专利名称：源自于香椿叶的萃取物及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自于香椿(Toona sinensis Roem.)叶的萃取物暨其制备方法，以及该萃取物供应用于卵巢癌和/或膀胱癌治疗的用途。
背景技术：
香椿(拉丁学名为Toona sinensis Roem或Cedrela sinensis，英文名为Chinesemahogany cedar或Chinese Toona)是一种属于楝科(Meliaceae)的多年生落叶性乔本植物，树皮为赭褐色，而嫩叶可供食用且全年可采。香椿原产于中国东南、西南至华北地区，如今已在全世界均有种植(Jennifer M.Edmonds and MartinStaniforth，TOONA SINENSIS(Meliaceae)，Curtis’s Botanical magazine，15(3)，186-193，1998；Xiao-Dong Luo et al.，Fitoterapia，71，492-496，2000；Jong-Cheol Park et al.，Kor.J.Pharmacogn，27(3)，219-223，1996)。
香椿因为全株植物均可被利用，而成为一经济价值极高的树种。据文献报导，香椿的各植物部位(种子、根皮、树皮、叶轴、树叶)均有保健或治疗的功能(EdmondsJM & Staniforth M，1998，同上所述(supra)；Park JC et al.，1996，同上所述)。
在食用方面，香椿籽油因为无色且气味芳香而非常适合作为食物用油。香椿的嫩芽和叶子含有丰富的胡萝卜素、胺基酸及维生素等营养物，而深受人们喜爱。另外，香椿的老叶可以当作牲畜的高营养价值饲料。
在药用方面，根据文献记载(Edmonds JM & Staniforth M，1998，同上所述；Xiao-Dong Luo et al.，同上所述；Park JC et al.，1996，同上所述)，香椿的树皮、根皮及种子在治疗神经痛，止血、驱寒、止痛、治胃、十二指肠溃疡、淋病、月经失调、蛔虫、抑制伤寒杆菌、抗阿米巴原虫、风湿关节痛及抗癌(余嗣明以及张泽当，Jounal of Anhui University Natural Science Edition，No.4，91-94，1990；刘月珍以及李玉平，河北林业科技，第4期，51-52，1997年12月)上具有疗效。
而根据文献记载，香椿叶具有消炎、解毒、杀虫、治肠炎、痢疾、疽、疔、漆疮、疥疮、白秃及改善体质的药用功能。另外，于民间相传，饮用香椿叶水萃取物以后，发现可改善高血压与糖尿病症状。最近，许胜光等人研究香椿叶的水性萃取物(aqueous extract)，而发现香椿叶的水性萃取物可降低由Alloxan所诱发的糖尿病鼠的血糖(Wang PH et al.，Toona Sinensis increase GLUT4 glucosetransporter protein in adipose tissue from Alloxan-induced diabetic rats，Annual Conference of Biomedical Science，p.198，2001)，并于另一个研究中发现香椿叶的水性萃取物具有抑制人类肺脏腺癌细胞A549(human lungadenocarcinoma cells A549)增生的效用(Hui-Chiu Chang et al.(2002)，AmericanJournal of Chinese Medicine，Vol.30，Nos.2 & 3，307-314)。
在其他方面，香椿叶可被使用作为染剂或釉剂。
另外，香椿的木材坚实、细致、不翘、不裂、耐湿，所以而香椿的木材常被用来当作高级家具、造船、桥梁等材料，也有被应用于制造羽毛球拍、乒乓球拍、网球拍及乐器。
香椿也是一种造林树种，当被应用于造林时，可防止土石流发生。另外，从香椿的木材可提炼出椿木油，该油可作为雪茄的赋香剂。
就申请人所知，至今尚无任何文献资料或专利前案曾经明示或暗示“香椿叶或源自于香椿叶的萃取物具有抑制卵巢癌和/或膀胱癌细胞生长的活性，而因此可被应用于制备用来治疗卵巢癌和/或膀胱癌的药物”。
发明内容
因此，在第一个方面，本发明提供一种从香椿叶所得的萃取物，其是借由一包含下列步骤的方法而被制得(1)在加热下以水来萃取香椿叶而得到一经水萃取的第一萃取物，以及(2)以一醇来萃取步骤(1)所得到的该经水萃取的第一萃取物而得到一经醇萃取的第二萃取物。
在第二个方面，本发明提供一种用以制备萃取香椿叶萃取物的方法，其包括下列步骤(a)在加热下以水来萃取香椿叶，以得到一水性萃取溶液(aqueous extractsolution)；(b)将得自于步骤(a)的水性萃取溶液干燥，以得到一被干燥的第一萃取物；(c)将得自于步骤(b)的第一萃取物溶子一醇溶剂内，以形成一醇萃取溶液；以及(d)将得自于步骤(c)的醇萃取溶液内的醇溶剂移除至于，以得到一被干燥的第二萃取物。
依据本发明的香椿叶萃取物被证实能有效地抑制卵巢癌细胞(特别是SKOV3与PA-1)的生长。因此，在第三个方面，本发明提供一种药学组成物，其包含有呈一可有效抑制卵巢癌细胞生长的数量的如上所述的香椿叶萃取物。
本发明的上述以及其他目的、特征与优点在参照以下的详细说明与较佳实施例和随文检附的附图后会变为明显可知。
