专利名称：一种sars冠状病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种SARS冠状病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
2002年11月至2003年2月，我国广东爆发病因不明的非典型肺炎(atypicalpneumonia)，随后在我国香港、越南、加拿大、新加坡、美国和中国等世界各地陆续出现相似的病例，引起全球民众恐慌和各国政府及科研人员的高度关注。2003年3月5日，世界卫生组织(WHO)就非典型肺炎向全球发布了卫生警报，并将此病命名为严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)。科学家研究表明，严重急性呼吸综合症(SARS)是由一种新的冠状病毒(sars)引发的。这种新的冠状病毒是一个包膜的正链RNA病毒，基因组全长29,727核苷酸，有11个开放阅读框，分别编码4种结构蛋白(S、M、N、E蛋白)、依赖于RNA的RNA聚合酶、5种未知蛋白。据报道，截至到2003年7月11日，全球32个国家和地区有8437个人感染了sars病毒，其中有813个人死亡。全世界致死率大约为10.5％。为了抑制病毒的传播扩散，一种有效的诊断SARS病毒的试剂盒是必需的。现有的几种检测方法大致可分为四类1分子检测方法(PCR检测)PCR检测有较高的特异性但灵敏度较差，这意味着一个阴性的实验结果并不能排除患者没出现SARS病毒表达，且实验过程较长约4-5小时，容易发生污染(即出现假阳性和假阴性结果)。而且由于病毒变种发生频繁、引物设计等原因，分子检测方法的检出率还有待进一步提高。
2免疫学方法(抗体检验)它的检测原理是基于用病毒蛋白去检测患者或疑似患者血液中的抗体，而对血清抗体的研究表明，“非典”病人发病后，最早的抗体IgM出现要在7天左右，10天时达到高峰，15天左右下降，抗体IgG 10天后产生，20天左右达到高峰。一般患者在刚发热时，血液里有病毒，但抗体还没有生成。有时“非典”患者在潜伏期，尚未出现症状或是症状并不典型，令医生难以判断，等到体内产生抗体，症状明确时，病情也随之加重，延误了治疗和隔离。
3细胞学方法(细胞培养)
细胞培养方法是最早发展的实验室检测手段，从SARS患者所采集的样本(如呼吸道分泌物，血液或者粪便)中的病毒，可以通过感染性细胞培养并产生出病毒，能够在电子显微镜下直接观察到病毒颗粒，因而十分准确。但技术难度高，操作复杂，所需时间长，对设备要求高，不适于大量检测。
4.蛋白质芯片方法(抗体检测)蛋白质芯片方法也是来检测抗体，与上述的免疫学方法检测抗体一样，都有一定的缺陷(见上述)。
现在的检测方法都存在着一定的问题，仍需一种更早期、更灵敏、更快捷、更有效的检测方法，进行早期鉴别诊断。因而我们迫切需要制备一种特异性高，亲和力强的单克隆抗体及以双抗体夹心法为基础的ELISA检测病毒抗原的诊断型试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗SARS病毒N蛋白的抗体，尤其是单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种早期检测SARS病毒的免疫检测方法。
本发明的再一目的是提供一种早期检测SARS病毒的诊断试剂盒。
本发明的一方面，提供了一种抗SARS病毒的抗体，所述抗体特异性地与SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质结合。较佳的，所述抗体为单克隆抗体。在一实施例中，所述抗体由保藏号为CCTCC NO-C200407的细胞株分泌。优选的，所述抗体亚型为IgG1。
本发明的另一方面，提供了一种分泌上述抗体的杂交瘤细胞株。优选的，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO-C200407。
本发明的另一方面，提供了一种早期检测SARS病毒的免疫检测方法，所述检测方法使用上述单克隆抗体。较佳的，所述抗体由保藏号为CCTCC NO-C200407的杂交瘤细胞株分泌。
本发明的另一方面，提供了一种检测SARS病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有与标记物结合的上述单克隆抗体；标记物包括荧光标记物、放射性标记物和酶标记物。较佳的，所述抗体由保藏号为CCTCC NO-C200407的杂交瘤细胞株分泌。
本发明的另一方面，提供了上述抗体在诊断SARS病毒感染所致疾病中的用途。优选的，所述疾病为严重急性呼吸综合症。
