的剂量范围提供了基础。
在本发明的某些方面，例如施用足以减少、抑制或消除对成瘾性药物如可卡因或尼古丁的需求的一定量的一种或多种mGluR2、3和/或5拮抗剂。此外，在某些方面，施用足以减少、抑制或消除成瘾性药物如可卡因或尼古丁的强化性质的一定量的mGluR2、3和/或5拮抗剂。此外，在某些方面，施用一定量的mGluR2和/或3拮抗剂，该量足以减少、抑制或消除抑郁症，如与成瘾性药物如可卡因或尼古丁戒断相关的抑郁症或与药物使用相关的抑郁症或不与任何药物使用相关的抑郁症。减少、抑制或消除本发明方法所靶定疾病的任何这些特征意味着对代谢型谷氨酸疾病的有效治疗。
通过调节mGluR2、3和5的活性可被有效治疗的疾病在本文中被称为代谢型谷氨酸疾病，其包括成瘾性疾病和抑郁症。代谢型谷氨酸疾病包括涉及一种或两种组I代谢型谷氨酸受体(mGluR)及一种或两种组IImGluR的疾病。成瘾性代谢型谷氨酸疾病包括例如尼古丁成瘾、酒精成瘾、阿片成瘾、安非他明成瘾、可卡因成瘾、甲苯丙胺成瘾等。
应当理解，在实施例部分中所提供的某些药物如可卡因和尼古丁滥用的数据也同时适用于其他药物滥用。现已广泛假定，对所有主要滥用药物的依赖性均是通过相同的神经生物和行为机制介导(Markou等人，1998；Markou A & Kenny PJ2002“长期暴露于药物滥用的神经适应性于各精神病诊断类别中所观察到的与抑郁症状的相关性”，Neurotoxicity Research，4(4)，297-313.；Koob & Le Moal，Neuropsychopharmacology，24(2)97-1292001；Barr，A.M.，Markou，A.和Phillips，A.G.(2002)“作为抑郁症模型的对精神刺激戒断的“crash”过程”，Trends in Pharmacological Sciences，23(1)，475-482，其内容在此完全引入作为参考；Cryan，J.F.，Markou，A.和Lucki，I.(2002)“啮齿动物中抗抑郁活性的评价近来的发展和将来的需求”，Trends in Pharmacological Sciences，23(5)，238-245)。因此，可以预计，在治疗一种药物成瘾中有效的化合物很可能在治疗另一种药物成瘾中也有效。例如，通过共同施用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀和5-羟色胺1A受体拮抗剂p-MPPI以增加5-羟色胺能神经传递，逆转了安非他明和尼古丁戒断的抑郁症样状况(Harrison，Liem和Markou，Neuropsychopharmacology 2001，其内容在此完全引入作为参考)。此外，所有主要滥用药物(尼古丁、可卡因、安非他明、酒精、阿片、苯环利啶)的戒断均可提高反映抑郁症样状态的脑部奖赏阈值(参考综述Markou等人，1998；Markou & Kenny 2002；Barr等人，2002；Cryan等人，2002；以及苯环利啶的原始研究参考文献Spielewoy，C.& Markou，A.2003，“长期苯环利啶治疗戒断可诱发脑部奖赏功能的持久抑制”，Neuropsychopharmacology，28，1106-1116和“可卡因”Ahmed等人.2002)。因此，治疗此种药物依赖性和戒断的抑郁症样状况可以帮助人们戒除药物使用。
一方面，成瘾性疾病为尼古丁成瘾。另一方面，成瘾性疾病为可卡因成瘾。另一方面，成瘾性疾病为酒精成瘾。另一方面，成瘾性疾病为阿片制剂成瘾。另一方面，成瘾性疾病为甲苯丙胺成瘾，另一方面，成瘾性疾病为安非他明成瘾。
另一方面，代谢型谷氨酸疾病为抑郁症。实施例1阐明如尼古丁戒断的负性情感(抑郁症样)状况的逆转所反映，mGluR2/3受体的阻断具有抗抑郁特性。因此，mGluR2和mGluR3的阻断可逆转在药物戒断过程中所观察到的抑郁症样症状以及可能的药物依赖过程中所观察到的抑郁症(Ahmed，S.H.等人，Nature Neuroscience，5625-626(2002)，其内容在此完全引入作为参考)。因此，基于已知的介导药物诱导抑郁症及非药物诱导抑郁症的神经生物相似性，施用有效量的mGluR2和mGluR3拮抗剂很可能可有效治疗非药物诱导的抑郁症(Markou等人，1998，其内容在此完全引入作为参考；Barr等人，2002，其内容在此完全引入作为参考；Cryan等人，2002，其内容在此完全引入作为参考；Harrison等人，Neuropsychopharmacology，2555-71(2001)，其内容在此完全引入作为参考；Markou A和Kenny PJ 2002，“长期暴露于药物滥用的神经适应性于各精神病诊断类别中所观察到的与抑郁症状的相关性”，NeurotoxicityResearch，4(4)，297-313，其内容在此完全引入作为参考)。另外的观察也进一步支持支持这样一个结论实施例1中所得的与成瘾性药物戒断的抑郁症样症状相关的结果，确定了mGluR2和/或mGluR3拮抗剂也可用于有效治疗非药物诱导的抑郁症。首先，共同施用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀和5-羟色胺1A受体拮抗剂p-MPPI作为一种经临床证实的抗抑郁药物治疗已显示可逆转尼古丁及安非他明两者戒断的抑郁症样状况(Harrison等人，(2001)，其内容在此完全引入作为参考)。其次，如实施例4中所示，共同施用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂帕罗西汀和5-羟色胺1A受体拮抗剂p-MPPI作为另一种经临床证实的抗抑郁药物治疗亦逆转安非他明戒断。第三，另一种经临床证实的抗抑郁治疗安非布他酮可逆转尼古丁戒断的抑郁症样状况(Cryan，J.F.等人，Psychopharmacology，168，347-358(2003)，实施例5)。因此，在实施例1和4中所示模型中，经临床证实的抗抑郁治疗可逆转药物戒断的抑郁症样状况。因此，可以推断，在模型中可使阈值正常化的治疗(例如mGluR2/3拮抗剂)可为一种临床有效的治疗。此外，通过相同抗抑郁治疗同时逆转安非他明和尼古丁戒断，表明在各种不同类型的抑郁症中存在共性，其独立于诱导抑郁症的机制和/或滥用药物的主要作用位点(尼古丁的尼古丁受体、安非他明的单胺能转蛋白)。
在另一项实施方案中，本发明提供了用于治疗抑郁症的抑郁症状和焦虑症状的方法。该方法包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、mGluR3及mGluR5的拮抗剂从而治疗抑郁症状和焦虑症状。在本发明此实施方案的另一方面，在其中所述对象经受抑郁症症状的抑郁时间段中施用至少一种mGluR2和/或mGluR3拮抗剂，而在所述对象经受焦虑症状的时间段中施用mGluR5拮抗剂。抑郁症以抑郁症状和焦虑症状为特征。因此，提供mGluR2/3/5组合治疗的本发明，提供了一种有效的抗抑郁疗法，其中mGluR2/3拮抗剂改善抑郁症状，mGluR5拮抗剂改善焦虑症状。因此，此实施方案利用了mGluR2/3拮抗剂的抗抑郁特性及mGluR5拮抗剂的抗焦虑特性(参见例如Cosford，N.D.等人，J.Med.Chem.16；46(2)204-6(2003)；Brodkin J.等人，Eur.J.Neurosci.，16(11)2241-4(2002)以及Brodkin J.等人，Pharmacol. Biochem.Behav.73(2)359-66(2002))。由于焦虑已知为抑郁症总体症状中的一个主要症状，所以本发明的此实施方案可有效治疗抑郁症的焦虑症状。
抑郁症状和焦虑症状在本领域中已被熟知。本发明此实施方案的方法可治疗一种或多种抑郁症状及一种或多种焦虑症状。抑郁症状包括例如但不仅限于以下症状持续的沮丧、焦虑或“空虚”感；睡眠太少或过多；食欲减退和体重减轻或食欲增加和体重增加；对以前感兴趣的活动丧失兴趣或乐趣；不安或易激惹；持续对治疗无反应的身体症状(例如头痛、慢性疼痛或便秘和其他消化系统疾病)；集中注意力、记忆或决断困难；疲劳或活力丧失；负罪、无望或无用感；以及死亡或自杀念头。
焦虑症状包括但不仅限于如下症状在数月、例如超过至少六个月的时期内发生数天过度忧虑；无原因的担忧许多事或活动如工作或上学和/或健康；不能控制忧虑；不安、感觉兴奋或紧张；疲倦；集中注意力有问题；易激惹；肌肉紧张；以及入睡或睡眠障碍或躁动和睡眠不足。
在涉及治疗代谢型谷氨酸疾病的方法的本发明实施方案的一些方面，所述对象为哺乳动物，例如罹患代谢型谷氨酸受体疾病如尼古丁成瘾、可卡因成瘾或抑郁症的人类对象。此文的实施例阐明了在啮齿类动物中的本发明方法。不过，应当理解，由于在成瘾性疾病和抑郁症的生理学方面(Markou等人，1998；Markou和Kenny 2002，其内容在此完全引入作为参考)以及mGlu受体的结构方面(Schoepp等人，Neuropharm.1999，38，1431-1476；Schoepp DD(2001)，J Pharmacol Exp Ther 29912-20)，啮齿类动物和哺乳动物之间存在相似性，因此这些方法预计于人类对象中亦有效。
“同时施用”两种或多种拮抗剂是指在足够短的时间段内施用各拮抗剂，使得足够浓度的各拮抗剂在同一时间存在于对象体内，以调节其各自mGlu受体目标。因此，应当认识到，代表同时施用的同时施用拮抗剂之间的最大时间差取决于例如所施用拮抗剂的半衰期、所施用的拮抗剂的量以及拮抗剂施用的方法和部位。
在本发明方法的某些方面，拮抗剂被施用数周、数月、数年以及可能无限期用于那些显示不能戒除药物使用的对象或者用于可能与药物使用无关或经药物使用诱导、但不使用此文中所建议的方法便不会自发缓解的的长期抑郁症。
在另一实施方案中，本发明提供了抑制药物使用行为、治疗抑郁症和/或治疗与药物使用和依赖性相关(Ahmed等人，2002，其内容在此完全引入作为参考)或与成瘾性药物戒断相关的抑郁症样状态的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2和/或mGluR3的拮抗剂，从而治疗成瘾性药物使用、抑郁症或成瘾性药物依赖性或药物戒断状况的抑郁症样状态。此实施方案基于实施例3中所提供的试验证据，即使用mGlu2/3受体拮抗剂如LY341495进行治疗可于大鼠中降低成瘾性药物如尼古丁的消耗量，以及实施例1中所提供的证据，即使用mGlu2/3受体拮抗剂如LY341495进行治疗可逆转与药物戒断相关的抑郁症样状态。成瘾性药物为例如尼古丁或可卡因。在某些方面，施用有效量的至少一种拮抗剂来降低尼古丁消耗量。例如，一方面，施用有效量的mGluR2和mGluR3拮抗剂如LY341495以降低尼古丁消耗量。在本发明的某些方面，在对象经受药物戒断时施用mGluR2和/或mGluR3抑制剂。在本发明的另一方面，在对象能动使用成瘾性药物的时间段过程中施用mGluR2和/或mGluR3抑制剂。在本发明的另一方面，在对象能动经受与药物使用相关或与药物使用不相关的抑郁症的时间段过程中施用mGluR2和/或mGluR3抑制剂。
在另一实施方案中，本发明提供了拮抗mGluR2、mGluR3和mGluR5中至少两种的方法，其包括向有需要的对象同时施用一定量的至少两种调节mGluR2、mGluR3和mGluR5中至少两种的拮抗剂。每一拮抗剂的量足以调节其目标mGluR。此量可小于拮抗剂单独施用时的有效量。不过，这些实施方案中所施用的量足以使拮抗剂的组合可有效用于治疗代谢型疾病。在某些方面，每一拮抗剂均以有效量提供以治疗代谢型谷氨酸疾病。在某些方面，所述对象罹患抑郁症、尼古丁成瘾或可卡因成瘾。在某些方面，调节mGluR2和mGluR3的拮抗剂与调节mGluR5的拮抗剂一起施用。例如，有效量的MPEP与有效量的LY341495一起施用。在另一实施方案中，亚有效量的MPEP与有效量的LY341495一起施用。在另一实施方案中，有效量的MPEP与亚有效量的LY341495一起施用。在另一项实施方案中，亚有效量的MPEP与亚有效量的LY341495一起施用。
在另一实施方案中，本发明提供了治疗成瘾性疾病(此文中也称为精神活性物质滥用)的方法，其包括在第一时间段中向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、3和5中至少一种的拮抗剂，随后在第二时间段中施用至少一种调节mGluR2和/或3中至少一种的拮抗剂。第一时间段例如为这样一种时间段，其中所述对象预期处于这样一种环境或被暴露于这样一种刺激，在该环境中或在该刺激存在下所述对象习惯性地使用成瘾性药物或其中所述对象能动地使用成瘾性药物。第二时间段例如为这样一种时间段，其中所述对象正患戒断和/或抑郁症。本发明此实施方案的一方面例如包括在第一时间段过程中施用MPEP和/或LY341495，在戒断或抑郁症阶段施用LY341495。
此实施方案基于此文实施例中所示的发现，即施用mGluR5拮抗剂和/或mGluR2/3拮抗剂可降低成瘾性药物如尼古丁或可卡因的自我施用。此外，此实施方案基于这一发现，即施用mGluR2/3拮抗剂可逆转至少尼古丁戒断的某些负性影响。在此实施方案的一方面，施用mGluR5拮抗剂和mGluR2和/或mGluR3拮抗剂，并监测药物依赖性和戒断的抑郁症样症状。如果戒断症状或抑郁症症状变得太过强烈，则至少暂时可终止施用mGluR拮抗剂，而mGluR2/3拮抗剂可继续施用。
在本发明的某些实施方案中，通过向对象施用有效量的AMPA/红藻氨酸受体激动剂或部分激动剂以治疗成瘾性疾病或抑郁性疾病。在此实施方案的某些方面，向对象施用一种或多种调节AMPA/红藻氨酸受体以及mGluR2、mGluR3及mGluR5中至少一种的激动剂或部分激动剂，通常，AMPA/红藻氨酸受体的一种激动剂或部分激动剂与至少一种mGluR2、mGluR3和/或mGluR5拮抗剂一起施用。在某些实施方案中，施用一种或多种调节AMPA/红藻氨酸受体的激动剂或部分激动剂以及调节mGluR5的拮抗剂，例如施用AMPA/红藻氨酸激动剂或部分激动剂和MPEP。在另一项实施方案中，一种和多种调节AMPA/红藻氨酸受体的激动剂或部分激动剂与一种或多种调节mGluR2和/或mGluR3的拮抗剂一起施用。
AMPA/红藻氨酸受体激动剂或部分激动剂包括例如CPCCOet(7-羟亚氨基环丙烷[b]苯并吡喃-1a-羧酸乙酯(Litschig S.等人，MolecularPharmacology 55(3)453-561(1999))。使用AMPA/红藻氨酸受体部分激动剂可提供超越AMPA/红藻氨酸受体激动剂的优势，即部分激动剂一般有着更好的副作用性质。
本发明方法中所采用的拮抗剂或激动剂的递送途径由特定的疾病决定。拮抗剂或激动剂可口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内和皮内递送，也可透皮递送(例如使用置于皮肤上的皮肤贴中的脂溶载体)，或者甚至通过胃肠道递送(例如使用胶囊或片剂)。此外，在某些方面，本发明方法中所使用的拮抗剂或激动剂直接递送至脑部或脑部的某些区域以激活或抑制位于特定脑部位点的受体，从而产生所需效果而不会抑制或激活位于其他脑部位点的受体，由此避免不需要的副作用或可抵消前述位点所介导的有益治疗效应的作用。如上所讨论，无论拮抗剂是单独还是组合，剂量均应足以提供有效量的拮抗剂。随所治疗患者的状况，将有必要改变剂量，在任何情况下，医生可为每一患者个体确定合适剂量。该剂量尤其取决于体重、生理状况以及所选施用方案。
在本发明方法中所采用的拮抗剂以单剂量或多剂量单独或与药学可接受载体组合施用。合适的药物载体包括惰性固体稀释剂或填充剂、无菌水溶液以及各种无毒有机溶剂。通过组合一种或多种拮抗剂与药学可接受载体所形成的药物组合物便可容易地以各种剂型施用，如片剂、锭剂、糖浆、可注射溶液等。如果需要的话，这些药物载体可含有其他成份，如调味剂、粘合剂、赋形剂等。因此，为口服施用，将含有各种赋形剂如枸橼酸钠、碳酸钙以及磷酸钙的片剂与各种崩散剂如淀粉、优选马铃薯或木薯淀粉、藻酸和某些复合硅酸盐以及粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶以及阿拉伯胶一起应用。另外，润滑剂如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石也经常用于压片。相似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填料。用于此目的的优选材料包括乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量的聚乙二醇。
当需要酏剂含水悬液用于口服施用时，拮抗剂可以与各种甜味剂或调味剂、染色物质或染料以及需要时的乳化剂或悬浮剂以及稀释液如水、乙醇、丙二醇、甘油及其组合联合。对于胃肠外施用，可采用于芝麻油或花生油或者于水性聚丙二醇中的制剂溶液以及先前所述的相应水溶性药学可接受金属盐的无菌盐水溶液。如果需要，此水溶液应经适当缓冲，并且液体稀释液应先使用足够盐水或葡萄糖实现等张。这些特别的水溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射。所采用的无菌水性介质均可通过所属技术领域的技术人员已知的标准工艺方便地获得。
在另一实施方案中，本发明提供了筛选药剂的方法，该药剂对非人类哺乳动物对象可提高已知抑制剂至少部分使颅内自我刺激(ICSS)阈值正常化的能力和/或提高已知抑制剂抑制成瘾性药物消耗的能力。该方法包括a)影响对象的ICSS阈值；b)向该对象施用足量的已知抑制剂，以在单独或与另一种抑制剂组合施用时抑制成瘾性药物的消耗和/或至少部分使ICSS阈值正常化，其中该已知抑制剂为mGluR2和/或mGluR3和/或mGluR5拮抗剂；c)向该对象施用有效量的试验药剂，其中该试验药剂为已知或可疑的mGluR2和/或mGluR3和/或mGluR5拮抗剂；以及d)确定是否该试验药剂可提高已知抑制剂至少部分使ICSS阈值正常化以及任选抑制一种或两种成瘾性药物的消耗的能力，从而鉴别可提高该已知抑制剂至少部分使ICSS阈值正常化的能力和/或提高已知抑制剂抑制成瘾性药物消耗的能力的药剂，或者备选地，确定是否该试验药剂可提高该已知抑制剂至少降低成瘾性药物消耗以及任选部分使ICSS阈值正常化的能力或者两种兼具，从而鉴别可至少提高该已知抑制剂抑制成瘾性药物的消耗和/或使ICSS阈值正常化的能力的药剂。
当代谢型谷氨酸疾病所导致的ICSS阈值的升高或降低被至少部分抑制时，颅内自我刺激(ICSS)阈值可被至少部分正常化(即调节回至未患代谢型谷氨酸疾病对象的ICSS阈值)。例如，长期尼古丁施用(Kenny等人2003)或长期自我施用可卡因(Ahmed等人，2002，其内容在此完全引入作为参考)的戒断已知可提高ICSS阈值(参见例如Kenny等人2003)。因此，部分使可卡因施用或尼古丁戒断过程中的ICSS阈值正常化将使ICSS阈值自升高的阈值降低至接近正常对象中所见的阈值，其中阈值升高反映一种抑制状态，通常可见于长期可卡因施用或尼古丁戒断过程中。因此，本发明此实施方案的方法可利用成瘾性药物(例如可卡因)的长期施用或成瘾性药物(例如尼古丁)施用的终止，以在施用已知抑制剂和试验药剂前影响(即去正常化)ICSS阈值。急性施用成瘾性药物通常降低ICSS阈值，而长期施用成瘾性药物和/或终止施用成瘾性药物通常增加ICSS阈值。
除上述方法外，ICSS阈值也可通过其他已知方法影响。例如，可使用长期轻度加压手段以诱导可为抗抑郁治疗逆转的阈值升高(Moreau J.L.，Bos M.，Jenck F.，Martin J.R.，Mortas P.和Wichmann J.(1996)，EurNeuropsychopharmacology，6，169-175；Moreau J.L.，Bourson A.，Jenck F.，Martin J.R.和Mortas P.(1994)，J Psychiatry Neurosci 19，51-56；Moreau J.L.，Jenck F.，Martin J.R.，Mortas P.和Haefely W.E.(1992)，EurNeuropsychophartnacoogy，2，43-49)。
实施例部分中公开了成瘾性药剂自我施用的方法和分析ICSS的方法。如实施例中所阐明及以下章节中所进一步讨论，本发明的方法不仅可用于鉴别有效提高已知抑制剂有效性的药剂，而且可用于确定与精神活性物质滥用或戒断相关的哪些特征/症状/状况受试验药剂的影响。
分析成瘾性物质消耗的方法可于自我施用定比强化程式下或于累进强化程式下进行，其实施例于实施例2和3中提供。在固定分配程式中，动物于活动杆作出“固定”次数的反应以获得药物注射。定比(FR)强化程式提供了药物是否是强化性的重要信息。相比之下，在累进比例(PR)强化程式下，每次动物于活动杆作出反应以接受药物注射，动物随后所必须作出的以接受下次注射的反应次数都累进增加。在限制总摄取的同时，通过确定动物自愿为药物注射所工作的努力程度，PR程式可允许更好地自累计药物剂量的可能饱和作用中分离出药物消耗的动机(Stafford等人，1998)。
这些特征导致在理论上对PR强化程式相比FR强化程式下控制觅药行为和药物使用行为的因素的不同解释。例如，有些研究人员已提出FR程式可测定药物的愉悦或快感作用(McGregor和Roberts 1995；Mendrek等人，1998)，而PR程式可更好地测定获取药物的诱因或动机(Markou等人，1993)。如上所述，在于FR程式下习得可卡因或尼古丁自我施用后，啮齿类动物如大鼠或小鼠可以转换至PR强化程式，其中可能要求杠杆按压的时序增加以获得每次随后的成瘾性药物如尼古丁或可卡因注射，或者于开始即以PR程式训练。例如，于累进比例强化程式下，可能需要5、10、17、24、32、42、56、73、95、124、161、208等次的杠杆按压以获得每次随后的注射。在某些方面，可将试验药剂施用于非人对象达一段时间、例如15分钟、30分钟、45分钟、1小时等，然后将该对象置于PR或FR强化程式试验期。此试验期可进行固定的时间段(例如1小时、2小时、3小时、4小时等)。每一试验期可确定一断点。断点定义为在该试验期终止前所获得的最高比例(即在所允许的时间段内、通常自获得最后一次药物注射起1小时，为得到药物注射所进行杠杆按压的最高次数)；如果该对象在1小时内不能搏得药物注射，则该时期终止。
本发明的筛选方法也可用于确定是否试验药剂可减少可卡因的快感作用。可卡因所诱导的ICSS阈值降低代表可卡因快感和欣快作用的精确计量。因此，为检验试验药剂可削弱可卡因的快感作用的假设，可以确定该试验药剂对可卡因诱导的ICSS阈值降低的影响。可卡因可以以足以降低ICSS阈值的量使用，例如10mg/kg，而不会影响ICSS过程的表现(Kenny等人，2002b；Markou & Koob 1992)。
此外，戒断和药物依赖的抑郁症样症状可通过测定终止施用成瘾性药物后及药物使用过程中(或者时间上紧密相关如在临使用药物前和/后)ICSS奖赏阈值的增加来测量。因此，可以通过确定是否试验药剂至少部分抑制在药物使用或戒断过程中所发生的ICSS奖赏阈值的增加(即正常化此阈值)来测定该试验药物抑制这些抑郁症样症状的能力。确定ICSS阈值的方法于本技术领域中已知并且公开于实施例部分。因此，本发明此实施方案的筛选方法不仅可鉴定可提高已知抑制剂的抑制作用的药剂，而且还可用于鉴定被该试验药剂改善的成瘾的特殊特性(例如药物的快感作用、使用药物的动机、与药物依赖性相关和/或药物戒断后的抑郁症)。
在此实施方案的某些方面，将已知或怀疑可拮抗mGluR2和/或mGluR3的试验药剂与已知为mGluR5拮抗剂的抑制剂组合进行分析。相反，在此实施方案的其他方面，将已知或怀疑可拮抗mGluR5的试验药剂与已知为mGluR2和/或mGluR3拮抗剂的抑制剂组合进行分析。在某些方面，该已知抑制剂为MPEP，该试验药剂已知或怀疑为mGluR2和/或mGluR3拮抗剂。在其他方面，该已知抑制剂为LY341495，该试验药剂已知或怀疑为mGluR5拮抗剂。
对于本发明的筛选实施方案，所述对象为非人类对象，例如灵长类动物或啮齿类动物，如小鼠或大鼠。非人类对象罹患代谢型谷氨酸受体疾病，例如尼古丁成瘾、可卡因成瘾或者抑郁症。如实施例中所阐明，该疾病可以使用本技术领域中已知的方法诱导，或者通过使用已知处于患此疾病高风险的生物系来诱导。