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明，附图中图1是一源自香椿叶的经水萃取的产物(即后文实施例1中所得到的“香椿5-4”)的一个HPLC洗提图(HPLC elution profile)；图2是依据本案方法的一个较佳具体例而得到的经醇萃取的香椿叶萃取物(即后文实施例1中所得到的“香椿5-2”)的一个HPLC洗提图；图3显示以不同的纯化处理所得到的5种香椿叶萃取物对于膀胱癌细胞株T24(bladder cancer cell line T24)的细胞毒性效用(cytotoxicity effect)，其中被用来当作该等香椿叶萃取物的萃取溶剂的H2O、50％EtOH以及99.5％EtOH被用作为对照组；图4显示依据本案方法的一个较佳具体例而得到的香椿叶萃取物(即“香椿5-2”)对于不同的癌细胞株的生长抑制效用，其中对照组为未加香椿叶萃取物的实验组；图5显示依据本案方法的一个较佳具体例而得到的香椿叶萃取物(即“香椿5-2”)在不同浓度(1mg/ml、100μg/ml)下对于卵巢癌细胞株SKOV3的细胞形态影响，其中对照组为未加香椿叶萃取物的实验组；图6显示依据本案方法的一个较佳具体例而得到的香椿叶萃取物(即“香椿5-2”)在不同浓度(1mg/ml、10μg/ml)下对于卵巢癌细胞株PA-1的细胞形态影响，其中对照组为未加香椿叶萃取物的实验组；以及图7显示带有卵巢癌细胞所长成的肿瘤的裸鼠在被投药以低剂量以及高剂量的依据本案方法的一个较佳具体例而得到的香椿叶萃取物(即“香椿5-2”)后所发生的肿瘤体积变化，其中肿瘤的体积每周被量测一次共计7周。
具体实施例方式
在许胜光博士所主导的一个先前研究(Hui-Chiu Chang et al.(2002)，American.Journal of Chinese Medicine，Vol.30，Nos.2 & 3，307-314)中，香椿叶的一个水性萃取物是根据Hui-Chiu Chang et al.(1998)，Am.J.Chin.Med.，Vol.30307-314中所揭示的方法而被制备出，其中100g的香椿叶被加入至1000mL的水中并予以沸腾加热处理直至剩下100mL的溶液，继而以1000xg来离心历时20分钟，而得到上澄液来供该研究的实验用。
上述的香椿叶水性萃取物经实验而被发现会借由抑制人类肺癌细胞A549的周期素D1(cyclin D1)与周期素E(cyclin E)的表现而有效地阻断该人类肺癌细胞A549的细胞周期进展(cell cycle progression)。
申请人进一步尝试以各种处理方式来萃取香椿叶，而得到一种香椿叶萃取物，其是借由一包括下列步骤的方法而被制得(1)在加热下以水来萃取香椿叶而得到一经水萃取的第一萃取物，以及(2)以一醇来萃取步骤(1)所得到的该经水萃取的第一萃取物而得到一经醇萃取的第二萃取物。
于是，本发明提供一种用以制备香椿叶萃取物的方法，其包括下列步骤(a)在加热下以水来萃取香椿叶以得到一水性萃取溶液(aqueous extractsolution)；(b)将得自于步骤(a)的水性萃取溶液干燥以得到一被干燥的第一萃取物；(c)将得自于步骤(b)的第一萃取物溶于一醇溶剂内以形成一醇萃取溶液；以及(d)将得自于步骤(c)的醇萃取溶液内的醇溶剂移除至干以得到一被干燥的第二萃取物。
较佳地，在本案方法的步骤(a)中，该水性萃取溶液的获得是借由将加入有香椿叶的水予以煮沸浓缩至一适量，继而予以过滤。该过滤处理可以使用纱布、棉花或具选定筛孔大小的滤网来进行。在本发明的一个较佳具体例中，该过滤处理是以纱布与棉花来进行。在本发明的另一个较佳具体例中，该过滤处理是以70筛孔(mesh)的滤网来进行。
较佳地，本案方法的步骤(b)至步骤(d)是在低温条件下被进行，俾使对香椿叶内所含活性组份的破坏可降低至最低程度。
较佳地，在本案方法的步骤(b)中所进行的干燥处理是选自于下列所构成的群组冷冻干燥处理(lyophilization)、低温喷雾干燥处理(spray-drying)、低温蒸发处理(evaporation)以及此等的任一组合。在本发明的一个较佳具体例中，步骤(b)中所进行的干燥处理是冷冻干燥处理。
较佳地，本案方法的步骤(b)可包含下列处理步骤(i)将得自于步骤(a)的水性萃取溶液离心而得到一上澄液与一沉淀物；以及(ii)将步骤(i)中所得到的该上澄液进行一干燥处理。
较佳地，步骤(i)是借由在低温下(例如4℃)下以3000rpm来离心该得自于步骤(a)的水性萃取溶液而被进行。
较佳地，用于步骤(ii)的干燥处理是选自于一由下列所构成的群组冷冻干燥处理(lyophilization)、低温喷雾干燥处理(spray-drying)、低温蒸发处理(evaporation)以及此等的任一组合。在本发明的一较佳具体例中，步骤(i)中所进行的干燥处理是冷冻干燥处理。
另外，步骤(i)所得到的该沉淀物也可以类似的方式予以干燥而生成一干燥产物。
较佳地，步骤(d)中所进行的醇溶剂移除是借由一选自于下列群组中的处理来进行蒸发处理(evaporation)、冷冻干燥处理(lyophilization)、喷雾干燥处理(spray-drying)，以及此等的任一组合。在本发明的一个较佳具体例中，步骤(d)是借由冷冻干燥处理而被进行。
较佳地，在本案方法的步骤(d)中，在进行醇溶剂移除之前，该得自于步骤(c)的醇萃取溶液可被过滤或离心，以移除里面可能含有的不溶性物质。更佳地，于步骤(d)中，该得自于步骤(c)的醇萃取溶液先在4℃下以3000rpm予以离心历时12分钟，而后进行醇溶剂移除。