本发明的另一方面，提供了上述单克隆抗体在制备检测试剂盒中的用途，检测试剂盒含有与标记物结合的单克隆抗体；标记物包括荧光标记物、放射性标记物和酶标记物。较佳的，所述抗体由保藏号为CCTCC NO-C200407的杂交瘤细胞株分泌。
本发明的另一方面，提供了上述单克隆抗体在制备治疗SARS病毒感染所致疾病的药物组合物中的用途，所述药物组合物包含本发明的单克隆抗体，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。优选的，所述抗体由保藏号为CCTCC NO-C200407的杂交瘤细胞株分泌。
本发明所述SARS病毒N蛋白、N蛋白、sars N蛋白均指SEQ NO2所示序列的蛋白。抗SARS病毒的抗体，指与SEQ NO2所示序列的蛋白特异性结合的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，优选单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体可通过本发明的杂交瘤产生，因此是可以从培养本发明的杂交瘤的培养液中获得的。然而，产生本发明的单克隆抗体的方法不受特别限制，但如果基因工程化的抗体能与SARS病毒N蛋白特异性结合，它也在本发明的范围内。
本发明的杂交瘤产生识别SARS病毒N蛋白作为抗原的单克隆抗体，并可通过经N蛋白免疫的动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合获得。本发明的杂交瘤细胞株已于2004年4月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(武汉)，保藏号为CCTCC NO-C200407。
本发明的杂交瘤可以用本领域已知的细胞融合技术产生。因此，用N蛋白作为免疫原免疫除了人以外的动物，将该动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤，从其选出产生识别N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤，从而获得了本发明的杂交瘤。
上述免疫原不受特别限制，但是可以是任何含有SARS病毒N蛋白的免疫原。例如可以通过在合适的培养基上培养表达SARS病毒N蛋白的工程菌株，或者含有SARS病毒N蛋白的融合蛋白。
经免疫产生本发明的杂交瘤的动物不受特别限制，包括但不限于山羊、绵羊、豚鼠、小鼠、大鼠和家兔。在其中优选的是小鼠。
本发明的单克隆抗体可以检测SARS病毒感染的存在与否。
本发明的单克隆抗体的应用领域不受特别限制，但能用于免疫测定，用于判断SARS病毒的感染。
基于上述单克隆抗体，本发明提出早期检测SARS病毒的免疫测定法，本发明的免疫测定法用至少一种本发明的单克隆抗体进行，方法可仅用一种抗体进行。
通常作为用于免疫测定方法的单克隆抗体，考虑灵敏度高超的单克隆抗体作优选抗体，因为与特异性低而背景噪声高的多克隆抗体相比较，其特异性高而背景噪声低。
作为本发明的免疫测定法，包括酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹、免疫层析等技术。上述各种免疫测定法可用于以竞争法或夹心法，用标记物标记的抗原或抗体测定靶抗原或抗体。
在上述各种免疫测定法中，ELISA和免疫层析技术是优选的。
上述竞争性方法基于测试标本中SARS病毒和已知量的标记的SARS病毒N蛋白与本发明的单克隆抗体定量竞争性结合反应。在上述特别提到的竞争性方法中，在含有SARS病毒的标本溶液中加入预定量的固定在载体上的抗体和预定量的用标记剂标记的SARS病毒N蛋白。然后，测定保留在载体上的标记剂活性或未保留在载体上的标记剂活性。对此，优选几乎同时加入抗体和标记抗原。
上述夹心法包括使SARS病毒夹在本发明固定的单克隆抗体和用标记剂标记的本发明的单克隆抗体或多克隆抗体之间，然后加入针对标记物(例如酶)的底物等，显示颜色等，从而检测标本中的SARS病毒。
上述提到的标记剂，可以是放射性同位素(例如125I)、酶、酶底物、磷光物质、荧光物质、生物素和着色物质。在将这些标记剂与抗原或抗体结合中，可使用马来酰亚胺法(J.Biochem.(1976)，79，233)，活化生物素法(J.Am.Chem.SOC.(1978)，100，3585)或疏水键法。
上述提到的酶，包括过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于用于该场合的底物，可选择适合该场合所用的酶的底物，包括例如ABTS、鲁米诺-H2O2、o-苯二胺一H2O2(针对过氧化物酶)、磷酸对硝基苯酯、磷酸甲基缴形酯、3-(2’-螺环金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，，2-二氧杂环丁烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯基-BETA-D-半乳糖(针对β-半乳糖苷酶)。
