专利名称：生物性创伤敷料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物性创伤敷料，其获自经处理的选自皮肤、小肠粘膜和羊膜的动物性材料，其保持表皮的生物学结构和成分，在真皮部分下层接触创面层中具有无细胞基质，并保留了细胞外基质原始形状，不含可引起宿主生物排斥的细胞性成分。本发明还涉及一种制备所述生物性创伤敷料的方法，所述经处理的动物性材料用于制备烧伤、切割伤等的创面覆盖的覆盖物以及制备植入物的用途，以及含有所述经处理的动物性材料的用于烧伤、切割伤等的创面覆盖的覆盖物。
背景技术：
皮肤作为人体最大且最为复杂的器官在损伤中最易受到破坏。还已知皮肤作为肌体表面的覆盖物具有约1.5-2.0平方米的体表面积。已知皮肤具有调节热量、防止通过水份蒸发造成脱水和作为屏障抵抗化学和感染性侵袭的功能。皮肤的结构有三层复层上皮(epidermis)，和由充分表征的基膜(basement membrane)将其分隔的下层组织基质，即真皮(dermis)。在表皮中的细胞有连续的增殖、成熟和死亡过程， 其分成一系列表示角质形成细胞成熟过程中不同阶段的层。基膜是一个具有均一厚度的动态结构，其连接表皮和下层结缔组织。基膜通过其半结缔组织性结构在机械上稳定表皮。而通过胶原蛋白纤维的组织为皮肤提供相当大的强度之真皮基质具有特化的成分和结构。胶原性网络结构由不同成分的弹性蛋白纤维、蛋白聚糖(proteoglycon)、纤联蛋白和其他成分内部交织而成。在真皮中，还存在着血管、淋巴管、神经、皮脂腺和汗腺以及毛囊。
表皮提供了肌体与环境之间的屏障，而真皮赋于皮肤强度、耐久性和弹性。
众所周知，烧伤患者由于皮肤结构的破坏引起水份丧失的急剧增加，由于蒸发的冷却作用造成患者身体中大量的热量丧失。为了维持正常体温，代谢速率加快，进而引起患者脂肪和蛋白质的迅速耗尽。
因此，在烧伤治疗中，通常需要尽早施行坏死物清除以及确定的创口覆盖有利于严重烧伤病人的预后。同时，烧伤治疗中最重要的任务是快速重建闭合的表皮以阻止肌体水分通过蒸发而丧失。
采取上述措施可消除因能量、蛋白质、电解质和体液丧失造成的急性致命威胁。此外，表皮是防止感染，也是防止烧伤后最常见死因的脓毒症的最有效屏障。
对于烧伤创面闭合最经典的标准方法是自体拉网状(split-thickness)皮肤移植。但是在超过50％体表面积的严重烧伤中， 自体移植受到患者供体部位稀少的限制。已经开发并使用了数种临时覆盖物，但是它们均无法提供如自体移植带来的全部益处。
多种皮肤替代物如同种异体移植，猪异种移植和人羊膜均被用作临时敷料。截止目前，尸源皮肤或是同种异体移植是最佳可得创伤敷料。
同种异体皮肤多年来在烧伤患者中用作有效临时创面敷料。当用作敷料时，通常将同种异体皮肤置于患者的创面，但是，最终所述皮肤将被患者排斥。通过既存在于表皮又存在于真皮的表达异源MHC抗原的细胞可引发所述排斥反应。所述细胞包括内皮细胞、成纤维细胞和表皮细胞。
人尸体来源的皮肤，无论是低温保藏的还是新鲜的，均是用于覆盖切割、烧伤创面的最佳生物敷料，尤其是当创面较大没有足够的自体移植物时。新鲜或冷冻的尸体皮肤(同种异源移植物)均能降低创面的细菌数目，减少蒸发性水份丧失，保护重要结构(包括防止创面干燥)、减轻疼痛。
尽管在缺乏自体移植皮肤时尸源皮肤是目前最有效的创面覆盖物，新鲜皮肤的来源十分有限，因为临床的需要总不能很好的与供体来源相匹配。由于众所周知的原因，尸源皮肤不是总能够获得。
