专利名称：活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法
技术领域：
本发明涉及一种活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法。
背景技术：
中药复方中的化学成份组成复杂，因而对复方的有效成份、有效部位研究一直是中成药基础研究和相关应用研究中心难点。单纯用中药化学和药理学的研究方法，来探求中药复方与功能主治相关的化学有效部位或有效物质基础，都易流于盲目和片面的弊端，而将两个学科结合起来，则是一个较有效率的思路，但是一直以来缺乏具体可行的系统研究的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法。
本发明的目的是这样实现的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，中药成方中的组成药材，其中有挥发油的药材用水蒸气蒸馏法提取挥发油，然后各个药材分别用水煎煮提取，每次1-3小时，加水量10倍以上，提取2次以上，合并多次提取液，浓缩，另取含有挥发油的药材提取后剩余的水煎液浓缩后，滤过，搅拌中缓缓加入乙醇，令含醇量达70-80％，静置24小时以上，则各药材的上清液部分为一个水平，沉淀部分为一个水平，挥发油部分为一个水平，水煎煮提取液为一个水平。
上述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，在上述所述的因素水平表的基础上，再根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原方对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第一次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是主要有效部分。
上述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，各个药材分别取第一步的主要有效部分，通过按比吸附量树脂量和药材量之比为1∶1装填的大孔树脂柱，先以去离子蒸馏水洗脱，再以25％乙醇洗脱，继以50％乙醇洗脱，最后以乙醇洗脱，分别收集各部分的洗脱液，回收乙醇，浓缩后的水溶液则为各个药材的多个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原复方对照组和上一步的有效部分组合的对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第二次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是第二步找到的主要有效部分。
上述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，各个药材分别取第二步的主要有效部分，浓缩后用盐酸调pH值至2，以正丁醇萃取，然后酸液用氢氧化钠调PH值至10，再以正丁醇萃取，萃取后的碱液用盐酸调PH值至中性，除去水溶液中的残留溶剂后，浓缩，即得各个药材的酸性萃取、碱性萃取和萃取后余下部分这三个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原复方对照组和上一步的有效部分组合的对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第三次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是第三步找到的主要有效部分。
上述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，各个药材分别取上一步的主要有效部分，折算成相当于原药材的生药克数，取不同的克数设为各药材的多个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，进行能够反映该中药复方某一主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，找出各味药材各自适宜的服用剂量。
本发明的优点在于1.本发明为寻找化学成份组成复杂的中药复方或天然药物中的有效部位或成份，提供了一种可行的系统研究方法。
2.本发明大大缩短实验周期，加快寻找并确定复方或天然药物中有效部位或成份的研究进程。研究进程是以指数幂的级数快速进展的。
本发明的
具体实施例方式实施例1活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，其特征是中药成方中的组成药材，其中有挥发油的药材用水蒸气蒸馏法提取挥发油，然后各个药材分别用水煎煮提取，每次1-3小时，加水量10倍以上，提取2次以上，合并多次提取液，浓缩，另取含有挥发油的药材提取后剩余的水煎液浓缩后，滤过，搅拌中缓缓加入乙醇，令含醇量达70-80％，静置24小时以上，则各药材的上清液部分为一个水平，沉淀部分为一个水平，挥发油部分为一个水平，水煎煮提取液为一个水平。
在上述所述的因素水平表的基础上，再根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原方对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第一次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是主要有效部分。
实施例2上述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，各个药材分别取第一步的主要有效部分，通过按比吸附量树脂量和药材量之比为1∶1装填的大孔树脂柱，先以去离子蒸馏水洗脱，再以25％乙醇洗脱，继以50％乙醇洗脱，最后以乙醇洗脱，分别收集各部分的洗脱液，回收乙醇，浓缩后的水溶液则为各个药材的多个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原复方对照组和上一步的有效部分组合的对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第二次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是第二步找到的主要有效部分。