可在4-40℃反应1分钟-18小时，然后测定结果显示的颜色或荧光、磷光或显色量，进行上述试验。另外，可使用所谓的速率试验，它在4-40℃范围内保温进行。
用市售的Bolton-Hunter试剂可方便地对上述抗原或抗体的进行放射性标记。例如，可通过将Bolton-Hunter试剂加到溶液中(该溶剂是通过将抗原或抗体溶于0.1M碳酸氢钠水溶液中制备的)，然后经过1-2小时，用G-25脱盐柱等除去未反应的Bolton-Hunter试剂部分。
另外，可使用氯亚明T法、碘原法等，方便的进行125I放射性标记。
上述提到的磷光物质，有例如异鲁米诺和丫啶酯等，上述提到的荧光物质，有例如荧光素和罗丹明等。对此，可方便地使用活化酯法或异氰酸酯法(“酶免疫测定技术”，IgakuShoin1987年出版)进行标记。上述提到的着色物质，有例如着色乳胶颗粒和胶体金。
为了用上述竞争性方法进行本发明的免疫测定法，在本发明的单克隆抗体通过已知方法物理或化学结合的固相中加人含有未知量的SARS病毒标本，使反应进行。同时，加入用标记剂标记的预定量的SARS病毒N蛋白，使反应进行。
在用上述夹心法实施本发明的免疫测定法中，将本发明中的单克隆抗体通过已知方法物理或化学结合于固相上加人含有未知量的SARS病毒的标本中，使反应进行。然后，加入用标记剂标记的本发明的单克隆抗体或多克隆抗体，使反应进行。
在两种情况下，需要充分洗涤固相，测量与标记试剂结合的活性。当标记剂是放射性同位素时，用孔计数器或液相闪烁计数器进行测量。当标记剂是酶时，加入底物，在染色后用比色和荧光测定酶活性。当标记剂是荧光物质、磷光物质或着色物质时，可分别通过本领域已知的方法进行测量。
本发明的免疫测定法使用本发明的单克隆抗体，因此具有杰出的特性，即可识别存在于SARS病毒中的N蛋白表位，而没有由于交叉反应而错误检测其他物质，因此可进行特异性非常高的测定。
为了实施本发明的免疫测定法，本发明提出了一种诊断试剂盒。该诊断试剂盒含有至少一种本发明的单克隆抗体，并可只含一种单克隆抗体。用于该诊断试剂盒的单克隆抗体不受特别限制，可以是任何识别SARS病毒N蛋白的单克隆抗体，也可以是本发明的单克隆抗体的分解产物，如F(ab’)2、Fab’、Fab等。
本发明的诊断试剂盒可用免疫学方法检测含SARS病毒的标本，如血液，口腔分泌物水或SARS病毒，因此可以判断SARS病毒的感染。
在本发明的诊断试剂盒中，本发明的单克隆抗体可预先固定在固相上，本发明的单克隆抗体还可以用上述标记剂标记。
用于本发明诊断试剂盒的固相不受特别限制，包括但不限于聚合物(如聚苯乙烯)、玻璃珠、磁性颗粒、微量滴定板、免疫层析用滤纸、玻璃滤器或其他不溶性载体。
本发明的诊断试剂盒还可含有其他组件。
上述其他组件不受特别限制，包括但不限于标记用的酶、其底物、放射性同位素、磷光物质、荧光物质、着色物质、缓冲液和培养皿，以及上述提到的成分。
虽然本发明的诊断试剂盒的形式不受特别限制，但含有本发明的诊断试剂盒所有组分的整合形诊断试剂盒是优选的，以便于快速、简单和方便的进行诊断。
上述整合型诊断试剂盒不受特别限制，例如可以是盒型、芯型等。
作为上述盒型的实施例，使用免疫层析技术，可提到例如一种具体实施方式
，它包括一种膜、一端固定在所述膜上(下游侧)的本发明的单克隆抗体、固定在对侧端(上游侧)的膜上的显色溶液、含有针对上述标记剂并安排在显色溶液附近并在其下游侧的底物的衬垫，和安置在膜中间的衬垫上的含有用上述标记剂标记的单克隆抗体。
在使用上文举例所述的具有盒型实施方式的诊断试剂盒中，将标本涂在含有用上述标记物标记的本发明的单克隆抗体的衬垫上，然后使标本中所含的SARS病毒和本发明的用标记剂标记的单克隆抗体进行结合，通过转移在本发明单克隆抗体固定的位置形成的结合产物，使上文提到的显色溶液显色，在该位置固定有本发明的单克隆抗体，形成SARS病毒N蛋白、用标记剂标记的多克隆抗体和固定化的单克隆抗体形成复合物。然后，上述标记试剂与上述底物反应以显示颜色等。测定显示的颜色等，从而进行SARS病毒感染的判断。
对于用足量显色溶液稀释标本，并将得到的溶液滴到膜上的实施例而言，不需要预先将显色溶剂置于膜上。当用着色乳胶颗粒等着色物质作为上述标记物时，不需要底物，可根据着色物质的显色来判断本发明的单克隆抗体固定的位点是否形成上述复合物。