此文中所使用的术语“试验药剂”指的是任何被检验其提高已知抑制剂抑制成瘾性药物使用或使ICSS阈值正常化能力的药剂。该方法通常被用作筛选试验法，以鉴定分子是否可担当用于治疗抑郁性疾病或成瘾性疾病如可卡因成瘾或尼古丁成瘾的治疗药剂。如上所示，该试验药剂可为已知可抑制mGluR2、mGluR3和/或mGluR5的药剂。此外，本发明的筛选方法可联合其他分析试验药剂拮抗mGluR2、mGluR3和/或mGluR5能力的方法。例如，使用本技术领域中已知的方法，一种基于细胞的高通量分析可用于筛选可为mGluR2、mGluR3和/或mGluR5拮抗剂的试验药剂。然后，被鉴定为mGluR2、mGluR3和/或mGluR5拮抗剂的试验药剂可于本发明此实施方案所提供的筛选方法中进行分析，以确定是否该试验药剂可提高已知抑制剂抑制成瘾性药物使用或影响ICSS奖赏阈值的能力。
试验药剂可为任何类型的分子，包括例如希望检测其担当治疗药剂能力的肽、肽模拟物、多聚核苷酸或者小的有机分子，该治疗药剂为可为接受其的对象提供治疗益处的药剂。
在另一实施方案中，本发明提供了可用于实施本发明方法的试剂盒。此试剂盒的组份取决于欲使用该试剂盒所执行的特定方法。例如，该试剂盒可用于实施治疗代谢型谷氨酸疾病的方法。在此方面，该试剂盒可以包含至少一个容纳调节代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、mGluR3和/或mGluR5的拮抗剂的容器。一方面，该试剂盒包阔含有mGluR5抑制剂的第一容器和含有mGluR2和/或mGluR3抑制剂的第二容器。一方面，该试剂盒包括MPEP的容器以及LY341495的容器。此试验试剂盒所包括的拮抗剂以足以允许向所述对象施用有效量的量和形式提供。例如，此试剂盒也可包括有关在治疗精神活性物质滥用和抑郁症中有效使用拮抗剂的说明书。在某些方面，该试剂盒包括对抑郁症个体或患有成瘾性疾病个体通常有用的信息。
另一方面，该试剂盒可用于筛选可提高已知抑制剂抑制成瘾性药物使用或至少部分使颅内自我刺激阈值正常化的能力的药剂。在此方面，该试剂盒例如包括含有已知抑制剂的容器。此外，该试剂盒可包括可向非人类哺乳动物对象施用的成瘾性药物的容器。
在另一实施方案中，本发明提供了一种治疗成瘾性疾病的方法，其包括在第一时间段中向有需要的对象施用有效量或亚有效量的安非布他酮以及在第二时间段中施用安非布他酮。第一时间段例如为这样一种时间段，其中所述对象预计处于这样一种环境或者被暴露于这样一种刺激，即所述对象习惯性地使用成瘾性药物，或其中所述对象能动地使用成瘾性药物。第二时间段例如为其中所述对象经受戒断和/或患有抑郁症的时间段。在此实施方案的一方面，在第一时间段中安非布他酮以较第二时间段中更低的剂量施用。
此实施方案基于实施例5中所示发现，即较低剂量、实际上为亚有效剂量(5mg/kg)的安非布他酮，可有效阻滞急性尼古丁施用的阈值降低作用，较高浓度(10-40mg/kg)的安非布他酮施用可使受尼古丁施用和/或戒断影响的ICSS阈值正常化。安非布他酮的亚有效剂量为其本身不降低脑部奖赏阈值、不过能够完全逆转急性尼古丁的奖赏增强作用的剂量。
在本发明此实施方案的另一方面，本发明提供了治疗成瘾性药物依赖和/或戒断和/或与药物使用或药物戒断相关的抑郁症的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂如帕罗西汀以及5-羟色胺1A受体拮抗剂。在本发明的某些方面，该5-羟色胺1A受体拮抗剂为p-MPPI。另一种可使用的5-羟色胺1A受体拮抗剂为吲哚洛尔。此实施方案基于实施例4中所示的结果。
在另一实施方案中，本发明提供了治疗成瘾性疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂如帕罗西汀、5-羟色胺1A受体拮抗剂和/或安非布他酮，并向该对象施用有效量的mGluR2、mGluR3和/或mGluR5拮抗剂。在此实施方案的某些方面，施用mGluR5拮抗剂时，在对象经受戒断的时间段中，停止该mGluR5施用。在某些方面，在患者经受戒断的时间段中，开始施用该选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、5-HT1A受体拮抗剂和/或安非布他酮。
现在，通过参考以下非限制性实施例，将对本发明进行更详细的说明。
实施例1组II代谢型及AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体调节大鼠中与尼古丁戒断相关的脑部奖赏功能缺乏本实施例阐明mGluR2和mGluR3受体拮抗剂和可能的AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体激动剂可降低大鼠中与尼古丁戒断相关的脑部奖赏功能缺乏。尼古丁戒断可在人类吸烟者中促成厌恶戒断综合征，其被假定可提供重要动机来源以有助于在戒断过程中吸烟习惯的持续及复发(Kenny和Markou，2001)。通过证实mGluII受体的激活在尼古丁依赖大鼠中促进了与自发性尼古丁戒断过程中所观察到的类似的ICSS阈值升高，此实施例所提供的数据强烈提示组II代谢型谷氨酸受体在产生与尼古丁戒断相关的奖赏缺乏中的作用。此外，VTA中mGluII受体的激活也于尼古丁依赖大鼠中提高了此阈值，这为VTA在介导尼古丁对奖赏通路作用中的重要作用提供了进一步的支持。与上述一致，mGluII受体的阻断也削弱了经受自发性尼古丁戒断大鼠中的奖赏缺乏。最后，通过证实AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体的拮抗在尼古丁依赖大鼠中促进了与自发性尼古丁戒断过程中所观察到的类似的ICSS阈值升高，此实施例所提供的数据也强烈提示AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体在产生与尼古丁戒断相关的奖赏缺乏中的作用。
材料和方法试验对象试验对象为149只在每一试验开始时体重为300-320g的雄性Wistar大鼠。大鼠获自Charles River实验室(Raleigh，NC)，并在可随意获取食物和水的条件下喂养。在12小时明/暗循环下(10:00am关灯)，将这些动物供养于温控动物饲养室中。每一试验中，动物均于明/暗循环的黑暗部分进行检测，除自发性尼古丁戒断试验中外，此时大鼠是于依照试验设计的时间点进行检测。
药物(-)-尼古丁酒石酸氢盐((-)-1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷)和(+)-MK-801马来酸氢盐(5R，10S)-(+)-5-甲基-10，11-二氢-5H-二苯并(a，d)环庚烯-5，10-亚胺马来酸氢盐)购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO；LY341495(2S-2-氨基-2-(1S，2S-2-羧基环丙烷-1-基)-3-(呫吨-9-基)丙酸)和NBQX二钠(2，3-二氧代-6-硝基-1，2，3，4-四氢苯并(f)喹喔啉-7-磺酰胺二钠)购自Tocris，Ballwin，MO。LY314582(LY354740((+)-2-氨基双环(3.1.0)己烷-2，6-二羧酸)的外消旋混合物)和MPEP(2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶)合成而得。CGP44532(3-氨基-2-(S)-羟丙基-甲基-膦酸)主要由Novartis Pharma AG提供。在每次施用前，临时制备药物。对于全身施用，在试验进行前30分钟，将所有药物溶于无菌水中并以1ml/kg体重的量通过腹膜内注射施用。对于直接VTA内施用，将LY314582溶于以下组成的人造脑脊液(aCSF)中(单位mM)126.6NaCl、27.4NaHCO3、2.4KCl、0.5KH2PO4、0.89CaCl2、0.8MgCl2、0.48Na2HPO4和7.1葡萄糖，pH7.4。大鼠在试验临开始前接受VTA内注射。除非另有说明，否则药剂剂量均指盐的形式。
装置于十六个有机玻璃(Plexiglas)操作室(25×31×24cm)(Med Associates，St.Albans，VT)中进行颅内自我刺激训练和检测。其一面室壁含有一个金属操纵轮，使其转动四分之一周需用0.2N的力。该轮(宽5cm)伸出室壁约3cm。通过恒定的电流刺激器进行颅内刺激。通过连接于安装在操作室上方的金触点旋转换向器上的柔软的双极导联将试验对象连至刺激回路。刺激参数、数据收集以及所有的检测期功能均通过微型计算机进行控制。
手术置入电极和套管通过吸入氧气中1-3％的氟烷麻醉大鼠，并将其定位于立体定位架中(Kopf Instruments，Tujunga，CA)。将切牙棒调整至耳间线上方5mm，并暴露颅骨。将不锈钢双极电极(长11mm)植入后侧下丘脑(AP距离前囟点-0.5mm；ML±1.7mm；DV距离硬脑膜8.3mm)。对于VTA注射试验，将双侧不锈钢导丝套管植入VTA上方3mm(AP距离前囟点-3.2mm；ML±1.7mm；DV距离颅骨表面5.3mm；与中线成10°角)，同时将ICSS电极植入。套管的特殊之处在于使用了14mm长的不锈钢管心针(30规格)。在ICSS范式中训练前，允许动物手术恢复至少7天。
渗透迷你泵手术通过吸入氧气中1-3％的氟烷麻醉大鼠，并将Alzet渗透迷你泵(型号2ML4(28天)；Alza公司，Palo Alto，CA)置于皮下(动物背部，与脊柱平行)进行处理。将泵充以无菌水或尼古丁盐溶液。依照动物体重调整尼古丁盐溶液的浓度，使得可递送9mg/kg/天(3.16mg/kg，游离碱)。此尼古丁剂量可维持与每天抽吸约30支香烟的人类吸烟者中所获得的那些浓度相当的稳定血浆水平(～44ng/ml)(Benowitz，1988，N Engl J Med 3191318-1330)。植入迷你泵后(或去除迷你泵后)，使用9mm不锈钢伤口夹关闭手术伤口，并局部使用抗生素软膏(Bacitracin)处理。
颅内自我刺激奖赏阈值程序依照Kornetsky和Esposito的改良离散试验电流阈值程序训练动物进行反应(Fed Proc 382473-2476，1979)，其在前面已经详细描述(Markou和Koob，1992 Physiol Behav 51111-119)。简言之，通过给以非附随性的电刺激启动试验。此电强化刺激的训练持续时间为500ms，由0.1ms的以50-100Hz传输的矩形阴极脉冲组成。对每一动物均调整所传输的电流强度，并使其典型处于50至200μA的范围内。在传输非附随性电刺激的7.5秒内，操纵轮子转动四分之一圈导致电刺激释放，该刺激与启动该试验的非附随性刺激的所有参数均相同。在不定的试验间间隔后(7.5-12.5秒，平均10秒)，再释放非附随性电刺激启动另一次试验。不能在7.5秒内对此非附随性刺激作出反应将开始进入试验间间隔。在试验间间隔中发生反应则使下一次试验延迟12.5秒开始。电流水平以交替下降和上升系列变化。每一电流强度均进行一套三次试验。电流强度以5μA的幅度变化。在每一试验期中，具有四个交替的下降-上升系列。每一系列的阈值被定义为产生“正分”(动物至少对三次试验中的两次作出反应)的两个连续电流强度与产生“负分”(动物未对三次试验中的两次或更多次作出反应)的两个连续电流强度之间的中点。该试验期的总体阈值被定义为四个单独系列阈值的平均。每一试验期的持续时间为30分钟。开始非附随性刺激与正性反应之间的潜伏期记录为反应潜伏期。每一试验期的反应潜伏期定义为所有发生正性反应的试验的平均反应潜伏期。在确定稳定的ICSS奖赏阈值后，大鼠于ICSS程序每天检测一次，除自发性尼古丁戒断试验外，此时依照试验设计的时间点对大鼠进行检测。
脑内注射步骤所有注射均通过17mm的注射器、经66秒以0.5μl/侧的量双侧施用。将注射器连接至经校准的聚乙烯-10管，该聚乙烯管预先加载以药物溶液，并在套管末端下突出3mm至VTA中。注射后，再将注射器保持固定不动60秒，以使药物扩散。然后将注射器除去并替换以14mm金属丝管心针，然后将动物直接置入ICSS检测装置中。使用Harvard微注射泵(型号975)进行注射。
试验设计全身施用试验。
这些试验研究了在经尼古丁处理的大鼠中，通过全身施用mGluII受体激动剂(LY314582)、GABAB受体激动剂(CGP44532)或者mGlu5拮抗剂(MPEP)、NMDA(MK-801)拮抗剂(MK-801)或AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体拮抗剂(NBQX)，是否可促成以ICSS阈值提高测定的尼古丁戒断。对于每一试验的药物，大鼠均于ICSS范式中进行训练，直至获得稳定的基线反应，其定义为连续3天阈值变异≤10％，同时需要检测约14天。在每一情况下，将未经药物处理的大鼠分为两个单独的组，使组间平均基线ICSS阈值或体重之间没有差异。然后将一组使用释放载体的皮下渗透迷你泵进行处理，第二组使用递送9mg/kg/天尼古丁酒石酸氢盐(3.16mg/kg/天尼古丁游离碱)的迷你泵进行处理。在迷你泵植入后，至少应有7天的间隔，此期间，继续每天测定ICSS奖赏阈值，然后评定任何全身施用对奖赏阈值的影响。在尼古丁处理的大鼠中，在突然去除迷你泵(即自发戒断)或施用尼古丁受体拮抗剂(即促成戒断)时，此时间间隔足以产生阈值的明显提高，但载体处理的大鼠则不然(Malin等人，1992，Pharmacol Biochem Behav43779-784；Malin等人，1994，Psychopharmacology 115180-184；Hildebrand等人，1997，Psychopharmacology 129348-356；Hildebrand等人，1999，Neuropsychopharmacology 21560-574；Epping-Jordan等人，1998，Nature 39376-79；Watkins等人，2000，J Pharmacol Exp Ther2921053-1064)。然后依照试验对象内拉丁方(Latin square)设计，对不同组的经尼古丁处理大鼠及其相应的未经尼古丁处理的对照组腹膜内注射mGluII受体激动剂LY314582(0、2.5、0.5、7.5mg/kg；n＝9尼古丁，n＝11对照)、GABAB受体激动剂CGP44532(0、0.065、0.125、0.25、0.5mg/kg；n＝5尼古丁，n＝5对照)、mGlu5受体拮抗剂MPEP(0、0.01、0.05、0.1mg/kg；n＝8尼古丁，n＝7载体或0、0.5、1、2、3mg/kg；n＝13尼古丁，n＝13载体)、NMDA受体拮抗剂MK-801(0、0.01、0.05、0.1、0.175、0.2mg/kg；n＝10尼古丁，n＝9对照)或者AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂NBQX(0、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.5、1mg/kg；n＝10尼古丁，n＝12对照)，并于30分钟后评定ICSS阈值。在拉丁方设计中，每次注射间允许最短48小时，在此期间，继续测定ICSS阈值以确保ICSS阈值回至基线。先前的试验证实，≥10mg/kg的LY314582和≥3mg/kg的MPEP于未经药物处理的大鼠中提高ICSS阈值(Harrison等人，2002，Psychopharmacology16056-66)，据此选择LY314582和MPEP的剂量。先前的试验也证实，≥0.25mg/kg的CGP44532于未经药物处理的大鼠中提高ICSS阈值(Macey等人，2001，Neuropharmacology 40676-685)，据此选择CGP44532的剂量。对于可能证实的药物间相互作用，重要的是试验应包括于基线条件下不会改变阈值的试验药物的剂量。
腹侧被盖区内LY314582试验在获得稳定的基线ICSS反应后(连续3天阈值变异≤10％)，将双侧套管伸向VTA的大鼠(n＝15)分为两组，使得组间平均基线奖赏阈值或体重没有差异。然后将一组使用递送载体的皮下渗透迷你泵进行处理，第二组使用递送尼古丁(3.16mg/kg/天尼古丁游离碱)的迷你泵进行处理。再将动物于ICSS范式中每天进行检测达7天，然后进行药物处理。如上所述，然后依照拉丁方设计，将LY314582(0、10、50和100ng/侧；n＝7尼古丁，n＝8对照)直接注射入两组大鼠的VTA，并于注射后立即评定ICSS奖赏阈值。在每次注射之间，至少有48小时间隔，期间继续测定ICSS阈值，以使得在进一步药物试验前阈值回至基线水平。在试验结束时，麻醉所有动物，将其脑部摘除并立即置于冰上。然后将脑切成50μm切片，并检查注射器和电极的放置(参见图1，注射位点的组织学确认)。只有那些注射点位于VTA中的大鼠方可纳入统计分析。
自发尼古丁戒断试验通过手术将渗透迷你泵从尼古丁处理大鼠(n＝15)(定义为已经经递送3.16mg/kg/天尼古丁游离碱的迷你泵处理至少七天的大鼠)或相应的对照大鼠(n＝17；经含有载体的迷你泵处理的大鼠)去除。然后于ICSS程序中，在去除渗透迷你泵后12、18、24、36、48和72小时对所有大鼠进行检测。这些时间点的选择是根据先前所观察到的、去除递送尼古丁的渗透迷你泵后的自发尼古丁戒断过程中的阈值提高时间过程进行的(Harrison等人，2001，Neuropsychopharmacology 2555-71；K.L.)。根据在12小时的时间点所获得的ICSS奖赏阈值，尼古丁戒断大鼠被分为两组，以使每组间奖赏阈值提高的幅度间没有差异(117.67±3.1％，n＝8；119.93±3.5％，n＝7)。类似地，对照大鼠也被分为两组，也使这些组间的平均奖赏阈值之间没有差异(106.45±5.2％，n＝7；103.63±3.6％，n＝10)。在于18小时时间点进行检测前30分钟，使用LY341495(1mg/kg)注射一组尼古丁戒断大鼠及一组对照大鼠；使用载体注射剩余大鼠。
统计分析对于所有试验，除自发尼古丁戒断试验外，均以先前阈值(即无药物的基线阈值)的百分数来表示药物所影响的阈值评分，以此计算相对于基线奖赏阈值的变化百分数。对这些基线评分的百分数进行两因素重复测定方差分析(ANOVA)，以治疗药物剂量作为试验对象组内因素，以泵内容物(尼古丁或对照)作为试验对象间因素。对于自发尼古丁戒断试验，以每只大鼠于去除迷你泵前一天阈值的百分数来表示戒断期间的每一时间点所获得的阈值评分，以此计算相对于基线奖赏阈值的变化百分数。对这些基线评分的百分数进行三因素重复测定ANOVA。试验对象组内因素为迷你泵去除后的时间，两个试验对象间因素为泵内容物(尼古丁或载体)和急性药物处理(LY314582或载体)。对于所有试验，以与阈值数据同样方法分析反应潜伏期。在ANOVA中有显著统计学效果后，使用Fisher’s LSD检验对平均值间进行post-hoc比较。
结果腹膜内施用mGluII受体激动剂LY314582(2.5-7.5mg/kg)于经尼古丁处理大鼠中提高了ICSS奖赏阈值，但于对照大鼠中则不然。这一作用反映于组别的显著统计学影响(F(1，18)＝7.43，p＜0.05)、剂量的显著影响(F(3，54)＝5.02，p＜0.005)以及显著的组别×剂量相互作用(F(3，54)＝2.79，p＜0.05)之中。Post-hoc分析揭示，与载体处理大鼠相比(p＜0.01)以及与使用相同剂量检测的对照大鼠相比(p＜0.01)，最高剂量的LY341582(7.5mg/kg)于经尼古丁处理大鼠中提高了奖赏阈值(图2A)。与其对奖赏阈值的作用相比，在任何检测的剂量下，LY314582于经尼古丁处理大鼠及对照大鼠中(F(3，54)＝0.59，NS)均对反应潜伏期没有影响(图2B)。
如表I中所示，在所检测的最低剂量时(0.065-0.25mg/kg)，选择性GABAB受体激动剂CGP44532于经尼古丁处理的大鼠中不促使奖赏阈值升高，而在所检测的最高剂量时，CGP44532(0.5mg/kg)于尼古丁处理大鼠和对照大鼠中均提高了奖赏阈值(F(4，32)＝16.62，p＜0.001)。CGP44532在经尼古丁处理大鼠中的作用与对照大鼠相比没有差异(组别×剂量相互作用F(4，32)＝0.05，NS)。在任何检测剂量下，CGP44532对反应潜伏期均没有影响(F(4，32)＝0.30，NS)。
数据(平均值±SEM)以基线ICSS阈值和反应潜伏期的百分数表示。
星号指示CGP44532处理和载体处理之间有显著统计学差异。
***P＜0.001，经使用重复测定的显著性两因素AVOVA分析后。
如图3所示，直接将LY341582(10-100ng/侧)双侧微注至VTA中于经尼古丁处理大鼠中显著提高了奖赏阈值，但于对照大鼠中则不然。同时也存在组别(F(1，13)＝4.81，p＜0.05)、剂量(F(3，39)＝4.77，p＜0.01)的显著影响，以及显著的组别×剂量相互作用(F(3，39)＝3.82，p＜0.05)。post-hoc分析揭示，50和100ng/侧剂量的LY314582足以在经尼古丁处理大鼠中提高奖赏阈值，同时不影响对照大鼠中的阈值。在VTA施用后，LY314582于经尼古丁处理大鼠或对照大鼠中均对反应潜伏期没有影响(F(3，39)＝1.94，NS)(图3B)。
如图4所示，长期尼古丁处理的戒断产生了与对照大鼠相比显著的ICSS阈值提高(F(1，27)＝15.3，p＝0.0006)。显著的组别×剂量×时间相互作用分析(F(5，135)＝3.3，p＝0.01)揭示如下注射载体的经尼古丁处理大鼠证实有显著的奖赏阈值提高，其于去除迷你泵后24小时达到峰值(图4A)。不过，在18小时的时间点前30分钟施用LY341495于尼古丁戒断大鼠中显著削弱了奖赏阈值的提高(p＜0.001)(参见图4A)，同时不会影响对照大鼠中的阈值(图4B)。在注射后的任何时间点，LY341495均对反应潜伏期没有影响(F(1，27)＝0.43，NS)。
如表2所阐明，MK-801(地佐环平(dizocilpine))(0.01-0.2mg/kg)于经尼古丁处理大鼠和对照大鼠中降低了奖赏阈值(F(6，66)＝7.5，p＜0.0001)。
数据(平均值±SEM)以基线ICSS阈值和反应潜伏期的百分数表示。
星号指示MK-801处理和载体处理之间有显著统计学差异。
*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，经使用重复测定的显著性两因素AVOVA分析后。
MK-801于经尼古丁处理大鼠和对照大鼠中以相似幅度降低了奖赏阈值，同时没有组别×剂量相互关系(F(6，66)＝1.2，NS)。在两组中，≥0.2mg/kg剂量的MK-801均可导致ICSS范式中行为表现分裂，以至大鼠不再对自我刺激作出反应，所以高于0.2mg/kg的剂量未再检测。此外，MK-801在任何所检测的剂量时于经尼古丁处理大鼠中均不促成奖赏阈值的类似戒断样的提高。MK-801确实可以显著增加反应潜伏期(F(6，72)＝2.9，p＜0.05)。Post-hoc分析证实，在MK-801剂量增加时，反应潜伏期也增加、特别是在对照大鼠中，这提示在较高剂量MK-801时，其行为表现渐增受到削弱。
如图3所示，低剂量的MPEP(0.01-0.1mg/kg)于经尼古丁处理大鼠或对照大鼠中不影响奖赏阈值(F(3，39)＝2.3，NS)或反应潜伏期(F(3，39)＝0.4，NS)。高剂量的MPEP(0.5-3mg/kg)于经尼古丁处理大鼠和对照大鼠中提高了奖赏阈值(F(4，96)＝8.4，p＜0.0001)。不过，在两组大鼠中，MPEP以类似幅度均提高了ICSS阈值，但没有组别×剂量相互作用(F(4，96)＝0.7，NS)。在任一组中，MPEP(0.5-3mg/kg)均对反应潜伏期没有影响(F(4，96)＝1.4，NS)。
数据(平均值±SEM)以基线ICSS阈值和反应时间的百分数表示。
星号指示MPEP处理和载体处理之间有显著统计学差异。