适用于本案方法的步骤(c)中的醇可为，例如，乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或此等的一种组合。在本发明的一个较佳具体例中，被使用于本案方法的步骤(c)中的醇是乙醇。
如下面实施例1中所示，由本案方法的步骤(b)所得到的该第一萃取物以及由本案方法的步骤(d)所得到的该第二萃取物被取样来作HPLC分析，而证实这两种萃取物的主要化合物波峰确有不同。
申请人也尝试将本案方法的步骤(d)所得到的该第二萃取物作进一步的萃取处理，包括(i)将该第二萃取物溶于50％的乙醇内，继而离心，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分；接而将该上澄液部分与该沉淀物部分分别予以冷冻干燥，而得到一经干燥的源自该上澄液部分的第三萃取物与一源自该沉淀物部分的第四萃取物；(ii)将上述步骤(i)所得到的第四萃取物溶于25％的乙醇内，继而离心，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分；接而将该上澄液部分与该沉淀物部分分别予以冷冻干燥，而得到一经干燥的源自该上澄液部分的第五萃取物与一源自该沉淀物部分的第六萃取物；(iii)将上述步骤(ii)中所得到的第六萃取物溶于逆渗透水(RO water)内，继而离心，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分；接而将该上澄液部分与该沉淀物部分分别予以冷冻干燥，而得到一经干燥的源自该上澄液部分的第一逆渗透水萃取物与源自该沉淀物部分的第二逆渗透水萃取物；以及(iv)将上述步骤(iii)中所得的第二逆渗透水萃取物溶于逆渗透(RO)水内，继而离心，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分；接而将该上澄液部分与该沉淀物部分分别予以冷冻干燥，而得到一经干燥的源自该上澄液部分的第三逆渗透水萃取物与一源自该沉淀物部分的第四逆渗透水萃取物，其中在上述步骤(i)、(ii)、(iii)与(iv)中，上澄液部分与沉淀物部分的分离是借由在4℃下以3000rpm来进行离心历时12分钟而被达成。
为探究以上所得到各种不同香椿叶萃取物的生物活性，申请人以选定的香椿叶萃取物来处理数种源自于妇女泌尿系统(urogynecological system)的癌细胞，以观察该等香椿叶萃取物是否具有细胞毒性。
一开始，申请人使用膀胱癌细胞株T24(bladder cancer cell line T24)来进行初步的抗癌细胞活性筛选，而发现依据本案方法所得到的该第二萃取物具有最佳的抑制癌细胞生长的活性，而由本案方法的步骤(b)所得到的该第一萃取物次之。
于是，申请人进一步以依据本案方法所得到的该第二萃取物来处理两种卵巢癌细胞株SKOV3与PA-1、两种子宫颈癌(cervical cancer)细胞株HeLa与HeLaS3以及一种子宫内膜癌(endometrial cancer)细胞株RL95-2，而发现该第二萃取物对于卵巢癌细胞具有选择性细胞毒性(selective cytotoxicity)。因此，本发明也预期到该香椿叶萃取物在制备供用于治疗卵巢癌的药学组成物上的应用。
于是，本发明提供一种药学组成物，其包含(a)一治疗有效量的一借由本案如上所述的方法而制得的该第二萃取物；以及(b)一药学上可接受的载剂。
包含有依据本案方法所制备的香椿叶萃取物的药学组成物可被应用于治疗一卵巢癌或膀胱癌。因此，对于一患有卵巢癌或膀胱癌的个体，可将依据本案方法所制备的香椿叶萃取物投药给该个体。
本发明也提供一种可用于治疗膀胱癌的药学组成物，其包含(a)一治疗有效量的一种选自于下列的香椿叶萃取物(i)一经由水来萃取香椿叶而得到的萃取物，以及(ii)一依序地经由水以及一醇来萃取香椿叶而得到的萃取物；以及(b)一药学上可接受的载剂。
如此处所用的，“药学上可接受的载剂”此术语是指本技艺所详知的适用于药物制造的载剂，这包括，但不限于，水、生理盐水、甘油、有机溶剂、安定剂、螯合剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、凝胶剂、脂质体等等。
依据本发明的药学组成物可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适于非经肠道的、口服的或局部投药的形式，这包括，但不限于，注射品(injection)、溶液(solution)、胶囊(capsule)、分散体(dispersion)、悬浮液(suspension)等等。
为了制造一口服固体状制品，一赋形剂以及，若需要的话，一黏合剂、一崩解剂、一润滑剂、一着色剂、一调味剂和/或类似的物可与依据本发明的香椿叶萃取物相混合。所形成的混合物接而可借由一本身为本技艺所知的方法而被形成为锭剂、经包覆的锭剂、颗粒、粉末、胶囊或类似的物。该等添加剂可为那些一般被使用于现今的技术领域当中者，包括赋形剂乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土(kaolin)、微晶纤维素(micro-crystalline cellulose)与硅酸(silicic acid)；黏合剂水、乙醇、丙醇、蔗糖溶液、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、虫胶(shellac)、磷酸钙与聚乙烯 咯酮(polyvinylpyrrolidone)；崩解剂干淀粉、藻酸钠(sodium alginate)、被粉末化的琼脂、碳酸氢钠、碳酸钙、硫酸月桂脂钠(sodium lauryl sulfate)、硬脂酸单甘油酯(monoglycerol stearate)与乳糖；润滑剂经纯化的滑石、硬脂酸盐类(stearate salts)、硼砂(borax)与聚乙二醇(polyethylene glycol)；以及矫味剂(corrigents)蔗糖、苦橙皮(bitterorange peel)、柠檬酸(citric acid)与酒石酸(tartaric acid)。