例如，对于用上述竞争性方法进行反应的上述芯型实施方式，可以使用具有多个孔的芯等，它们是整体形成的，包括(a)含有本发明单克隆抗体的孔，(b)含有液体试剂的孔(如缓冲溶液)，该液体试剂中含有上述标记试剂标记的SARS病毒N蛋白，和(c)含有液体试剂(如缓冲溶液)的孔，该液体试剂含有针对上述标记试剂的底物，为了用夹心法实施反应，提到一种芯等，具有多个整体形成的孔，包括(a)含有不溶性载体的孔，在载体上固定有本发明的单克隆抗体，(b)含有液体试剂(如缓冲溶液)的孔，该试剂含有用上述标记试剂标记的单克隆抗体，和(c)含有液体试剂(如缓冲液)的孔，含有针对上述标记剂的底物。
在使用例如上述本发明的芯型诊断试剂盒中，反应和试验通常与进行竞争法或夹心法使用的相同方式进行。
本发明的诊断试剂盒可以是用于实施上述竞争性方法或上述夹心法的试剂盒。然而优选的是使用夹心法的试剂盒。上述夹心法具有优点，即灵敏度高，需要的反应时间短，准确率高。用上述免疫层析技术，可以制备一种试剂盒，它使得测试方法方便而简单，而且用它可以简单的通过肉眼观察判断结果。当以ELISA技术使用上述夹心法时，酶反应产物的形成由试验目标物质的量决定，因此可建立一种系统，可方便的通过显色等，以肉眼观察确定SARS病毒感染阳性。
本发明诊断试剂盒所用的标本不受特别限制，包括但不限于血液、漱口水和消化道排泄物，优选血液。
因为本发明的诊断试剂盒使用单克隆抗体，具有高水平的检测灵敏度，不产生假阴性或假阳性问题，在批与批之间没有任何差异。
根据本发明，用单克隆抗体识别SARS病毒N蛋白作为抗原，可消除存在于样品中的其它物质的影响，从而可以非常高的灵敏度和特异性检测SARS病毒的存在。由于已建立了产生针对SARS病毒N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤，现在可以几乎半永久性的产生同一单克隆抗体。使用本发明的单克隆抗体的诊断试剂盒可用漱口水作为标本，因此可简单方便有效的检测SARS病毒N蛋白感染，而不对病人造成任何痛苦。另外，在仅使用一种单克隆抗体的情况下，使用本发明的单克隆抗体的诊断试剂盒可稳定地获得非常高的准确率，而在批与批之间没有任何差异，因此可以特异性的和高度准确的检测SARS病毒感染。上述诊断试剂盒易于进行测定，操作简单。
本发明实施例中使用的SARS抗原检测试剂盒是通过双抗体夹心ELISA原理检测病人血清中的N蛋白，能够实现早期的诊断。SARS抗原检测试剂盒检测原理，用抗sars N蛋白的单克隆抗体和抗N蛋白的多克隆抗体作为固相化抗体和酶标抗体，如果待测样品中存在sars病毒的N抗原，则形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。SARS抗原检测试剂盒能在病人感染病毒早期就能检测出N抗原，从而及早的诊断出病毒感染者，及时发现及时治疗隔离，防止疾病的蔓延。
SARS病毒N蛋白与病毒基因组RNA结合形成核衣壳，而且有许多功能提供进核的信号，干扰细胞的生长，病毒复制和RNA包装。文献报道，感染冠状病毒后，N蛋白是数量最多的病毒有关蛋白，并且N蛋白的抗原性较强，这些特征使N蛋白成为一个很好的诊断候选靶点。而且，双抗体夹心ELISA法是一种非常灵敏的病毒检测技术，在检测大多数病毒时比其它血清学方法特异性更高。并且ELISA敏感性高、操作简便，配套仪器设备的发展使操作程序规范化和自动化，从而进一步提高了稳定性。
此外，本发明还提出了上述单克隆抗体在制备治疗SARS病毒感染所致疾病的药物组合物中的用途。所述药物组合物包含本发明的单克隆抗体，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
图1、三次免疫后兔子抗血清效价的检测。
图2、双抗体夹心ELISA检测不同浓度的N蛋白和JC蛋白检测结果(见图2)表明检测的N蛋白浓度与OD值呈线形关系，其灵敏度为62.5ng/ml，即当N蛋白的浓度为62.5ng/ml时，检测结果仍为阳性。而且与无关蛋白JC成阴性反应。通过进一步优化实验条件，检测灵敏度可能会进一步提高。
图3、双抗体夹心ELISA检测三个不同稀释度的10份正常人血清。
图4、双抗体夹心ELISA检测三个不同稀释度的10份肿瘤病人血清。
图5、双抗体夹心ELISA检测三个不同稀释度的10份SLE病。
图6、双抗体夹心ELISA检测三个不同稀释度的10份梅毒病人血清。
图7、双抗体夹心ELISA检测三个不同稀释度的10份HBV病人血清。