因此，一种易于应用的、可备于货架代替尸源皮肤的产品对于烧伤治疗而言具有重要意义。
异种移植是指获自不同于受者的动物种类之组织的移植。尽管已经尝试了许多不同类型的动物皮肤，目前最常用于异种移植的是猪皮肤。
新鲜、冷冻和冷冻干燥条件下的猪异种移植为商业化的，但是，部分市售的新鲜及冷冻猪皮肤的卫生性和存活性遭到质疑。冷冻的和冷冻干燥的异种移植物在处理上有困难。冷冻的皮肤需保持冷冻状态并在使用前融化。冷冻干燥的异种移植物经过冷冻干燥除去水份，虽然其可以常规保存，但是在需要经过在无菌盐水中浸泡而重建。
在短期内，异种移植物和同种异源移植物都能用作创面覆盖材料，但是，异种移植物不能被血管化。因此，如果置于创面超过数日，则不能有效抵御感染。
与尸源皮肤相比，异种移植物的粘附性、止血性质和通过使用异种移植物减轻痛苦等方面的功能与尸源皮肤几乎相同。但是，由于异种移植物的抗原性较强，所以造成快速的排斥反应。通常，在异种移植物干燥和脱落及与创面强烈粘附之前，应于用后第三天去除异种移植物，这需要切割。
目前，开发并使用了数种临时覆盖物，但是均不能提供同种异体移植的全部有利之处。所述产物包括异种移植物和多种不同的人造的渗透性膜。由于所述产物为临时性的，它们需要频繁的更换，由此将未完全愈合的创面暴露于细菌污染之下。此外，它们还与免疫排斥相关，以及掺入和形成不适于随后的自体移植物着床的肉芽组织。
为克服上述用于烧伤治疗的不同异种移植物存在的诸多缺陷，本发明首次开发了一种新的生物性创伤敷料，其采用经本发明所述方法处理的动物性材料，制备烧伤治疗用的生物性创伤敷料，取得了临床上的巨大成功。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种生物性创伤敷料，其获自经处理的动物性材料，其特征在于保持了表皮的生物学结构和成分，且在真皮部分下层接触创面层中具有无细胞基质，并保留了细胞外基质原始形状，不含有可引起宿主生物排斥的细胞性成分。
具体地，经处理的本发明所述生物性创伤敷料主要结构为完整的表皮组织+完整的基底膜结构+经特殊处理过的真皮层。本领域已知，胶原参与创面愈合的全过程，胶原具有促进上皮细胞的粘附和分化的功能。本发明所述生物性创伤敷料中其真皮层主要为胶原，利用所述敷料覆盖烧伤创面，实际上为创面提供了外源性的胶原。
在本发明中，所述动物性材料选自哺乳动物的皮肤、小肠粘膜和羊膜。所述哺乳动物优选为猪、牛、羊、兔、狗或鸡，特别优选为猪。在本发明中，所述动物性材料经处理，优选的经化学方法处理，选择性去除了与待植入创面相接触的下层中可引起排斥反应的细胞性成分。
其中所述化学方法包括但不限于采用甲醛、戊二醛、双醛淀粉、糖醛、氨氰、二酰亚胺、二异氰酸和环氧化合物等固定剂或其混合物处理所述动物性材料。在本发明的一个优选实施方案中，采用戊二醛处理所述动物性材料的表皮。
本发明还涉及一种制备选择性固定选自皮肤、小肠粘膜、羊膜的动物性材料的方法，其中所得动物性材料保持了表皮的生物学结构和成分，且在真皮部分下层接触创面层中具有无细胞基质，并保留了细胞外基质原始形状，不含有可引起宿主生物排斥的细胞性成分。经上述加工的动物皮肤或小肠粘膜、羊膜保留了期望的表皮(或上皮)生物结构，具有低抗原性的非细胞性真皮，可用作烧伤患者治疗中的生物性创伤敷料。