实施例3
上述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，各个药材分别取第二步的主要有效部分，浓缩后用盐酸调pH值至2，以正丁醇萃取，然后酸液用氢氧化钠调PH值至10，再以正丁醇萃取，萃取后的碱液用盐酸调PH值至中性，除去水溶液中的残留溶剂后，浓缩，即得各个药材的酸性萃取、碱性萃取和萃取后余下部分这三个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原复方对照组和上一步的有效部分组合的对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第三次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是第三步找到的主要有效部分。
实施例4上述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，各个药材分别取上一步的主要有效部分，折算成相当于原药材的生药克数，取不同的克数设为各药材的多个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，进行能够反映该中药复方某一主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，找出各味药材各自适宜的服用剂量。
举例如下如，采用四次成功的步步深入的L9(34)正交试验，就可将组成复方的某单味药材的提取(如水箭煮)总化学成份，切分到其1/81的化学组成部份第一次总化学成份的1/3第二次总化学成份的1/3×1/3＝1/9第三次总化学成份的1/3×1/3×1/3＝1/27第四次总化学成份的1/3×1/3×1/3×1/3＝1/81而复方的化学成份，在人体中达到服用后能使该化学成分发挥药理活性的有效血药浓度的，最大不过数十种，所以应用本方法能够通过较少次的循环实验，就能迅速的找出复方中的化学成份组成最少的有效部位。
初步实践简述如下黄芪12g白术12g防风6g。其功能主治中选增强免疫功能的药理作用为重点，确定以小鼠碳廓清实验的结果为对照指标。
小鼠20-26g/只，雌雄各半。实验按体重分为每组10只，除L9(34)正交实验的9组外，另设对照组、正常组和模型组。
对照组的供试样制备将三味药材分别粉碎成细粉，按处方量称重后混匀，加入水一定体积，临用时摇匀使成混悬液，抽取折算的体积数给小鼠灌胃。
其它的供试样配制时，每个按不同路线提取得到的部分，各自折算成相当于原药材的量来配制。
模型组采用腹腔注射氢化可的松30mg/kg/日，连续给药至实验结束(周期8-10日)。各给药组于注射氢可的第二天开始灌胃给予供试样，同时并行每日注射氢可，直至最终的碳廓清指标测定，具体实验操作详见参考文献。第一步供试样的制备1.黄芪每次加10倍量水煎煮2次，2hr/次，合并煎液，浓缩至1∶1(药材重量∶体积)，下表中称为“水煎液”。取水煎液醇沉，搅拌加入乙醇令含醇量约达80％，放置24hr，上清液浓缩至一定体积。取浓缩液上D101大孔吸附树脂柱，依次用水、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至1∶1(m/v)，下表中称为“总苷”。取上述醇沉后的沉淀，加水溶解，滤过，滤液在下表中称为“醇沉后的沉淀”。
2.白术和防风各自水煎液的制备及醇沉的条件同黄芪，表中称谓的含义也同黄芪，醇沉后的上清液浓缩后，称为“醇沉后的溶液”。另取两药材分别粉碎成粗粉，采用2005版药典附录中的“挥发油测定法”提取挥发油，提得的挥发油用β-环糊精包裹后备用，在表中称为“挥发油”。
因素水平表
实验结果正常组3.8，造模组0，由于实验结束时，该组小鼠剩余数量不足以进行统计，我把结果数值定为0，对照组4.2。
表格右下角的最后一列、从“均值1”行至“极差”行，所填人的内容是空白列的计算结果。
第一步实验的分析总结将实验结果的平均值填入因素水平表。
分析药理作用较强的有效部分确定A.黄芪为均值最高的总苷。B.白术根据后两个水平的比较，水煎液＝2.8，水煎液+挥发油＝1.3，则挥发油起到的是负作用(1.3-2.8＝-1.5)；据前两个水平比较，同样都有挥发油的情况下，明显醇沉后的溶液作用强度高于水煎液(2.6＞1.3)。所以，其有效部分是醇沉后的溶液。C.防风水平1和3比较，挥发油起正作用(2.7-1.2＝1.5)；水平2和3比较，都有挥发油的情况下，水煎液和醇沉后的沉淀无明显差异(2.7＝2.7)。因此，挥发油肯定是有效部分之一，而水煎液醇沉分离的路线似乎不合适，可在下一步重新设计。第二步黄芪前面步骤不变，同第一步总苷部分的提取，但在其过程中，自上柱之后，改为依次用水、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇洗脱，收集后三种洗脱液。白术取上一步醇沉后的溶液部分，同黄芪总苷条件，上树脂柱，依次用水、25％乙醇、50％乙醇、乙醇洗脱，分别收集洗脱液。防风取上一步水煎液，滤过，取滤液，后同黄芪总苷条件，上树脂柱，依次用水、25％乙醇、50％乙醇、乙醇洗脱，分别收集洗脱液。挥发油因无合适的仪器设备，仍取第一步的挥发油，不作进一步分离的设计。其它的具体实验条件及操作，包括药理实验部分，基本都与第一步相同，此不赘述。
实验结果正常组4.2，对照组3.7。另设一对照组，供试样的组成是第一步各药材的有效部分，即黄芪的总苷+白术的醇沉后溶液+防风的(挥发油+水煎液)。对照组结果为3.9。因在第一步中，已将因素水平表、正交实验各分组结果统计表等详细示例列出了，所以第二步的类似表格在此略去。
第二步实验的分析总结将实验结果的平均值填入因素水平表。
