增强学习与记忆能力的方法

专利名称：增强学习与记忆能力的方法
技术领域：
本发明涉及一种增强学习记忆能力的方法，通过提高N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)2B受体的表达增强学习记忆能力的方法，属于神经生物学技术领域。
背景技术：
大量的研究证明，记忆在大脑里的贮存是由神经细胞突触的相互作用而控制的。Hebb在1949年指出当突触前和突触后神经元同时被激活时，其相互联结强度增大，而这一神经元突触间联结强度的变化直接影响大脑的学习和记忆能力。
N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体在神经元突触联结中起到异常重要的作用。当突触前后的神经元被同时激活时，NMDA受体即被激活并开放其通道，允许Ca2+流进入突触后神经细胞，从而引发一系列的生化反应，最终调节神经元的突触可塑性及学习记忆的能力。
NMDA受体由NR1和不同种类的NR2亚基组成(Nakanishi，Science 258，597-603，1992；Hollmann&Heinemann，Annu.Rev.Neurosci 17，31-108，1994)。NR1亚基是钙离子通道蛋白，而NR2亚基则调节通道的启闭(Monyer et al.，Science 256，1217-21，1992)。在海马和皮层等组成的前脑区，通常只有NR2A和NR2B与NR1亚基一起构成受体复合物(Monyer et al.，Neuron 12，529-40，1994)。个体从幼年到成年的转变及衰老过程中，NR2B基因表达量逐渐降低(Sheng et al.，Nature 368，144-147，1994；Okabe et al.，J.Neurosci.18，4177-88，1998)，同时NMDA通道的开放时间也逐渐缩短(Carmignoto&Vicini，Science 258，1007-11，1992；Hestrin，Neuron 9，991-9，1992)，最终导致神经突触可塑性及学习记忆能力的降低。
进一步研究发现，NMDA受体活化是诱导长时程增强(LTP)的必要条件，在神经突触可塑性和记忆中起到重要作用。破坏海马区的NMDA受体会造成突触可塑性的阻抑及记忆功能的丧失。例如，使用NMDA受体拮抗剂可完全阻止大多数海马突触中LTP的产生。在大脑内注入了NMDA受体拮抗剂的大鼠，学习记忆能力降低。用遗传工程敲除技术使小鼠某个基因缺失是研究基因功能的有效手段，把NMDA受体或参与NMDA受体生物活性的基因敲除后，也可以观察到动物学习记忆能力降低(Silva et al.，1992a；Silva et al.，1992b；Chen&Tonagawa1997年的综述)。利用NMDA受体基因敲除小鼠所做的实验结果表明，在大脑的某一特定区域完全抑制NMDA受体，可使某种类型的记忆受到抑制，但这些结果并未指明NMDA受体在更多类型的学习与记忆中扮演的角色，也未指明这些结果在提高学习与记忆能力方面以及在改善与学习记忆相关的异常或疾病方面的应用价值。研究结果表明NMDA受体、神经突触可塑性、LTP及各种类型的学习记忆之间具有密切的相关性，但确切关系如何，尚不十分明确。这些研究结果在提高学习与记忆的能力，以及在提高学习记忆能力，改善神经异常或疾病方面的应用价值如何，也未予以指明。随着年龄的增长，老年痴呆症和中风等神经性异常和疾病变得越来越普遍。发明一种能提高学习和记忆的能力的方法，并能改善神经性疾病导致的学习记忆能力降低，在神经医学领域将具有十分重要的意义。

发明内容
本发明运用转基因、功能基因组学、化学遗传学等方法，研究学习记忆的分子机制，明确在学习记忆中起关键作用的基因；并在此基础上，提出提高个体学习与记忆能力的方法；提出可缓解与学习记忆相关的神经退行性疾病的方法；提出筛选调节学习记忆能力的新化合物的方法；提出鉴定在与学习记忆相关的生物过程中起作用的基因的方法。