图8、双抗体夹心ELISA检测三个不同稀释度的10份HCV病人血清。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook、Russell等人，分子克隆实验室手册III(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1SARS N蛋白的表达将SARS N蛋白的全长基因(SEQ ID NO1)插入到表达载体pETs后，转染大肠杆菌BL21(DE3)。加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L诱导细菌表达N蛋白，然后按照操作手册经Ni-NTA亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测。
实施例2多克隆抗体的制备动物免疫用实施例1表达纯化的N蛋白三次免疫家兔。第一次免疫用福氏完全佐剂与N蛋白等量混匀后乳化，皮下多点注射，1mg/只，第二、三次免疫用福氏不完全佐剂与N蛋白等量混匀后乳化，免疫方法与用量同第一次免疫。每次免疫间隔一个月左右，第三次免疫后一周取血。
间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA)检测抗血清的效价用N蛋白包被ELISA检测板，含10％牛血清、0.1％Tween的PBS封闭液封闭，然后加入不同稀释度的抗血清，37℃孵育2小时，同时设相同稀释度的免疫前兔血清做为阴性对照，最后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig的抗体。37℃孵育1小时，充分洗涤后加入底物四甲基联苯胺(TMB)显色并测定450nm处光吸收值。
检测结果如图1，间接ELISA检测抗血清的效价为1,024,000，即当抗血清稀释1,024,000倍时仍为阳性。
抗体的分离及HRP酶标记用硫酸铵盐析法分离兔抗血清中的抗体，通过戊二醛两步法将HRP与其偶联，制备成酶标抗体。用ELISA标定其使用的最适稀释度(方法同上)。ELISA结果显示酶标抗体的最适稀释度为1∶500。
实施例3抗N蛋白的杂交瘤细胞株的建立及其单抗的制备1、动物免疫用基因重组的N蛋白三次免疫BALB/C小鼠。免疫方法同兔，第三次免疫后一个月，回忆刺激小鼠。用间接ELISA法检测抗血清的效价为64000。
2、杂交瘤的制备和筛选取回忆刺激3天后的小鼠脾脏细胞与NS-1、SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG进行融合，经间接ELISA方法筛选和克隆后，得到杂交瘤细胞株，其中S-39-2克隆用于本工作(保藏号为CCTCC NO-C200407)。该细胞株分泌的抗体亚型为IgG1。
3、腹水的制备及抗体的纯化每只小鼠腹腔注射0.5ml pristane，7-10天后腹腔注射106个杂交瘤细胞，7-10天后取腹水。腹水先硫酸铵盐析法初步纯化后，再用protein G免疫亲和层析法进一步纯化。
4、单抗的亲合常数测定参照Beatty的方法(Beatty JD，Beatty BG，VlahosWG.Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzymeimmunoassay.J Immunol Methods，100(1987)173-9)，将N蛋白分别以0.625、1.25、2.5、5ug/ml的浓度包被，加入倍比稀释的纯化单抗(见本实施例第3点)，再加入HRP酶标记的羊抗小鼠Ig的抗体，TMB显色测OD450值。以抗体浓度的对数为横坐标，OD450值为纵坐标，得一生长饱和曲线，4种抗原浓度得到4个不同的曲线，每个曲线的平坦部OD450值做为100％，求出50％OD450值对应的抗体浓度，通过Beatty的公式计算出亲和常数为Kaff＝3.1×109L/mol。
实施例4检测本试剂盒的灵敏度及特异性1、双抗体夹心ELISA法检测基因重组的N蛋白和一种无关的植物蛋白JC蛋白用含0.01％Thimerosal的PBS稀释纯化后的抗N蛋白单抗(约5ug/ml)包被ELISA检测板，100ul/孔，4℃过夜。在Thermol洗板机上用洗涤液(1M Tris-HCl，含0.1％Tween，0.01％Thimerosal)洗5次。用稀释液(含10％小牛血清、0.01％Thimerosal的PBS)封闭，200ul/孔，37℃，2小时。再洗涤，加入不同稀释度的基因重组的N蛋白和JC蛋白(用含0.01％Thimerosal的PBS稀释)，100ul/孔，37℃，2小时。洗涤后，加入1∶500稀释的酶标抗N蛋白的多克隆抗体(用稀释液稀释)，100ul/孔，37℃，1小时。然后洗涤，加入TMB底物，100ul/孔，反应10分钟后加入2M H2SO4，100ul/孔，终止反应。在Thermol酶标仪上读取OD450值。
检测结果(见图2)表明检测的N蛋白浓度与OD值呈线形关系，其灵敏度为62.5ng/ml，即当N蛋白的浓度为62.5ng/ml时，检测结果仍为阳性。而且与无关蛋白JC成阴性反应。通过进一步优化实验条件，检测灵敏度可能会进一步提高。