分析药理作用较强的有效部分确定A.黄芪为50％乙醇部分。B.白术为25％乙醇部分。C.防风三个水平间的差异微小，从组成上看，(25％乙醇+挥发油)部分在作用相同的情况下最为精简。结合第一步的结果，也可以猜想，防风药材在本方中的主要有效部分，可能只是挥发油。
另外还可以看出，大多数实验组的作用强于对照组(3.7)和(第一步有效部分)对照组(3.9)，后两者之间，对照组更强些。说明将药材提取分离、甩掉部分无用(甚至起负作用)的成分后，药效仍能得以维持，甚而得到加强。第三步黄芪和白术分别取其第二步的有效部分，同样按如下步骤制备用稀盐酸调pH值至2，水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇提取液，蒸干，得到下表中所称的“酸性”部分。水溶液再用氨试液调pH值至10，水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇提取液，蒸干，得到下表中所称的“碱性”部分。余下的水溶液用稀盐酸调pH值至中性，得到下表中所称的“余下”部分。防风取第二步上柱以后的水洗脱液和25％乙醇洗脱液，下表中称“水洗”和“25％乙醇”。挥发油部分仍同第二步。
实验结果正常组3.9，对照组3.7。另设一对照组，供试样品组成为第二步各药材的有效部分，即黄芪的50％乙醇部分+白术的25％乙醇部分+防风的挥发油部分。对照组结果为4.1。
分析药理作用较强的有效部分确定A.黄芪为酸性部分。B.白术为余下部分。C.防风为(水洗+挥发油)部分。
权利要求
1.一种活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，其特征是中药成方中的组成药材，其中有挥发油的药材用水蒸气蒸馏法提取挥发油，然后各个药材分别用水煎煮提取，每次1-3小时，加水量10倍以上，提取2次以上，合并多次提取液，浓缩，另取含有挥发油的药材提取后剩余的水煎液浓缩后，滤过，搅拌中缓缓加入乙醇，令含醇量达70-80％，静置24小时以上，则各药材的上清液部分为一个水平，沉淀部分为一个水平，挥发油部分为一个水平，水煎煮提取液为一个水平。
2.根据权利要求1所述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，其特征是在上述所述的因素水平表的基础上，再根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原方对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第一次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是主要有效部分。
3.根据权利要求1或2所述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，其特征是各个药材分别取第一步的主要有效部分，通过按比吸附量树脂量和药材量之比为1∶1装填的大孔树脂柱，先以去离子蒸馏水洗脱，再以25％乙醇洗脱，继以50％乙醇洗脱，最后以乙醇洗脱，分别收集各部分的洗脱液，回收乙醇，浓缩后的水溶液则为各个药材的多个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原复方对照组和上一步的有效部分组合的对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第二次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是第二步找到的主要有效部分。
4.根据权利要求1或3所述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，其特征是各个药材分别取第二步的主要有效部分，浓缩后用盐酸调pH值至2，以正丁醇萃取，然后酸液用氢氧化钠调PH值至10，再以正丁醇萃取，萃取后的碱液用盐酸调PH值至中性，除去水溶液中的残留溶剂后，浓缩，即得各个药材的酸性萃取、碱性萃取和萃取后余下部分这三个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，同时设原复方对照组和上一步的有效部分组合的对照组，进行能够反映该中药复方主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，将各个水平的均值填入因素水平表中各自相对应的表栏中，分析该表，根据均值的大小确定各药材第三次分离后，得到的化学组成部份中起最主要作用的即是第三步找到的主要有效部分。
5.根据权利要求1或4所述的活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法，其特征是各个药材分别取上一步的主要有效部分，折算成相当于原药材的生药克数，取不同的克数设为各药材的多个水平，继而根据因素水平的数量选择正交表，再配制各组的供试药品，进行能够反映该中药复方某一主要功效的药理动物实验，最后根据实验结果，统计计算，找出各味药材各自适宜的服用剂量。
全文摘要
活用正交试验设计寻找中药复方中化学有效部位或成份的方法。单用中药化学和药理学的研究方法，探求中成药与主治相关的有效物质基础，易流于片面。本发明中药成方中的组成药材，其中有挥发油的药材用水蒸气蒸馏法提取挥发油，然后各个药材分别用水煎煮提取，每次1－3小时，加水量10倍以上，提取2次以上，合并多次提取液，浓缩，另取含有挥发油的药材提取后剩余的水煎液浓缩后，滤过，搅拌中缓缓加入乙醇，令含醇量达70－80％，静置24小时以上，则各药材的上清液部分为一个水平，沉淀部分为一个水平，挥发油部分为一个水平，水煎煮提取液为一个水平。本发明用于中成药中化学有效部位的分离和确定及其制剂应用。
文档编号A61K36/00GK1836672SQ20051000984
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月23日 优先权日2005年3月23日
发明者刘凯 申请人:刘凯