本发明提出了可用于增强个体学习记忆能力的方法。该方法是通过修饰大脑神经突触的NMDA受体，从而使该受体的功能增强，表现在突触可塑性的增强和NMDA受体活性的增强，即受体通道开放时间的延长或波峰的增加。
本发明提出了可用于改善与学习记忆相关的神经退行性疾病或异常的方法。该方法是通过修饰异常大脑内神经突触的NMDA受体，使该受体的功能增强，最终提高病人学习与记忆的能力。
本发明提出了通过遗传操作改变人类和动物大脑以增强其学习记忆的能力。遗传改造导致动物大脑内神经突触NMDA受体被修饰，从而增强NMDA受体的功能。
本发明提出了通过转基因技术使其大脑内能表达转入的NR2B基因的非人类的转基因动物。本发明中的动物是啮齿类，最常用的是大鼠。
本发明提出了鉴定具有通过增强NR2B基因表达从而增强学习记忆能力的化合物的方法。该方法是在NR2B基因的启动子上连接一段报告基因，再加入可能促进NR2B启动子表达的化合物，然后测定报告基因的表达，如果表达增强则说明该被试化合物可通过促进NR2B基因的表达来增强学习记忆功能。
本发明提出了在体或离体鉴定通过影响NMDA受体的功能来增强学习记忆能力的化合物的方法。离体鉴定的方法是a.两组离体培养的细胞，一组细胞转入能编码NR2B的外源DNA分子，另一组不转入；b.在未转化组细胞中加入可能促进NR2B表达或提高NMDA受体活性的化合物；c.比较加入化合物而未被转化的细胞与转化细胞，必要时还可比较未加入化合物也未被转化的细胞的NMDA受体功能。在加入化合物而未被转化的细胞中NMDA受体功能如果与转化细胞NMDA受体功能一致，则说明被试化合物能通过影响NMDA受体功能来增强学习与记忆能力。
在体鉴定实验原理同上，只是将培养细胞换成转基因和未转基因两组动物。
本发明提出了另一种在体和离体鉴定通过增强NMDA受体而增强学习记忆能力的化合物的方法。离体鉴定的方法是a.离体培养的细胞分成两组；b.一组细胞中加入可能会增强NMDA受体功能的被试化合物；c.直接或间接地测定两组细胞中NMDA的功能以确定被试化合物对NMDA受体的影响。该实验中所用的细胞均是经NR2B基因转化的细胞，其有利之处是它们对各种被试化合物的敏感性更强。
在体鉴定的方法原理同上，以动物代替细胞。实验中所用动物也是转基因动物，优点是它们对被试各种化合物的敏感性更强。
本发明提出了鉴定能影响NMDA受体介导的学习记忆过程中的基因和基因产物的方法。方法是a.将动物或离体培养的细胞分成两组，其中一组转入能编码NR2B的外源DNA分子，另一组不转入；b.比较转基因和非转基因组动物或细胞的基因表达情况(测定其mRNA或蛋白质的含量)或蛋白质修饰情况(测定共价键或非共价键情况)；C.将在转基因动物或细胞中表达发生变化的一种或多种基因，或修饰发生变化的一种或多种基因产物分离出来；d.鉴定分离出来的基因或基因产物。
本发明提出了另一种鉴定影响NMDA受体介导的学习记忆能力的基因或基因产物的方法。方法是a.培养带有NMDA受体的细胞并分成两组；b.在其中一组直接或间接地激活NMDA受体；c.比较两组细胞中基因表达(测定mRNA或蛋白质的含量)或蛋白质修饰情况(测定共价键或非共价键情况)；d.将在被激活组受体中表达发生变化的一种或多种基因，或者修饰发生变化的一种或多种基因产物分离出来；e.鉴定分离出来的基因或基因产物。
本发明中的实验表明，转基因大鼠前脑中NR2B的超常表达导致了NMDA受体活性的增强，促使神经突触对10-100赫兹刺激的反应时程增加。在六大行为测试的实验中，这些转基因大鼠的学习与记忆能力都得到提高，说明NR2B在调节突触可塑性和记忆形成随年龄而变化的过程中起着关键作用。也进一步说明NMDA受体功能的增强可导致突触可塑性的提高，从而显著增强哺乳动物学习与记忆的能力。