一经使用，所述生物性创伤敷料的真皮部分能够为肌体创伤所接受，并可作为形成血管的模板，在长期置于创伤处时能够提供对感染的抗性。
在本发明具体涉及了一种制备生物性创伤敷料的方法，其包括如下步骤处理动物性材料，以除去真皮下层中的细胞性成分a)用固定液固定动物性材料表皮层；和b)依次用水和洗涤液洗涤经处理的动物性材料。
本发明所述方法中，所述动物性材料选自皮肤、小肠粘膜、羊膜。
在本发明的一个优选实施方案中，所述方法还包括步骤c)，将所得经处理的动物性材料进行灭菌处理。
适于本发明所述方法的固定剂选自甲醛、戊二醛、双醛淀粉、糖醛、氨氰、二酰亚胺、二异氰酸和环氧化合物或其混合物，优选为戊二醛。
在本发明所述方法中，通常可在室温下进行操作，固定的时间可以为1-120分钟，特别优选为5-60分钟，最优选5-30分钟。
适于本发明所述方法的洗涤液选自0.1％-10％的Triton X 100或SDS，或其混合物。
在本发明所述方法中，洗涤液洗涤的时间可以从1-100分钟，优选为20-60分钟，特别优选从25-45分钟。
本发明还涉及一种由上述方法制备的生物性创伤敷料。由前述处理过程知晓，本发明所述的生物性创伤敷料主要结构为完整的表皮组织+完整的基底膜结构+经特殊处理过的真皮层。其可应用于烧伤创面，使创面重新获得机械屏障，减少创面水分蒸发，防止创面污染，有利于淤滞带的恢复。
本发明另一方面，所述生物性创伤敷料还任选的包含已知可用于促进伤口生长和/或防止创面感染的药物。具体的，所述促进伤口生长的药物包括但不限于；表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，生长激素。
所述防止创面感染的药物包括但不限于磺胺类药物，例如SD银和碘伏。
具体地，在本发明的一个实施方案中，采用如下步骤处理所述动物性材料，以除去动物性材料的真皮下层中的细胞性成分a)用固定液固定动物材料表皮层；
b)依次用水和洗涤液洗涤经处理的动物性材料；任选的，还包括步骤c)，将所得经处理的动物性材料进行灭菌处理。
本发明中，所述动物性材料选自皮肤、小肠粘膜、和羊膜。
其中，适于制备本发明所述生物性创伤敷料的固定剂选自戊二醛溶液或甲醛溶液或其混合物，优选为戊二醛。可以采用固定的时间为1-30分钟，特别优选为10-20分钟。
适于制备本发明所述生物性创伤敷料的洗涤液选自0.1％-10％的Triton X 100或SDS，或其混合物。洗涤液洗涤的时间可以从1-100分钟，优选为20-60分钟，特别优选从25-45分钟。
本领域技术人员知晓，能够采用常规组织学染色方法(HE染色)观察，或通过免疫组织化学方法进行特异性抗原抗体标记后观察，确定经上述方法处理获得的本发明所述生物性创伤敷料。
本发明的又一方面还涉及由上述方法处理的动物性材料用于制备生物性创伤敷料的用途。优选的，所述生物性创伤敷料用于烧伤、切割伤等的创面覆盖治疗。
本发明的再一方面，涉及用于烧伤、切割伤等的创面覆盖治疗的生物性创伤敷料，其获自通过上述方法处理的动物性材料。
特别的，应用本发明所述生物性创伤敷料，能够得到与采用同种异体皮类似的治疗效果，同时还具有便于储存和运输的优点。具体的，同源异体皮的保存及运输需要超低温冰箱及液氮等条件，不易实现。而本发明所述生物性创伤敷料仅需在常温冰箱(4℃左右)中保存，运输温度＜30℃即可。
下面结合实施例和
对本发明进一步予以描述。
