专利名称：多酚及其氧化物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学和有机化学研究领域，具体涉及α-突触核蛋白与多酚及其氧化物的反应机理以及在诊断探针和药物开发中的应用。
背景技术：
帕金森病是一种除了阿尔次海默综合症以外，最为常见的神经功能退化性疾病。它有两个主要的病理特征一是患者大脑黑质部位多巴胺能神经细胞的程序性死亡；二是患者脑内死亡的神经细胞中有不溶性的Lewy体的出现，其主要成分为α-突触核蛋白(α-Synuclein，α-Syn)的积聚形式。在临床上，它主要表现为病人反应迟缓，震颤，机体僵硬，进一步失去平衡等症状。在65岁年龄的人群中，该病患者约占1％左右，而年龄达到85岁的人群中该病占的比例就上升到了4-5％。近年来，随着人口老龄化的进一步到来，帕金森病给人们的生活带来的压力将显得越加严峻。
目前，人们对帕金森病已经有了广泛的研究，但对其致病机理还不是完全清楚。虽然已经知道遗传突变和环境毒素等与帕金森病有关，但是导致细胞死亡的原因还不清楚。最近一些关于α-突触核蛋白与膜的作用以及α-突触核蛋白对多巴胺能神经细胞具有选择性毒性的研究让我们在细胞退化的基础上对帕金森病的致病机理有了更进一步的了解。
发明内容
本发明者发现，α-突触核蛋白可与多酚及其氧化物(多酚极容易自氧化为醌)发生特异反应，形成共价的加合物抑制了α-突触核蛋白的纤维化，从而完成了本发明。
具体而言，本发明第一方面涉及多酚类化合物及其氧化物在制备用于抑制α-突触核蛋白纤维化的制剂中的用途。
本说明书中所用的术语“多酚”或“多酚类化合物”具有本领域技术人员通常认可和理解的含义，其通常是指具有2个或2个以上羟基的芳环类化合物。在一些较佳的实施方案中，所述多酚类化合物包括，但不局限于，邻苯二酚，对苯二酚，多巴胺，左旋多巴，对苯二醌，茶多酚，EGCG，维生素C，对硝基苯酚或间苯三酚。如
图1所示，所述多酚类化合物首先在空气中氧化成为醌，然后与α-突触核蛋白发生特异性结合，从而阻止了α-突触核蛋白的纤维化。
在本发明中，术语“α-突触核蛋白”的含义不仅包括全长蛋白，任何α-突触核蛋白的片段也包括在其范围内，例如但不局限于，N-端片段α-Syn1-60。
基于α-突触核蛋白与多酚及其氧化物之间的特异性反应，本发明还涉及用多酚及其氧化物来检测α-突触核蛋白的用途。例如，可用经标记(如同位素标记)的多酚类化合物及其氧化物对样品中α-突触核蛋白存在与否、含量、以及在组织样品中的位置等方面进行检测。
本发明另一方面还提供了一种α-突触核蛋白与多酚类化合物及其氧化物的加合物，在所述加合物中，多酚类化合物及其氧化物与α-突触核蛋白中赖氨酸的侧链氨基共价连接。所述加合物可以呈单体形式，也可以是寡聚体加合物形式，较佳的是2-8聚体形式。通过将α-突触核蛋白与多酚类化合物及其氧化物混合，在合适的条件下培育一定时间(例如37℃下0-48小时)，就可获得本发明的加合物。该方法具有操作简单，反应迅速等优点。
在较佳的实施方案中，所述多酚类化合物及其氧化物宜带有标记(如同位素标记3H或18F等)，以便在放射性同位素检测或PET(正电子断层成像)用作探针。
另外，本发明的α-突触核蛋白与多酚类化合物及其氧化物的加合物还可作抗原，来产生针对该加合物的抗体。如上所述，本领域技术人员应能理解还可利用α-突触核蛋白与多酚类化合物及其氧化物之间的特异性反应，通过在含有赖氨酸残基的α-突触核蛋白的片段中引入多酚类化合物及其氧化物，例如多巴胺或多巴醌，以此作为抗原制备针对多巴胺加合物的单抗或多抗用于临床诊断。
因此，本发明另一方面还提供了针对上述α-突触核蛋白或其片段与多酚类化合物及其氧化物的加合物的抗体。
本发明获得的加合物具有以下用途(1)可用来研究具有多酚结构的化合物的引入对α-突触核蛋白纤维化的影响；(2)通过α-突触核蛋白与多酚类化合物的反应产物的更强毒性，制备帕金森病的药物筛选模型，筛选抗帕金森病的药物；(3)利用本发明的反应，在α-突触核蛋白中引入3H或18F标记的多酚类化合物作为探针用于放射性同位素检测或PET(正电子断层成像)；(4)研究α-突触核蛋白在多巴胺能神经细胞程序性死亡过程中的作用；(5)利用本发明得到的多酚化合物-α-突触核蛋白的共价交联寡聚体加合物，结合其它生物工程技术，制备针对寡聚体的单抗或多抗用于实验研究，并开发帕金森病诊断抗体。