运用NR2B转基因动物的研究指出，当NMDA受体的功能增强的程度适当时，学习与记忆的能力才随之增强。例如，与非转基因动物相比，当NMDA受体通道的衰退时间延长15-20％时，可增加转基因动物学习记忆行为的能力；继续增加NMDA受体的活性(例如本发明中将通道衰退时间、峰值或通道开放增加30％、40％、50％或更多时)，学习记忆的增强度却相对要低。
本发明的主要技术如下(一)转基因的技术和方法1、获取编码NR2B的基因序列见相关报道。例如，本发明中所需要的大鼠NR2B基因序列见GenBank Accession No.U60210；人NR2B基因序列见GenBank Accession No.NM000834。
2、本发明所用转基因的启动子来源于αCαMK II基因，该基因仅在前脑区具有活性(Mayford et al.，Cell 81，891-904，1995)。已知针对大脑内某些特殊类型的细胞，还有另外一些启动子可以引导外源基因的组织特异性表达，例如pkcγ启动子，telencephalin启动子，neuronal enolase启动子以及prp启动子等。对体细胞进行基因转化，组织特异性则不是启动子的必要条件，所以，一般构建的启动子如CMV启动子或β-actin启动子均应可用于体细胞的基因转化。
3、本发明中转基因动物制备方法见具体实施方法中所述。其他可参考以下文献Joyner，“Gene Targeting”IRL Press，Oxford，1993；Hogan et al.(Eds.)，“Manipulating the Mouse Embryo-A LaboratoryManual，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1994；Wasserman&DePamphilis，“A Guide to Techniques inMouse Development，”Academic Press，San Diego CA，1993.有一种将外源DNA导入生殖细胞的方法是用显微注射技术把构建的基因注射到早期胚胎(如4细胞期前)的前核中(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，5016，1981；Brinster et al.，Proc.Natl.A cad.Sci.USA 82，4438，1985).本发明中用该方法制备NR2B转基因大鼠的详细过程见Tsien et al.，Cell 87，1317-26，1996。
在上述生殖细胞的转化中，被转化的基因可以是构建的一段线性基因，也可以是一个环状质粒，还可以是整合了目的基因的病毒载体，可以被整合进宿主的基因组。目的基因还可被构建成为一种外源染色体质粒，可以在宿主细胞中自我复制。
还可利用携带了NR2B基因的重组病毒载体从体内、体外和exvivo感染神经细胞来获得转基因动物。逆转录病毒、腺病毒和单腺疱疹病毒等均可作为病毒载体。
结果发现，NR2B转基因大鼠获得新信息(即学习)和保存已有信息(即记忆)的能力都得到提高。
(二)其他技术和方法能增强NMDA受体功能的所有方法，都应该能发生如在NR2B转基因动物中所观察到的学习与记忆能力的提高。因此，通过NR2B的高表达来改变NMDA受体中NR2B与NR2A的比例，也可能得到同样的结果。另外一些增强NMDA受体功能的方法是(但不局限于此)1).利用一些小分子物质直接或间接地增加NMDA受体的功能；2).在转录水平(例如调节启动子)、翻译水平(可以包括调节上游的转录因子)和/或翻译后水平(蛋白质的共价或非共价修饰)来调节受体亚基的表达3).利用一些能在细胞内作用于NMDA受体的胞内区域，或者作用于受体下游反应中的信号分子的物质，来调节受体与它下游的靶物质之间的相互作用；4).利用一些物质在细胞内刺激下游基因的表达，下游基因是指在转基因大鼠或细胞中所看到的那些表达异常的基因；5).通过调整其他神经元受体(如AMPA受体、GABA受体、serotonin受体)或突触前神经传递因子释放等间接增强NMDA受体介导的过程，来影响NMDA受体的应答反应。