为了制造一口服液体状制品，一调味剂、一缓冲剂、一安定剂以及类似的物可与依据本发明的香椿叶萃取物相混合。所形成的混合物接而可借由一本身为本技艺所知的方法而被形成为一供内服用的溶液、一糖浆、一酏剂(elixir)或类似的物。在此例中，该调味剂可相同于那个于上面所提到者。该缓冲剂的例示物为柠檬酸钠，而该安定剂的例示物为黄蓍胶(tragacanth)、阿拉伯胶(gum arabic)与明胶。
为了制造一注射品，一pH值调控剂、一缓冲剂、一安定剂、一等渗性剂(isotonicity)以及类似的物可与依据本发明的香椿叶萃取物相混合。所形成的混合物接而可借由一本身为本技艺所知的方法而被形成为一皮下的、肌肉内的或静脉内注射品。该pH值调控剂与缓冲剂的实例包含柠檬酸钠、醋酸钠与硫酸钠。该安定剂的例示物包含焦亚硫酸钠(sodium pyrosulfite)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙硫醇酸(thioglycollic acid)与硫代乳酸(thiolactic acid)。该等渗性剂(isotonicity)的实例包括氯化钠与葡萄糖。
较佳地，依据本发明的药学组成物被制造成适于注射用的形式，例如粉末针剂(powder injection)、注射用冻晶产品(lyophilization product for injection)、乳化针剂(emulsion injection)、油性针剂(oily injection)、微脂体针剂(liposome injection)等形式。
如此处所用的，“治疗有效量”此术语是指当一种含有依据本发明的香椿叶萃取物的药学组成物被投予一需要该组成物来治疗的个体时，一足以提供所欲达致的治疗功效且不会对非标的组织或器官产生非所欲的严重危害的用量。该治疗有效量会视不同的因素而变化，该等因素包括，例如，病症的种类，要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况以及反应，药物的投药途径等。此一治疗有效量可为熟习此技艺人士来决定。
依据本发明的药学组成物的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化要被治疗的疾病的严重性，投药途径，以及要被治疗的个体的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，依据本发明的药学组成物的每日投药剂量通常是0.67mg/Kg体重至6.7mg/Kg体重，呈单一剂量或是分成数个剂量的形式，且可被非经肠道地、口服地或局部地投药。较佳地，依据本发明的药学组成物可以经由腹腔内注射(intraperitoneal injection)、连续静脉内注射(continuous intravenousinjection)、局部动脉单一注射(topical arterial single injection)、局部肿瘤直接注射(topical tumor direct injection)等方式被投药。在一个较佳具体例中，依据本发明的药学组成物可借由腹腔内注射或局部肿瘤直接注射方式来投药。
依据本发明的药学组成物可被每天投药，较佳地，可以每周连续投药5天，然后休息2天，共计进行一为43天的期间或是直到出现缓解(remission)为止。
依据本发明的药学组成物可被单独地投药，或是与其他用于治疗卵巢癌和/或膀胱癌的治疗方法或治疗药物来组合使用。该等治疗方法包括化学疗法和外部光束放射疗法(external beam radiation therapy)，而该等治疗药物包括，但不限于，太平洋紫杉醇(paclitaxel)、顺氯氨铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、环磷醯胺(cyclophosphamide)以及多索如必辛(doxorubicin)。
本发明将就下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，该等实施例仅为例示说明使用，而不应被解释为本发明的实施的限制。
实施例实施例1.香椿叶萃取物的制备本实施例中所使用的香椿叶是采自于种植在中华民国台湾省云林县土库镇的香椿树。
萃取程序A采取香椿幼嫩叶并用水清洗一下，而后以每公斤香椿叶使用4L的逆渗透水(ROwater)的用量，将适量的逆渗透水与香椿叶相混合，并予以煮沸历时30分钟。之后，取出香椿叶，并以慢火将萃取液浓缩，然后以滤网(70mesh)予以过滤。所得到的滤液可直接使用Virtis机来进行冷冻干燥，而得到一香椿叶粗萃取物(crudeextract)，其被称为“香椿5-4”(另又称“TSL-CE”)。一般而言，依此方式来处理100g的香椿叶平均可得到大约5～6g的冻干粉末。