所以，本发明另一方面还涉及本发明的α-突触核蛋白与多酚类化合物及其氧化物的加合物在筛选抗帕金森病的药物中的用途，以及在放射性同位素检测或正电子断层成像中作为探针的用途。
附图简述图1显示了多酚类化合物与α-突触核蛋白反应的示意图。多酚类化合物在空气中先氧化为醌，再与α-突触核蛋白的反应生成加合物。
图2显示了不同多酚类化合物抑制α-突触核蛋白纤维化的结果，其中HQ，对苯二酚；CA，邻苯二酚；L-dopa，左旋多巴；DA，多巴胺；Q，对苯二醌；pNP，对硝基苯酚；VC，维生素C；pXG，对苯二甲醇。对苯二甲醇不含酚羟基，作为负对照，它不能抑制α-突触核蛋白的纤维化。
图3显示了分子排阻层析分离纯化寡聚体的结果，其中1为未反应的α-突触核蛋白；2，3，4分别为α-突触核蛋白与对苯二酚、邻苯二酚及对苯二醌反应1天后的样品。在洗脱时间为30～35分钟的峰为单体蛋白质，在23～29分钟的峰是寡聚体蛋白。
图4显示了寡聚体的MALDI-TOF质谱分析，图中M为单体，D为二聚体。
图5显示了SDS-PAGE电泳鉴定共价交联的寡聚体的结果，其中左边样品溶解于常规的SDS-PAGE上样缓冲液，右边样品溶解于含有8M尿素的上样缓冲液中。
图6显示了寡聚体对PC12细胞的毒性结果，其中Monomer表示从分子排阻层析实验中分离得到的单体；del DA表示α-突触核蛋白与多巴胺反应1天后，通过脱盐而除去剩余的多巴胺后的样品，其为α-突触核蛋白的单体和寡聚体的混合物。
具体实施例方式
实验材料邻苯二酚，对苯二酚，多巴胺，左旋多巴，EGCG，Thioflavin T购自Sigma公司，对苯二醌，茶多酚，维生素C，对硝基苯酚为国产的分析纯试剂。
实施例1α-突触核蛋白的表达和纯化将人源α-突触核蛋白的基因或片段克隆到pET-3a质粒中，然后将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。从平板上挑取单菌落接种于50mL LB中，37℃过夜震荡培养。次日将过夜菌按1∶100的比例转接到2L LB培养基中，37℃震荡培养至A600达到0.6～0.8。加终浓度为0.01mM的IPTG，在220rpm转速下继续培养4小时。以后的操作皆在冰上进行。4000rpm离心10分钟，收集菌体，经冰上预冷的细菌缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)洗涤后，按每升LB培养基的菌体悬浮于40mL的比例加入破菌缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.5mM PMSF，pH8.0)。置于冰浴30分钟后，用超声波破菌(5×5分钟)，15,000rpm离心20分钟。测量上清体积，用30％饱和度的(NH4)2SO4溶液沉淀，在冰浴上搅拌1小时后，10,000rpm离心15分钟。取上清，补加(NH4)2SO4到50％的饱和度后，在冰上搅拌1小时，10,000rpm离心15分钟。将沉淀用尽可能少的平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0)溶解，15,000rpm离心20分钟去处不溶物。用Sephadex G-25柱脱盐。将脱盐后的蛋白溶液上样于预先用缓冲液平衡的DEAE-Sephadex A-25阴离子交换柱，用同一缓冲液洗脱杂蛋白到A280＜0.02。用含有0～500mM NaCl的洗脱液(50mM Tris-HCl，pH8.0)梯度洗脱，用试管分部收集穿出组分。用15％SDS-PAGE鉴定蛋白条带，把含有目标蛋白的组分合并，用Amicon浓缩后用FPLC superose-12柱层析进一步纯化，可得到95％以上纯度的蛋白质。