如前所述，NR2B即是调节的靶标。在本发明中，可以通过遗传操作的方法使NR2B在大脑某一区域得到高表达。一个受体可用能编码NR2B亚基的载体稳定地转化。这种转化一般应用于幼年或胚胎时期的受体，这样受体在幼年期和成年期其突触可塑性就得到了增强。特殊情况下，可对胚胎时期的生殖细胞进行转化，这样受体就可将转入的基因传至其后代。这种转化技术还可用于人类，详见下述。
另外，受体的体细胞也可用于稳定或临时性地转入能编码NR2B亚基的载体。体细胞转化适用于幼年或成年的受体，以校正或逆转大脑中的缺陷或病理情况，即基因治疗。基因治疗即是将外源的NR2B基因转入靶细胞，其表达的额外的NR2B亚基能与NMDA受体整合在一起。
本发明中的病体和受体既指人也指动物，发明的方法可应用于一切含有NMDA受体的具有中枢神经系统的有机体。
在本发明中，前脑区的NMDA受体是增强的靶标，前脑区包括皮层、纹状体、海马结构(hippocampal structures)、海马形成区(hippocampal formation)、杏仁核和边缘系统。其他与学习相关的脑区也可作为作用靶区，包括小脑和丘脑区、和基底神经节。只要具有NMDA受体的神经系统的任何区域都可以通过增强NMDA受体来达到目的。可用于改善与学习记忆相关的多种不适和疾病，如精神分裂症、老年痴呆症、其他与衰老相关的学习记忆损害以及包括滥用药物和酒精引起的记忆损害等的各种失忆症，还可用于由于脑部外伤、中风或局部缺血(如溺水)而导致的大脑损伤的个体的恢复。
本发明中所指的动物是指除了人之外的一切脊椎动物。也指动物个体在发育的各个阶段，包括胚胎和胎儿阶段。本发明中所用的动物是啮齿类，常用的是小鼠、大鼠和兔子；但并不是说局限于此，猫、狗、海豚和灵长类动物均可以使用。
本发明中用于转基因的目的基因是NR2B基因的全部编码区；或者它的互补DNA(cDNA)；或者含有NR2B部分或全部编码区的外源基因，前脑中组织特异性的启动子可以启动其表达。本发明中所用的NR2B编码顺序与受体动物是同源的，但这不是必须的。
(三)利用NMDA受体功能增强对突触可塑性、学习记忆的深入影响来鉴定化合物1、体外鉴定通过增强NR2B基因的表达来增强学习记忆能力的化合物的方法(1)构建带有报告基因的NR2B启动子重组DNA片段；(2)在上述重组基因中连接上可能调节NR2B启动子的被试化合物；(3)测定报告基因的表达；如果报告基因表达增强，即可说明被试化合物可以通过增强NR2B基因的表达来增强学习与记忆的能力。
另外，用未转化的某些细胞也可体外筛选化合物两组离体培养的一定类型的细胞，其中一组经被试化合物处理，用生化或电生理的方法测定其NMDA受体的活性。如果受体活性比未处理组高，则说明该化合物可进一步用于药物学研究。
2、利用转基因动物体内鉴定通过增强NR2B基因的表达或NMDA受体的活性来增强学习记忆能力的化合物的方法(1)两组大鼠，其中一组为NR2B转基因动物，另一组不转基因；(2)以可能正性调节NR2B基因表达或NMDA受体活性的被试化合物处理未转基因的动物；(3)用生物化学或行为测试的方法比较化合物处理未转基因的动物与转基因动物的学习与记忆能力(需要时还可与既未用化合物处理又未转基因的动物的学习记忆能力进行比较)。
如果在化合物处理未转基因的动物组出现的学习记忆能力的变化，与转基因组学习记忆能力的变化一样，即可说明被试化合物可以通过增强NR2B基因的表达或NMDA受体的活性来增强学习记忆的能力。
3、体内鉴定通过增强NMDA受体的活性来增强学习记忆能力的化合物的另一种方法(1)两组动物；(2)以可能正性影响NMDA受体活性的被试化合物处理其中一组动物，另一组不予处理；(3)直接或间接测定并比较两组动物中NMDA受体的活性。
结果可说明被试化合物对NMDA受体功能的影响。