**P＜0.01，经使用重复测定的显著性两因素AVOVA分析后。
如图5所示，AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂NBQX(0.01-1mg/kg)于经尼古丁处理大鼠中显著改变了ICSS奖赏阈值，但于对照大鼠中则不然。此作用反映于组别的显著统计学影响(F(1，20)＝10.82，p＜0.005)、剂量的显著影响(F(7，140)＝2.8，p＜0.01)以及显著的组别×剂量相互作用(F(7，140)＝2.11，p＜0.05)之中。Post-hoc分析揭示NBQX于经尼古丁处理大鼠中对奖赏阈值的双峰作用。低剂量(0.025-0.1mg/kg)的NBQX于尼古丁处理大鼠中提高奖赏阈值，而较高剂量(0.5-1mg/kg)的NBQX则有效性较低，与载体处理组相比并不显著增加阈值(图5A)。在任何所检测的剂量下，NBQX于尼古丁处理大鼠或对照大鼠中均对反应潜伏期没有影响(F(7，140)＝0.31，NS)(图5B)。
本数据通过证实mGluII受体活化于经尼古丁处理大鼠中促成了与尼古丁戒断过程中所观察到的那些现象类似的奖赏缺乏，为组II代谢型谷氨酸受体在调节与尼古丁戒断相关的脑部奖赏功能缺乏中的作用提供了有力证据。此外，位于VTA中的mGluII受体的活化也于经尼古丁处理大鼠中促成类戒断样奖赏缺乏，这为VTA在介导尼古丁对脑部奖赏通路作用中的重要地位提供了进一步的证据(Hildebrand等人，1999；Mansvelder和McGehee，2000；Mansvelder等人，2002)。最后，mGluII受体的阻断削弱了于经受自发尼古丁戒断的大鼠中所观察到的脑部奖赏功能缺乏。先前，mGluII受体激动剂LY354740显示可削弱于自发尼古丁戒断过程中所观察到的听觉惊愕反射增加(Helton等人，1997)。对这些观察的一种可能的解释是位于不同脑部位点的mGluII受体可以以不同方式调节尼古丁戒断的各种方面。
讨论本发明基于实施例中所给出的试验结果，与mGluII和GABAB受体在介导与尼古丁戒断相关的奖赏缺乏中的作用和可能的机制有关。全身施用选择性mGluII受体激动剂LY314582(2.5-7.5mg/kg)而不是GABAB受体激动剂CGP44532(0.065-0.5mg/kg)，在尼古丁依赖性大鼠中促成颅内自我刺激(ICSS)奖赏阈值(奖赏功能的一种灵敏量度)的类戒断样提高，而在对照大鼠中则不然。LY314582不影响反应潜伏期，后者是ICSS范式中行为表现的量度。将LY314582双侧微注(10-100ng/侧)至腹侧被盖区中，同样于尼古丁依赖性大鼠中促成阈值提高，不过在对照大鼠中则不然。此外，单次注射mGluII受体拮抗剂LY341495(1mg/kg)削弱了于经受自发尼古丁戒断大鼠中的奖赏阈值的提高。最后，由于mGluII受体的活化可降低谷氨酸传递，因而假设突触后谷氨酸受体的阻断也将于尼古丁依赖性大鼠中促成类似戒断样奖赏缺乏。因此，选择性AMPA/红藻氨酸(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸/红藻氨酸)受体拮抗剂NBQX(0.001-1mg/kg)，也于尼古丁依赖性大鼠中促成ICSS阈值类似戒断样的提高，不过于对照大鼠中则不然；而分别是mGlu5(代谢型谷氨酸5)和NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体拮抗剂的MPEP(0.01-3mg/kg)和MK-801(0.01-0.125mg/kg)则不会。总体而言，这些数据证明，在尼古丁依赖性大鼠中，位于VTA中的mGluII受体对脑部奖赏功能的抑制性调节增加，这对与尼古丁戒断相关的奖赏缺乏起到一定作用。此外，于AMPA/红藻氨酸受体处的谷氨酸传递降低很可能也对尼古丁戒断所诱导的奖赏缺乏起作用。
不受理论所限制，本发明部分是基于以下考虑。现已存在尼古丁戒断过程中所观察到的厌恶综合征对烟草成瘾起一定作用(Kenny和Markou，2001，Pharmacol Biochem Behav 70531-549)。确实，如通过颅内自我刺激(ICSS)奖赏阈值的提高所测定，尼古丁戒断最近显示可促成脑部奖赏功能缺乏，其幅度及持续时间均与经受停用其他主要滥用药物大鼠中所观察到的类似(Epping-Jordan等人，1998 Nature 39376-79；Harrison等人，2001Neuropsychopharmacology 2555-71)。此外，此脑部奖赏功能缺乏已被提出作为促使人类吸烟者渴求、复发及继续烟草使用的主要动机因素(Epping-Jordan等人，1998)。不过，与对尼古丁产生其奖赏效应机制的透彻研究(参见Picciotto和Corrigall，2002 J Neurosci 223338-3341)相比，对介导与尼古丁戒断相关的奖赏缺乏的机制几乎没有了解。
包括尼古丁在内的药物滥用的通常特性为其增加中伏隔(mesoaccumbens)奖赏通路中多巴胺传递及由此促进脑部奖赏功能的能力(Pontieri等人，1996；Picciotto，1998；Di Chiara，2000)。尼古丁被认为部分是通过激活VTA中兴奋性谷氨酸传递而达到这一点(Schilstrm等人，1998；Mansvelder和McGehee，2000；Mansvelder等人，2002)。因此，由于位于VTA中的mGluII受体为降低谷氨酸传递的突触前自身受体(Bonci等人，1997；Wigmore和Lacey，1998；Manzoni和Williams，1999)，故在经尼古丁处理的大鼠中，位于VTA中的mGluII受体的灵敏度增加可能是应答尼古丁于此脑部位点延迟激活兴奋性谷氨酸传递模式而发生。
在尼古丁戒断过程中，当尼古丁不再对兴奋性谷氨酸传递具有刺激作用时，VTA中mGluII受体功能的增加预计可降低谷氨酸传递并因此降低脑部奖赏系统的活性。电生理学和体内微透析试验与此假说相一致。例如，Manzoni和Williams(1999)证实，延长阿片制剂处理增加了mGluII受体激动剂对VTA多巴胺神经元中兴奋性谷氨酸流的抑制作用。类似地，重复可卡因处理增加了NAcc中mGluII受体的含量和二聚作用，并因此增加了此脑部位点mGluII受体对谷氨酸外流的抑制作用(Xi等人，2001)。令人感兴趣的是观察到，类似试验也证实在重复使用阿片和安非他明处理后，VTA中GABAB受体功能增加(Manzoni和Williams，1999；Giorgetti等人，2002)。不过我们发现，与对照相比，经尼古丁处理大鼠中GABAB受体对脑部奖赏功能的调节未受改变，这提示GABAB受体可能不涉及于介导与尼古丁戒断相关的奖赏缺乏之中。
先前的试验已经发现，mGluII受体激动剂LY354740于经受自发尼古丁戒断的大鼠中改善了听觉惊愕反应增加(Helton等人，1997)。类似地，mGluII受体激动剂于经受阿片戒断的大鼠中减少了戒断体征(Fundytus和Coderre，1997；Vandergriff和Rasmussen，1999)。这些观察结果可能看似与此文中所提供的数据不符，在所提供的数据中，全身性及VTA内施用选择性mGluII受体激动剂于经尼古丁处理大鼠中促成了戒断样奖赏缺乏，并且阻断这些受体逆转了自发尼古丁戒断。
不过，有累计证据表明谷氨酸传递在药物戒断的各种方面中有着不同作用。例如，谷氨酸传递增加、特别是在蓝斑(LC)和扁桃体(Zhang等人，1994；Rasmussen，1995；Taylor等人，1997)中的谷氨酸传递增加，被认为在阿片戒断综合征的“身体”方面的表达中起着重要作用，而中伏隔奖赏系统中谷氨酸传递降低被认为对阿片及其他滥用药物戒断过程中的奖赏和动机缺乏表现起着一定作用(Keys等人，1998；Lu和Wolf，1999；Manzoni和Williams，1999；Giorgetti等人，2002)。确实，Shaw-Lutchman和同事(2002)最近证实，cAMP反应元件(CRE)-所介导的转录为细胞活性的标记物，其于经受促成型吗啡戒断的大鼠中，在LC和扁桃体中增加，在VTA中降低，这提示在吗啡戒断过程中，这些位点的活性以相反方向被改变。基于这些观察结果，对于谷氨酸在介导尼古丁戒断的不同方面中的作用，也很可能存在类似的分离。不过，值得注意的是，药物戒断的情感方面、特别是脑部奖赏功能的缺乏，被认为与药物戒断的其他症状相比在维持药物依赖性中更为重要(Markou等人，1998；Kenny和Markou，2001；Ahmed等人，2002)。
谷氨酸传递可调节中伏隔多巴胺神经元的兴奋性，并在介导奖赏通路的基线活性中起着必要作用(Kalivas和Stewart，1991；Suaud-Chagny等人，1992；Kalivas，1993)。如上所述，mGluII受体可在VTA中担当突触前自身受体，抑制谷氨酸传递。因此，假设mGluII受体通过降低谷氨酸传递而于尼古丁戒断大鼠中提高奖赏阈值，至少部分提高奖赏阈值，同时，于突触后谷氨酸受体处阻断谷氨酸传递也将于尼古丁处理大鼠中促成类似于经受自发尼古丁戒断大鼠中的奖赏阈值提高。
因此，在低剂量时，AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂NBQX于经尼古丁处理大鼠中促成奖赏阈值提高，但于对照大鼠中则不然。此观察结果提示，AMPA/红藻氨酸受体处谷氨酸传递的降低对与尼古丁戒断相关的奖赏缺乏起着一定作用。这些数据也与证实延长尼古丁处理可降低NAcc和VTA中AMPA受体免疫反应性的近期发现相一致(Lee等人，2001)。在正常情况下，AMPA/红藻氨酸受体是中伏隔奖赏通路中兴奋性谷氨酸传递的主要调节剂(Pennartz等人，1990；Hu和White，1996)。因此，与mGluII受体功能增加类似，在经尼古丁处理大鼠中AMPA受体表达降低将预计可降低中伏隔多巴胺传递，并因此对抗尼古丁对此系统的延长刺激作用。
奇怪的是，阻断经尼古丁处理大鼠中NMDA受体不但不促成奖赏阈值提高，反而降低阈值，在经尼古丁处理大鼠和对照大鼠中均反映了奖赏效应。有相当的证据表明，NMDA受体在介导尼古丁对中伏隔多巴胺传递的刺激性作用中起着决定性作用(Schilstrm等人，1998；Fu等人，2000；Mansvelder和McGehee，2000)。因此，可以预计，通过拮抗NMDA受体来阻断尼古丁对奖赏通路的刺激作用，在延长尼古丁处理过程中所发生的逆适应性过程如mGluII受体敏感性增加，将会引起ICSS阈值提高。
对这些数据的一个解释是，在脑部奖赏回路中存在许多族NMDA受体，其可能对脑部奖赏功能有着相反作用。确实，NMDA受体的拮抗剂本身是奖赏性的，并已显示可在直接VTA内施用后降低ICSS阈值(David等人，1998)。阻断mGlu5受体也不促成尼古丁戒断，相反于对照及尼古丁处理大鼠中提高ICSS阈值。这些数据证实在两组大鼠中，mGlu5受体的阻断降低脑部奖赏功能至相似程度。
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实施例2mGluR5拮抗剂MPEP于大鼠和小鼠中减少尼古丁自我施用本实施例阐明了阻断mGluR5于大鼠和小鼠中均减少尼古丁自我施用，这也与显示mGluR5在可卡因自我施用中的作用的发现相一致。大鼠的可卡因自我施用被认为可反映可卡因的奖赏效应，其也已显示对调节多巴胺能(Corrigall & Coen 1991；Picciotto和Corrigall 2002)、胆碱能(Watkins等人，1999；Corrigall等人，2002；Picciotto和Corrigall 2002)及K-氨基-丁酸(GABA)能(Dewey等人，1999；Paterson和Markou 2002；Picciotto和Corrigall 2002)神经传递非常灵敏。另外的工作也已提示了谷氨酸在介导尼古丁奖赏效应中的可能作用(McGehee等人，1995；Schilstrom等人，2000；Reid等人，2000)。特别是，神经化学试验指出，全身性尼古丁施用可导致腹侧被盖区(VTA)及伏隔核(NAcc)中谷氨酸水平的显著增加(Reid等人，2000；Schilstrom等人，2000)。此外，近期Mansvelder及同事(2002)所进行的电生理学试验表明，在暴露于与吸烟者脑部中所经受的相似浓度和持续时间的尼古丁水平的切片中，在VTA水平上，至中脑多巴胺神经元的GABA能和谷氨酸能输入之间存在复杂的相互作用。总之，尼古丁被认为通过中枢神经系统中多种神经递质之间的相互作用而发挥其奖赏效应。这些递质中主要的是中脑缘多巴胺系统，但是近来谷氨酸也已显示起着重要作用。
基于氨基酸的序列同源性、第二信使系统以及药理学，代谢型谷氨酸受体(mGluR)的八个亚型被分入三组(Conn和Pin1997)。组ImGluR包含代谢型谷氨酸受体亚型5(mGluR5)和mGluR1，其通过刺激磷脂酶C起作用(Conn和Pin1997)。mGluR5的分布已有具体描述，其显示在大鼠脑部中于NAcc、纹状体以及海马中分布较多(Shigemoto等人，1993；Tllakssen-Greene等人，1998)。代谢型谷氨酸受体已被显示涉及于神经递质释放(Cartmell和Schoepp 2000；Schoepp 2001)、突触可塑性和学习(Holscher等人，2001)、神经保护(Battaglia等人，2001，2002)、多巴胺依赖性运动行为(综述请参见Vezina和Kim1999)以及疼痛(综述请参见Spooren等人，2001)的调节之中。
近来，与本发明最相关的是，已显示缺乏mGluR5的小鼠将不能习得静脉可卡因自我施用(Chiamulera等人，2001)。此外，施用特别的mGluR5拮抗剂2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶(MPEP，Gasparini等人，1999)导致可卡因自我施用的剂量依赖性降低，同时不会影响对食物的反应(Chiamulera等人，2001)。此外，已显示持续一周的重复可卡因施用导致伏隔核壳及背侧纹状体中mGluR5 mRNA的表达水平显著增加，在停止可卡因施用后持续三周(Ghasemzadeh等人，1999)。除可卡因自我施用之外，MPEP也已显示在实验动物中的许多行为范式中有着数种作用。先前的工作指出，于啮齿动物中施用MPEP具有显著的抗焦虑及抗抑郁样作用(Spooren等人，2000b；Tatarczynska等人，2001)。此外，MPEP显示可于啮齿类动物中阻断恐惧条件反射(Schulz等人，2001)、发挥抗帕金森样作用(Ossowska等人，2001；Breysse等人，2002)以及具有抗惊厥活性(Chapman等人，2000)。总之，MPEP已显示在啮齿类动作中的许多不同行为范式中具有广泛不同作用，mGluR5也已显示涉及于可卡因自我施用和可能的可卡因长期作用中。
基于以上所概括的显示mGluR5受体在介导可卡因奖赏效应中的作用(Chiamulera等人，2001)以及谷氨酸在介导尼古丁奖赏效应中的作用的先前发现，本试验计划确定MPEP在以两种剂量(0.03和0.01mg/kg/注射)之一规律自我施用尼古丁的大鼠中及未经药物处理的小鼠中对静脉用尼古丁的强化效应的影响。另外，还研究了MPEP施用对大鼠中食物所维持的反应的影响，以确定MPEP作用的特异性。此外，此文中所使用的小鼠自我施用程序包括了匹配的对照小鼠，以允许评定药理学处理的非特异性作用。
材料和方法试验对象将到达实验室时体重为300-350g的雄性Wistar大鼠(Charles River，Raleigh，NC)在12小时颠倒的明/暗循环下(10:00am开灯)成组(两只/笼)供养于温度和湿度均可控的动物饲养室中，除检测过程中外，不限制饮水，同时，在获得尼古丁自我施用行为后，将食物限制于20g/天。将到达实验室时为10-12周龄的雄性DBA/2J小鼠(Harlan实验室，Indianapolis，IN)也于在12小时颠倒的明/暗循环下(6:00am开灯)成组(4只/笼)供养于温度和湿度均可控的动物饲养室中，除检测过程外，均不限制食物和饮水。所有行为检测均于明/暗循环的黑暗相进行。所有试验对象均依照国立卫生研究所指南及美国实验动物管理评估及认证协会(AAALAC)进行处理、供养及使用。
药物(-)尼古丁酒石酸氢盐购自Sigma(St.Louis，MO)，将其溶于盐水中并使用氢氧化钠调整pH值至7.0(±0.5)。然后将溶液通过0.22μm针头过滤器(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA15219)进行过滤以达到无菌目的。尼古丁浓度以游离碱浓度记录。MPEP由Novartis Pharma AG友好捐献，将其溶于0.09％氯化钠中，并分别于大鼠和小鼠中以1或10ml/kg的量腹膜内施用，预处理时间为30或15分钟。
装置大鼠自我施用和食物反应操作盒如前所述，于十二个有机玻璃操作室进行静脉尼古丁自我施用和食物所维持的反应，每一操作室均置于隔音盒中(Markou和Paterson 2001)。
小鼠自我施用操作盒小鼠的所有尼古丁自我施用均于由4个相同检测笼(8×8×8cm)所组成的装置(San Diego Instruments，San Diego，CA)中进行，这可允许同时检测两对小鼠(参见Semenova等人，1995，1999；Kuzmin等人，1996a，1997)。盒子由不透明塑料制成，含有两个孔一个用于鼻子伸探(nose poke)，一个用于尾端固定。所有检测期功能和数据均以计算机进行控制和记录。
大鼠自我施用和食物所维持的反应食物训练和习得尼古丁自我施用在将导管置入颈静脉中处理(参见Markou和Paterson 2001)后约一周，于FR5 TO20sec程式下训练大鼠自我施用两种剂量(0.01[n＝9]和0.03[n＝9]mg/kg/注射，游离碱)的尼古丁(参见Markou和Paterson 2001)。允许另外两组大鼠于FR5 TO20sec(n＝10)及FR5 TO210sec(n＝10)程式下对食物(45mg Noyes饲料颗粒)作出反应。采用这两种不同程式是为了评定MPEP对与尼古丁所用相同强化程式(FR5 TO20sec)下以及使食物反应率与尼古丁所观察到的那些相等的强化程式(FR5 TO210)下的食物反应的影响。若对活动杠杆反应，则以0.1ml/注射的容量经1秒钟递送尼古丁溶液(Razel Scientific Instruments Inc，Stamford，CT)，而对非活动杠杆反应则不产生任何结果。当大鼠按压活动杠杆的次数为其按压非活动杠杆次数的两倍以上，并且每1小时试验期接受了最少6次注射或90个颗粒，同时每试验期所获得强化物数目的变异低于20％时，方可认为大鼠已经习得稳定的操作性反应。大鼠约花费两周的时间以建立稳定的操作性反应速率。所有的检测每天进行一小时，每周进行五天。
小鼠静脉内自我施用使用先前所述的方法进行急性尼古丁自我施用(Semenova等人，1995，1999；Kuzmin等人，1996a，1997)。在检测期过程中，将小鼠的尾部固定于装置表面以允许进行药物递送；固定小鼠的尾部可令小鼠移动其所有四肢、头部及整个身体。通过侧尾静脉向成对的两只小鼠施用药物或载体注射(经1秒钟递送1.6μl/注射)，视每对动物之一的每次鼻子伸探而定(主动型小鼠)。与递送药物或载体注射相关的唯一信号是泵的噪音。对小鼠进行一次或两次检测，每次检测之间大约相隔1个月。第二次检测只在原始小鼠总体的一亚群中进行(每一原始小鼠组中的2-7对小鼠)。这样做是为了增加试验对象/试验条件的数目，并且涉及到在与原始检测不同的一组试验条件下随机分配和检测这些小鼠(即不同的尼古丁和/或MPEP剂量)。对于该有限亚群的小鼠而言，在两次检测之间有一个月的时间间隔，故此重复检测不太可能会影响试验结果。
试验步骤试验1MPEP施用对定比强化程式下大鼠尼古丁自我施用和食物所维持反应的影响在习得稳定的0.01mg/kg/注射(n＝9)或0.03mg/kg/注射(n＝9)尼古丁自我施用或者FR5 TO20sec程式(n＝10)或FR5 TO210sec程式(n＝10)下稳定的食物所维持反应后，启动药物检测。依照拉丁方设计，在试验期前30分钟，于腹膜内施用MPEP(0、1、3和9mg/kg)，在每一检测剂量之间至少相隔6天。只有在动物已经显示在前三天中已经习得稳定的自我施用行为——定义为每日表现间的变异低于20％，方可施用药物。
试验2在未经药物处理的小鼠中施用MPEP对尼古丁自我施用的影响不同组别的动物可获得盐水或四种尼古丁剂量(0.016、0.048、0.16及0.48μg/注射)中的一种。每一动物组由9-17对动物组成，每组包括2-7只至少一个月前(参见上文)已经经历一次检测试验期的小鼠。在开始检测前15分钟，使用MPEP(腹膜内0、5、10、20mg/kg)进行预处理。
数据分析试验1使用两因素ANOVA对数据进行分析，以MPEP剂量作为试验对象组内因素(4水平)，以强化物作为试验对象组间因素(4水平0.01和0.03mg/kg/注射尼古丁，以及可用于FR5 TO20sec和FR5 TO210sec程式的饲料颗粒)。数据以基线(定义为前三天的平均值；活动杠杆数据)的百分数及杠杆按压的次数(只对于非活动杠杆)表示。显著性水平设定于p＜0.05。
试验2数据分析基于每对动物中主动和被动小鼠鼻子伸探的对比，使用公式R＝log(AT/PT)-log(ABL/PBL)，其中(AT/PT)为在30分钟检测过程中主动相对被动小鼠鼻子伸探总次数的比例，(ABL/PBL)为在10分钟预检测过程中主动与被动小鼠鼻子伸探总次数的比例。当R值分别为高于、等于或低于0时，药物的作用被认为是强化、中性或反作用。基于其是否处于特定条件组别平均值的2倍标准偏差内，将一些数据点(237对小鼠中的9对)从最终分析中排除。使用单因素ANOVA对盐水预处理后获得的尼古丁自我施用数据进行分析，以尼古丁(4水平)定义为试验对象组间因素。使用两因素AVONA对R-标准数据进行分析，以MPEP剂量(4水平)和尼古丁剂量(4水平)定义为试验对象组间因素。对于每一可用的尼古丁和盐水自我施用剂量，均使用单因素ANOVA对预设的R标准数据进行分析，以MPEP剂量(4水平)定义为试验对象组间因素。使用Student-Newman-Keuls posthoc检验对合适的个体进行比较，因为分析表明，0.048μg/注射的尼古丁是小鼠唯一可靠的自我施用剂量，因而使用单因素ANOVA对0.048μg/注射尼古丁的总自我注射剂量进行分析，以MPEP剂量作为试验对象组间因素(参见试验结果)。此外，对于可靠自我施用的尼古丁剂量(0.048μg/注射)的原始鼻子伸探反应速率，也进行两因素ANOVA分析，以主动/被动小鼠作为一个因素，以MPEP剂量作为另一因素。使用三因素ANOVA对小鼠体重及预试验鼻子伸探活动水平进行分析(定义尼古丁剂量、MPEP剂量以及小鼠(即主动/被动)作为试验对象组间因素)。
结果试验1MPEP施用对定比强化程式下大鼠尼古丁自我施用和食物所维持反应的影响显著的MPEP×强化物相互作用影响[F(9，102)＝4.22，p＜0.001]表明，MPEP以不同方式影响尼古丁自我施用和食物所维持的反应(图6；表4)。此外，还存在MPEP剂量(F[3，102]＝23.33，p＜0.001)和强化物(F[3，34]＝14.07，p＜0.001)的显著主要影响(图7)。Newman-Keuls post-hoc检验表明，与对照情况相比，3和9mg/kg的MPEP显著降低了0.01mg/kg/注射尼古丁剂量的自我施用，但只在9mg/kg时降低了0.03mg/kg/注射剂量的自我施用。与尼古丁所维持的反应相比，在任何所施用的MPEP剂量下，于FR5 TO20sec或FR5 TO210sec程式下食物所维持的反应均未显著降低。非活动杠杆数据的分析指出，对于任何强化物，均不存在MPEP对非活动杠杆按压的影响，如缺乏MPEP剂量的主要影响所表明。强化物对非活动杠杆按压有影响[F(3，34)＝4.47，p＜0.01]，但没有显著的MPEP×强化物相互作用。
表4在整个1小时试验期中，在大鼠尼古丁自我施用和食物所维持的反应中所获得的强化物数目。数据表示为基线条件下所有试验对象中所观察到的原始值范围，同时也表示为MPEP(0、1、3和9mg/kg)预处理后所获得强化物的平均值±SEM。