实施例2多酚及其氧化物抑制α-突触核蛋白的纤维化将邻苯二酚，对苯二酚，多巴胺，左旋多巴，对苯二醌，茶多酚，EGCG，维生素C，对硝基苯酚，间苯三酚等配成储液，分别以不同的浓度和200μMα-突触核蛋白一起在37℃保温，在第0，1，2，4，6天，每天取出20μl蛋白，保存于-20℃。用Thioflavin T(ThT)与蛋白质结合后482nm的荧光强度值来表征α-突触核蛋白纤维化的快慢。在冻存的20μl蛋白中加入5μM的ThT，然后补加50mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0)到1mL，以446nm为激发波长，测定482nm的荧光强度。作482nm的荧光强度与保温时间曲线图(图2)。从图2可以看出，随着保温时间的延长，加入化合物的样品的482nm的荧光强度的增幅远远小于α-突触核蛋白独自积聚样品的荧光强度。这说明这些化合物都能显著抑制α-突触核蛋白的纤维化。
实施例3α-突触核蛋白或N-端片段α-Syn1-60与多酚及氧化物的反应将邻苯二酚，对苯二酚，多巴胺，左旋多巴，对苯二醌，茶多酚，EGCG，维生素C，对硝基苯酚等以0.05～10mM的浓度，分别和200μM的α-突触核蛋白或α-Syn1-60在37℃保温0～48小时。用下列方法鉴定紫外-可见光谱分析。将不同保温时间的反应混合物取出60μL，加入缓冲液稀释到600μL后，进行波长范围为265nm-450nm的紫外-可见光谱扫描。从谱图上可以看出，在波长280nm和345nm处出现了两个吸收峰。280nm的吸收光谱的增加，表明有酚加成到了α-突触核蛋白上；而345nm吸收光谱的增加，则表明有新的化合物生成。
α-突触核蛋白，赖氨酸，酪氨酸，甘氨酸和N-乙酰甘氨酸分别与对苯二醌在37℃反应0-24小时后，在不同的时间各取出60μL，加缓冲液到600μL后，进行波长范围为265nm-450nm的紫外-可见光谱扫描。α-突触核蛋白，赖氨酸，酪氨酸，甘氨酸与对苯二醌反应后，其345nm的吸收值随着反应时间的延长而增加；而N-乙酰甘氨酸与对苯二醌反应后或对苯二醌独自保温后，其345nm的吸收值随着反应时间的延长却不增加，这说明与对苯二醌反应的是游离的氨基。α-突触核蛋白中，有15个赖氨酸残基和一个N-端的氨基，因此，α-突触核蛋白与多酚及其氧化物的反应，是α-突触核蛋白的赖氨酸侧链的氨基与多酚的氧化物的反应。
将反应混合物进行分子排阻分析，收集单体蛋白质进行电喷雾质谱测定，其分子量比α-突触核蛋白或α-Syn1-60增加104n+16m，其中n，m为整数(1≤n≤6，0≤m≤4)。104n表明有n个对苯二醌分子共价交联到α-突触核蛋白上。16m表明蛋白中的甲硫氨酸侧链可能被氧化为亚砜结构，而使分子量增加为16的倍数。
核磁共振波谱分析。将400μMα-突触核蛋白用换为92％D2O的PBS缓冲液后，进行1H-1H COSY图谱扫描。然后加入4mM的对苯二醌反应48小时后，进行1H-COSY图谱扫描。对比两个图谱发现，在芳环区域(化学位移在6.0到8.0之间)没有新的位点出现，这排除了酪氨酸残基与对苯二醌反应的可能。用300μM的15N标记的α-突触核蛋白进行HSQC图谱扫描。然后加入3mM对苯二醌或3mM多巴胺反应24小时后，进行HSQC图谱扫描。将反应前后的图谱重叠发现，有三个新的点出现。由于与溶剂的快速交换，赖氨酸侧链的氨基不在HSQC谱中出现，说明α-突触核蛋白与多酚及其氧化物反应后生成了仲胺键。
实施例4寡聚体蛋白的制备将对苯二醌或多巴胺与α-突触核蛋白在37℃保温1～2天后，取出100μL反应混合物，注射到预先用100mM PBS溶液平衡好的Superose-12HR 10/30柱(Pharmacia公司产品)中，以0.4mL/min的流速进行洗脱。A280与洗脱时间图(图3)上可以看出，未保温的α-突触核蛋白只在30～35分钟出现一个峰，这是单体蛋白的峰；而于对苯二醌或多巴胺反应1～2天后，除了在30～35分钟出现一个峰外，还在23～29分钟出现了一个峰，这就是寡聚体蛋白的峰。收集23～29分钟洗脱出的蛋白，即得到含多酚化合物的寡聚体蛋白。