该方法可做如下的改变以NR2B转基因动物代替上述未转基因的动物；或者一组转基因，一组不转基因；或者一组进行基因敲除使NMDA受体功能降低或丧失功能(Tsien et al.，1996，supra)。
4、鉴定那些影响NMDA受体介导的学习记忆过程的基因或基因产物的方法(1)利用转基因动物体内鉴定的方法a.两组动物，一组转NR2B基因，一组不转入；b.通过测试mRNA或蛋白质的产生或者翻译后蛋白质的修饰等比较两组动物的基因表达情况；c.将在转基因动物中表达发生变化的基因或者发生修饰的基因产物分离出来；
d.鉴定这些基因或基因产物。
该方法可作如下变化将以上的转基因动物、未转基因的动物与基因敲除的动物进行比较。
该方法还可作如下的变化用化学或神经元电刺激的方法增强未转基因动物的NMDA受体功能，观察处理后动物的基因表达情况，并将该结果与转基因动物的基因表达情况进行比较。
(2)体外鉴定的方法以上实验可用转基因的神经元细胞或非神经元细胞代替动物(转入基因可以是NR2B基因，或者有选择地同时转入NR2A，NR2C，NR2D等NR2其他亚基的基因)，用生物化学或生理的方法观察基因转入后细胞的变化情况。
利用转基因动物的细胞或组织块也可以在体外鉴定基因或基因产物。
(3)通过本发明也可推导出其他鉴定基因和基因产物的方法。例如用酵母双杂交方法、噬菌体展示或免疫沉淀等，可鉴定出与受体或者编码受体的基因之间有物理作用的蛋白质，即能得到与细胞中NMDA受体信号传导途径相关的有用信息。
利用NMDA受体编码区的多态性和突变性来进行诊断的方法。可发生在受体编码区或非编码区的突变或多态性，与某种学习与记忆相关，能被鉴定出来。这些多态性与学习记忆的增强或损伤相关。被鉴定出来的多态基因可以用于预测智商或者学习记忆能力的测定，或者可以用于诊断学习记忆异常的诱因。
本发明的有益效果体现在以下几个方面在该发明中首先明确了NMDA受体在各种类型的学习与记忆中都起着“主要分子开关”的作用，这对明确学习记忆的机制有着十分重要的作用，可促进神经生物学基础理论研究的发展。
不仅如此，本发明提出的一系列方法还具有显著的实用价值，具体表现在1.运用本发明中的方法，通过改变与学习记忆密切相关的大脑区域(如海马)NMDA受体的数量，来改变神经元中的突触可塑性，从而提高哺乳动物学习与记忆的能力。
2.运用本发明中的方法，可通过多种方法修饰NMDA受体，增强受体的活性，以缓解和改善与学习记忆相关的神经退行性疾病或异常。
3.运用本发明中的方法，可对与学习记忆相关的神经退行性疾病或异常进行基因治疗。
4.由于增强NMDA受体的活性可提高学习记忆的能力，则损害NMDA受体的功能也即可损害学习记忆能力。运用本发明提供的方法可通过损害NMDA受体的功能改善需要抑制认知等方面的疾病，如慢性疼痛(可塑性或记忆的一种形式)；或用于遭遇到精神创伤后的选择性失忆。
5.运用本发明中的方法，可筛选具有通过增强NR2B基因表达从而增强学习记忆能力的化合物，这给研制治疗与学习记忆相关的疾病的新药，或重新评价有关药物提供了重要的方法和技术。
6.运用本发明中的方法，能鉴定出影响NMDA受体介导的学习记忆过程的基因和基因产物。这不仅可促进脑功能基因组学基础理论的发展，还可利用新发现的基因或基因产物为靶标，进行新药的筛选。
7.运用本发明中的方法，利用NMDA受体编码区的多态性和突变性来进行诊断的方法。可发生在受体编码区或非编码区的突变或多态性，与某种学习与记忆相关，能被鉴定出来。这些多态性与学习记忆的增强或损伤有关。被鉴定出来的多态基因可以用于预测智商或者学习记忆能力的测定，或者可以用于诊断学习记忆异常的诱因。
具体实施例方式
(一)NR2B转基因大鼠的制备与特点1、转化基因的制备pJT-NR2B与Sal一起被消化，再从质粒DNA中纯化出线型NR2B转化基因表达载体pJT-NR2B(CaMKII启动子和NR2B基因)。
2、转基因大鼠的制备方法将上述制备的线型DNA注射进纯种大鼠的受精卵前核中(Tsien et al.，cell 87，1317-261996)。该鼠经过交配产生F1和F2。研究发现这种杂交产生的野生型的F2具有良好的学习能力。