试验2在未经药物处理的小鼠中MPEP施用对尼古丁自我施用的影响R标准数据的统计分析表明，未经药物处理的小鼠习得尼古丁的自我施用，如尼古丁的显著主要作用所示[F(4，71)＝3.4，p＜0.05]。Post-hoc比较表明，0.048μg/注射尼古丁剂量的自我施用显著不同于盐水施用(图8)。R标准数据的统计分析表明，存在MPEP×尼古丁剂量显著相互作用的趋势[F(3，90＝1.89，p＝0.056)。基于MPEP对每一尼古丁剂量自我施用的影响的预设对比，单因素ANOVA表明，MPEP只对0.048μg/注射尼古丁剂量的自我施用有显著影响[F(3，46)＝3.53，p＜0.05]，这也是实际上可可靠自我施用的唯一尼古丁剂量。Post-hoc比较指出，在所有检测剂量下，MPEP均显著降低了尼古丁自我施用(图8)。有趣的是，图8A似乎显示20mg/kg的MPEP降低R标准至零以下的趋势，这可能表明在该检测条件下此剂量的MPEP使尼古丁反其作用。分析显示，MPEP对总自我注射尼古丁剂量没有显著影响(图8B)。然而，如小鼠(主动对比被动)×MPEP相互作用影响所指示，MPEP于主动型小鼠中显著降低了鼻子伸探反应[F(3，96)＝3.46，p＜0.05]。对于预检测鼻子伸探活性，任何试验组间均无差异。此外，如缺乏显著的三因素相互作用所示，不同条件之间体重也没有显著差异。表5显示了每组小鼠的原始数据，以在预检测和自我施用过程中对于主动和被动小鼠所记录的每分钟鼻子伸探数目表示。
表5小鼠自我施用试验的原始数据。表中数据包括每一条件的样本大小，其以小鼠的对数表示，同时还包括在预检测和检测期中、在所有条件下对于主动和被动试验对象所记录的鼻子伸探反应速率，其以每分钟的平均反应±SEM表示。对于0.048μg/kg/注射的尼古丁剂量，在小鼠因素(主动对比被动)和MPEP因素之间存在显著的相互作用，这表明相比于被动小鼠，MPEP以不同方式影响主动小鼠中的鼻子伸探率。
讨论本试验结果表明，MPEP施用在大鼠中选择性地降低了尼古丁自我施用，在可获得的尼古丁剂量较低时功效增加，同时在所采用的两种食物所维持的强化程式的任一种下，均不影响食物所维持的反应。此外，在未经药物处理的小鼠中施用MPEP显示可抑制已表明可可靠自我施用的尼古丁剂量(0.048μg/注射的尼古丁)的自我施用。这些数据表明，在两种不同的啮齿类动物中，尼古丁预处理降低了自我静脉施用的尼古丁的强化效应。
在大鼠中，尚没有明显的活动抑制效应可用来解释尼古丁自我施用的减少，如在两种强化程式任一种下维持高水平的食物反应所表明，在这两种强化程式中，其中一种使其反应率等于对尼古丁所观察到的比率。在小鼠试验中，施用MPEP对鼻子伸探活动没有影响。先前的研究已一般性地指出，MPEP在啮齿类动物中对运动活性没有影响。在大鼠中，以2.5-10mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)递送MPEP对大鼠的探索性运动活性没有影响(Tatarczynska等人，2001；Henry等人，2002)，尽管其他试验表明更高剂量的MPEP抑制自发性运动活性；但是即使是非常高的剂量也对旋转杆(rotarod)行为没有影响(Spooren等人，2000a)。在小鼠中也与之类似，Tatarczynska和其同事(2001)证实，30mg/kg的MPEP(i.p.)对旋转杆行为没有影响，但是不同的试验(Spooren等人，2000a)表明，更高剂量的MPEP降低了竖直运动活性。总之，先前的工作和这些关于大鼠中食物所维持的反应的数据说明，于本试验中所使用的MPEP剂量下，极其不可能用非特异性运动影响解释尼古丁自我施用减少。此外，所观察到的MPEP对尼古丁相比食物所维持反应的影响的差异不能归因于比率依赖性作用，因为使用FR5 TO210sec程式提供了对尼古丁和对食物相当的反应率，即使在这些条件下，MPEP也不影响对食物的反应。
借助本试验中所使用的小鼠自我施用技术，小鼠显示出在所检测的五种跨越宽范围的尼古丁剂量之一显示自我施用。此种在未经药物处理的小鼠中自我施用的程序已被用来研究吗啡(Semenova等人，1995，1999；Kuzmin等人，1996a，1997)、可卡因(Kuzmin等人，1996b；1997)、酒精(Kuzmin等人，1999)、尼古丁(Stolerman等人，1999；Fattore等人，2002)、安非他明(Cossu等人，2001)以及γ-羟丁酸(Martellota等人，1998)的自我施用。在本试验中使用宽范围的尼古丁剂量，这是因为在所使用的DBA/2J小鼠中尚不确定可能的自我施用尼古丁剂量范围，并且使用宽范围的尼古丁剂量可允许MPEP预处理后尼古丁剂量-反应曲线的较大移位。尽管从只使用一种单位剂量的自我施用药物的试验只能得出有限结论，但仍然在广泛的大鼠自我施用试验的上下文中及在这些试验之外提供了本小鼠试验数据。尽管先前显示物理应力(即足部冲击)不影响使用本程序的吗啡自我施用(Kuzmin等人，1996)，但小鼠试验程序中所使用的局部管制可增加药物自我施用行为(Piazza等人，1990；Shaham等人，1993；Ramsey和VanRees，1993)。与小鼠技术相比，在本试验中大鼠试验所采用的方法学检查了两种不同单位剂量的尼古丁的自我施用行为，并且检查了尼古丁自我施用的维持而不是习得。此外，大鼠试验包括两种食物所维持的强化程式，一种程式(FR5 TO20sec)与用于尼古丁自我施用工作的程式相同，另一程式(FR5 TO210sec)用于使对尼古丁与对食物的反应水平均衡。就小鼠试验所获得的结果而言，如R标准所测定，MPEP显示显著降低了0.048μg/注射尼古丁剂量的自我施用。相反，尽管存在MPEP对总尼古丁摄入有影响的趋势，但其并不显著。尽管如此，对于0.048μg/注射尼古丁剂量下的原始鼻子伸探数据的两因素ANOVA清楚地显示，MPEP预处理对主动及被动小鼠有不同影响，主动小鼠显示在MPEP施用后鼻子伸探率降低。总之，尽管获自本试验中小鼠试验的数据在单独考虑时只提供了MPEP对尼古丁自我施用影响的有限证据，但其确实为大鼠试验中所提供的完整和有说服力数据提供了趋同证据。
啮齿类动物中MPEP对尼古丁自我施用的影响与先前于小鼠中所见对可卡因自我施用的影响相一致(Chiamulera等人，2001)。其显示，在任何于野生型对照小鼠中有效的剂量下，缺失mGluR5的突变小鼠均不能习得可卡因自我施用，不过食物所维持的反应则不受影响。mGluR5缺失的影响通过于野生型小鼠中施用MPEP得到了证实，后者显示可剂量依赖性地降低可卡因自我施用，同时不影响食物所维持的反应。有趣的是，作者证实在突变型及野生型小鼠中施用可卡因导致NAcc中多巴胺水平的相似升高，这可能表明单独增加中脑多巴胺水平不足以维持可卡因自我施用。近来的发现也支持此假说，其表明多巴胺(D2)受体剔除小鼠可自我施用可卡因(Caine等人，2002)，同时多巴胺(D1)受体剔除小鼠习得可卡因诱导的条件性位置偏好(Miner等人，1995)。然而，尽管mGluR剔除小鼠与野生型小鼠相比，NAcc多巴胺水平的绝对水平没有差异，但其NAcc多巴胺水平上升至这些水平所经时间却有明显差异。可能就是这种差异导致所观察到的野生型小鼠和纯合mGluR5缺失突变小鼠之间可卡因自我施用和可卡因所诱导的运动过多的差异。
关于急性尼古丁的奖赏效应，近期的一项试验(Harrison等人，2002)研究了MPEP施用对脑部奖赏刺激程序中所测定的尼古丁奖赏的影响。尽管单独的MPEP提高了脑部奖赏阈值，但MPEP施用对0.25mg/kg尼古丁的降低奖赏作用没有影响(Harrison等人，2002)。与重复、静脉内递送的自我施用的0.03或0.01mg/kg/注射的尼古丁的作用相比，结果的差异可归于在先前试验中(由试验者)施用的高的多的剂量(0.125和0.25mg/kg i.p.)的尼古丁。重要的是，经外侧下丘脑自我刺激和静脉尼古丁自我施用的神经生物基础可能完全不同(Harrison等人，2002)，可能就是这些差异导致了两次试验中MPEP的不同作用。
许多试验已经表明mGluR在调节纹状体和NAcc中多巴胺神经传递中的作用，通常，组ImGluR(mGluR5和mGluR1)被认为涉及于调节突触后反应(Schoepp，2001)。有趣的是，最近发现，伏隔内施用组ImGluR拮抗剂可阻断D-1受体激动剂的运动激活效应(David和Abraini 2001)。如上文所说明，先前已显示mGluR5大量集中于NAcc中，在施用尼古丁后，此处可见细胞外多巴胺水平的显著升高。另外，小鼠中mGluR5的缺失导致可卡因自我施用和可卡因所诱导的活动过度的缺失，同时可卡因所诱导的NAcc多巴胺增加相对没有变化(Chiamulera等人2001)。连同表明MPEP对尼古丁自我施用影响的本发现一起考虑，一种解释就是mGluR5在对药物所诱导的Nacc中多巴胺释放的突触后反应中起着调节作用，因而可降低尼古丁自我施用。或者，假设谷氨酸在介导尼古丁(Watkins等人2000)和可卡因(Zhang等人2001)的奖赏效应中起着一定作用，那么在调节神经兴奋剂的奖赏效应中，多巴胺可能起着较通常所假设的而言较不关键的作用。
MPEP的抗焦虑作用可能与其对尼古丁和可卡因自我施用的影响有关。尽管于较低剂量时，尼古丁已显示具有抗焦虑性(File等人，1998；Szyndler等人，2001)，但在较高剂量时，尼古丁可产生焦虑症状(File等人1998；Irvine等人2001)。施用安非他明、可卡因以及尼古丁均于实验动物中增加了应激激素的血浆水平(参见Sarnyai等人2001)。已假设，大鼠中所观察到的长期自我施用尼古丁的焦虑产生效应可在维持尼古丁自我施用中起着一定作用(Irvine等人2001)。使用抗焦虑药苯并二氮杂类化合物进行预处理于大鼠中选择性降低了可卡因所维持的反应，而不影响食物所维持的行为(Goeders等人1989；1993；Goeders 1997)。先前的研究已经表明了MPEP于啮齿类动物中的类似抗焦虑药作用(Spooren等人2000b；Tatarczynska等人2001)。因此很可能MPEP的抗焦虑作用可阻断尼古丁所诱导的轻度升高的焦虑程度，并因而阻断其部分奖赏效应。
总之，本试验表明，MPEP预处理于大鼠及未经药物处理的小鼠中显著降低了尼古丁自我施用，对食物所维持的反应没有影响，亦没有任何运动抑制活性。此处假设，施用MPEP于中脑缘回路末段中调节尼古丁所诱导的多巴胺水平增加的突触后反应。然而，鉴于本试验和现有对于mGluR5的精确定位和功能的知识有限，故不能排除MPEP于NAcc以外的位点和/或通过类似抗焦虑药作用的作用方式。本试验结果可能为戒烟以及更广泛的抗药物滥用指出了一个新的治疗靶点。
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实施例3同时阻断代谢型谷氨酸5和代谢型谷氨酸2/3受体在治疗药物成瘾和抑郁症中的效用的补充证据本实施例阐明了阻断mGlu5和/或mGlu2/3受体处的谷氨酸能传递可降低可卡因和尼古丁的强化性质(本试验数据；Paterson等人2003)，并且还指出，同时阻断这些受体对抑制药物使用行为具有加合效应。大部分滥用药物已经显示可增加遍及脑部奖赏回路的兴奋性谷氨酸能传递(Kalivas和Duffy，1998；Mansvelder和McGehee，2000；Ungless等人，2001；Wolf，2003)。尽管兴奋性谷氨酸能传递在调节脑部奖赏回路中的精确作用尚不清楚，但兴奋性谷氨酸能传递的增加可对成瘾性药物的强化性质起一定作用。确实，阻断谷氨酸能传递已显示可降低可卡因及其他滥用药物的奖赏作用(Harris和Aston-Jones，2003；Laviolette和van der Kooy，2003)。
Chiamulera及其同事(2001)证实，mGlu5受体基因缺失小鼠不会习得可卡因自我施用行为，基于这一观察结果，近来人们已对代谢型谷氨酸5受体在调节成瘾性药物的强化效应中的作用有所关注。不过，在这些小鼠中，食物自我施用的习得却不受影响，这证明在这些小鼠中，可卡因消耗量的降低并非继发于学习过程中的缺陷(Chiamulera等人，2001)。与以上一致，选择性mGlu5受体拮抗剂MPEP于野生型对照小鼠中降低了可卡因自我施用(Chiamulera等人，2001)。类似地，如以上实施例2所示，MPEP于大鼠和小鼠中均可降低尼古丁自我施用，并可削弱可卡因和吗啡所诱导的条件性位置偏好(McGeehan和Olive，2003；Popik和Wrobel，2002)。新近，阻断代谢型谷氨酸2/3(mGlu2/3)受体已显示可削弱许多滥用药物的行为性作用(David和Abrain，2003)。另外，如实施例1中所阐明，mGlu2/3受体拮抗剂LY341495可削弱于经受自发性尼古丁戒断大鼠中所观察到的、通过ICSS奖赏阈值提高所测定的脑部奖赏功能的缺陷(抑郁症样症状)。总体而言，这些数据提示，mGlu5和mGlu2/3受体在调节多种滥用药物、包括可卡因和尼古丁的行为性作用和药物成瘾和非药物诱导性抑郁症中的抑郁症状中起着重要作用。
急性可卡因施用已显示可降低颅内自我刺激(ICSS)阈值(Esposito等人，1978；Frank等人，1988；Kenny等人，2003a；Kenny等人，2003b；Kokkinidis和McCarter，1990；Markou和Koob，1992)。因为ICSS可直接激活脑部奖赏回路(Olds和Millner，1954)，因而ICSS阈值被认为可提供脑部奖赏功能的操作量度。因此，可卡因施用后所观察到的ICSS阈值降低可反映脑部奖赏功能的增加，这极可能构成了可卡因欣快作用的基础。这种与使用可卡因相关的脑部奖赏功能增加被认为与可卡因自我施用行为的建立和维持有关(Kenny等人，2003b；Stewart等人，1984)。
本试验的第一目标是研究MPEP在大鼠中对尼古丁自我施用的影响，以及在具有两种不同的可卡因自我施用每日获取程式(1和6小时)的大鼠中对可卡因自我施用的影响。其次，通过检查MPEP是否降低了渐进比例强化程式下的可卡因或尼古丁的反应，我们研究了是否MPEP可降低大鼠获得可卡因或尼古丁的“动机”。然后通过检查是否MPEP可削弱急性可卡因施用对ICSS阈值的降低作用，我们又研究了是否MPEP可降低与可卡因使用相关的正性情感状态。下一步，我们检查了mGlu2/3受体拮抗剂LY34159在大鼠中对尼古丁自我施用的影响，其先前显示可削弱尼古丁戒断(Kenny等人，2003c)。最后，通过联合MPEP和LY341495，我们检查了是否同时阻断mGlu5和mGlu2/3对尼古丁自我施用行为具有加合的抑制作用。
材料和方法试验对象试验对象为在到达实验室时体重为300-320g的Wistar大鼠。大鼠获自Charles River实验室(Raleigh，NC)，并以每笼两或三只大鼠成组供养，食物和水随意获取。动物供养于12小时明/暗循环下(10:00am关灯)的温控动物饲养室中。在每种情况下，均于明/暗循环的黑暗相中对动物进行检测。所有动物均依照关于动物管理的国立卫生研究所指南进行处理。动物设施及试验方案均满足实验动物管理评估及认证协会的要求。
药物盐酸可卡因和(-)尼古丁酒石酸氢盐购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO。根据本技术领域中所熟知的程序合成2-甲基-6-[苯基乙炔基]-吡啶。LY341495获自Tocris。在每次临施用前制备药物。对于全身性可卡因施用，将可卡因溶于无菌0.9％(w/v)盐水中，在ICSS试验前10分钟以1ml/kg体重的容量腹膜内(i.p.)注射施用。对于全身性MPEP施用，将MPEP溶于无菌水中，并在ICSS或自我施用前30分钟以1ml/kg体重的容量通过i.p.注射施用。对于全身性LY341495施用，将LY341495溶于无菌盐水中，在自我施用前30分钟以3ml/kg体重的容量通过i.p.注射施用。
装置于十六个有机玻璃操作室(25×31×24cm)(Med Associates，St.Albans，VT)中进行颅内自我刺激训练和检测。操作室的地面由相隔1.25cm的平行铝棒构建。其一面室壁中含有一个金属操纵轮，转动四分之一周需用0.2N的力。该轮(宽5cm)伸出室壁约3cm。每一检测室均被包围在隔光隔音的容器(62×63×43cm)中。通过恒定的电流刺激器(Stimtech型号1200；SanDiego Instruments，San Diego，CA)进行颅内刺激。通过连接于固定在操作室上方的金触点旋转换向器上的柔软的双极导联(Plastics One，Roanoke，VA)将试验对象连至刺激回路。刺激参数、数据收集以及所有的检测期功能均通过微型计算机进行控制。
在16个隔音有机玻璃操作室(29×24×19.5cm)中进行可卡因和尼古丁自我施用。每一室中均有一面室壁含有一金属可收缩杠杆，其固定于地面上方2.5cm，需要0.1N的力来按压。塑料旋转接头连接动物和注射器，通过释放药物的Razel泵进行操纵。通过IBM兼容型微型计算机来控制数据收集和所有的编程功能。
手术通过吸入氧气中1-3％的异氟烷将使用静脉导管处理的大鼠麻醉，并使用硅橡胶导管对大鼠进行处理，如前所述将其置入颈静脉(Caine等人，1993)。然后将导管经皮下连通至固定于动物背部的聚乙烯组件。此组件由一导管(Plastic One Co.，Roanoke VA)组成，该导管附着于一块4cm2的具有环氧树脂的聚乙烯网。将此聚乙烯网置于动物背部的皮肤下。手术后，每天使用0.15ml含有肝素化盐水(30USP单位/ml)和Timentin(100mg/ml；SmithKline Beecham Pharmaceuticals，费城，Pa.)的无菌抗生素溶液冲洗导管。通过吸入氧气中1-3％的异氟烷将使用ISCC电极处理的大鼠麻醉，并将其置于立体定位架中(KopfInstruments，Tujunga，CA)。将切牙棒调整至耳间线上方5mm，并暴露颅骨。依照Pellegrino等人(1979)的图集，将不锈钢双极刺激电极(长11mm)植入后外侧下丘脑(AP距离前囟点-0.5mm；ML±1.7mm；DV距离硬脑膜8.3mm，切牙棒位于耳间线上方5mm)。在颅骨上打四个凹槽以容纳螺丝钉，使用螺丝钉和牙科丙烯酸树脂将电极固定于合适位置。在ICSS训练或自我施用程序前，允许动物手术恢复至少7天。
静脉内可卡因自我施用程序对大鼠(n＝14)进行食物限制，使其体重维持于自由饲养条件下所获得正常体重的85％，然后按照定比5(FR5)强化程式训练其按压一次杠杆以得到45mg饲料颗粒。一旦获得稳定的食物强化反应，即按照FR5强化程式在每天的1小时试验期中对大鼠进行可卡因自我施用检测，检测9天，在试验期中，对杠杆的5次按压反应可导致一次可卡因注射递送(250μg/注射，溶于0.1ml无菌0.9％无菌盐水中；在4秒内递送)，同时也开始一段20秒的暂停(TO)期，暂停期以位于杠杆上方的光信号指示，在暂停期间，对杠杆的按压反应不导致任何结果。由此，使用FR5 TO20sec强化程式。
静脉内尼古丁自我施用程序使用导管置入颈静脉处理后约一周，与上述可卡因类似，于FR5 TO20sec程式下训练大鼠(n＝8)自我施用尼古丁(0.03mg/kg/注射，游离碱)。对活动杠杆的反应可导致经1秒以0.1ml/注射的容量递送尼古丁溶液(Razel Scientific Instruments Inc.，Stamford，Conn.，USA)，而对于非活动杠杆的反应则没有任何结果。当大鼠按压活动杠杆的次数为其按压非活动杠杆次数的两倍以上、每小时试验期最少接受6次注射或90粒饲料颗粒、同时每试验期所获得的强化物数目的变异低于20％时，认为其已经习得稳定的操作性反应。大鼠花费约2周以建立稳定的操作反应率。所有的检测每天进行1小时，每周进行5天。
颅内自我刺激(ICSS)奖赏阈值程序(Markou和Koob，1991，1993)依照Kornetsky和Esposito(1979)的改良离散试验电流阈值程序训练大鼠(n＝9)进行反应。简言之，通过递送非附随性电刺激启动试验。此电强化物的训练持续时间为500ms，由0.1ms的以50-100Hz传输的矩形阴极脉冲组成。对不同动物选择不同的刺激频率，以使得每一试验对象的基线电流强度阈值位于50至200μA的范围内，因而使阈值升高或降低均可被检测到。在试验过程中，该频率保持恒定。在输出非附随性电刺激的7.5秒内，操纵轮子转动四分之一圈，则输出一电刺激，该刺激与启动该试验的非附随性刺激在所有参数方面均相同。在不定的试验间间隔后(7.5-12.5秒，平均10秒)，再输出一非附随性电刺激启动另一次试验。不能在7.5秒内对此非附随性刺激作出反应将导致进入试验间间隔。在试验间间隔中发生反应将延迟12.5秒开始下一次试验。电流水平可于交替下降和上升系列中变化。每一电流强度都进行一套三次试验。电流强度以5μA的幅度变化。在每一试验期中，具有四个交替下降-上升系列。每一系列的阈值被定义为产生“正分”(动物至少对三次试验中的两次作出反应)的两个连续电流强度与产生“负分”(动物未对三次试验中的两次或更多次作出反应)的两个连续电流强度之间的中点。该试验期的总体阈值被定义为四个单独系列阈值的平均值。每一试验期的持续时间为30分钟。开始非附随性刺激与正性反应之间的时间记录为反应潜伏期。每一试验期的反应潜伏期定义为所有发生正性反应的试验的平均反应潜伏期。在确立稳定的ICSS奖赏阈值后，除在检测可卡因对ICSS阈值的降低作用这一时间段中于依照试验设计的时间点对大鼠进行检测外，大鼠均于ICSS程序每天检测一次。
试验3.1MPEP施用对定比强化程式下可卡因自我施用的影响如上所述，在定比(FR)强化程式下于可卡因自我施用范式中训练后，将大鼠分成均衡的两组，使得其在基线条件下可卡因自我注射率没有差异。从第十天起(递增期)，在一组大鼠中将获得可卡因自我施用的时间从1小时增加到6小时/每日试验期(长获得机会或LgA大鼠；n＝7)。先前的研究已经表明，此获得可卡因自我施用的程式可导致每日可卡因消耗量的累进增加或递增(Ahmed和Koob，1997；Ahmed等人2001)。在另一组中(短获得机会或ShA大鼠；n＝7)，获得可卡因自我施用的时间维持于每天试验期1小时。先前的研究已表明，此获得可卡因自我施用的程式可维持稳定的每日可卡因消耗量水平。在经过22天每天1小时(ShA)或6小时(LgA)获得可卡因自我施用后，两组大鼠均接受其首次MPEP注射。依照试验对象组内拉丁方设计，使用MPEP(0、1、3或9mg/kg)对LgA和ShA大鼠进行注射，并于30分钟后开始每日可卡因自我施用期。在拉丁方设计中，每次注射之间允许至少48小时，在此期间，LgA和ShA大鼠进行其每天的可卡因自我施用以确保在下次MPEP施用前其可卡因反应速率回至注射前基线水平。在完成拉丁方设计后，所有大鼠接受MPEP注射(6mg/kg)，并于30分钟后开始每日的可卡因自我施用期。
试验3.2MPEP施用对累进比例强化程式下可卡因和尼古丁自我施用的影响如上所述，在定比强化程式下，动物对活动杠杆作出“固定”次数的反应以获得药物注射。定比(FR)强化程式可为药物是否呈强化性提供重要信息。相反，在累计比例(PR)强化程式下，每次动物对活动杠杆作出反应获得一次药物注射，动物随后为获得下次注射所必须作出反应的次数累进增加。在限制总摄取的同时，通过确定动物愿为获取药物注射所工作的努力程度，该PR程式可允许更好地自累计药物剂量的可能的饱和效果中分离出药物使用的动机(Stafford等人.1998)。这些特征导致对PR程式下相比FR程式下控制觅药行为的因素在理论上具有不同的解释。例如，有些研究人员近期已提出FR程式可衡量药物的愉悦或快感作用(McGregor和Roberts 1995；Mendrek等人.1998)，而PR程式可提供对获取药物的诱因或动机的更好量度(Markou等人，1993)。如上所述，在于FR程式下习得可卡因或尼古丁自我施用后，将大鼠转换至PR强化程式，其中要求如下杠杆按压次序以获得每次随后的尼古丁或可卡因注射5、10、17、24、32、42、56、73、95、124、161、208等。每次PR期前30分钟，使用MPEP(0、1、3或9mg/kg)对大鼠进行注射。所有的PR期持续3小时。在3小时的试验期中，所有试验对象均达到断点。断点定义为在该时期终止前所获得的最高比例；如果该试验对象在一小时内不能博得一次药物注射，则该时期终止。