图1本发明所述生物性创伤敷料的HE染色切片图。其中A部分为所述创伤性敷料的表皮层，B部分为所述创伤性敷料的真皮层。
实施例实施例1利用猪皮肤制备本发明所述生物创伤性敷料将新鲜猪皮去毛，用生理盐水或缓冲液冲洗干净。将10ml戊二醛和5ml甲醛，加水至500ml，然后用所得混合液涂布表皮30分钟。再用蒸馏水冲洗5遍，每次5000ml。经冲洗后的皮肤放入1％Triton X100(5000ml)中60分钟，再次用水冲洗3次，每次5000ml。将经冲洗的表皮放入1％SDS溶液(5000ml)中浸泡3小时。冲洗后灭菌消毒。制备成切片备用。
实施例2所述生物性创伤敷料的表征如实施例1所述处理的猪皮得到本发明所述生物性创伤敷料，分别采用常规组织学染色和免疫组织化学方法进行抗原抗体标记，观察经处理的皮肤结构。
常规组织学染色法(HE染色疏木精伊红)观察切取经实施例1所述方法处理的1cm×1cm大小的表皮，用石蜡包埋，经组织学切片后，HE染色，显微镜观察。结果显示，所述方法制备的动物表皮具有完整的表皮组织及表皮上的角化层结构，在表皮组织与真皮组织交界处的真皮层内，仍然有未脱除的细胞，但是在真皮下层，即将与所要用于覆盖的烧伤创面接触的层面内，细胞已经被完全脱除，该层面内仅保留了细胞外的基质成分与结构(参见图1)。免疫组织化学法观察切取经实施例1所述方法处理的1cm×1cm大小的表皮，经冰冻切片后，利用MHC(主要组织相容性复合体)进行特异性免疫标记，显微镜观察。结果显示，经本发明所述方法制备的动物表皮，在表皮层及表皮与真皮交界处的真皮层内有明显的抗原抗体阳性反应，而在与所要用于覆盖的烧伤创面接触的层面内，显示无任何抗原抗体反应。
上述实验结果表明，经本发明所述方法处理的哺乳动物的表皮层、小肠粘膜和羊膜的上皮层均被完好保留。因此，所述材料能够很好的起到对机体与外界的屏障作用。由于在靠近将要与所覆盖的创面相接触的真皮层内的细胞已被完全脱除，因此，在创面覆盖时，不会引起机体对其产生排斥反应，从而延长了创面的覆盖时间。
实施例3本发明所述生物性创伤敷料与常规敷料的效果比较(一)动物实验比较使用体重为250-300克的纯种Wister大白鼠10只，将其乙醚麻醉，固定。用碘伏消毒。在每只大白鼠背部制成直径为3厘米断层创面两处。分别将本发明所述方法制备的生物性创伤敷料与常规制备的猪皮移植入上述形成的创面，考察常规制备的猪皮与本发明所述生物性创伤敷料对创面覆盖的效果。结果如下1.一般观察10只Wister大白鼠，术后1天左右少动，进食水量较少；术后2天左右，逐渐活动正常，恢复术前状态。
2.首次打开敷料包采用本发明所述生物性创伤敷料覆盖的移植创面，术后3天打开敷料包，未见创面有渗出、感染现象，覆盖物的色泽无改变。
采用常规处理的猪皮覆盖的移植创面，术后3天打开敷料包，有少许血性渗出，及1处皮下少量积液，无明显感染现象，覆盖物外观变化不明显。
3.创面愈合过程术后7天，采用本发明所述生物性创伤敷料覆盖的移植创面，无感染现象，覆盖物大部分转红，与创面粘附性好。
术后7天，采用常规处理的猪皮部分变干，呈深褐色或暗黑色，4个创面有皮下积液、淤血斑及少量分泌物。
术后14天，采用本发明所述生物性创伤敷料覆盖的移植创面，上皮生长，扩展明显，部分覆盖物干痂脱落、创基愈合，无裸露创面。
术后14天，采用常规处理的猪皮部分有液化现象，少部分有脱落，创面裸露。
4.最后创面愈合情况术后21天，采用本发明所述生物性创伤敷料变干脱落，创面愈合。