3、转基因动物的基因型分析用动物尾巴的血液提取DNA，分析所有后代的基因型。用动物尾DNA(约1μg)在以下条件下进行扩增30个热循环(1min，94℃；45sec，55℃；1min，72℃)。采用Northernblot方法分析SV40的poly(A)，以测定转化基因的mRNA。做Westernblot时，从Upstate Biotechnology购买抗NR1，NR2A，NR2B的抗体。从大鼠前脑中制备突触膜蛋白。样品溶于7.5％-SDS聚丙烯酰胺中，分别用上述制备的抗体进行免疫印渍(immunoblotting)，以过氧化物标记的二抗和ECL检测系统(NEN Life Science产品)进行分析。在做原位杂交时，解剖动物大脑并迅速冷冻。
4、结果转基因大鼠在其生长、体重和交配方面都显正常，其笼外行为与野生型的同胞没有显著差异，也未见其有强占性和骚动性方面的迹象。Northern blot分析表明在大鼠的皮层和海马区NR2B转化基因的表达较高，而在丘脑、脑干和小脑等部位的表达较弱。Western blot分析方法显示在转基因大鼠中，其皮层和海马部位NR2B蛋白质都有增加。同时在这些区域可见NR1蛋白质有少量增加，而NR2A蛋白质量不变。结果显示在受体复合物中NR2B与NR2A的比率和NMDA受体总数都有所增加。
用原位杂交的方法分析转化基因的解剖学分布，发现转化基因高浓度分布在皮层、纹状体、海马和杏仁核部位。在光镜水平，未见转基因动物结构异常，而且，海马和皮层中树状棘的形状和结构也正常。
(二)NR2B转基因大鼠的电生理学分析突触可塑性是指神经元之间信息传递的效率的变化。科学家们普遍认为突触可塑性是突触水平研究学习记忆的最佳细胞分子模型，30多年来的研究进展已充分证明突触可塑性参与了记忆的获取、巩固和提取。学习记忆涉及到脑的许多区域和许多细胞分子过程，其中海马脑区是参与学习记忆的重要脑区之一，而突触长时程增强(LTP)和突触长时程减弱(LTD)是突触可塑性的表现。因此，我们测试与对比了NR2B转基因大鼠和野生型同笼对照大鼠海马CA1区突触传递的长时程增强(LTP)的特性。
1、海马脑片记录海马脑片取自于4～6月龄的转基因大鼠以及正常大鼠，快速得到海马的脑片后放到28℃、盛有人工脑脊液的孵育盒内。脑薄片在记录盒中放置两个小时以上再记录。将一双钨丝组成的刺激电极放在海马CA1区，同样在海马CA1区的辐射层，通过装有人工脑脊液的玻璃微电极(3-12兆欧)记录胞外场电位。
2、结果我们在CA1区Schaffer collateral侧支通路上做了一系列的LTP实验。结果显示，一个单串的强直刺激(100Hz，1sec)可以在正常对照大鼠海马(4～6个月)的脑片上，诱发出虽小的但可信的突触长时程增强现象(LTP123.05±0.60％)。然而同样的刺激可以在转基因大鼠脑片上诱导出显著增强的LTP(LTP146.54±0.70％，P＜0.05)。
(三)NR2B转基因大鼠的行为学分析1、方法行为学测试成年(3至6个月)转基因大鼠以及正常大鼠，标准条件(23±1℃，湿度50±5％)下饲养。所有的实验在隔音的、特殊的行为学测试室内完成。所有的实验者都不知道每只动物的基因型。
新物体辨别实验实验装置为一开场箱子，长、宽、高分别为120、120、38cm，木质合板做成，用黑色的、无毒油漆漆成黑色。训练前，将动物放到实验箱内适应环境5分钟，每天3次，连续3天。训练时，将两件物体相隔80cm英寸放在实验箱内，将动物放到实验箱内，让其自由探索5分钟。动物在离物体1英寸的距离内将头朝向此物体或除了尾巴以外的身体部位接触到此物体时被认为是在探索这一物体。记录下动物探索每一物体的时间。相隔一定的时间后，再将动物放回次实验箱内，让其自由探索5分钟。之后，其中一个已经熟悉的物体被一新的物体所取代。所有的物体根据自身的复杂性和情感上的中立性进行平衡。而且，为了避免物体和实验箱内留有气味信息，每次实验结束后，实验箱和物体均用70％的酒精擦拭。偏好指数被定义为花在探索某一物体上的时间与探索两种物体的时间总和的比值，它可用来衡量识别记忆。双因子方差分析和posthoc Dunnett’test用来分析基因型对行为学反应的影响。