另外，上述的经过过滤处理而得到的滤液可于冷冻干燥之前进行一离心处理在4℃下以3000rpm(Beckman AvantiTMJ-30I)予以离心历时12分钟，而得到一上澄液部分以及一含有不溶物的沉淀物部分。该上澄液部分接而使用Virtis机来进行冷冻干燥，而得到一呈冻干粉末的水萃取物(water extract)，其被称为“TSL-1”。
上述所得到的“香椿-4”与“TSL-1”都是本发明中所称的“经水萃取的第一萃取物”，为方便例示，申请人使用“TSL-1”来进行下面的进一步萃取程序。
萃取程序B将上述萃取程序A所得到的“TSL-1”萃取物(50g)溶于99.5％乙醇(400ml)内以进行醇萃取。所形成的醇溶液在4℃下以3000rpm(Beckman AvantiTMJ-30I)予以离心历时12分钟，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分。该上澄液部分接而使用Virtis机来进行冷冻干燥，而得到一呈冻干粉末的经进一步纯化的醇萃取物(thefurther purified alcohol extract)，其被称为“香椿5-2”(另又称“TSL-2”)。
依此方式来处理100g的“TSL-1”萃取物，可以得到大约1g的“香椿-2”冻干粉末。
萃取程序C上述萃取程序B所得到的沉淀物部分以Virtis机予以冷冻干燥，继而溶于50％乙醇内。所形成的50％醇溶液在4℃下以3000rpm(Beckman AvantiTMJ-30I)予以离心历时12分钟，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分。该上澄液部分接而使用Virtis机来进行冷冻干燥，而得到一呈冻干粉末的萃取物，其被称为“香椿5-5”(另又称“TSL-3”)。
萃取程序D上述萃取程序C所得到的沉淀物部分以Virtis机予以冷冻干燥，继而溶于25％乙醇内。所形成的25％乙醇溶液在4℃下以3000rpm(Beckman AvantiTMJ-30I)予以离心历时12分钟，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分。接而使用Virtis机来分别冷冻干燥该上澄液部分与该沉淀物部分，而得到两个呈冻干粉末的分别被称为“TSL-4”与“TSL-4P”的萃取产物。
萃取程序E将上述萃取程序D所得到的萃取产物“TSL-4P”溶于RO水内，而所形成水性溶液在4℃下以3000rpm(Beckman AvantiTMJ-30I)予以离心历时12分钟，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分。接而使用Virtis机来分别冷冻干燥该上澄液部分与该沉淀物部分，而所得到两个呈冻干粉末则分别被称为“TS-H2O-1”(另又称“TSL-5”)与“TSL-5P”的萃取产物。
萃取程序F将上述萃取程序E所得到的萃取产物“TSL-5P”溶于RO水内，而所形成水性溶液，在4℃下以3000rpm(Beckman AvantiTMJ-30I)予以离心历时12分钟，而得到一上澄液部分以及一沉淀物部分。接而使用Virtis机来分别冷冻干燥该上澄液部分与该沉淀物部分，而得到两个呈冻干粉末，分别被称为“香椿5-4R”(另又称“TS-H2O-2”或“TSL-6”)与“TSL-7”的萃取产物。
实施例2.香椿叶萃取物的HPLC分析为了解依据本案方法所获得的香椿叶萃取物的主要成份分布，将实施例1的萃取程序A与萃取程序B所分别得到的“香椿5-4”与“香椿5-2”拿来进行分析高压液相层析(HPLC)。
实验操作方法于本实施例中，HPLC分析仪器为Hitachi L-7100pump，L-7420uv/vis detector，D-2410 degaser；分析软体为D-7000 HPLC System Manager；分析管柱为MightysilRP-18 GP 250-4.6(5m)；分析条件梯度溶剂A甲醇；B水；0~10分钟20％~50％A；10~20分钟50％~70％A；20~40分钟70％A；流速为1ml/min；波长254nm。
结果图1与图2分别显示“香椿-4”与“香椿5-2”的HPLC洗提图。比较图1与图2可清楚看出，在相同的分离条件下，“香椿5-4”与“香椿5-2各自含有的主要化合物不太一样。“香椿-4”与“香椿-2”在5、16与18分钟的滞留时间点处都出现有同样的化合物波峰，而且“香椿5-2”内所含有的化合物有大部分是出现在前面跑出来的3~4个波峰内，但“香椿5-4”在25与26分钟的滞留时间点处另多了2~3个波峰讯号。
实施例3.香椿叶萃取物的XTT细胞增殖分析(XTT cell proliferation assay)为筛选具有抑制癌细胞生长活性的香椿叶萃取物，本实施例使用XTT细胞增殖分析(XTT cell proliferation analysis)，并以购买自美国类型培养收集中心[American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108USA]的膀胱癌细胞株T24(bladder cancer cell line T24)来测试实施例1中所制得的5种香椿叶萃取物，包括“香椿-4”、“香椿-2”、“香椿-5”、“香椿5-5R”与“香椿5-4R”。
实验操作方法于实施例1中所制得的5种香椿叶萃取产物“香椿-4”、“香椿-2”、“香椿5-5”、“香椿5-5R”与“香椿5-4R”被拿来进行XTT细胞增殖分析(Roche MolecularBiochemicals)。各个香椿叶萃取物的测试浓度分别为1、10与100μg/mL，并以H2O、50％EtOH以及99.5％EtOH作为对照组。