术后21天，采用常规处理的猪皮覆盖的创面大部分愈合，有部分小创面裸露及占位现象。
(二)临床实验效果病例选择30例临床患者，男22例，女8例，最大年龄45岁，最小年龄16岁，平均年龄28.5岁。最大烧伤面积30％，最小烧伤面积10％，平均烧伤面积20.5％。
分组本组资料分四组2.1三度烧伤创面行切削痂手术，自体网状皮移植，本发明所述生物性创伤敷料覆盖，共8例。
2.2深二度烧伤创面应用6例。洗必太酒精猪皮作对照。
2.3浅二度烧伤创面应用10例。洗必太酒精猪皮作对照。
2.4感染烧伤创面应用6例。洗必太酒精猪皮作对照。
处置方法3.1如实施例1所述制备本发明生物性创伤敷料。“洗必太”酒精猪皮用新鲜断层猪皮为原料，用75％酒精+0.1％洗必太液浸泡一周后使用。使用前用生理盐水冲洗三到五次，并根据创面大小剪裁。注意冲洗本发明生物性创伤敷料时勿揉搓，以免损伤其表皮层。
3.2创面处理切削痂创面须彻底止血。深浅烧伤创面予以彻底清创，用0.1％洗必太湿敷半小时后应用。感染创面先清除分泌物，然后用0.1％洗必太湿敷半小时，再应用生物性创伤敷料。
3.3覆盖创面将准备好的生物性创伤敷料按创面大小剪裁后覆盖创面，生物性创伤敷料须紧贴于创面，敷料下不能有气泡、渗血、渗液。避免影响治疗效果。并加压包扎，患肢制动。
3.4换药时间切削痂创面术后一周检视创面；深浅二度烧伤创面及感染创面每隔两到三天检视创面。如生物性创伤敷料与创面贴附紧密，无积血、积液、溶解等现象无需更换生物性创伤敷料，反之，则需更换敷料直至创面愈合。生物性创伤敷料与创面贴附紧密时勿强行揭去敷料以免损伤新生的上皮组织。当创面愈合后生物性创伤敷料将自行脱落。
4、观察指标每次检视创面应观察两种生物性创伤敷料与创面贴附是否紧密、溶解、有无占位、脱水、积液积血情况、坏死组织脱落快慢以及愈合时间。
5、创面细菌培养生物性创伤敷料应用前后做创面细菌培养。
6、创面印片检查观察生物性创伤敷料应用前后局部细胞学变化。结果浅二度或深二度创面早期应用本发明所述生物性创伤敷料后，渗出明显减少，创面洁净，创缘炎症反应轻，与创面贴附紧密，无溶解、占位、脱水情况。覆盖创面五天内本发明所述生物性创伤敷料保持湿润无干燥现象。深二度烧伤坏死组织溶解迅速，分离完全，上皮生长加快，创面愈合提前。浅二度创面愈合时间为7-10天，平均8.5天；深二度创面愈合时间12-15天，平均13.5天。三度切削痂创面术后7-8天创面全部愈合。感染创面应用后创面坏死组织脱落快，渗出明显减少，创面洁净，敷料溶解慢，肉芽组织形成好，有利于早期植皮。
浅二度或深二度创面早期应用“洗必太”酒精猪皮后，与创面贴附紧密，无溶解，但占位明显，敷料脱水干燥。浅二度创面愈合时间为12-14天，平均12天；深二度创面愈合时间16-19天，平均17.5天。感染创面应用后创面坏死组织脱落不明显，渗出减少不明显，敷料溶解快。
对感染创面作了创面印片检查，以了解应用生物敷料前后创面细胞学改变。用无菌载玻片请放于创面上，使渗出液粘附于玻片，推片后行瑞氏染色，以40×10高倍镜检查。应用本发明所述生物性创伤敷料前白细胞满视野，呈脓球状。应用后白细胞数减少至偶见，形态恢复，正常并可见单核细胞、巨噬细胞及游移的上皮细胞。