试验3.3MPEP对可卡因诱导的ICSS阈值降低的影响MPEP在试验3.2中显示可在大鼠和小鼠中于FR下降低尼古丁自我施用。本实施例中的试验(结果如下所述)证实，MPEP可于FR下降低大鼠中可卡因和尼古丁自我施用(对于尼古丁在小鼠中也是如此)，并且可于PR强化程式下在大鼠中降低可卡因和尼古丁的自我施用。MPEP可减少可卡因自我施用行为的一个可能机制是通过降低可卡因的快感作用。可卡因诱导的ICSS阈值降低代表了可卡因快感和欣快作用的一个精确量度。因此，欲检验MPEP可削弱可卡因的快感作用的假说，我们检查了是否MPEP可阻断可卡因诱导的ICSS阈值降低。先前的观察显示，10mg/kg剂量的可卡因可诱导最大幅度的ICSS阈值降低，同时不影响本试验中所使用的ICSS程序中的行为表现(Kenny等人，2002b；Markou和Koob1992)，基于这些观察选择了这些试验中所使用的可卡因剂量(10mg/kg)，并且此剂量也与ShA大鼠在其每天1小时获得可卡因自我施用过程中所消耗的可卡因的量相当。如上所述，使用ICSS电极对大鼠(n-9)进行处理，并于ICSS程序中训练，直至获得稳定阈值(经连续5天，阈值变异≤10％)。为确定是否MPEP可削弱可卡因降低ICSS阈值效应的幅度，于开始ICSS试验期前30分钟依照试验对象组内拉丁方设计使用MPEP(0、3、6或9mg/kg)对大鼠进行注射。然后在20分钟后、开始ICSS试验期前10分钟，所有大鼠再接受盐水注射。在拉丁方设计中，每一注射日之间允许经过72小时，期间，继续评定每日ICSS阈值以确信在下次药物施用前ICSS阈值回至注射前基线水平。在完成拉丁方设计后，在开始ICSS试验期前30分钟，所有大鼠均接受MPEP注射(1mg/kg)，在开始ICSS试验期前10分钟，再接受盐水注射。在该处理方案后，于开始ICSS试验期前30分钟、依照试验对象组内拉丁方设计再一次使用MPEP(0、3、6或9mg/kg)对大鼠进行注射。然后在20分钟后、开始ICSS试验期前10分钟，所有大鼠再接受可卡因注射(10mg/kg)而不是盐水注射。在拉丁方设计中，每一注射日之间允许经过72小时，期间，继续评定每日ICSS阈值以确信在下次药物施用前ICSS阈值回至注射前基线水平。在完成拉丁方设计后，在开始ICSS试验期前30分钟，所有大鼠均接受MPEP注射(1mg/kg)，在开始ICSS试验期前10分钟，再接受可卡因注射(10mg/kg)。
为确定是否MPEP可削弱可卡因降低阈值效应的持续时间，先使用无菌水或MPEP(3mg/kg)对大鼠进行注射，然后于20分钟后，在开始首次ICSS试验期前10分钟再使用盐水或可卡因(10mg/kg)进行注射。大鼠依照试验对象组内拉丁方设计接受所有注射，以使每只大鼠接受四种可能的药物组合(水-盐水；水-可卡因；MPEP-盐水；MPEP-可卡因)。然后在第二次注射(盐水或可卡因)后10、40、70和100分钟评定ICSS阈值。在拉丁方设计中，每一注射日之间允许经过72小时，期间，继续评定每日ICSS阈值以确信在下次药物施用前ICSS阈值回至注射前基线水平。
试验3.4mGluR2/3拮抗剂对定比程式下尼古丁自我施用的影响如前所述，如通过大鼠中自发尼古丁戒断过程中ICSS阈值升高的降低所测得的，组II代谢型谷氨酸受体拮抗剂LY341495显示可削弱尼古丁戒断(Kenny等人，2003c)。为检查是否mGlu2/3受体还在调节尼古丁强化作用中起作用，我们检查了是否LY341495可减少FR强化程式下尼古丁自我施用。如上所述，在于尼古丁自我施用范式中训练后，依照试验对象组内拉丁方设计、使用LY341495(0、0.1、0.5、1、3或5mg/kg)对大鼠进行注射，于30分钟后开始每日尼古丁自我施用试验。在拉丁方设计中，每次注射之间允许最少18小时，期间，大鼠进行每日尼古丁自我施用试验，以确信在下次LY341495施用前，对尼古丁的反应速率回至注射前基线水平。
试验3.5药物组合LY341495和MPEP对FR程式(评定消耗量)和PR程式(评定药物施用动机)下尼古丁自我施用的影响在前面，MPEP显示可在大鼠和小鼠中减少FR程式下尼古丁自我施用(Paterson等人，2003)。本试验证明了(结果如下所述)LY341495类似地减少大鼠中于FR程式下的尼古丁自我施用。因此，我们假设，分别通过MPEP和LY341495同时抑制mGlu5和mGlu2/3受体，可能于大鼠中对尼古丁自我施用具有加合的抑制作用。在这里我们已经显示(结果如下所述)，LY341495(0.5mg/kg)可减少尼古丁自我施用约35％。因此1)我们使用此剂量的LY341495(0.5mg/kg)与先前显示对尼古丁(Paterson等人，2003)或可卡因(此文中所报导的本试验1的结果)自我施用没有影响的一定剂量(1mg/kg)的MPEP的组合对大鼠进行注射，并对FR强化程式下尼古丁自我施用行为进行评定(30分钟预处理)；2)我们也使用经显示在单独施用时对尼古丁自我施用没有影响的一定剂量的LY341495(1mg/kg)与1mg/kgMPEP(此剂量的MPEP也已显示在单独施用时对尼古丁自我施用没有影响)的组合对大鼠进行注射，并评定此药物组合处理对尼古丁自我施用的影响；以及3)最后，我们使用1mg/kg的LY341495和9mg/kg的MPEP(在单独施用时此剂量的MPEP可减少尼古丁自我施用；Paterson等人。2003)的药物组合对大鼠进行注射，并检查其对累进比例强化程式下尼古丁自我施用的影响(30分钟预处理)。
统计分析在可卡因自我施用试验的递增期过程中，通过两因素重复测定方差分析(ANOVA)对首次MPEP注射前23天中，ShA和LgA大鼠的可卡因反应数进行分析。在MPEP处理期过程中，通过将MPEP处理后可卡因反应的数目表示为可卡因反应基线数目的百分数，来计算相对可卡因反应基线数目的变化百分数。对于ICSS试验，在结果部分显示每一试验的平均原始阈值和反应潜伏期(±SEM)。对于所有ICSS试验，通过将药物所影响的原始阈值评分表示为基线阈值的百分数，来计算相对于基线奖赏阈值的变化百分数。基线阈值为首次MPEP注射前三天所获得的平均阈值。对于第一次ICSS试验(MPEP对可卡因诱导的阈值降低的影响)，对基线评分百分数进行两因素重复测定ANOVA分析，以MPEP剂量(1-9mg/kg)和可卡因剂量(0或10mg/kg)作为两个试验对象组内因素。对于第二次ICSS试验(MPEP对可卡因诱导的阈值降低的持续时间的影响)，对基线评分百分数进行三因素重复测定ANOVA分析，以MPEP(0或3mg/kg)、可卡因(0或10mg/kg)以及第二次注射后的时间(10、40、70和100分钟)作为三个试验对象组内因素。对于所有ICSS试验，以与阈值数据同样方式对反应潜伏期数据进行分析。尼古丁反应的基线数为首次LY341495注射前5天尼古丁反应的平均数。在LY341495处理期过程中，通过将LY341495处理后的尼古丁反应数表示为尼古丁反应基线数的百分数，来计算相对于尼古丁反应基线数的变化百分数。累进比例数据表示为所达到的最高比例(即断点)或所获得注射的数目(数据以原始值表示)。在ANOVA中证明有显著统计学作用后，使用Fisher’s LSD检验在平均值间进行post-hoc比较。显著性水平设定于0.05。
结果试验3.1MPEP施用对定比强化程式下可卡因自我施用的影响如图9A中可见，在递增期过程中，与ShA大鼠相比，LgA大鼠中可卡因反应数渐进增加。此效应反映于每日给药机会(1或6小时)的统计学显著主要影响(F(1，21)＝10.96，p＜0.01)、治疗天数的显著主要影响(F(12，252)＝10.96，p＜0.001)以及给药机会×天数的显著相互作用(F(12，252)＝1.69，p＜0.05)。MPEP(1-9mg/kg)可于ShA和LgA大鼠中减少可卡因自我施用(F(4，48)＝9.34，p＜0.001)(图9B)。Post-hoc分析证实，3(p＜0.05)、6(p＜0.01)和9(p＜0.001)mg/kg MPEP于ShA大鼠中显著降低可卡因反应(图9B)。Post-hoc分析还证实，只有最高剂量的MPEP(9mg/kg)于LgA大鼠中显著降低可卡因反应(p＜0.01)(图9B)。不过，不存在剂量×给药机会相互作用(F(12，252)＝0.97，N.S.)。当将ShA和LgA大鼠的可卡因反应折拢(collapse)时，MPEP显著降低可卡因反应(F(4，52)＝9.36，p＜0.001)(图9C)，同时Post-hoc分析也证实，3(p＜0.01)、6(p＜0.01)和9(p＜0.001)mg/kg MPEP可于折拢组中显著降低可卡因反应。
试验3.2MPEP施用对累进比例强化程式下可卡因和尼古丁自我施用的影响以MPEP剂量和强化物作为两个因素的两因素ANOVA揭示了两个因素之间具有显著相互作用影响[F(6，48)＝3.95，p＜.01]、MPEP具有主要作用[F(3，48)＝3.95；p＜.01]以及强化物没有显著的主要作用[F(2，16)＝1.41，p＝0.27]。如图10中可见，MPEP(1-9mg/kg)降低累进比例强化程式下可卡因反应(在总ANOVA中具有显著的相互作用影响后，MPEP在随后单因素ANOVA中具有显著影响F(3，15)＝12.76；p＜.001)和尼古丁反应(在总ANOVA中具有显著的相互作用影响后，MPEP在随后的单因素ANOVA中具有显著影响F(3，18)＝11.28；p＜.001)，而对食物反应没有统计学显著影响(在总ANOVA中具有显著的相互作用影响后，MPEP在随后的单因素ANOVA中对食物反应没有影响F(3，15)＝2.84；p＝0.07)。因为累进比例强化程式可提供动物获取药物“动机”的量度，故这些数据证实，MPEP可降低大鼠获得可卡因或尼古丁的动机，而不会影响其获得食物的动机，因而证实了该影响的特异性。
试验3.3MPEP对可卡因诱导的ICSS阈值降低的影响如图11A中可见，可卡因(10mg/kg)显著降低ICSS阈值(F(1，8)＝98.21；p＜0.001)。相反，MPEP显著提高ICSS阈值(F(4，32)＝8.22，p＜0.001)，同时post-hoc分析证实，6(p＜0.05)和9(p＜0.01)mg/kg MPEP显著提高ICSS阈值。不存在可卡因×MPEP相互作用(F(4，32)＝0.75，N.S.)。基于我们先验假说的进一步分析揭示，与接受载体注射的经可卡因处理的大鼠相比，先前接受MPEP(9mg/kg)的经可卡因处理的大鼠中，ICSS阈值被显著提高(p＜0.05)(图11A)。不过，与经载体预处理的盐水处理大鼠相比，先前接受MPEP(9mg/kg)的尼古丁处理大鼠的ICSS阈值仍显著得低(p＜0.001)。可卡因(10mg/kg)显著降低ICSS反应潜伏期(F(1，8)＝42.13，p＜0.001)(图11B)。相反，MPEP显著增加反应潜伏期(F(4，32)＝2.8，p＜0.05)。进一步的分析证明，只有最高剂量的MPEP(9mg/kg)显著增加反应潜伏期(p＜0.05)(图11B)。其中不存在可卡因×MPEP相互作用(F(4，32)＝2.16，N.S.)。
如图12A中可见，可卡因(10mg/kg)显著降低ICSS阈值(F(1，8)＝62.73，p＜0.001)。此可卡因诱导的ICSS阈值降低为时间依赖性的；可卡因×时间相互作用(F(3，24)＝30.75，p＜0.001)。Post-hoc分析揭示，与使用载体预处理的盐水处理大鼠相比，在可卡因注射后10(p＜0.001)和40(p＜0.001)分钟使用载体预处理的经可卡因处理大鼠中，ICSS阈值被显著降低。MPEP(3mg/kg)在任何时间点均对ICSS阈值没有影响(F(1，8)＝0.002，N.S.)，同时不存在可卡因×MPEP×时间相互作用(F(3，24)＝1.02，N.S.)。Post-hoc分析揭示，与经载体-盐水处理大鼠相比，在可卡因注射后10(p＜0.001)和40(p＜0.001)分钟使用MPEP预处理的经可卡因处理大鼠中，ICSS阈值被显著降低。可卡因显著降低ICSS反应潜伏期(F(1，8)12.65，p＜0.01)(图12B)。此可卡因诱导的反应潜伏期降低也为时间依赖性的；可卡因x时间相互作用(F(3，24)＝6.62，p＜0.01)。Post-hoc分析揭示，与使用载体预处理的盐水处理大鼠相比，在可卡因注射后10(p＜0.001)分钟使用载体预处理的可卡因处理大鼠中，反应潜伏期被显著降低。MPEP(3mg/kg)在任何时间点均对反应潜伏期没有影响(F(1，8)＝2.67，N.S.)，同时不存在可卡因×MPEP×时间相互作用(F(3，24)＝0.14，N.S.)。Post-hoc分析揭示，与经载体-盐水处理大鼠相比，在可卡因注射后10(p＜0.001)分钟使用MPEP预处理的可卡因处理大鼠中，ICSS阈值被显著降低。
试验3.4mGluR2/3拮抗剂对定比程式下尼古丁自我施用的影响如图13中可见，LY341495(0.1-5mg/kg)降低FR程式下尼古丁自我施用(F(5，35)＝3.75，p＜0.01)。Post-hoc分析证明，0.1(p＜0.01)、0.5(p＜0.05)、3(p＜0.01)和5(p＜0.01)mg/kg LY341495显著降低尼古丁反应(图13)。
试验3.5药物组合LY341495和MPEP对FR程式和PR程式下尼古丁自我施用的影响如图14中可见，LY341495(0.5mg/kg)和在实施例2中所示对尼古丁(也可参见Paterson等人，2003)或可卡因自我施用没有影响的一定剂量的MPEP(1mg/kg)的组合，显著降低了尼古丁反应(F(2，17)＝8.6，p＜0.01)。
Post-hoc分析证明，单独的LY341495(0.5mg/kg)(p＜0.05)以及LY341495(0.5mg/kg)和MPEP(1mg/kg)的组合(p＜0.01)显著减少了尼古丁自我施用。LY341495(0.5mg/kg)和MPEP(1mg/kg)的组合较单独的LY341495(0.5mg/kg)更大幅度地减少了尼古丁自我施用，尽管此影响刚好没能达到统计学显著性(p＝0.053)。类似地，一定剂量的LY341495(1mg/kg)与无行为活性剂量的MPEP(1mg/kg)的组合也减少了尼古丁自我施用(图15)。最后，另外的数据(图16)表明，9mg/kg MPEP与1mg/kg LY341494的组合显著降低了累进比例强化程式下尼古丁自我施用。
讨论来自本实验室的近期观察已经显示，重复、延长的(6小时)获得可卡因自我施用导致LgA大鼠中每日可卡因消耗量的逐步增加或“递增”(Ahmed和Koob，1998；Ahmed等人，2002)。相反，限制获得可卡因自我施用(1小时)的ShA大鼠维持稳定模式的每日可卡因消耗量。本数据证明，在大鼠中与ShA和LgA大鼠中，mGlu5受体拮抗剂MPEP类似地降低可卡因消耗量，这提示阻断mGluR5受体于药物依赖性个体及非药物依赖性个体中均可降低药物使用。在前面，MPEP已显示于野生型对照小鼠中减少可卡因自我施用(Chiamulera等人，2001)，而且，mGlu5缺失的遗传修饰小鼠未能习得可卡因自我施用行为，即使在这些小鼠中食物强化反应未受改变(Chiamulera等人，2001)。类似地，以上实施例2阐明MPEP于大鼠和小鼠中均降低尼古丁自我施用。因此，此实施例中的数据与mGlu5受体于药物依赖性和非药物依赖性个体中调节可卡因和尼古丁自我施用行为中的重要作用相一致。不过，MPEP于ShA和LgA大鼠中以相似幅度降低可卡因消耗量。因而，LgA大鼠中所观察到的可卡因摄入量的递增不大可能与可卡因自我施用行为的mGlu5受体调节改变有关。
可卡因的快感作用被认为在建立和维持可卡因自我施用行为中起着重要作用(Stewart等人，1984；Kenny等人，2003a)。可卡因诱导的ICSS阈值降低被认为是可卡因快感作用的准确量度。有趣的是，减少可卡因自我施用的MPEP剂量(1-9mg/kg)不能削弱全身性施用可卡因后所观察到的ICSS阈值降低幅度。类似地，MPEP(3mg/kg)不削弱可卡因降低ICSS阈值的持续时间。因为可卡因诱导的ICSS阈值降低是可卡因诱导的脑部奖赏功能易化的准确量度，故而这些观察提示，即使可卡因的快感作用保持不变，MPEP也减少可卡因的消耗量。重要的是应注意到，高剂量的MPEP(6-9mg/kg)单独即可提高ICSS阈值，这提示mGlu5受体可正性调节基线脑部奖赏功能。不过，单独对ICSS阈值没有影响的低剂量MPEP(3mg/kg)却显著减少了可卡因自我施用行为。因此，不大可能MPEP通过降低基线脑部奖赏功能来减少可卡因自我施用行为，并因此诱导反作用的行为状态。总之，此实施例中的数据提示，MPEP通过一种不依赖于可卡因快感作用的机制减少可卡因自我施用(即消耗量)。
对以上观察的一种可能解释为MPEP降低大鼠自我施用可卡因的动机，但不会改变可卡因诱导的脑部奖赏功能增加(即可卡因诱导的欣快感)。为检验此可能性，我们检查了是否MPEP可降低累进比例(PR)强化程式下对可卡因和尼古丁的反应。PR程式提供了动物获得滥用药物“动机”的量度。有趣的是，MPEP于PR强化程式下显著降低可卡因和尼古丁的断点。此观察提示，MPEP可降低大鼠获得可卡因和尼古丁的动机，并因此导致药物消耗量的减少。
下一步，我们检查了是否阻断mGlu2/3受体将类似于阻断mGlu5受体而减少大鼠中尼古丁自我施用。以上实施例1阐明了通过施用mGlu2/3受体拮抗剂LY341495来阻断mGlu2/3受体，于大鼠中削弱了尼古丁戒断的抑郁症样状况。本数据证实，mGlu2/3受体拮抗剂LY341495于大鼠中减少尼古丁消耗量，这提示阻断mGlu2/3受体可降低尼古丁的强化效应。最有趣的是，共同施用对可卡因或尼古丁自我施用没有影响的一定剂量的MPEP(1mg/kg)加强了LY341495(0.5mg/kg或1mg/kg)对尼古丁自我施用的抑制作用。此外，在单独施用时减少可卡因或尼古丁自我施用的9mg/kgMPEP在联合使用1mg/kg LY341495时，也减少了累进比例强化程式下的尼古丁自我施用，并且此效应要强于单独使用任一药物，这清楚证明了这些效应的增效作用。这些观察提示，同时阻断mGlu2/3和mGlu5受体较单独阻断任一受体亚型对于治疗药物成瘾具有更好的功效，并且此mGlu2/3和mGlu5受体的同时阻断同时降低药物消耗量以及参与药物使用行为的动机。
此外，如以上实施例1中所阐明，阻断mGluR2/3受体可逆转尼古丁戒断的情感性抑郁症样状况。因此，于mGlu2和/或mGlu3以及mGlu5受体处带有双重拮抗作用的药学治疗1)可较单独阻断任一受体更大程度地减少滥用药物的消耗量，如尼古丁和可卡因；以及2)逆转药物戒断的情感状况，以及可能的药物依赖性。对药物消耗量及药物戒断的这些作用均有助于增加吸烟者、药物使用者以及滥用者的戒瘾率。最后，3)于mGlu2/3以及mGlu5受体处带有双重拮抗作用的药学治疗也可有效治疗非药物诱导的抑郁症。
实施例3中所引用的参考文献Chiamulera，C.，Epping-J0rdan，M.P.，Zocchi，A.，Marcon，C.，Cottiny，C.，Tacconi，S.，Corsi，M.，Orzi，F.，Conquet，F.，2001，Nat Neurosci，4，873-874。
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实施例4选择性5-羟色胺再摄取抑制剂帕罗西汀联合5-羟色胺(5-HT)1A受体拮抗剂于大鼠中逆转安非他明戒断过程中所观察到的奖赏缺乏本实施例阐明了共同施用5-HT1A受体拮抗剂p-MPPI和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂帕罗西汀可降低安非他明戒断所诱导奖赏缺乏的幅度并缩短其持续时间。
原理奖赏刺激中的“兴趣或乐趣减少”是安非他明戒断的情感症状，同时也是抑郁症的核心症状。此症状的操作性量度是戒断过程中脑部刺激奖赏阈值的提高。资料表明，由共同施用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)氟西汀和5-羟色胺1A受体拮抗剂p-MPPI导致的5-羟色胺神经传递增加，可逆转药物戒断过程中所观察到的奖赏缺乏(Harrison等人，2001，其内容在此全部引入作为参考)。
目的我们进一步检验了这样一种假说，即使用一种较氟西汀更具选择性的SSRI帕罗西汀增加5-羟色胺能神经传递，可缓解安非他明戒断的情感症状。
方法使用离散试验电流阈值自我刺激程序以评定脑部奖赏功能。于无药物戒断动物中评定单独的帕罗西汀和p-MPPI及其组合的效果。我们还评定了单独的帕罗西汀和p-MPPI及其组合对与安非他明戒断相关的奖赏缺乏的影响。
结果在无药物戒断的大鼠中，单独的帕罗西汀或p-MPPI对阈值没有影响，而帕罗西汀和p-MPPI共同施用则提高了阈值。安非他明戒断导致阈值提高。共同施用p-MPPI和帕罗西汀缩短了安非他明戒断诱导的奖赏缺乏的持续时间。
结论增加5-羟色胺能神经传递于无戒断大鼠中可降低脑部奖赏功能，而同样的治疗可逆转与安非他明戒断相关的奖赏缺乏。考虑到与氟西汀相比，帕罗西汀对5-羟色胺转运蛋白更具选择性，这些结果有力地表明，安非他明戒断的情感症状与非药物诱导的抑郁症类似，可能部分通过5-羟色胺能神经传递降低而介导。
在停止施用安非他明后所经受的戒断综合征以情感症状为特征，包括奖赏刺激中的“兴趣或乐趣减少”(American Psychiatric Association 1994；Markou和Kenny 2002)。“兴趣或乐趣减少”的症状同时也是抑郁症的核心症状以及精神分裂症的负性症状(American Psychiatric Association1994)。脑部奖赏阈值升高是此症状的操作性量度，因为其反映了对奖赏电刺激的敏感性降低。在大鼠中，从属于不同药理学类型的滥用药物戒断，如尼古丁(Epping-Jordan等人，1998；Harrison等人，2001)、安非他明(Leith和Barrett 1976；Lin等人，1999；Paterson等人，2000；Harrison等人，2001)、可卡因(Markou和Koob，1991)、吗啡(Schulteis等人，1994)、酒精(Schulteis等人，1995)以及苯环利定(Spielewoy和Markou，2003)，可提高大鼠脑部刺激奖赏阈值。
5-羟色胺能神经传递的降低已经涉及于非药物诱导抑郁症的病因之中。支持这一假说的证据包括于抑郁患者中证实5-羟色胺能抗抑郁治疗有效、脑脊液中5-羟色胺代谢物水平降低、内分泌测定反映5-羟色胺能神经传递降低以及5-羟色胺耗竭后可见抑郁症状恶化(参见综述Caldecott-Hazard等人，1991；Markou等人，1998)。抑郁症治疗中的近期进展表明，共同施用吲哚洛尔可加速选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)抗抑郁作用的延迟发生(Rickels等人，1989；Blier和de Montigny，1999；Bordet等人，1998；Zanardi等人，1998；McAskill等人，1998)。现已假设，SSRI抗抑郁作用的加速可能是通过吲哚洛尔的5-HT1A受体拮抗剂作用，尽管此药通过5-HT1A、5-HT1B和-肾上腺素能受体拮抗作用(Assie和Koek 1996；Bourin等人，1998；Gobert和Millan 1999)以及-肾上腺素能受体部分激动作用(Clifford等人，1998；Gobert和Millan 1999；Pauwels和Palmier 1994)而具有广泛效果。体内微透析工作证实，急性共同施用5-HT1A受体拮抗剂与SSRI可迅速提高前脑5-羟色胺透析水平，超过急性施用单独的SSRI治疗后所见到的水平(Auerbach和Hiorth 1995；Hiorth 1993；Kreiss和Lucki 1995；Artigas等人1996；Blier和de Montigny1994；也可参见Cremers等人，2000)。
我们近来报道了共同施用5-HT1A受体拮抗剂4-(2’-甲氧基-苯基)-1-[2’-(n-(2”-吡啶基)-p-碘苯甲酰氨基)-乙基-哌嗪(p-MPPI)(Kung等人，1994)以及SSRI氟西汀(Wong等人，1995)，可逆转尼古丁或安非他明戒断过程中所观察到的奖赏缺乏(即奖赏提高)，同时不影响尼古丁戒断的体征(Harrison等人，2001)。这些数据表明，增强5-羟色胺能神经传递可选择性缓解药物戒断的情感症状。此外，上述结果以及一套相关研究证实，5-羟色胺能处理对脑部奖赏机制的影响依赖于试验对象的快乐状态(Harrison等人，2001；Harrison和Markou 2001)。