实施例5寡聚体的鉴定将收集的寡聚体蛋白进行激光基质解离吸附质谱测试，在谱图(图4)上接近30,000Da有一个主要的峰，在接近15,000Da有一个小峰，这表明有二体的共价加合物。将收集的寡聚体蛋白用冷冻干燥冻干后，用含8M尿素或不含尿素的SDS上样缓冲液溶解，然后加样到胶浓度为15％的SDS-PAGE上进行电泳分析，用马斯亮蓝R250染色。电泳结果显示(图5)，除36KDa和54KDa的条带外，还有更大分子量的条带。单体的α-突触核蛋白在SDS-PAGE电泳图谱上的分子量为18KDa，这说明形成了二体，三体甚至更大分子量的共价交联寡聚体。
实施例6寡聚体的毒性用DMEM培养基(另含有60％马血清，10％牛胎血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)在37℃下于5％CO2培养箱中增殖PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞，rat pheochromocytoma)，显微镜下检测细胞的生长情况，以每孔1×105个活细胞的密度接种于48孔培养板中，相同条件下继续培养24小时后，把培养基换成200μL不含酚红的DMEM培养基。在细胞培养板中加入终浓度为10μM的蛋白质积聚物(样品为α-突触核蛋白与多巴胺反应1天后除去过量的多巴胺，以及从分子排阻层析中分离得到的多巴胺-α-突触核蛋白的单体加合物)。继续培养24小时后，加入终浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，三小时后加入相同细胞培养液体积的细胞裂解液(20％SDS，50％DFM，pH4.7)，并过夜培养。利用MTT被活细胞还原的能力读取570nm下的可见光吸收值(图6)。从图上可以看出，单体加合物对PC12细胞的MTT的还原率在90％以上，而去除多巴胺的样品对PC12细胞的MTT的还原率在75％左右。多巴胺与α-突触核蛋白反应后主要形成单体加合物以及少量的寡聚体。因此说明寡聚体对细胞是具有毒性的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.多酚类化合物及其氧化物在制备用于抑制α-突触核蛋白纤维化的制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多酚类化合物选自邻苯二酚，对苯二酚，多巴胺，左旋多巴，对苯二醌，茶多酚，EGCG，维生素C，对硝基苯酚或间苯三酚。
3.多酚类化合物及其氧化物在用于检测α-突触核蛋白中的用途。
4.一种α-突触核蛋白与多酚类化合物及其氧化物的加合物，其特征在于，在所述加合物中，多酚类化合物及其氧化物与α-突触核蛋白中赖氨酸的侧链氨基共价连接。
5.根据权利要求4所述的加合物，其特征在于，所述多酚-α-突触核蛋白加合物呈单体或寡聚体加合物形式。
6.根据权利要求5所述的加合物，其特征在于，所述多酚类化合物及其氧化物带有标记。
7.一种抗体，其特征在于，它针对权利要求4所述的α-突触核蛋白或其片段与多酚类化合物及其氧化物的加合物。
8.权利要求4所述的α-突触核蛋白与多酚类化合物及其氧化物的加合物在筛选抗帕金森病的药物中的用途。
9.权利要求4所述的α-突触核蛋白与经标记的多酚类化合物及其氧化物的加合物在放射性同位素检测或正电子断层成像中作为探针的用途。
全文摘要
本发明提供了多酚类化合物及其氧化物在制备用于抑制α－突触核蛋白纤维化的制剂中的用途，以及在用于检测α－突触核蛋白中的用途。本发明还涉及一种多酚类化合物及其氧化物与α－突触核蛋白中赖氨酸的侧链氨基共价连接而形成的单体或寡聚体加合物及其用途和针对该加合物的抗体。
文档编号A61K31/375GK1723878SQ20041005294
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月19日 优先权日2004年7月19日
发明者胡红雨, 李洪涛 申请人:中国科学院上海生命科学研究院