结论烧伤治疗中应用的常规方法制备的异体猪皮，但由于其抗原性高，应用在创面上溶解早，以及具有占位的特性，影响了大面积烧伤救治成功率。本发明所述方法处理所得的生物性创伤敷料利用哺乳类动物皮肤与人类皮肤有着相似的组织结构和组成的特性，实现对机体的屏障功能。为克服异源动物皮肤较人类皮肤对患者所引发的抗原性更高的缺陷，本发明所述方法实现了在保留动物性材料的保水性、透气性及屏障功能的基础上，有针对性降低其与所要覆盖创面部分的免疫原性，作为烧伤创面覆盖材料达到了与同种异体皮相同的效果。
此外，本发明所述方法制备的生物性创伤敷料还具有良好的机械屏障作用。
上述临床实验结果表明，本发明所述生物性创伤敷料应用后，创面保持湿润无干燥现象，起到了机械屏障作用。同时，由于其抗原性比其它方式获得的动物皮肤低，接近同种异体皮，可覆盖创面时间延长，且无占位性，无交叉感染，为创面提供了良好的上皮化环境，加速了创面愈合时间。
临床应用结果还表明，采用本发明所述生物性创伤敷料，由于其经处理的真皮层中主要为胶原，能够使上皮生长加快，修复加快，创面愈合提前。
上述临床应用结果显示，本发明所述生物性创伤敷料治疗烧伤创面的效果优于传统处理的猪皮，与同源异体皮的效果相似。
权利要求
1.一种生物性创伤敷料，其获自经处理的动物性材料，其特征在于保持了表皮的生物学结构和成分，且在真皮下层接触创伤面部分保留了原细胞外基质的相似结构，具有无细胞表皮部分，选择性去除真皮部位可引起宿主产生排斥的细胞性成分。
2.权利要求1所述的生物性创伤敷料，其中所述动物性材料选自皮肤、小肠粘膜、和羊膜，所述动物选自猪、牛、羊、兔、狗和鸡。
3.一种制备权利要求1所述生物性创伤敷料的方法，其包括如下步骤处理动物性材料以除去真皮下层中的细胞性成分a)用固定液选择性固定动物性材料；b)依次用水及洗涤液洗涤经固定步骤a)处理的动物性材料。
4.权利要求3所述的方法，其还包括步骤c)，将所得经处理的动物性材料进行灭菌处理。
5.权利要求3所述的方法，其中所述动物性材料选自皮肤、小肠粘膜、和羊膜，所述动物选自猪、牛、羊、兔、狗和鸡。
6.权利要求3所述的方法，其中固定剂选自戊二醛溶液或甲醛溶液，或其混合物；洗涤液选自0.1％-10％的Triton X 100或SDS，或其混合物。
7.权利要求3所述的方法，其中所述方法在室温下处理1-120分钟，优选5-60分钟，特别优选5-30分钟。
8.一种由权利要求3所述方法制备的动物性创伤敷料。
9.权利要求1所述生物性创伤敷料用于制备烧伤、切割伤创面覆盖的覆盖物的用途。
10.权利要求1所述生物创伤性敷料用于制备植入物的用途。
11.一种用于烧伤、切割伤创面覆盖的覆盖物，其由权利要求1所述生物性创伤敷料组成，任选的，其还含有已知用于促进伤口生长和/或防止感染的药物。
全文摘要
本发明涉及一种生物性创伤敷料，其获自经处理的选自皮肤、小肠粘膜和羊膜的动物性材料，其保持表皮的生物学结构和成分，在真皮部分下层接触创面层中具有无细胞基质，并保留了细胞外基质原始形状，不含可引起宿主生物排斥的细胞性成分。本发明还涉及一种制备所述生物性创伤敷料的方法，所述经处理的动物性材料用于制备烧伤、切割伤等的创面覆盖的覆盖物以及制备植入物的用途，以及含有所述经处理的动物性材料的用于烧伤、切割伤等的创面覆盖的覆盖物。
文档编号A61L15/00GK1608681SQ20031012430
公开日2005年4月27日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年10月17日
发明者胡杰 申请人:胡杰