专利名称：2’，4’－二羟基－6’－甲氧基－3’，5’－二甲基查耳酮作为肿瘤多药耐药性逆转剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮的用途，特别是作为肿瘤多药耐药性逆转剂、与抗肿瘤药物合用于多药耐药性肿瘤细胞，提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的新用途。
背景技术：
多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。MDR多针对天然抗肿瘤药物，如阿霉素(Doxorubicin，DOX)、秋水仙碱(Colchicine，COL)、长春花碱(Vinblastine，VBL)、长春新碱(VCR)、柔红霉素(DNR)、紫杉醇(TAX)等。在抗肿瘤化疗(chemotherapy)中，肿瘤细胞在受到一种抗肿瘤药物作用之后，甚至在抗肿瘤药物作用之前，会产生针对这种药物及其相关药物，甚至无关药物的抗性，因此MDR是肿瘤化学治疗的主要障碍之一。
MDR的逆转剂与抗癌药物合用，将会大幅度地提高化疗药物对MDR肿瘤的疗效。目前的主要研究的逆转剂包括以下几类①钙离子通道阻滞剂；②钙调蛋白抑制剂；③蒽环类和长春碱类类似物；④类固醇和激素类似物；⑤环抱菌素类；⑥其它杂类疏水的阳离子化合物；⑦P-gp单克隆抗体。尽管许多化合物或药物具有体外逆转MDR的作用，但由于毒副作用很大，至今尚未开发成功有效的应用于临床的MDR逆转药物。找到特异性强而毒性副作用小的MDR逆转剂是目前国内外研究的重要课题。
近年来，从天然产物来源的化合物中寻求高效低毒的抗肿瘤药物逐渐成为研究的热点。尤其是在黄酮类化合物中，人们发现一些具有抗肿瘤活性的化合物，同时也具有逆转肿瘤多药耐药性的作用，如EGCG，斛皮素等。
查耳酮是黄酮类化合物中的重要成员，本发明所述的查耳酮，其化学名称为2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查耳酮(2’，4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’，5’-dimethylchalcone，DMC)，分子式为C18H18O4，其结构通式为
该化合物的制备方法为水翁干燥花蕾4kg，在室温下用70％甲醇(10L)浸泡提取三次，合并提取液，减压回收甲醇，得浸膏，将浸膏用水悬浮，以石油醚萃取，萃取多次，合并萃取液，减压回收，得到石油醚部位(18.4g)。石油醚部位经硅胶(200-300mesh)柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯(40∶1-5∶1)梯度洗脱，得到20个流份(Fr.1-Fr.20)。Fr.14经葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱纯化，甲醇洗脱，收集到6个流分(Fr.A3-F3)。Fr.E3通过重结晶得到化合物2′，4′-二羟基-6′甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮发明内容本发明的目的在于提供一种2′，4′二羟基-6′甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮的新用途，即作为肿瘤多药耐药性逆转剂的应用。
经研究发现，该化合物不仅具有杀灭肿瘤细胞的作用，而且能够逆转肿瘤细胞多药耐药性。将其作为新型的肿瘤化疗药物增敏剂和增效剂，可以提高多药耐药性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的作用效果，具有良好的应用前景。
为了更好理解本发明的实质，通过以下实施例和附图举例说明，但并不限制本发明的范围。
图1 DMC对多药耐药性肿瘤细胞KB-A1的逆转作用图2 DMC对KB-A1细胞内阿霉素(DOX)积累量的影响实施例1 DMC对多药耐药性肿瘤细胞KB-A1的逆转作用将对数生长期细胞104cells/ml接种于96孔培养板，每孔0.2ml，细胞贴壁后，分组加入药物，一组加入5μM DMC和0-20μg/ml浓度的DOX，另一组仅加入0-20μg/ml浓度的DOX。置37℃，5％ CO2及饱和湿度的培养箱培养培养48h，实验终止前4小时每孔加入10μl 5mg/ml MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)，培养结束后每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)，振荡10min，使MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算细胞的存活率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，求出半数抑制浓度(IC50)，计算逆转倍数(reversal index，RI)。
从图1可以看出经过5μM的DMC处理后，耐药细胞株KB-A1对化疗药物阿霉素(DOX)的IC50从13.9μg/ml降到了3.6μg/ml，逆转倍数为3.9。这说明DMC具有提高多药耐药性细胞株KB-A1对化疗药物DOX敏感性的作用，即可以逆转肿瘤的多药耐药性。
实施例2 DMC对KB-A1细胞内阿霉素(DOX)积累量的影响将KB-A1和KB-3-1细胞以105cells/ml接种于96孔培养板，贴壁培养后，对照组单独加入10μg/ml的DOX，其它各组分别加入10μg/ml的DOX和5、10、20μM DMC，继续培养4h，用冰冷的PBS(phosphate buffered saline)清洗细胞两次，加入0.5M HCl-50％乙醇溶液，DOX溶出后，上清用荧光酶标仪测定(Ex485nm，Em538nm)阿霉素(DOX)的含量。
实验表明(图2)，DMC可以显著的影响多药耐药细胞KB-A1内阿霉素(DOX)的积累量。分别加入5、10、20μM DMC，使细胞内DOX的积累量增加1.4、1.8和3.1倍。这说明DMC是通过增加化疗药物DOX在肿瘤细胞内的积累量达到逆转肿瘤多药耐药性的作用。
实施例3 DMC对多药耐药性肿瘤细胞KB-A1移植瘤的影响将KB-A1细胞以2×106cells/0.1ml皮下注射接种于裸鼠腋下，当肿瘤生长到5×5mm大小时，随机分五组，每组5只裸鼠。五组分别为对照组；DMC(40mg/kg)作用组；DOX(2mg/kg)作用组；DMC(20mg/kg)+DOX(2mg/kg)作用组；DMC(40mg/kg)+DOX(2mg/kg)作用组。DMC于第1-9天裸鼠腹腔注射，DOX于第2、4、6、8天裸鼠腹腔注射。药物作用18天后，处死裸鼠取出肿瘤称重。肿瘤抑制率(IR)通过以下公式计算IR＝(1-药物作用组肿瘤均重/对照组肿瘤均重)×100％表1 DMC对多药耐药性肿瘤细胞KB-A1移植瘤的影响
研究结果表明(表1)，DOX和DMC单独给药均不能显著抑制肿瘤的生长，但DOX与DMC联合用药可以显著抑制肿瘤的生长，瘤重抑制率最大可达70％。这说明DMC可以增强DOX对多药耐药性肿瘤的化疗效果，在体内起到逆转肿瘤多药耐药性的作用。
权利要求
1.一种2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮，分子式为C18H18O4，结构通式为 其特征在于，该化合物作为肿瘤多药耐药性逆转剂的应用。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种2′，4′－二羟基－6′－甲氧基－3′，5′－二甲基查耳酮的新用途，即作为肿瘤多药耐药性逆转剂的应用。该化合物作为新型的肿瘤化疗药物增敏剂和增效剂，可以提高多药耐药性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的作用效果，具有良好的应用前景。
文档编号A61K31/12GK1680248SQ20051002324
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月12日 优先权日2005年1月12日
发明者魏东芝, 钱峰, 叶春林, 卢艳花 申请人:华东理工大学