膀胱癌细胞T24被培养于添加有10％胎牛血清(FCS)、10000单位/mL的青霉素(penicillin)、10mg/mL的链霉素(streptomycin)、0.025mg/mL的两性霉素B(Amphotericin B)的DMEM-F12培养基内。
XTT细胞增殖分析(Roche)是借由下列方式来进行将细胞以5×103个细胞/100μl/井的浓度接种于96井培养盘的各井中，并将培养盘置于一含5％CO2的培养箱中培养历时24小时。之后，将1μl的各个香椿萃取液(溶于PBS中)加入至被培养的T24细胞至一最终浓度为100μg/mL、10μg/mL或1μg/mL。另取1μl的水、50％酒精、99.5％酒精加入至T24细胞中以作为对照组。培养历时72小时之后，移除培养基并加入100μl的新鲜培养基以及一预先配好的50μl的XTT混合试剂(XTT试剂∶电子偶合试剂＝50∶1)，并将培养盘置于培养箱内历时4小时，之后，以ELISA读取机在波长492nm及690nm下量测吸光值(OD＝OD492-OD690)，并计算出药物的抑制50％癌细胞生长的浓度(IC50)，也就是实验组的吸光值为对照组所具者的二分之一时的细胞浓度。
结果图3显示实施例1中所制得的5种香椿叶萃取产物“香椿5-4”、“香椿5-2”、“香椿5-5”、“香椿5-5R”与“香椿5-4R”的XTT细胞增殖分析结果，其中吸光值越低则表示存活的细胞数越少。从图3清楚可见，“香椿5-2”对于膀胱癌细胞株T24的细胞毒性最强，而“香椿-4”次的。此外，“香椿-2”对于膀胱癌细胞株T24的细胞毒性具有剂量-依赖性，而所计算出的IC50是71.3μg/mL。
实施例4.香椿叶萃取物对于膀胱癌细胞株T24的的细胞周期的影响本实施例进一步探究“香椿5-2”对于膀胱癌细胞株T24的细胞周期的影响。以不同剂量的“香椿5-2”来处理非同步化的(unsynchronized)的膀胱癌细胞株T24历时24小时，之后，以萤光活化细胞拣别机分析[Fluorescence-activated cellsorter(FACS)analysis]来评估细胞周期变化。
实验操作方法将癌细胞以2×105个细胞/盘的浓度接种于6cm培养盘内，并予以培养历时24小时，之后培养基被换成含有1、10或100μg/mL的“香椿5-2”的培养基，并继续培养历时24小时。之后，用胰蛋白(trypsin)来处理培养盘，并以培养基来中和所收集的细胞，以1500rpm离心历时5分钟，去除上清液并加入300μl的PBS来均匀冲散细胞，并缓慢加入700μl的99.5％酒精以将细胞固定。经放置在4℃下作用30分钟后，再次离心以去除上清液，并加入含0.1％triton及0.05％RNase的PBS。于37℃下作用1hr之后进行离心以去除上清液，并加入含40μg/ml的溴化丙锭(propidium iodide)的PBS。于4℃下进行避光作用历时30分钟后，以60μmMesh Filter来冲散过筛，再以流式细胞仪进行分析。
结果参见下面表1，申请人发现，在以“香椿5-2”处理之后，处在G2阶段的膀胱癌细胞T24增多，特别是当以100μg/mL来处理时。由于使用会标的化至处在不同细胞周期阶段的细胞的药物的组合治疗是为癌症治疗的标准方式，表1中所示的结果提供了依据本发明的香椿叶萃取物在临床应用上的有用资料。
表1
实施例5.香椿叶萃取物的活体外抗癌细胞试验(in vitro anti-cancer celltest)本实施例进一步以“香椿5-2”来处理数种源自于妇女泌尿系统(urogynecological system)的癌细胞，包括两种卵巢癌(ovarian cancer)细胞株SKOV3与PA-1、两种子宫颈癌(cervical cancer)细胞株HeLa与HeLaS3以及一种子宫内膜癌(endometrial cancer)细胞株RL95-2，以观察“香椿5-2”对该等癌细胞是否具有细胞毒性。
癌细胞株的来源与培养于本实施例中，所使用的SKOV3、PA-1、HeLa、HeLaS3以及RL95-2皆购买自ATCC，且此等癌细胞株均被培养于添加有10％FCS、10000单位/mL的青霉素、10mg/mL的链霉素、0.025mg/mL的两性霉素B的DMEM-F12培养基内。
实验操作方法将癌细胞以15×105个细胞/盘的浓度接种于10cm培养盘内并予以培养过夜。之后，将培养基换成含有1mg/mL“香椿5-2”(“香椿-2”有先被溶于PBS内以供浓度调配)的培养基，并继续培养24或48小时。之后，以胰蛋白(trypsin)(0.05％胰蛋白/0.02％EDTA，配于PBS内)来处理培养盘，并将所收集的细胞置于微试管(microtube)内。将微试管置于一冰浴上，令细胞悬浮于悬浮液(0.05％胰蛋白/0.02％EDTA，配于PBS内)中，并和锥虫蓝(trypan blue)以1∶1的比例来均匀混合，而后在显微镜(Nikon TS100)下以血球计数器(hemacytometer)来计数存活的细胞数目。
结果为进一步确认“香椿5-2”对于源自妇女泌尿系统(urogynecological system)的癌细胞是否具有细胞毒性(cytotoxicity)，以浓度为1mg/mL的“香椿5-2”来处理卵巢癌细胞株SKOV3与PA-1、子宫颈癌细胞株HeLa与HeLaS3以及子宫内膜癌细胞株RL95-2历时24小时或48小时，并与未加“香椿5-2”的对照组作比较，所得到的结果被显示于图4中，其中纵座标表示与对照组相比较的细胞存活率(％)。