帕罗西汀是一种苯基哌啶化合物，其作为化学和药动学上独特的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，并且在抑制5-羟色胺再摄取方面较其他SSRI如氟西汀、舍曲林、氯米帕明以及氟伏沙明更具选择性和有效性(Tulloch和Johnson 1992)。SSRI经假设是通过增强5-羟色胺能传递而缓解抑郁症的症状(Tignol 1993；Bourin等人，2001)。不过，SSRI如氟西汀对去甲肾上腺素转运蛋白也发挥作用，去甲肾上腺素为抑郁症中所涉及的另一递质系统(Caldecott-Hazard等人，1991；Markou等人，1998)。因此，本研究的目的是通过证实更具选择性且在化学上独特的SSRI帕罗西汀也可缓解药物戒断的情感方面症状来扩展先前我们有关氟西汀的发现，并因而进一步证实5-羟色胺能(神经传递)对这些效应起着一定作用。
总之，基于以下证据1)使用5-HT1A受体拮抗剂预处理可增强经帕罗西汀施用所诱导的前脑5-羟色胺水平升高(Romero等人，1996)；2)共同施用吲哚洛尔及帕罗西汀可于人体中加速帕罗西汀的抗抑郁效果的产生(Bordet等人，1998；Zanardi等人，1998)，以及3)我们先前关于氟西汀联合5-HT1A受体拮抗剂可逆转安非他明戒断的发现，此处假设认为，共同施用5-HT1A受体拮抗剂p-MPPI和帕罗西汀可于大鼠中缓解安非他明戒断诱导的奖赏缺乏。因此，本系列试验评定了1)帕罗西汀对基线条件下脑部奖赏阈值的影响；2)p-MPPI以及共同施用的p-MPPI+帕罗西汀对基线条件下脑部奖赏阈值的影响；3)这些药物治疗对安非他明戒断诱导的奖赏缺乏的影响。
材料和方法试验对象雄性Wistar大鼠(Charles River，Hollister，CA)(试验开始时为300-320g)在12小时明/暗循环下成对供养于温度和湿度可控的环境中。食物和水随意获取。每一试验使用不同组的试验对象。所有试验对象均依照国立卫生研究所“实验动物管理和使用指南”进行处理。动物设施及试验方案均满足实验动物管理评估及认证协会的要求。除非由于行为参数时间过程评定而使试验设计另有说明，否则大部分行为检测均于试验对象的明/暗循环的明亮阶段进行。
装置试验装置由16个有机玻璃操作室组成(30.5×30×17cm)(Med AssociatesInc.，St.Albans，VT)，这些操作室被埋放于隔音盒中(San DiegoInstruments，San Diego，CA)。每一操作室含有一不锈钢栅格地板及一个位于室壁上的金属操纵轮，操纵轮转动四分之一周需要0.2N的力。金触点旋转换向器及双极导联将动物和刺激回路相连(Plastics One，Roanoke，VA)。通过恒定的电流刺激器施用脑部刺激(Stimtek 1200，San DiegoInstru ments，San Diego，CA)。
手术步骤在氟烷麻醉下(1-1.5％氟烷/氧气混合物)，将11mm长的不锈钢双极电极置入大鼠后外侧下丘脑(AP距离前囟点-0.5mm；L±1.7mm；DV距离硬脑膜-8.3mm)，同时将切牙棒置于耳间线上方5mm处(Pellegrino等人，1979)。在进行任何行为检测前，允许动物手术恢复至少七天。将一半电极置于右脑半球，另一半电极置于左脑半球以平衡可能的脑部不对称。
药物将盐酸帕罗西汀(通常由SmithKline Beecham，Worthing，West Sussex，U.K.提供)溶于含有几滴聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80)(Sigma，St.Louis，MO)的盐水中，并使用0.05M氢氧化钠将其pH调至约6.5。以4ml/kg的容量腹膜内施用帕罗西汀。将4-(2’-甲氧基-苯基)-1-[2’-(n-(2”-吡啶基)-p-碘苯甲酰氨基)-乙基-哌嗪盐酸盐(p-MPPD(Research Biochemicals Inc.，Natick，MA)溶于无菌水中，并于热水浴中超声10至20分钟，然后使用0.1M氢氧化钠将其pH调至约5.2。以1ml/kg的容量皮下施用p-MPPI。将d-硫酸安非他明(获自国立滥用药物研究所，Bethesda，MD)溶于盐水中，并以1ml/kg的容量腹膜内施用。
颅内自我刺激行为程序ICSS离散试验电流阈值程序是最初由Kornetsky和其同事所开发试验程序(Kornetsky和Esposito，1979)的改进版(详情请参见Markou和Koob 1992；Harrison和Markou 2001)。最初，按照定比1强化程式训练试验对象转动操纵轮。电强化物的训练持续时间为500msec，并由以100Hz频率释放的0.1ms矩形阴极脉冲组成。根据每一动物调节所释放的电流强度，并使其典型位于100至200μA的范围中。在成功熟悉这一步骤后(在不到20分钟内，两期各100次强化)，按照离散试验电流阈值程序逐步训练大鼠。
在每一试验开始时，大鼠接受一次非附随性电刺激。在接下来7.5秒的有限同步期(limited hold)中，如果试验对象通过转动操纵轮四分之一周作出反应(正性反应)，则其接受与先前非附随性刺激相同的第二次附随性刺激。在紧随正性反应后的2秒期中，其他的反应记为额外反应，但这些反应不产生结果。如果在7.5秒的有限同步期中没有反应，则记为负性反应。有限同步期之后的试验间间隔(ITI)的平均持续时间为10秒(7.5秒至12.5秒)。在ITI期间发生的反应记为暂停反应，其导致下次试验延迟另外12.5秒开始。根据经典限度心理物理学方法改变刺激强度。试验对象接受自下降系列开始的四次交替的上升和下降系列电流强度。在每一系列中，每组试验间刺激强度以5μA的幅度变化(每组3次试验)。在于上述程序中训练后，对大鼠进行检测直至其获得稳定的基线阈值(在5天内，±10％)。只有在行为表现稳定后方可开始药物检测，这通常发生于两至三周的每日基线检测后。每一检测期通常持续30分钟，并为行为评定提供两个因变量
阈值每一下降系列的电流阈值定义为成功完成一组试验(三次试验的两次或多次试验中产生正性反应)和动物未能对三次试验中的两次或多次试验作出正性反应的两组连续试验中的第一组试验的刺激强度之间的刺激强度。在上升系列过程中，阈值定义为相反的情形。因此，在每一试验期过程中，记录了四个电流阈值，取这些值的平均值作为每一试验对象每一检测试验期的电流阈值。
反应潜伏期非附随性刺激开始和正性反应之间的时间记为反应潜伏期。每一检测试验期的反应潜伏期定义为所有发生正性反应试验的平均反应潜伏期。
实施例4.1帕罗西汀对脑部刺激奖赏的影响在检测试验期前120分钟，依照试验对象组内拉丁方设计施用SSRI帕罗西汀(0、1.25、2.5、5、10mg/kg；n＝13)，每次药物注射之间至少相隔7天，以确保在进行下一次药物注射前回至基线水平。
实施例4.2p-MPPI及p-MPPI+帕罗西汀的组合对脑部刺激奖赏的影响使用析因试验设计评定p-MPPI单独以及与两种剂量帕罗西汀的组合对脑部刺激奖赏的影响。p-MPPI的剂量(0、1、3、10mg/kg)为试验对象组内因素，帕罗西汀的剂量(0、1.25或5mg/kg；n分别＝9、11和14)为试验对象组间因素。于检测前135分钟施用p-MPPI，于检测前120分钟施用帕罗西汀。在施用帕罗西汀时，每次药物注射之间至少相隔7天；在单独施用p-MPPI时，每次药物注射之间至少相隔3天，以确保在进行下一次药物检测前回至基线阈值水平。
实施例4.3帕罗西汀、p-MPPI以及p-MPPI+帕罗西汀的组合对安非他明戒断过程中奖赏缺乏的影响所使用的安非他明施用方案为Leith和Barrett(1976)所用方案的改进型，与Lin等人(1999)和Harrison等人(2001)所用方案相同。d-硫酸安非他明以上升剂量方案腹膜内施用，每天三次(6:00 A.M.、12:00 P.M.、6:00P.M.)，持续四天，从1mg/kg开始并稳定于5mg/kg(即1、2、3、4、5、5、5、5、5、5、5、5mg/kg；总剂量＝50mg/kg；n＝46；4试验组，n＝11-12/组)。另一组大鼠(n＝43；4试验组，n＝10-12/组)于相同时间点注射盐水。在此长期药物施用阶段中，在每天首次注射安非他明或盐水前(即5:30A.M.)，每天测量体重、颅内自我刺激奖赏阈值以及反应潜伏期。然后在末次注射安非他明或盐水后12、36、42、60、84、108、132和156小时测定颅内自我刺激奖赏阈值和反应潜伏期。基于动物在末次注射安非他明或盐水后12小时期间的行为表现，将试验对象分为各治疗组以使各组之间戒断对阈值提高的最初影响相同。在末次注射安非他明或盐水后的12、36、60、84、108、132和156小时测量体重。在36小时的检测试验期前急性施用载体、p-MPPI(3mg/kg)、帕罗西汀(1.25mg/kg)或p-MPPI(3mg/kg)+帕罗西汀(1.25mg/kg)。此时间点的选择是基于在先前安非他明戒断过程中所观察到的阈值提高的时间过程(Lin等人，1999；Paterson等人，2000；Harrison等人，2001)。帕罗西汀和p-MPPI剂量的选择是基于试验1和试验2的结果。在检测前135分钟施用p-MPPI，在检测前120分钟施用帕罗西汀。
数据分析在实施例4.1和4.2中，奖赏阈值和反应潜伏期表示为每一药物处理前三天中所评定的平均基线阈值的百分数。使用单因素重复测定方差分析(ANOVA)及线性回归分析对实施例4.1数据进行分析。使用两因素混合因素ANOVA对实施例4.2数据进行分析，以p-MPPI的剂量作为试验对象组内因素，以帕罗西汀的剂量作为试验对象组间因素。由于先前对p-MPPI+帕罗西汀的药物组合可提高奖赏阈值这一假说已被有力证实(Harrison和Markou 2001)，故使用线性回归分析对每一剂量-反应曲线进行进一步的分析(Hinkle等人，1998)。在实施例4.3中，所有的奖赏阈值和反应潜伏期数据均以首次注射安非他明或盐水临进行前五天中的平均基线值的百分数表示。体重数据以首次注射安非他明或盐水临进行前体重的百分数表示。使用两因素混合因素ANOVA对长期药物处理过程中所收集的数据进行分析。试验对象组内因素为治疗天数，试验对象组间因素为长期药物处理(盐水或安非他明)。使用三因素混合因素ANOVA对安非他明(或盐水)戒断过程中所收集的数据进行分析。试验对象组内因素为安非他明或盐水处理后的时间，两个试验对象组间因素为长期药物处理(安非他明或盐水)和戒断过程中所施用的急性药物处理。有统计学显著的相互作用后再继以post-hoc Newman-Keuls检验。显著性水平设定于p＜0.05。所有统计分析均使用BMDP统计软件包进行(BMDP Statistical Software Inc.，CA)。
结果基线阈值和反应潜伏期使用单因素ANOVA对实施例4.1和实施例4.2的基线数据进行分析，以评定基线行为表现的可能偏离。在任意试验中，均未发现阈值或反应潜伏期有显著性差异。实施例4.1平均阈值范围110.62-123.52μA；平均反应潜伏期范围3.17-3.34秒。实施例4.2p-MPPI+载体平均阈值范围110.29-113.73μA；平均反应潜伏期范围3.15-3.26秒；p-MPPI+帕罗西汀(1.25mg/kg)平均阈值范围130.22-132.28μA；平均反应潜伏期范围3.25-3.27秒；p-MPPI+帕罗西汀(5mg/kg)平均阈值范围129.19-134.39μA；平均反应潜伏期范围3.29-3.37秒。实施例4.3被分为盐水“戒断”组的试验对象(n＝43)[平均阈值±SEM139.18±5.46μA；平均反应潜伏期±SEM3.46±0.06秒；平均体重±SEM508.83±7.40g]和被分为安非他明戒断组的试验对象(n＝46)[平均阈值±SEM133.17±4.97μA；平均反应潜伏期±SEM3.41±0.06秒；平均体重±SEM513.99±7.13g]的平均基线阈值、反应潜伏期及体重之间均没有显著统计学差异。基于在末次注射安非他明或盐水后的12小时期间动物的行为表现，将动物分为各治疗组，以使各组间戒断对阈值提高的最初影响相同。
实施例4.1帕罗西汀对脑部刺激奖赏的影响在本试验所施用的剂量下，帕罗西汀对阈值[F(4，48)＝1.77，n.s.]或反应潜伏期[F(4，48)＝2.16，n.s.]均没有显著统计学影响(Figures 17A和17B)。线性回归分析并不显著(p＞.05)。
实施例4.2p-MPPI及p-MPPI+帕罗西汀的组合对脑部刺激奖赏的影响阈值数据分析揭示了帕罗西汀的主要影响[F(2，31)＝22.22，p＜0.01]以及p-MPPI的主要影响[F(3，93)＝5.65，p＜0.05]，但两种药物之间没有显著的相互作用[F(6，93)＝0.33，n.s.]。基于先前关于p-MPPI+氟西汀施用的发现(Harrison和Markou 2001)的先验假说，即施用p-MPPI+帕罗西汀可提高阈值，这允许对这些数据进行进一步的分析。对每一剂量-反应曲线的线性回归分析揭示，单独施用p-MPPI对奖赏阈值没有影响[F(1，5)＝3.748，n.s.]，而p-MPPI和帕罗西汀(1.25mg/kg或5mg/kg)组合施用则以p-MPPI剂量相关方式提高了阈值[分别对于两种不同剂量帕罗西汀而言，F(1，7)＝7.75，p＜0.05及F(1，10)＝7.95，p＜0.05](图18A)。反应潜伏期数据的分析证实，帕罗西汀可增加反应潜伏期[F(2，31)＝9.41，p＜0.01]，而p-MPPI对反应潜伏期没有影响[F(3，93)＝0.17，n.s.]，并且与帕罗西汀对反应潜伏期的影响没有相互作用[F(6，93)＝1.28，n.s](图18B)。
实施例4.3帕罗西汀、p-MPPI以及p-MPPI+帕罗西汀的组合对安非他明戒断过程中奖赏缺乏的影响长期安非他明施用在首次每日注射前即刻进行的检测过程中，与盐水暴露动物的阈值相比，长期施用安非他明(处理4天)可显著提高阈值(前次注射安非他明或盐水后12小时)[F(1，87)＝117.95，p＜0.01]。处理天数×长期药物处理的显著性相互作用分析[F(3，261)＝50.81，p＜0.01]证明，盐水暴露的动物的阈值以与处理持续时间相关的方式得到了提高，在给药第1天(首次注射前，基线)和第2天之间以及给药第2天和第3天之间均观察到显著的提高，但在该药第3天和第4天之间没有观察到提高。在给药第2、3和4天，盐水暴露的动物的阈值显著高于盐水暴露的动物的阈值。在此试验阶段中，盐水暴露大鼠的阈值保持稳定(图19A)。
反应潜伏期数据分析揭示了显著的处理天数×药物处理的相互作用[F(3，261)＝2.82，p＜0.05]。与给药第1天(处理前1天；基线)相比，盐水暴露动物的反应潜伏期在给药第2天要显著降低，而盐水暴露动物的反应潜伏期在处理过程中保持稳定。然而，在长期药物处理过程中的任意时期，盐水暴露大鼠的反应潜伏期均与盐水暴露大鼠没有显著差异(图19B)。
与盐水暴露的对照动物体重相比，长期施用安非他明可显著降低动物体重[F(1，87)＝282.5，p＜0.01]。处理天数×药物处理的显著性相互作用分析[F(3，261)＝209.77，p＜0.01]证明，盐水暴露大鼠的体重以处理持续时间依赖性方式被降低，长期安非他明处理的每一天与前日相比均可观察到体重的明显降低。相比之下，盐水暴露动物的体重在给药第2天和第3天之间显著增加。在给药第2、3、4天，盐水暴露动物的体重显著低于盐水暴露动物的体重(图19C)。
安非他明戒断在末次安非他明注射后，盐水暴露大鼠相对于盐水暴露大鼠显示阈值提高[F(1，81)＝84.88，p＜0.01]。时间×长期处理×急性处理的显著性相互作用分析[F(21，567)＝1.63，p＜0.05]揭示如下。与载体处理的盐水暴露大鼠相比，在36小时时间点前以载体处理的盐水暴露大鼠于戒断第12、36、42、60及84小时显示阈值提高，并于末次注射安非他明后108小时回至基线水平(图20A及20D)。帕罗西汀(图4A及4D)和p-MPPI(图20B及20E)均对盐水暴露动物的阈值没有影响。不过，帕罗西汀(图20D)和p-MPPI(图20E)均可缩短奖赏缺乏的持续时间，如未经药物处理大鼠在安非他明戒断前24小时回至基线奖赏阈值(定义为与载体处理的盐水暴露大鼠无显著统计学差异)所表明。与载体处理的盐水暴露大鼠相比，共同施用p-MPPI+帕罗西汀导致于给药后的36小时时间点阈值的显著提高，同时在60小时时间点阈值显著降低(图20F)。如未经药物处理大鼠于安非他明戒断前48小时回至基线奖赏阈值水平(定义为与载体处理的盐水暴露大鼠没有显著的统计学差异)所表明，此组合处理可缩短奖赏缺乏的持续时间(图20F)。与载体处理的盐水暴露大鼠相比，同样的组合处理于盐水暴露大鼠中没有显著影响(图20C)。不过，与同一组的以后行为表现相比(即84、108、132及156小时时间点；图20C)，在给药后36小时时间点时，存在该处理诱导的阈值提高趋势。
戒断过程中的反应潜伏期分析揭示了显著的时间×急性处理相互作用[F(21，567)＝4.00，p＜0.01]。急性载体或p-MPPI处理对反应潜伏期没有影响。不过，在末次安非他明或盐水注射后36小时，经帕罗西汀以及p-MPPI+帕罗西汀组合处理的动物的反应潜伏期要显著低于经载体或p-MPPI处理的大鼠的反应潜伏期(图21)。
在末次安非他明注射后，安非他明暴露动物相对于盐水暴露大鼠有着更低的体重百分数[F(1，81)＝427.12，p＜0.01；图22]。时间×长期处理×急性处理的显著性相互作用分析[F(18，486)＝1.69，p＜0.05]揭示如下。如末次注射后12小时和132小时时间点之间体重显著增加所表明，在停止长期药物施用后，经载体处理的盐水暴露大鼠和安非他明暴露大鼠的体重均有显著增加(图22A)。单独以p-MPPI处理的安非他明暴露大鼠显示与载体处理大鼠相似的体重增加(图22B)。单独以帕罗西汀处理的安非他明暴露大鼠在戒断过程中无体重增加(图22C)。最感兴趣的是，以药物组合处理的安非他明暴露大鼠较其各自的对照(即以p-MPPI+帕罗西汀急性处理的盐水暴露大鼠)更快地开始体重增加(图22D)。
讨论以所检测的剂量急性施用SSRI帕罗西汀对奖赏阈值或反应潜伏期均没有显著影响(图17A和17B)。不过，在施用1.25mg/kg以上剂量后，可以见到奖赏阈值有轻微的非显著性提高，然而帕罗西汀对反应潜伏期的影响与之较不一致。施用SSRI对奖赏阈值和反应潜伏期产生了少量影响(10％)或没有影响(Harrison和Markou 2001；Harrison等人，2001；Lin等人，1999；Lee和Kornetsky 1998；Katz和Carroll 1977)。这种由SSRI施用诱导的少量奖赏阈值提高可与这些药物对运动行为表现的非特异性作用有关，或与5-羟色胺能神经传递的药理学增强所导致的奖赏降低有关。
在单独施用时，施用5-HT1A受体拮抗剂p-MPPI对脑部奖赏阈值或反应潜伏期没有影响。相比之下，共同施用p-MPPI+帕罗西汀(1.25mg/kg或5mg/kg)(在单独施用时此剂量的帕罗西汀对阈值没有影响)可以以p-MPPI剂量相关方式显著提高阈值。这些药物组合对反应潜伏期没有影响，这表明p-MPPI诱导帕罗西汀对脑部刺激奖赏作用的增强，而不是改变动物进行操作反应的能力。这些数据与先前所报道的在单独施用时以p-MPPI拮抗5-HT1A受体对脑部刺激奖赏没有影响但可增强另一种SSRI氟西汀的降低奖赏作用的报道是一致的(Harrison等人，2001；Harrison和Markou 2001)。共同施用5-HT1A受体拮抗剂和SSRI的降低奖赏作用可归因于p-MPPI诱导增强了帕罗西汀所引发细胞外5-羟色胺增加(Bel和Artigas1993；Blier和de Montigny 1994；Hjorth 1993)。基于这些表明p-MPPI可增强帕罗西汀(1.25mg/kg)对脑部刺激奖赏作用的结果，故单独或与p-MPPI(3mg/kg)组合施用此剂量的帕罗西汀，以尝试缓解安非他明戒断诱导的奖赏缺乏。
在长期药物处理过程中，在首次每日注射安非他明或盐水前测定脑部刺激奖赏阈值(在给药物第2、3和4天；在前天末次注射后12小时进行此检测)。与盐水暴露大鼠相比，在给药第2、3和4天，安非他明暴露动物的奖赏阈值被显著提高。安非他明暴露动物的奖赏阈值以处理持续时间依赖性方式增加，这表明每天此时刻的奖赏阈值测定可允许评定安非他明戒断诱导的奖赏缺乏的累进形成。不过，这些奖赏缺乏形成的累进性是有限的。与药物处理3天后(给药第4天)相比，施用安非他明2天后(给药第3天)奖赏缺乏的幅度没有增加便可以说明这一点(图19A)。此结果与先前所报道的在给以各种不同安非他明施用方案后奖赏阈值的提高幅度有限是一致的(Lin等人，1999；Paterson等人，2000)。与那些盐水对照动物相比，长期施用安非他明对反应潜伏期没有影响，这表明奖赏阈值的提高是由于对奖赏的特殊作用而并非与动物进行操作反应的能力改变有关。
长期施用安非他明导致体重的处理持续时间依赖性降低。在每天安非他明处理后观察到体重的累进降低。相反，在此试验期过程中使用盐水长期处理动物的体重增加(参见图18C)。这些数据与关于安非他明厌食作用的报道是一致的(Caul等人，1988)。与安非他明施用过程中所观察到的体重降低形成对比，长期施用尼古丁抑制体重增加，导致与盐水暴露对照动物同期体重增加相比，在尼古丁施用阶段体重没有变化(Harrison等人，2001)。尽管本试验没有找寻体重减轻的原因，但据报道，施用安非他明可通过改变食物消耗量、代谢速度以及脂肪代谢来减轻体重(Caul等人，1988；Jones等人，1992)。或者，在本试验长期施用安非他明过程中所观察到的体重减少可能是由于药物所诱导的刻板症所致行为破坏的结果，据报道，多重每天注射安非他明可加重刻板症(Segal等人，1980)。
在安非他明戒断过程中，动物的体重以与盐水暴露对照大鼠相似的速度增加(图22A)。这些数据与以往关于安非他明戒断和盐水对照大鼠体重增加相似的报道相一致(Mucha等人，1990)。急性帕罗西汀处理防止安非他明戒断七天中的体重增加。已经报道，在大鼠中单次高剂量口服施用帕罗西汀(120-300mg/kg)可使体重和食物消耗降低(Ryan等人，2001)。因此，经帕罗西汀处理的动物在安非他明戒断过程中未能获得体重增加可能是帕罗西汀处理的此种厌食作用的结果。相比之下，与非戒断动物及经载体处理的安非他明戒断动物相比，在安非他明戒断过程中共同施用帕罗西汀+p-MPPI导致更早的体重增加。这些数据提示，共同施用5-HT1A受体拮抗剂和帕罗西汀促进了安非他明戒断所诱导的体重减轻的逆转，而单独施用帕罗西汀可防止(七天中)或延缓安非他明戒断过程中的体重增加。
在重复先前发现的过程中，安非他明戒断导致奖赏缺乏，这反映于脑部奖赏阈值相对盐水暴露大鼠及药物处理前基线阈值有所提高(Leith和Barrett 1976；Kokkinidis和Zacharko 1980；Harrison等人，2001；Lin等人，1999；Paterson等人，2000)。急性施用p-MPPI或帕罗西汀对戒断诱导的奖赏缺乏的作用不一致，但是帕罗西汀显著增加了安非他明和盐水暴露大鼠的反应潜伏期。急性施用p-MPPI+帕罗西汀可降低戒断诱导的奖赏缺乏48小时，这表明安非他明戒断动物对奖赏电刺激的敏感性快速恢复。与安非他明戒断所诱导的奖赏缺乏的快速缓解相反，同样的药物组合处理显示在36小时的检测试验期中可增强安非他明戒断所诱导的奖赏缺乏(施用药物组合处理后两小时)，如与经载体处理的安非他明戒断大鼠相比奖赏阈值提高所示。类似地，在36小时的检测过程中，此组合处理导致盐水暴露大鼠中奖赏阈值的少量和短暂提高(即奖赏降低)。
在安非他明和盐水戒断大鼠中，急性帕罗西汀和p-MPPI+帕罗西汀处理均可于药物处理后两小时的检测试验期中降低反应速度。在经帕罗西汀处理的动物中，此反应速度的降低看起来不影响安非他明戒断或盐水对照动物的奖赏阈值。不过，使用药物组合处理的盐水暴露动物的安非他明戒断所诱导奖赏缺乏的明显增强以及奖赏阈值的提高(即奖赏降低)，可能与此药物处理对履行行为任务的非特异性影响有关。尽管先前的发现已经表明，奖赏阈值为奖赏的有效及可靠量度，其受行为操纵的影响最小(Markou和Koob，1992)，但当奖赏阈值提高伴以反应速度降低(及反应潜伏期增加)时，也可能这些结果与行为表现的破坏而非脑部奖赏功能的改变相关。