2、双抗体夹心ELISA法检测人血清单克隆抗体包被、洗涤、封闭和酶标多抗反应等同实施例4.1，只是在加入抗原时是加了不同稀释度的人血清，血清用含0.01％Thimerosal的PBS稀释。以下图的阴性对照为稀释液，阳性对照为1ug/ml的基因重组N蛋白。
结果(图3-8)表明无论正常人血清还是非SARS病人血清(包括肿瘤、过敏性患者、感染病毒的病人如HBV、HCV以及梅毒)与本检测系统均呈阴性反应，显示了本检测试剂盒有较好的临床应用前景。
实施例5ELISA检测试剂盒的制备抗N蛋白的多克隆抗体包被的ELISA检测板(48人份)，HRP标记的单抗5ml，TMB底物10ml，10％小牛血清稀释液20ml，1M Tris-HCl洗涤液100ml。
实施例6ELISA检测试剂盒的制备抗N蛋白的单克隆抗体包被的ELISA检测板(48人份)，HRP标记的多抗5ml，TMB底物10ml，10％小牛血清稀释液20ml，1M Tris-HCl洗涤液100ml。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>一种SARS冠状病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用<130>040521<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1266<212>DNA<213>SARS病毒N蛋白<400>1atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga 60cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag120cgccgacccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat180ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt240ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc300aaaatgaaag agctcagccc cagatggtac ttctattacc taggaactgg cccagaagct360tcacttccct acggcgctaa caaagaaggc atcgtatggg ttgcaactga gggagccttg420aatacaccca aagaccacat tggcacccgc aatcctaata acaatgctgc caccgtgcta480caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc540agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct600ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga atggctagcg gaggtggtga aactgccctc660gcgctattgc tgctagacag attgaaccag cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa720caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc780
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65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr100 105 110Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys115 120 125Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys130 135 140Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu145 150 155 160Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly165 170 175Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg180 185 190Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro195 200 205Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu210 215 220Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln225 230 235 240Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser
245 250 255Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr260 265 270Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly275 280 285Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln290 295 300Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg305 310 315 320Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly325 330 335Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile340 345 350Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu355 360 365Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro370 375 380Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp385 390 395 400Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser405 410 415Ala Asp Ser Thr Gln Ala
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权利要求
1.一种抗SARS病毒的抗体，其特征在于，所述抗体特异性地与SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质结合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO-C200407的细胞株分泌。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体亚型为IgG1。
5.一种分泌权利要求2所述抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCCNO-C200407。
6.一种早期检测SARS病毒的免疫检测方法，其特征在于，使用权利要求2或3所述的单克隆抗体。
7.一种早期检测SARS病毒的检测试剂盒，其特征在于，至少含有一种如权利要求2或权利要求3所述的单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体与标记物结合，该标记物包括荧光标记物、放射性标记物和酶标记物。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于包括一种膜、一端固定在所述膜上的本发明的单克隆抗体、固定在对侧端的膜上的显色溶液、含有针对上述标记剂并安排在显色溶液附近，在其下游侧的底物的衬垫，和安置在膜中间的衬垫上的含有用上述标记剂标记的单克隆抗体。
10.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在制备治疗SARS病毒感染所致疾病的药物组合物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种对SEQIDNO2所示序列的蛋白有特异性的单克隆抗体，产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明的单克隆抗体可以用于诊断和治疗SARS病毒感染所致疾病，特别是严重急性呼吸综合症。作为一种应用，本发明还提出了至少含有一种本发明单克隆抗体的诊断试剂盒。
文档编号A61P31/14GK1673231SQ20041005287
公开日2005年9月28日 申请日期2004年7月15日 优先权日2004年7月15日
发明者孙兵, 尚勃, 季永镛, 田林, 李林 申请人:中国科学院上海生命科学研究院