从图4清楚可见，在1mg/mL的作用浓度下，对于卵巢癌细胞株SKOV3与PA-1，“香椿5-2”在24小时的处理时间下即已展现出强力的生长抑制效用(几乎可以完全抑制这两种卵巢癌细胞的生长)。而对于子宫内膜癌细胞株RL95-2与子宫颈癌HeLaS3，“香椿5-2”在48小时的处理时间下所显现出的癌细胞生长抑制效用并不高。对于子宫颈癌细胞株HeLa，“香椿5-2”在48小时的处理时间下显现出60％的癌细胞生长抑制效用。
下面表2显示“香椿5-2”对于所测试的5种癌细胞株的各别IC50值，其中IC50值的计算是根据加药48时以后，会有50％细胞存活(将对照组的存活细胞总数当作100％)的药物浓度。如表2中所示，“香椿5-2”对于卵巢癌细胞株SKOV3与PA-1的IC50值分别为28μg/mL与10μg/mL。这些数据显示“香椿5-2”具有被制造成一有效的抗卵巢癌药物的潜力。
表2
实施例6.香椿叶萃取物对于卵巢癌细胞的细胞形态与细胞周期的影响本实施例进一步研究卵巢癌细胞在受到本发明的香椿叶萃取物作用后所产生的细胞形态以及细胞周期变化。
实验操作方法参照实施例5的实验操作方法中所描述的方式，将卵巢癌细胞株SKOV3与PA-1培养于培养盘内，并分别以1mg/mL、100μg/mL与10μg/mL的“香椿5-2”予以处理后，于显微镜下观察细胞形态的变化。
另外，参照实施例4的实验操作方法中所描述的方式，将卵巢癌细胞株SKOV3培养于培养盘内，并分别以100μg/mL与10μg/mL的“香椿5-2”予以处理后，进行FACS分析。
结果图5与图6分别显示“香椿5-2”在所使用的剂量下对于卵巢癌细胞株SKOV3与PA-1所造成的形态影响。如图5与图6(在100X的放大倍率下)所示，在1mg/mL的使用剂量下处理24小时后，“香椿5-2”造成大量的细胞凋亡(apoptosis)以及细胞漂浮(cell floating)。而在100μg/mL与10μg/mL的使用剂量下处理24小时后，“香椿5-2”仍然会各别地导致卵巢癌细胞株SKOV3与PA-1的显著细胞死亡。
另外，卵巢癌细胞株SKOV3在以不同剂量的“香椿5-2”予以处理24小时后，借由FACS分析来观察卵巢癌细胞株SKOV3的细胞周期分布(cell cycledistribution)。结果被示于下面表3中。
表3
卵巢癌细胞株SKOV3在以“香椿5-2”予以处理4小时后，借由细胞存活分析(cell survival assay)来作评估，而发现“香椿5-2”对于位于M阶段的卵巢癌细胞株SKOV3有一升高的细胞毒性(表4)。
表4活的死亡的 细胞凋亡(数目) (数目) 的细胞(％)8h没有Tx历时4小时 83 11.28h TS 1mg/ml Tx历时4小时157 12 7.112h没有Tx历时4小时 77 11.312h TS 1mg/ml Tx历时4小时 72 911.116h没有Tx历时4小时 113 32.616h TS 1mg/ml Tx历时4小时 59 34.820h没有Tx历时4小时 80 22.420h TS 1mg/ml Tx历时4小时 82 66.824h没有Tx历时4小时 104 87.124h TS 1mg/ml Tx历时4小时 88 14 13.7M阶段没有Tx历时4小时91 99.0M阶段TS 1mg/ml Tx历时4小时 78 36 31.6注缩写TS表示“香椿-2”萃取物，缩写Tx表示处理。
表3与表4的果示，“香椿5-2”提高卵巢癌胞株SKOV3停在G2/M段(G2/M phase)，且于在M段的卵巢癌胞株SKOV3更具毒性施例7.香椿 萃取物的活体 物模型香椿叶的萃取物于抑制肿瘤细胞的试验为确认依据本发明的香椿叶萃取物能否于活体内产生抗癌效用，本实施例进一步以裸鼠来进行活体内动物模型试验。
实验操作方法将2×105SKOV3细胞/0.1mL PBS接种子雄性裸鼠(Foxn1nu/Foxn1nu)(24-29公克重，5-6周大，n＝5)的背部皮下，待发展出至少3mm的肿瘤后(约需一个星期)，再予以腹腔内注射香椿5-2以观察治疗效果。
香椿5-2的准备如下将香椿5-2溶于PBS内再加以过滤，并配制成67.25mg/mL及672.5mg/mL，然后依每只裸鼠的体重给予香椿5-2(剂量0.6725μg/g体重或6.725μg/g体重)。
结果
体内带有由卵巢癌细胞株SKOV3(2×105细胞)的皮下注射所发展出的明显肿瘤团块的雄性裸鼠被腹腔内注射以0.67μg/g体重(低剂量)或6.7μg/g体重(高剂量)的“香椿5-2”，每个星期予以注射5天共计进行7周。
从解剖检查发现，被投药以高剂量(6.7μg/g体重)的香椿叶萃取物的试验组显示出裸体内的肿瘤有明显缩小至近乎消失的程度，而被投药以低剂量(0.67μg/g体重)的香椿叶萃取物的试验组也显示出裸鼠体内的肿瘤有缩小。至于被注射以磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)的对照组，裸鼠体内的肿瘤显现出持续成长。相较于以PBS处理的对照组，“香椿5-2”的腹腔内注射处理明显地以一剂量依赖性关是来抑制肿瘤团块的生长。
图7显示，在经过7周的观察下，裸鼠身上的肿瘤团块体积变化。特别地，被注射以高剂量的“香椿5-2”的裸鼠，其体内原有的肿瘤团块几乎消失不见。此外，参见表5，在“香椿5-2”的腹腔内注射历时7周之后，并没有对试验裸鼠的骨髓、肾脏或肝脏造成任何显著的毒性。
表5