本数据与另一SSRI氟西汀在相同试验程序中的作用惊人地相似(Harrison等人，2001；Harrison和Markou 2001)。在这两种情况下，急性施用SSRI均可降低安非他明戒断诱导的奖赏阈值提高的持续时间24小时，这种作用通过共同施用5-HT1A受体拮抗剂和SSRI而得到急剧增强。此外，与安非他明戒断过程中所观察到奖赏缺乏的快速缓解相反，任一SSRI和5-HT1A受体拮抗剂的组合均可降低对照动物对奖赏电刺激的敏感性。这些试验之间的一个差别为用于缓解奖赏缺乏的SSRI的剂量。在单独施用时，5mg/kg的氟西汀可降低奖赏缺乏的持续时间，而2.5mg/kg的氟西汀则不然。共同施用p-MPPI和任一剂量的氟西汀均可逆转安非他明戒断过程中所观察到的奖赏缺乏。在本试验中，1.25mg/kg的帕罗西汀产生与5mg/kg的氟西汀相似的结果。不过，在临床实践中，相似剂量的这些药物被开具用于治疗抑郁症，这提示在人类中这两种药物具有相似的抗抑郁症效能(Tignol 1993；Nemeroff 1993；Dunner和Dunbar 1992；Chouinard等人，1999；Wagstaff等人，2002)。本数据表明，帕罗西汀在逆转与安非他明戒断相关的奖赏缺乏方面较氟西汀更有效。这些数据连同以前有关帕罗西汀为较氟西汀更具选择性和有效性的5-羟色胺再摄取抑制剂的报道(Tulloch和Johnson，1992)，提示了5-羟色胺传递降低在介导精神兴奋剂戒断所诱导的奖赏缺乏中起着重要作用。这一假说与表明滥用药物戒断过程中5-羟色胺能传递降低的体内微透析数据(Parsons等人，1995；Weiss等人，1996)是一致的。尽管这些数据没有排除去甲肾上腺素能传递在与精神兴奋剂戒断相关的奖赏缺乏中的作用，但本数据为5-羟色胺能假说提供了有力支持。
在共同施用任一帕罗西汀或氟西汀以及5-HT1A受体拮抗剂后所观察到的对电刺激敏感性的快速恢复可能归因于前脑结构如额叶皮质、海马以及纹状体中的5-羟色胺能传递增加(Bel和Artigas 1993；Dreshfield等人，1996；1997；Invernizzi等人，1994；Gobert和Millan 1999)。这些数据与这样一种假说相一致，即SSRI当与吲哚洛尔联合时其临床抗抑郁作用快速起效(Bordet等人1998；Tome等人1997a；1997b；Zanardi等人1998；也可参见Berman等人1999)是部分归因于吲哚洛尔的5-HT1A受体拮抗剂特性。不过，其他受体如5-HT1B以及□-肾上腺素能受体也可对吲哚洛尔增强SSRI的抗抑郁作用发挥一定作用(参见前言)。
与组合药物处理后对照大鼠的奖赏阈值短时提高(也为典型急性药物处理)相反，这些急性处理可永久性逆转戒断所诱导的奖赏缺乏。在急性帕罗西汀处理后的这一结果可能较氟西汀处理后更令人惊讶。由于氟西汀的代谢产物去甲氟西汀也具有活性，因而其半衰期长，与氟西汀不同，帕罗西汀的半衰期为约24小时(Lemberger等人，1985；Prakash和Foster1999)。因此，这些急性处理在逆转戒断所诱导的奖赏缺乏中的效力可能与戒断所诱导的奖赏缺乏的有限持续时间有关。因而，随着时间的进行，急性药物处理所诱导的5-羟色胺能神经传递增强的下降可能与奖赏阈值随着戒断症状减轻而逐渐回至基线水平相符。此外，这些试验中的奖赏缺乏于健康试验对象中可通过药物处理(安非他明戒断)而短暂诱导。因此，与脑部奖赏系统的长期失衡相关的相似缺陷相比，急性药物处理在逆转健康试验对象中的此奖赏缺乏可能更有效。
在盐水暴露的对照大鼠中，共同施用SSRI和5-HT1A受体拮抗剂后奖赏阈值的提高似乎与通过抗抑郁治疗增强5-羟色胺能传递可在抑郁个体中提高情绪并缓解奖赏缺乏的假说并不一致(本数据；Harrison等人，2001；Harrison和Markou 2001)。这一明显矛盾在本试验数据中此种处理对安非他明戒断大鼠(增加奖赏)和对照大鼠(降低奖赏)脑部奖赏功能的影响之间也可观察到。这些数据提示，5-羟色胺能传递增强对脑部奖赏功能的影响依赖于在处理时试验对象的“快感”状态(Ahmed和Kood 1998；Koob和LeMoal 1997；Harrison等人，2001；Harrison和Markou 2001)。
总之，本数据表明，共同施用5-HT1A受体拮抗剂和帕罗西汀可增强SSRI在“正常”试验对象中的降低脑部刺激奖赏的作用。与共同施用帕罗西汀和5-HT1A受体拮抗剂在“正常”试验对象中所诱导的奖赏降低作用相反，相同的药物组合可缓解在安非他明戒断过程中所观察到的脑部刺激奖赏缺乏(快感缺乏试验对象中奖赏增加)。通过表明另一种具有更高5-羟色胺转运蛋白选择性、在化学和药动学上独特的SSRI可逆转与安非他明戒断相关的奖赏缺乏，这些有关帕罗西汀的数据扩展了先前有关氟西汀的数据。因此，这些数据提高了安非他明戒断诱导的奖赏阈值提高作为抑郁症模型的预测有效性。而且，这些SSRI数据(本数据；Harrison等人，2001)支持这样一种假说，即5-羟色胺能传递降低可能是一种导致安非他明戒断过程中所观察到的“兴趣和乐趣减少”的神经生物学异常(AmericanPsychiatric Association 1994；Markou等人，1998；Harrison等人，2001)。此外，鉴于大量证据表明5-羟色胺能传递降低与非药物诱导抑郁症相关，本数据也可表明药物诱导的抑郁症及非药物诱导抑郁症的神经生物学基础中的相似性(Markou等人，1998；Markou和Kenny 2002；Barr等人，2002)。特别地，5-羟色胺能传递降低可部分解释这两种类型抑郁症中“兴趣或乐趣减少”情感症状。
实施例4中所引用的参考文献Ahmed S，Koob GF(1998)，“中度至过多药物摄入的转变快感设定点的改变”，Science 282298-300。
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实施例5安非布他酮于大鼠中增强脑部奖赏功能并逆转尼古丁戒断的情感和躯体症状此实施例阐明了抗抑郁药安非布他酮可增强脑部奖赏功能并逆转尼古丁戒断的情感和躯体症状。
原理安非布他酮为一种非典型抗抑郁药，同时也是唯一经批准用于戒烟的非尼古丁疗法。其用途已经引起了许多争论，如非尼古丁药剂如何可帮助戒烟。
目的我们评定了安非布他酮在大鼠中对于基线条件下以及继于长期尼古丁施用戒断后的脑部奖赏功能的影响。
方法使用了离散试验颅内自我刺激范式，其可提供电流强度阈值，该阈值是大鼠在基线条件下以及继于长期尼古丁施用(3.16mg/kg/天，通过渗透性迷你泵给药七天)戒断后的奖赏量度。在尼古丁戒断动物中，基于尼古丁戒断征象列表记录体征。
结果安非布他酮(10-60mg/kg)于非戒断试验对象中剂量依赖性地降低了奖赏阈值，这表明奖赏增加。有趣的是，亚有效剂量的安非布他酮(5mg/kg)完全阻断急性尼古丁(0.25mg/kg)的阈值降低作用。长期尼古丁戒断动物显示戒断体征增多以及脑部奖赏阈值升高，这表现出奖赏刺激中“兴趣或乐趣的减少”(即快感缺失)。安非布他酮(10-40mg/kg)均逆转了奖赏缺乏和体征，同时最高剂量(40mg/kg)诱导阈值升高的延长逆转。
结论除减少戒断症状的表达外，安非布他酮可作用于多重水平以改变尼古丁所影响的脑部奖赏回路。首先，与其他抗抑郁药不同，安非布他酮可于非戒断试验对象中提高基线条件下的脑部奖赏功能。第二，在低剂量下，安非布他酮可阻断尼古丁对奖赏的影响。第三，安非布他酮可逆转尼古丁戒断的负性情感症状。这些作用很可能共同作用于介导安非布他酮独特的拒烟特性。
介绍吸烟是世界范围内一个主要的公共健康问题。据估计在发达国家中，与烟草相关的死亡占所有死亡的20％(Peto等人，1992)。累积证据表明，尼古丁是烟草中的一种活性成份，其可导致和维持烟草成瘾(Stolerman和Jarvis 1995)。尽管实际上每年多达40％的吸烟者尝试戒烟，但只有约6％的人能够成功地维持戒烟(Jorenby等人，1999)。因此，极有必要来了解构成尼古丁成瘾的神经生物学机制及目前戒烟方案中所使用的疗法。
有两种类型的药理学疗法已经由美国食品及药物管理局批准用于戒烟(Hughes等人，1999；Glover和Glover 2001)。第一种是尼古丁替换疗法，其允许吸烟者使用其他更安全的尼古丁制剂如嚼口香糖、透皮贴片或者滤气器来取代香烟中的尼古丁(Hughes等人，1999)。第二种疗法为非尼古丁疗法，为非典型抗抑郁药安非布他酮(Hurt等人，1997；Jorenby等人1999；Hays等人2001；Tashkin等人2001；Ahluwalia等人2002；George等人2002)。虽然使用尼古丁替换疗法背后的基本原理是由直觉获得的，但为什么安非布他酮对此适应症有效尚不清楚。第一次认识到安非布他酮的效用是偶然通过观察，即服用此药物的抑郁患者其吸烟减少(Balfour2001)。众多临床试验提供了安非布他酮有效性的可能机理，这些临床试验表明在负性情感和吸烟癖好及戒烟的困难性之间存在着很强的联系(Breslau等人，1992；1998；Lipkus等人，1994；Laje等人，2001)。的确，在吸烟者中，尼古丁依赖性症状与情感抑郁症候学的程度相关(Anda等人，1990；Glassman等人，1990)。不过，近期的试验证实，安非布他酮可同样有效地用于戒烟而不取决于是否有重症抑郁症的既往史，这提示此疗效不依赖于或者说不排斥其抗抑郁特性(Hayford等人，1999)。并且，最初评定安非布他酮于戒烟中疗效的试验也排除了抑郁患者(例如Jorenby等人，1999)。此外，其他抗抑郁药、包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(可能除三环去甲替林外)也显示在非抑郁症吸烟者中降低戒烟率方面相当没有疗效(参见Kotlyar等人，2001)。因此，施用安非布他酮可能具有超出其抗抑郁特性的独特的神经化学及行为结果，从而产生其禁烟效果。
与滥用药物戒断相关的奖赏缺乏可用作测定“兴趣或乐趣减少”症状的动物模型，此症状可表征药物戒断所诱导抑郁症及非药物所诱导抑郁症，具有构建、会聚及预测有效性(Geyer和Markou 1995；Barr等人，2002；Cryan等人，2002；2003)。颅内自我刺激(ICSS)的使用为研究人员提供了一种评定此种停止给药(即药物戒断)后脑部奖赏改变的可靠的行为性读数(Leith和Barrett 1976；Markou和Koob 1991；Epping Jordan等人，1998；Cryan等人，2002；Spielewoy和Markou 2002)。使用此范式，我们先前已经显示，长期施用尼古丁戒断可诱导脑部奖赏功能的急剧降低，如通过脑部奖赏阈值的升高而反映(Epping-Jordan等人，1998；Harrison等人，2001a；Semenova和Markou 2003)。此阈值提高是尼古丁戒断综合征情感方面表现为数不多的几个操作性量度之一(Kenny和Markou 2001)。除情感症状外，人体尼古丁戒断也以躯体症状为特征，如心动过缓、失眠、胃肠道不适以及食欲增加(Hughes等人，1991)。在戒断动物中，这些症状可依照目视进行评定(Malin等人，1992；Malin 2001)。近期已证实，在通过中枢机制介导的脑部奖赏阈值升高的神经解剖位点及那些看起来经中枢和外周介导的躯体戒断症状之间存在明显分离(Hildebrand等人，1999；Watkins等人，2000)。情感症状已经公认对促使复发以及继续使用尼古丁具有很大的动机性意义(Markou等人，1998)。此外，尼古丁戒断的躯体症状也可能促成吸烟行为。因此，尼古丁戒断的情感及躯体方面的动物模型是理解尼古丁依赖性的神经生物学基础以及开发促进戒烟的有效治疗策略的重要手段(Kenny和Markou 2001；Malin 2001)。本试验考察了安非布他酮对基线条件下及继于长期施用尼古丁戒断后的脑部奖赏功能的影响。此外，也评定了安非布他酮对戒断的躯体症状的影响。
材料和方法动物将到达时体重为275-350g的雄性Wistar大鼠(Charles River，Raleigh-Durham，N.C.，USA)成对供养于温度和湿度受控的饲养室中，除检测过程外，食物和水随意获取。在12小时颠倒的明/暗循环下供养大鼠，光照1800小时。所有的试验步骤均于黑暗循环中进行，并且依照Scripps研究院的动物管理及应用委员会的要求。在开始任何试验步骤前，允许动物熟悉其新环境至少一周，期间，至少处理大鼠两次。
ICSS装置所有训练和检测均于十六个有机玻璃操作室(25×31×24cm；MedAssociates，Georgia，Vt.，USA)中进行，这些操作室分别被罩于隔音盒中(San Diego Instruments，San Diego，Calif.，USA)。每一操作室一面侧壁中心有一个金属操纵轮(5cm宽)，其转动四分之一周需用约0.2N的力。使用恒定电流刺激器(Stimtech型号1200；San Diego Instruments)递送颅内刺激。通过连接于固定在操作室上方的金触点旋转换向器(model SL2C；Plastics One)上的双极导联(Piastics One，Roanoke，Va.，USA)将试验对象连至刺激回路。刺激参数、数据收集以及所有的检测期功能均通过微型计算机进行控制。
手术ICSS电极植入当试验对象达到最低体重325g时，将直径0.25mm的不锈钢双极电极(型号MS303/2；Plastics One)切成长度11mm，于后外侧348下丘脑水平将其植入前脑内侧束。此区域短暂电刺激是强化性的，如大鼠进行一次操作(转动操纵轮)以获得电刺激所示(Markou和Koob 1992)。使用了可提供作为奖赏量度的电流强度阈值的离散试验ICSS程序(Markou和Koob1992)。许多滥用药物均可提高脑部奖赏功能，如ICSS阈值降低所指示，而戒断滥用药物可降低脑部奖赏功能，如阈值提高所指示。
使用异氟醚/氧气混合气体(1-3％异氟醚)麻醉试验动物并将其固定于立体定位架中(David Kopf Instruments，Tujunga，Calif.，USA)，使切牙棒位于耳间线上方5.0mm。依照如下坐标置入电极AP距离前囟点-0.5mm；ML±1.7mm；DV距离硬脑膜-8.3mm。一半试验对象在脑部右侧接受电极植入，另一半在脑部左侧接受电极植入，以平衡可能的脑部不对称。使用牙科聚丙烯树脂(Teets甲基丙烯酸甲酯假牙材料；CoOral-Lite Mfg.Co.，Diamond Springs，Calif.，USA)将电极固定于埋置入颅骨的四个不锈钢螺钉。使用13.3mg/ml溶于生理盐水的硫酸庆大霉素溶液冲洗手术伤口，用丝线缝合伤口，并覆盖以聚维酮碘抗菌药膏。手术后，在开始行为训练前，允许动物恢复至少7天。
渗透泵的植入和移除使用异氟醚/氧气混合气体(1-3％异氟醚)麻醉试验动物并沿动物背部、平行于脊柱用皮下渗透迷你泵[Alzet型号2ML1(七天)；AlzaCorporation，Palo Alto，Calif.，USA]对动物进行处理，并使流量计指向臀侧。泵中注以生理盐水或尼古丁溶液。依照动物体重和泵入速度调整尼古丁浓度，使得可递送3.16mg/kg/天的剂量(9mg/kg/天尼古丁酒石酸氢盐)。伤口以不锈钢伤口夹关闭并覆以聚维酮碘抗菌药膏。七天后，在异氟醚麻醉下手术移除渗透泵，重新夹闭伤口并以抗菌药膏处理。
脑部刺激奖赏阈值试验程序(ICSS)最初以定比1(FR1)强化程式训练试验对象转动操纵轮。对于每四分之一圈，试验对象接受100Hz频率的0.1毫秒矩形方波脉冲的500毫秒脉冲串。在成功习得此反应后，即定义为指定时间段(通常＜20分钟)内的200次连续强化，按照改良的Kornetsky和Esposito离散试验电流阈值程序(Kornetsky和Esposito 1979)来训练试验对象，如先前Markou和Koob(1992)所指出。
试验以电刺激开始，继之以7.5秒反应窗，在此反应窗期间，动物可作出反应以获得与初始非随附性刺激相同的第二次随附性刺激。在此7.5秒反应窗中的反应被认为是正性反应，而此期间内没有反应被认为是负性反应。在正性反应后紧随的2秒钟时期内的其他反应将不产生任何结果。在正性反应或反应窗(在负性反应时)结束之后的试验间间隔(ITI)为7.5秒至12.5秒，平均持续时间为10秒。在ITI中所发生的反应导致下一试验开始前延迟另外12.5秒。在按照离散性试验程序训练的过程中，ITI的持续时间及暂停反应延迟逐步增加，直至动物可以于固定刺激强度下连贯反应。然后按照电流阈值程序对试验对象进行检测，其中刺激强度于四个交替的上升和下降系列中以5mA的幅度变化。在每一电流步骤，首次下降列起始电流设定于预备训练末所估计的试验对象个体基线阈值上30-40mA，以提供三个试验段。在动物不能对三次试验中的至少两次作出正性反应的两个连续的试验段后或者在出现15次连续递减后，将终止下降系列。在动物对三次试验中的至少两次作出正性反应的两个连续的试验段后或者在出现15次连续递增后，将终止上升系列。自交替系列所获得的四种电流阈值的平均值定义为试验对象对该试验期的ICSS阈值。在出现15次刺激递增(或递减)后或者确定出各列阈值后(参见下文)，终止各列试验。每一检测试验期通常持续30分钟。
阈值每一下降系列的电流阈值定义为成功完成一组试验(三次试验中作出两次或更多次正性反应)与动物未能对三次试验中的两次或更多次试验作出正性反应的连续两组试验中的第一组试验的刺激强度之间的刺激强度。在上升系列中，阈值定义为成功未成功完成一组试验(三次试验中作出两次或更多次负性反应)与动物能对三次试验中的两次或更多次试验作出正性反应的连续两组试验中的第一组试验的刺激强度之间的刺激强度。因此，在每一检测试验期过程中，测定四次阈值，并取这些值的平均值作为每一试验对象的阈值。在于上述脑部刺激奖赏程度中训练后，对大鼠进行检测直至达到稳定的基线阈值(在5天内，±10％)。只有在动物的行为表现稳定后，方可开始药物检测，这通常是在基线检测后2-3周进行。每次药物注射之间，要求回至基线阈值水平。
戒断综合征躯体症状的等级将大鼠分别置于透明的塑料圆柱形容器中(30×38cm)，其中大鼠可以自由活动。在第一次检测试验期前，让试验对象熟悉容器3天，每天10分钟。在检测试验期过程中，由富有经验的观察人员盲性观察大鼠10分钟，并根据尼古丁戒断症状检查表(Hildebrand等人，1999；Watkins等人，2000；Malin 2001)记录下述症状的频率身体颤动、咀嚼、颊部震颤、逃脱企图、眨眼、舔足、喘息、舔生殖器、头部摇动、上睑下垂、挠抓、齿颤、翻滚以及打哈欠。任何症状的多次连续计数均需要有明确的试验期之间的间歇。上睑下垂，如果持续存在的话，则每分钟只能计数一次。对于统计学分析，躯体症状的总数定义为上述戒断症状单独发生率的总和。此外，“腹部收缩”的范畴包括了喘息和翻滚；“面部肌束颤动”包括了颊部震颤、咀嚼以及齿颤；同时“各种其他症状”包括了摇动、逃脱企图、舔、挠抓以及打哈欠。药物将(-)-尼古丁酒石酸氢盐(Sigma，St Louis，Mo.，USA)溶于无菌生理盐水中(0.9％氯化钠)。盐酸安非布他酮通常由Glaxo-SmithKline，ResearchTriangle Park，N.C.，USA提供，并溶于无菌蒸馏水中。尼古丁剂量以游离碱的形式表示，而安非布他酮剂量以盐的形式表示。所有注射均以1ml/kg容量施用。
试验1急性安非布他酮处理对基线条件下ICSS奖赏阈值的影响依照试验对象组内拉丁方设计施用安非布他酮(0、10、20、30mg/kg，膜内，n＝8)(30分钟预处理)，在连续药物处理之间相隔最少3天。在回至基线值后，给以所有动物安非布他酮注射(40mg/kg，腹膜内)，至少3天后，接着再腹膜内注射60mg/kg安非布他酮。这两种最高剂量的安非布他酮最后施用，以避免高剂量安非布他酮的任何可能的长期持续作用。不过，未观察到此种作用。尽管这些试验中所使用的剂量高于所推荐的人体每日剂量(300mg/day)[参见GlaxoSmithKline关于Zyban(盐酸安非布他酮)缓释片的产品信息2002，可获自互联网us.gsk.com/products/assets/us_zyban.pdf]，不过由于不同种属中药物药代动力学及代谢的差异，此种对比至多只是很粗略的比较。应当注意到，所使用的安非布他酮剂量处于可于啮齿类动物中产生显著抗抑郁样行为作用(例如Cryan等人，2001)并可增加下丘脑细胞外多巴胺和去甲肾上腺素浓度(Li等人，2002)的范围之中。
试验2急性安非布他酮对急性尼古丁诱导的ICSS阈值降低的影响在单独的一组未经药物处理的动物中，依照试验对象组内拉丁方设计，与尼古丁(0、0.25mg/kg，皮下；15分钟预处理)组合施用安非布他酮(0、5、10、20mg/kg，腹膜内，n＝10)(30分钟预处理)，在连续的药物处理之间相隔最少3天。尼古丁的剂量选自本实验室先前的剂量-反应试验，其表明尼古丁于此剂量时具有最强的奖赏影响(Harrision等人，2002)，安非布他酮的剂量基于上述试验1的结果进行选择。
试验3急性安非布他酮处理对继于长期尼古丁或盐水施用戒断的ICSS奖赏阈值的影响用渗透迷你泵处理未使用药物的动物，迷你泵中含有个体化的尼古丁溶液(3.16mg/kg/天，游离碱)或盐水。尼古丁的剂量选择基于先前广泛的剂量-反应试验，该试验表明，暴露于此剂量尼古丁7天可导致如通过ICSS(脑部奖赏阈值的提高)和戒断躯体症状所评定的显著和可重复的戒断综合征(Epping-Jordan等人，1998；Harrison等人，2001a；Malin 2001)。此剂量尼古丁可维持稳定的血浆尼古丁水平(44ng/ml)，该水平与每天吸用30支烟的吸烟者所报道的尼古丁水平(40-42ng/ml)相当(参见Epping-Jordan等人，1998)。在植入迷你泵后，此后每天均评定阈值，以确定长期尼古丁暴露对奖赏阈值的影响。在泵置入后七天(准确的说是七个24小时)，将泵移除，以促成尼古丁戒断综合征。在泵移除后12、18、24、36、48及72小时测定ICSS阈值。在18小时时间点前30分钟向动物注射安非布他酮(0、10、20、40mg/kg腹膜内；n＝8-11)。选择此时间点是因为在先前的试验中于此时间点可观察到最大的戒断诱导的奖赏缺乏(脑部奖赏阈值提高)(Epping-Jordan等人，1998；Harrison等人，2001a；Semenova和Markou2003)。
试验4急性安非布他酮对继于长期尼古丁施用戒断的躯体症状的影响用渗透迷你泵处理单独的未使用药物的动物，迷你泵中含有溶于盐水中的尼古丁(3.16mg/kg/天，使用七天)。如上所述，此尼古丁剂量基于广泛的剂量反应试验选择，并且此剂量尼古丁可于大鼠中产生明显的戒断综合征(Malin等人，1992；Epping-Jordan等人，1998；Harrison等人，2001a；Malin 2001；Skjei和Markou 2003)。此外，选择此剂量尼古丁允许直接比较安非布他酮对躯体症状的影响(本试验4)以及多尼古丁戒断过程中所观察到的奖赏阈值提高的影响(上述试验3)。为诱导尼古丁戒断的躯体症状，在植入后6天再18小时移除迷你泵。在移除迷你泵后的6、12及24小时进行大鼠的行为表现观察。在12小时时间点前30分钟对大鼠注射安非布他酮(0、5、10、20、40mg/kg，腹膜内；n＝6-8)。选择这些时间点是基于终止尼古丁暴露后躯体症状表现的时间进程(Epping-Jordan等人，1998；Harrison等人，2001a；Semenova和Markou 2003；Skjei和Markou2003)。
数据分析和统计阈值数据以每次药物处理或植入迷你泵前3至5天的基线值的百分数表示。由于在电极置入过程中的微小差异以及其他极少了解的试验对象个体因素，因此各大鼠的原始电流强度阈值在基线条件下有变化，因而阈值数据的统计分析使用了百分数值。本实验室先前的广泛工作已经显示，使用如此文稿中所说明的试验对象组内设计以及以执行任何操作前的稳定基线阈值百分数表示阈值数据是评定脑部奖赏功能变化的可靠且有效的方法(参见Markou和Koob 1992)。使用合适的试验对象组内、混合设计ANOVA对所有数据进行分析。在检验具有显著统计学影响后，酌情再进行Fisher个体比较检验。显著性水平设定为P＜0.05。
结果试验1急性安非布他酮处理对基线条件下ICSS电流阈值的影响急性安非布他酮处理诱导脑部奖赏阈值的显著降低[F(5，35)＝7.445，P＜0.001]，这预示着脑部奖赏功能增强(图23)。Post-hoc分析表明，安非布他酮在所检测的所有剂量下以及以剂量依赖方式直至40mg/kg(40mg/kg与经10mg/kg安非布他酮处理的动物显著不同)时，与载体条件相比，均降低了脑部奖赏阈值。原始的3天平均基线阈值位于128.19-143.63mA的范围中。
试验2急性安非布他酮对急性尼古丁诱导的ICSS阈值降低的影响如试验1，安非布他酮(10和20mg/kg，但不是5mg/kg)于同时经盐水处理的动物中降低了脑部奖赏阈值[F(3，54)＝7.822，P＜0.001](图24)。类似地，尼古丁处理导致脑部奖赏阈值降低[F(1，18)＝11.550，P＜0.003]，这与先前的发现一致(Harrison等人，2002；Skjei和Markou 2003)。ANOVA揭示了在尼古丁因素和安非布他酮因素之间具有显著相互作用的有力趋势[F(3，54)＝2.405，P＝0.077]。计划比较表明，单独无效剂量(5mg/kg)的安非布他酮完全逆转了急性尼古丁的奖赏增强作用。不过，更高剂量的安非布他酮(10和20mg/kg)与尼古丁的组合导致阈值降低，而这种降低并不显著不同于单独施用尼古丁所诱导的阈值降低。原始的3天平均基线阈值位于111-133.26mA范围中。
试验3急性安非布他酮处理对长期施用尼古丁或盐水戒断过程中及之后的ICSS电流阈值的影响通过迷你泵施用尼古丁导致脑部奖赏功能的少量但仍显著的降低[F(1，74)＝5.75，P＜0.05]，在施用的第3天可见最大作用。不过，在第七天移除迷你泵时，阈值回至基线水平(P＞0.8)，并与经盐水处理的动物没有差异(P＞0.1)。该结果模式提示，对尼古丁的轻度降低阈值作用可产生耐受性(参见图25)。在植入迷你泵前的原始5天平均基线值对于经盐水处理动物为119.75mA，对于经含尼古丁迷你泵处理的动物为120.08mA。
为评定尼古丁戒断对脑部奖赏阈值的影响，将移除迷你泵后的阈值以植入迷你泵前于基线条件下评定的5天基线阈值的百分数表示。因此，戒断阶段所报道的这些百分数的变化可反映相对于基线脑部奖赏阈值的变化，而非相对于尼古丁暴露过程中的阈值的变化，在此暴露过程中，在尼古丁的影响下阈值可能已经发生了改变。不过，如上所述，在暴露于尼古丁的第七天，经尼古丁处理大鼠的阈值可回至基线水平。如所预计的，与经盐水预处理动物的阈值相比，长期施用尼古丁戒断显著地提高了脑部奖赏阈值[F(1，68)＝22.219，P＜0.001]。另外，ANOVA揭示，阈值随时间有显著改变[F(5，340)＝23.047，P＜0.001]。此外，在预处理(尼古丁或载体)和时间因素之间[F(5，340)＝5.731，P＜0.001]以及在处理(安非布他酮或载体)和时间因素之间[F(15，340)＝13.568，P＜0.001]存在显著的相互作用。
计划比较揭示，尼古丁戒断于盐水注射动物中在所有的直至戒断后36小时的检测时间点均导致奖赏阈值的显著提高。在48小时和72小时时间点，戒断诱导的奖赏缺乏已回复正常。在施用安非布他酮后30分钟(戒断后17.5小时)，在所有剂量均存在显著的并且呈剂量依赖性的奖赏阈值降低，而不论动物是否经尼古丁预处理。而且，在注射安非布他酮(40mg/kg)后，在使用盐水预处理的动物与使用尼古丁预处理的动物之间不再存在任何显著差异。此外，在盐水预处理的动物中，阈值的这种降低比较短暂，并且在所有动物中于下一个检测时间点时(24小时)均被完全逆转，这与试验1的结果相似。有趣的是，然而与注射盐水的经尼古丁预处理的动物相比，注射40mg/kg安非布他酮的经尼古丁预处理动物仍显示奖赏阈值有显著降低(P＜0.001)(参见图26A)。
对阈值数据曲线下面积的分析(经整个72小时戒断阶段)证实，尼古丁预处理具有显著影响[F(1，68)＝13.705，P＜0.001 ]。没有药物(安非布他酮)处理的总体统计学显著影响或者药物×泵相互作用。计划比较表明，经尼古丁预处理的动物较相应经盐水预处理动物具有更高的阈值水平曲线下面积。在以所检测的安非布他酮最高剂量(40mg/kg)处理的动物中，这种阈值提高被完全逆转(参见图26B)。原始的5天平均基线阈值位于108.69-131.83mA范围中。
试验4急性安非布他酮处理对继于长期施用尼古丁戒断的躯体症状的影响在移除含有尼古丁的迷你泵后6小时并且在进行任何药物处理前，总戒断躯体症状的数量有显著增加。在12小时的观察时间点前使用载体处理的尼古丁暴露大鼠中，戒断12小时后的这些躯体症状的明显程度也相同。存在安非布他酮处理与时间的显著相互作用[F(4，31)＝23.76，P＜0.001]。Posthoc比较揭示，在12小时戒断时间点前30分钟施用安非布他酮(20-40mg/kg)所导致的总体躯体症状表达相比同样动物在安非布他酮施用前的6小时时间点所显示的躯体症状数目(试验对象组内比较)以及那些也经受尼古丁戒断的经载体处理的大鼠的躯体症状数目(试验对象组间比较)有所逆转(参见图27A)。最后，还应当注意到，在施用安非布他酮(泵移除后6小时；参见图27A)前以及处理后的若干小时(泵移除后24小时以及安非布他酮施用后12.5小时)，各组总体躯体症状数目之间没有显著差异(P＞0.05；载体＝20.7±7.3；安非布他酮5mg/kg＝18.6±4；安非布他酮10mg/kg＝17.1±4.6；安非布他酮20mg/kg＝14.1±2.2；安非布他酮40mg/kg＝14.6±2.6)。这些数据表明，经盐水处理大鼠和经安非布他酮处理(泵移除后12小时)大鼠之间的差异并非源于基线差异，并且急性安非布他酮处理对尼古丁戒断躯体症状的表达没有长期(12.5小时)影响。
使用单因素ANOVA以检查安非布他酮对12小时戒断时间点时各躯体症状的影响。其证实，腹部收缩(翻滚和喘息)量因安非布他酮施用而显著降低[F(4，31)＝4.037，P＜0.01]，但其他症状则不然。计划比较揭示，安非布他酮(10-40mg/kg)可逆转戒断诱导的腹部收缩的增加(参见图27B)。
讨论本试验提供了有关安非布他酮可作用改变受尼古丁影响的脑部奖赏回路的显著证据。首先，安非布他酮可提高基线条件下的脑部奖赏功能。其次，在低剂量时，安非布他酮可阻断急性尼古丁所诱导的促进奖赏作用。第三，其可逆转表现为奖赏缺乏和戒断躯体症状的尼古丁戒断的负性情感状态。如降低ICSS阈值所表明的安非布他酮提高基线条件下脑部奖赏功能的能力与我们以及其他研究者先前使用ICSS自其他抗抑郁药所得到的数据完全相反。这些研究表明，急性施用抗抑郁药如地昔帕明、帕罗西汀或氟西汀对基线条件下的阈值没有影响或诱导阈值升高(Atrens等人，1977；Katz和Carroll 1977；Binks等人，1979；Hall等人，1990；Markou等人，1992；Lee和Kornetsky 1998；Lin等人，1999；Harrison等人，2001a；2001b；Cryan和Markou，观察资料尚未发表)。安非布他酮的此不同作用可能构成了其在戒烟中相比许多其他抗抑郁药具有优势的基础。相反，Mc-Carter和Kokkinidis(1988)证实，使用安非布他酮处理28天对ICSS反应速度没有影响。不过，在这两组数据之间作出比较非常困难，因为McCarter和Kokkinidis的程序在操作上与我们的试验不同，并且只使用了一种安非布他酮剂量(20mg/kg)。已经提出，如果在精神病人群、包括抑郁患者中有着高吸烟率(Leonard等人，2001)，则吸烟者可能使用尼古丁来自我治疗抑郁症状(Glassman等人，1990；Markou等人，1998；Markou和Kenny 2002)。的确，这些大规模的流行病学观察资料近来已在神经化学方面得到证实，其中显示，在吸烟者中蓝斑的α2去甲肾上腺素能受体被下调至与先前抗抑郁药治疗所报道相似的程度(Klimeck等人，2001)。此外，尼古丁戒断导致的脑部奖赏功能缺陷与那些重症情感性疾病中所观察到的相似(Markou和Kenny2002)。总之，这些观察资料提示，抗抑郁药治疗可能对降低吸烟率是一种有效的治疗，因为其治疗了潜在的抑郁症状。不过，不断增加的证据表明，抗抑郁药如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂只可于抑郁患者的某些亚群中减少尼古丁摄入，甚至可能根本不减少尼古丁摄入，并且可能在非抑郁患者中的疗效有限(K0tlyar等人.2001)。相比之下，安非布他酮在健康及精神病人群中同样有效，并因此其疗效超出了其抗抑郁特性的范围(Hayford等人，1999)。此处我们提出，安非布他酮的戒烟效果可能是由于其对甚至是在基线非戒断状态下的脑部奖赏功能的另外作用，该作用不为其他抗抑郁药所具有。
构成安非布他酮作用的神经化学机制仍未得到很好阐明。近期的数据指出，安非布他酮对行为的影响可能是由于其对去甲肾上腺素能系统的作用(Ascher等人，1995；Cryan等人，2001；Dong和Blier 2001)。虽然如此，与其他许多抗抑郁药不同，安非布他酮还可作为多巴胺再摄取抑制剂(虽然是在微摩尔范围)(Ascher等人，1995)，并且微透析试验已经显示，以在电流试验中可降低脑部奖赏阈值的剂量范围急性施用安非布他酮可增加细胞外的多巴胺(Nomikos等人，1989；Li等人，2002)。鉴于多巴胺系统早已与脑部奖赏机制相关，古安非布他酮的此特性可能促进其奖赏增强作用。多巴胺能机制也已涉及于尼古丁的奖赏方面以及尼古丁戒断综合征的表现之中(Hildebrand等人，1998，1999；Kenny和Markou 2001；Ferrar等人，2002；Mansvelder等人，2002；Picciotto和Corrigall 2002)。不过，近期的研究已经显示，尽管伏隔核中多巴胺浓度的增加是发生ICSS反应所必需的，但其与ICSS的短时动力学并不平行(Garris等人，1999)。因此，虽然多巴胺涉及奖赏的某些方面(很可能是新发现或预期)，也可以补充其他的相应神经化学机制以维持奖赏的自我刺激“快感”方面(Wise和Stein1969；Herberg等人，1976；Garris等人，1999)。因此，通过在侧下丘脑水平使用ICSS，我们能够获得边缘区(如伏隔核，一个明显但并非独占涉及于奖赏介导的区域)活性经突触调节的一个指标，从而允许检测非多巴胺能神经递质的调节。由于安非布他酮对多巴胺能及去甲肾上腺素能转运蛋白均有影响，因此此种调节与电流试验相关。的确，近期的电生理数据提示，持续的安非布他酮处理(通过迷你泵维持两天)可改变蓝斑区去甲肾上腺素能神经元的发放，并且在较低程度上改变5-羟色胺能中缝神经元，但不可改变多巴胺能腹侧被盖区神经元(Dong和Blier 2001)。此外，一项近期人体影像研究证实，治疗有效剂量的安非布他酮在多巴胺转运蛋白只有22％的占有率(Meyer等人.2002)，这表明安非布他酮的疗效可能并非仅仅通过多巴胺介导。
此外，近期的证据提示，安非布他酮可担当神经元尼古丁乙酰胆碱受体的功能性拮抗剂(Fryer和Lukas 2002；Slemmer等人，2000；Miller等人，2002)。我们的数据显示，自身无效剂量的安非布他酮可阻断尼古丁的急性奖赏影响，支持了这一假说。在更高剂量时，安非布他酮促进脑部奖赏功能的独立作用也得到证明，这就使得安非布他酮可能的尼古丁拮抗剂作用难以解释。虽然如此，我们的观察资料也为在戒烟前开始安非布他酮治疗的临床实践提供了神经化学方面的凭证(Hughes等人，1999)。很可能安非布他酮可急性作用于削弱尼古丁对奖赏的影响，从而增加戒烟的可能性。的确，一种典型的尼古丁受体拮抗剂美加明已显示在组合使用尼古丁贴时为一种有效的戒烟辅助手段(Rose等人，1994)。有趣的是，在药物鉴别范式中，安非布他酮与尼古丁是统一的。不过，与尼古丁的鉴别特点不同，安非布他酮对美加明的阻断不敏感，这表明介导安非布他酮和尼古丁的鉴别提示的作用机制不同(Young和Glennon 2002；Wiley等人，2002)。
此文中，安非布他酮于所检测的所有剂量(10、20和40mg/kg)均可逆转戒断情感方面的症状，这进一步提示其对奖赏系统的作用与其疗效相关。此外，我们的数据显示，与经盐水处理的对照相比，安非布他酮对经尼古丁预处理动物的奖赏阈值有着明显不同的影响。在经盐水处理的对照动物中，安非布他酮诱导阈值短时降低，在所检测的下一个时间点时便回至基线，这与我们最初的剂量决定试验的结果一致。如前所示，经长期尼古丁预处理的动物，在持续尼古丁暴露过程中显示阈值有少许降低的同时，在戒断尼古丁施用时显示阈值显著升高(Epping-Jordan等人，1998)。所检测的安非布他酮最高剂量(40mg/kg)可显示延长逆转戒断所致的缺陷，在第二个注射后检测期(施用安非布他酮后6.5小时)，阈值仍然显著低于先前经尼古丁处理的载体给药动物。此外，对整个为期72小时的奖赏阈值分析表明，经受尼古丁戒断并注射安非布他酮(40mg/kg)的动物与那些未经尼古丁戒断的动物没有差异。施用较低剂量的安非布他酮(10和20mg/kg)也可逆转奖赏缺乏，尽管此效果的持续期不如施用40mg/kg安非布他酮后所见。这些发现显示，安非布他酮可诱导戒断所致奖赏缺乏的逆转，这与其在基线条件下对奖赏功能的作用不同。很可能这种削弱戒断所诱导奖赏缺乏的延长对于安非布他酮的戒烟特性极其重要，因为戒断的情感方面症状被认为是促使再次使用药物的重要因素(Kenny和Markou 2001)。这些数据与先前关于抗抑郁药氟西汀和帕罗西汀的数据不同，氟西汀和帕罗西汀在单独给药时不太改变戒断综合征情感方面的症状(Harrison等人2001a，2001b)。不过，在组合5-羟色胺1A自身受体拮抗剂施用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂时，奖赏功能的这种缺陷则被抵消(Harrison等人2001a，2001b)。这些发现与近期证实5-羟色胺能中缝背核(dorsal raphe nucleus)在介导尼古丁戒断的某些情感方面症状中作用的资料相一致(Cheeta等人，2000)。此外，Rasmussen及其同事(1997；2000)已经显示，5-HT1A受体拮抗剂可于大鼠中逆转尼古丁戒断过程中所观察到的听觉惊愕反射的增加。
除了抵消尼古丁戒断症状的情感分量外，安非布他酮还可逆转自发性尼古丁戒断综合征躯体症状的表达。此观察结果与先前报道安非布他酮可逆转尼古丁戒断躯体症状的研究相一致(Malin 2001)。此种逆转的机制尚不清楚。因为多巴胺能信号传导减低被认为是尼古丁戒断躯体症状表现中的一个关键因素(Hildebrand等人，1999)，因此可能安非布他酮对多巴胺系统的直接作用可抵消此缺陷。不过，安非布他酮对其他通路如去甲肾上腺素能及5-羟色胺能系统的作用也不能排除，因为它们也涉及于介导躯体症状的表达(Kenny和Markou 2001；Malin 2001)。尼古丁戒断的情感及躯体方面的逆转也可解释安非布他酮在戒烟中的显著疗效，因为戒断的负性方面被公认可促进吸烟习惯(Glassman等人，1990；Breslau等人，1992；Laje等人，2001)。的确，近期临床试验证实，负性情感是安非布他酮对戒烟作用的一个重要中介(Shiffman等人，2000；Lerman等人，2002)。
应当注意到，本试验中安非布他酮的所有作用均是在急性施用后研究的，尚不清楚是否长期施用也仍存在此种作用。先前关于安非布他酮对脑部奖赏功能作用的唯一研究是有关基线条件下的长期施用(McCarter和Kokkinidis 1988)。此试验证实，使用安非布他酮处理28天对ICSS反应速度没有影响。不过，在这两组数据之间难以作出比较，因为McCarter和Kokkinidis只于基线条件下研究了安非布他酮的作用，并且其程序在操作上与我们的试验不同。在他们的试验中只使用了一种安非布他酮剂量(20mg/kg)并且没有进行急性检测的事实使得更加难以评定是否这些负性作用与本数据有关。使用大鼠中尼古丁戒断的的脑部奖赏阈值及躯体症状作为人体中相似作用的指标的一个主要缺点是，戒断的这些方面持续时间相对较短，为2-3天(Kenny和Markou 2001)。因此，这种较短的持续时间使得研究长期施用可能疗法的效果更加困难。不过，与其他精神疾病模型相似(例如Geyer等人，2001；Lucki 2001；Cryan等人，2002；Seong等人，2002)，这2-3天的窗口期也足以允许检测新治疗方法的可能疗效，并因此可提供具有预测有效性的模型(Geyer和Markou 1995)。进一步的研究是给予明确这些问题，并评定长期施用安非布他酮对尼古丁戒断的各种不同方面症状的影响。
总之，这些数据证实，安非布他酮作为戒烟助剂的有效性可能是由于其改变急性尼古丁对奖赏功能方面以及逆转尼古丁戒断综合征的负性情感和躯体症状的能力。安非布他酮诱导的脑部奖赏功能增强即使在非尼古丁戒断情况下也可促使吸烟者改变其动机优先，并因此导致烟草消耗量减少。进一步的研究仍将需要，以评定长期安非布他酮处理对脑部奖赏及尼古丁戒断的影响。
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尽管已参照其某些优选实施方案对本发明进行了详细说明，但应当理解，其改良和变更也仍同样在此文中所说明及声明的精神及范围之中。
权利要求
1.治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节代谢型谷氨酸受体2、代谢型谷氨酸受体3及代谢型谷氨酸受体5的拮抗剂，从而治疗该疾病。
2.治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节代谢型谷氨酸受体2及代谢型谷氨酸受体5的拮抗剂，从而治疗该疾病。
3.治疗代谢型谷氨酸疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节代谢型谷氨酸受体3及代谢型谷氨酸受体5的拮抗剂，从而治疗该疾病。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述疾病为成瘾性疾病。
5.权利要求4的方法，其中所述成瘾性疾病为尼古丁成瘾、酒精成瘾、阿片成瘾、安非他明成瘾、甲苯丙胺成瘾或者可卡因成瘾。
6.权利要求4的方法，其中所述成瘾性疾病为尼古丁成瘾。
7.权利要求4的方法，其中所述成瘾性疾病为可卡因成瘾。
8.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述疾病为抑郁症。
9.根据权利要求1的方法，其中的拮抗剂为2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶。
10.一种组合，其包含(a)至少一种选自代谢型谷氨酸受体2拮抗剂和代谢型谷氨酸受体3拮抗剂的活性成份，以及(b)至少一种代谢型谷氨酸受体5拮抗剂，并且任选含有至少一种药学可接受载体，其中活性成份于每种情况下均以游离形式或药学可接受盐的形式存在；该组合用于同时、分别或相继使用。
11.一种组合，其包含(a)至少一种对代谢型谷氨酸受体2和代谢型谷氨酸受体3显示拮抗活性的活性成份，以及(b)至少一种代谢型谷氨酸受体5拮抗剂，并且任选含有至少一种药学可接受载体，其中活性成份于每种情况下均以游离形式或药学可接受盐的形式存在；该组合用于同时、分别或相继使用。
12.一种组合，其包含(a)至少一种代谢型谷氨酸受体2拮抗剂，以及(b)至少一种对代谢型谷氨酸受体3和代谢型谷氨酸受体5显示拮抗活性的活性成份，并且任选含有至少一种药学可接受载体，其中活性成份于每种情况下均以游离形式或药学可接受盐的形式存在；该组合用于同时、分别或相继使用。
13.一种组合，其包含(a)至少一种代谢型谷氨酸受体3拮抗剂，以及(b)至少一种对代谢型谷氨酸受体2和代谢型谷氨酸受体5显示拮抗活性的活性成份，并且任选含有至少一种药学可接受载体，其中活性成份于每种情况下均以游离形式或药学可接受盐的形式存在；该组合用于同时、分别或相继使用。
14.根据权利要求10至13中任一项的组合，其为组合制剂或药物组合物。
15.根据权利要求10至13中任一项的组合，其用于同时、分别或相继使用以治疗成瘾性疾病或抑郁症。
16.治疗患有成瘾性疾病或抑郁症的温血动物的方法，其包括向所述动物施用对成瘾性疾病或抑郁症联合治疗有效量的根据权利要求10至13中任一项的组合，且其中化合物也可以以其药学可接受盐的形式存在。
17.药物组合物，其包含对成瘾性疾病或抑郁症联合治疗有效量的根据权利要求10至13中任一项的药物组合以及至少一种药学可接受载体。
18.根据权利要求10至13中任一项的组合在制备用于治疗成瘾性疾病或抑郁症的药物中的用途。
19.一种商品包装，其包含根据权利要求10至13中任一项的组合以及其在治疗成瘾性疾病或抑郁症中同时、分别或相继使用的说明书。
20.治疗精神活性物质滥用的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、mGluR3及mGluR5的拮抗剂或根据权利要求10至13中任一项的组合，其中所述有效量足以于所述对象中减少、抑制或消除对所述精神活性物质的需求和/或消耗。
21.权利要求20的方法，其中的精神活性物质为尼古丁、酒精、阿片、安非他明、甲苯丙胺或者可卡因。
22.权利要求21的方法，其中向所述对象施用LY341495和2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶。
23.筛选药剂的方法，该药剂可提高已知抑制剂至少部分使非人类哺乳动物对象的颅内自我刺激(ICSS)阈值正常化的能力，其包括a)影响该对象的ICSS阈值；b)向该对象施用足量的已知抑制剂，以在单独或联合另一种抑制剂施用时至少部分使ICSS阈值正常化，其中已知抑制剂为mGluR2、mGluR3及mGluR5中至少一种的拮抗剂；c)向该非人类哺乳动物对象施用有效量的试验药剂，其中该试验药剂为mGluR2、mGluR3及mGluR5中至少一种的已知或可疑拮抗剂；以及d)确定是否该试验药剂可提高已知抑制剂至少部分使ICSS阈值正常化的能力，从而鉴定可提高该已知抑制剂至少部分使ICSS阈值正常化能力的药剂。
24.权利要求23的方法，其中该方法将试验药剂鉴定为有效用于治疗抑郁症或成瘾性疾病的药剂。
25.权利要求23的方法，其中该已知抑制剂为LY341495或2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶。
26.权利要求23的方法，其中该试验药剂可提高已知抑制剂抑制对成瘾性物质的需求和/或消耗的能力。
27.治疗成瘾性疾病的方法，其包括a)在第一时间段中向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、3及5中至少一种的拮抗剂，其中该第一时间段为这样一种时间段，其中所述对象预计处于这样一种环境或暴露于这样一种刺激，在该环境中或在该刺激存在下所述对象习惯性地使用成瘾性物质；以及b)在第二时间段中施用至少一种调节mGluR2和/或3中至少一种的拮抗剂，其中所述第二时间段为其中所述对象正在经受戒断和/或抑郁症的时期。
28.权利要求27的方法，其中在第一时间段中施用2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶和LY341495之一或全部，在第二时间段中施用LY341495。
29.治疗抑郁症的抑郁症状和焦虑症状的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节代谢型谷氨酸受体2、代谢型谷氨酸受体3及代谢型谷氨酸受体5的拮抗剂，从而治疗抑郁症的抑郁症状和焦虑症状。
30.权利要求29的方法，其中当所述对象经受抑郁症状时施用代谢型谷氨酸受体2和代谢型谷氨酸受体3的拮抗剂，当所述对象经受焦虑症状时施用代谢型谷氨酸受体5的拮抗剂。
31.权利要求30的方法，其中向所述对象施用LY341495和2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶。
全文摘要
本发明提供了通过同时抑制属于至少两种不同组别的至少两种mGluR来治疗与代谢型谷氨酸受体(mGluR)相关疾病的方法。在一项实施方案中，提供了一种治疗与mGluR2、mGluR3及mGluR5相关疾病的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的至少一种调节mGluR2、mGluR3及mGluR5的拮抗剂。通过此方法治疗的疾病包括例如尼古丁成瘾、可卡因成瘾以及抑郁症。
文档编号A61K31/44GK1694701SQ03825021
公开日2005年11月9日 申请日期2003年9月10日 优先权日2002年9月10日
发明者A·马尔库, P·肯尼, N·佩特森, S·塞梅诺娃 申请人:诺瓦提斯公司, 斯克里普斯研究所