以上的实验结果清楚显示，依据本发明的香椿叶萃取物具有发展为一抗卵巢癌药物的高潜力。
于本说明书中被引述的所有文献资料以其整体被并入本案作为参考资料。若有所冲突时，本发明的说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下，可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的申请专利范围所示者的限制。
权利要求
1.一种香椿叶萃取物，其特征在于该香椿叶萃取物是借由一包含下列步骤的方法而被制得(i)在加热下以水来萃取香椿叶而得到一经水萃取的第一萃取物，以及(ii)以一醇来萃取步骤(i)所得到的该经水萃取的第一萃取物而得到一经醇萃取的第二萃取物。
2.一种香椿叶萃取物，其特征在于该香椿叶萃取物是借由一包含下列步骤的方法而被制得(a)在加热下以水来萃取香椿叶，以得到一水性萃取溶液；(b)将步骤(a)中所得到的水性萃取溶液干燥，以得到一被干燥的第一萃取物；(c)将步骤(b)中所得到的第一萃取物溶于一醇溶剂内，以形成一醇萃取溶液；以及(d)将得自于步骤(c)的醇萃取溶液内的醇溶剂移除至干，以得到一被干燥的第二萃取物。
3.如权利要求1或2所述的香椿叶萃取物，其特征在于其中该香椿叶萃取物可供应用于制备一用于治疗卵巢癌或膀胱癌的药物。
4.一种用以制备一香椿叶萃取物的方法，其特征在于该方法包含下列步骤(a)在加热下以水来萃取香椿叶，以得到一水性萃取溶液；(b)将得自于步骤(a)的水性萃取溶液干燥，以得到一被干燥的第一萃取物；(c)将得自于步骤(b)的第一萃取物溶于一醇溶剂内，以形成一醇萃取溶液；以及(d)将得自于步骤(c)的醇萃取溶液内的醇溶剂移除至干，以得到一被干燥的第二萃取物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于其中在步骤(a)中，该水性萃取溶液的获得，是借由将加入有香椿叶的水予以煮沸浓缩至一适量，继而予以过滤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于其中该过滤处理是借由使用一选自下列的器具来进行纱布、棉花、一具选定筛孔大小的滤网，以及此等的一种组合。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于其中步骤(b)中所进行的干燥处理是选自于下列所构成的群组冷冻干燥处理低温喷雾干燥处理、低温蒸发处理，以及此等的一种组合。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于其中步骤(b)中所进行的干燥处理是冷冻干燥处理。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于其中步骤(b)包含下列处理步骤(i)将得自于步骤(a)的水性萃取溶液离心而得到一上澄液与一沉淀物；以及(ii)将步骤(i)中所得到的该上澄液进行一干燥处理。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于其中步骤(ii)所进行的干燥处理是选自于下列所构成的群组冷冻干燥处理、低温喷雾干燥处理、低温蒸发处理以及此等的一组合。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于其中被使用于步骤(c)中的醇是选自于下列所构成的群组乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇，以及此等的一种组合。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于其中被使用于步骤(c)中的醇是乙醇。
13.如权利要求4所述的方法，其特征在于其中步骤(d)中所进行的醇溶剂移除，是借由一选自于下列群组中的处理来进行冷冻干燥处理、蒸发处理、喷雾干燥处理，以及此等的一种组合。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于其中步骤(d)是借由冷冻干燥处理而被进行。
15.一种药学组成物，其特征在于该药学组成物包含(a)一治疗有效量的一借由权利要求4的方法而被制得的香椿叶萃取物；以及(b)一药学上可接受的载剂。
16.如权利要求15所述的药学组成物，其特征在于其中该药学组成物是供应用于治疗一选自于卵巢癌与膀胱癌的癌症。
17.一种用以抑制一选自于卵巢癌细胞与膀胱癌细胞的癌细胞的生长的药学组成物，其特征在于该药学组成物包含(a)一治疗有效量的一借由权利要求4的方法而被制得的香椿叶萃取物；以及(b)一药学上可接受的载剂。
18.一种用于治疗膀胱癌或卵巢癌的药学组成物，其特征在于该药学组成物包含(a)一治疗有效量的一选自于下列的香椿叶萃取物(i)一经由水来萃取香椿叶而得到的香椿叶萃取物；(ii)一如权利要求1或权利要求2的香椿叶萃取物；或(iii)一借由权利要求4的方法而被制得的香椿叶萃取物；以及(b)一药学上可接受的载剂。
全文摘要
本发明揭示一种借由依序地以水以及一醇来萃取香椿叶而被制得的香椿叶萃取物。本案也揭示用以制备香椿叶萃取物的方法，以及使用该等萃取物来制备供应用于治疗卵巢癌和/或膀胱癌的药物的用途。
文档编号A61P35/00GK1631409SQ20031012447
公开日2005年6月29日 申请日期2003年12月24日 优先权日2003年12月24日
发明者袁行修, 许胜光, 贾宜琛 申请人:高雄医学大学