恐惧条件反射此试验运用恐惧条件反射箱和多种参数监视器。简言之，整个装置有以下几部分组成反射箱(50×50×44cm)，底部有40根铁栅栏组成；发生器；扬声器；光束扫描器和工作台。反射箱的壁是透明的，因此动物的凝固反应可以通过装在窗帘上的窥视窗观察到，训练前，每只动物都要放到反射箱内让其适应环境，每次5分钟，一共进行3次。条件刺激为85dB、2.8kHz的声音，非条件刺激为一持续的0.75mA的足部电击。训练时，每只动物单独放到反射箱内，自由探索3分钟，接着给予30秒的声音刺激，从声音刺激结束前2秒开始给予2秒钟的电刺激。声音和电刺激匹配以后，让动物继续呆在反射箱内30秒，然后立刻将其放回鼠笼内。在这个过程中，实验者使用5秒采样实践方法和光束扫描系统记录动物的凝固反应。凝固被定义为除了呼吸运动以外的身体所有部位都不动。电刺激后的30秒内的凝固反应为早期凝固。在保持测试实验中，每一只动物被放到反射箱内，记录3分钟内的凝固反应，这种情况下的条件反射称为场景恐惧条件反射。接下来，动物被放到另外一个新的反射箱内(三角形的箱子，光滑的平底，壁被染成黄和黑两色)。在给予声音刺激前监视3分钟。然后，给予训练是相同的声音，持续3分钟，记录凝固反应，这时称为线索恐惧条件反射。双因子方差分析和posthocDunnett’test用来分析基因型对行为学反应的影响。水迷宫实验水迷宫实验的装置为直径1.2米的圆形池子，具体过程和以前所描述的一样，参见Tsien et al.，1996。动物的运动轨迹通过摄像头描绘出来，并记录下逃避的潜伏期。单因子方差分析和posthocDunnett’test用来分析基因型对逃离潜伏期的影响。
2、结果我们首先做了新事物辨别实验，此实验用来检测动物的视觉认知记忆，在进化上是比较保守的，它是需要海马的参与。(Reed&Squire，Behav.Neurosci.111，667-75，1997；Myhrer，Behav.Neurosci.102，356-62，1998；Mumby et al.Behav.Neurosci.110，266-81，1996)。为了增加实验的难度，我们使用了5分钟训练计划。在训练部分中，从探索偏好指数来看，花在探索两个物体的时间总和，转基因及野生型动物间并不存在明显差异，提示两组动物探索两物体的动机以及对两物体的好奇心是相同的。在保持实验中，其中一个熟悉的物体被一新的物体所取代，让动物探索5分钟。在1个小时的保持实验中，两组动物对新事物表现出相同的偏好，提示两组动物对记忆中的物体在一个小时内记忆的保持能力是相同的。然而，一天或三天后再来做保持实验时，转基因动物对新事物显示出了较强的偏好。表明转基因动物具有较好的长期记忆。
接着，我们做了动物的两种联合性情感记忆，场景恐惧条件反射和线索恐惧条件反射。给予动物非条件刺激(如电击足部)和条件刺激(如声音)，经过几次匹配后，动物就建立了恐惧条件反射。已经证实场景恐惧条件反射要依赖于海马的，而线索恐惧条件反射是非海马依赖性的(Philips&LeDoux，Beha.Neurosci.106，274-85，1992)。但这两种类型的恐惧条件反射是需要NMDA受体的激活(Kim etal.，Beha.Neurosci.106，591-6，1992；Davis et al.，InThe psychology oflearning and memory(Bower GH.Ed).New YorkAcademic Press，1987)。两种条件反射都是在训练后1小时、1天、3天和7天进行。首先，我们分析场景恐惧条件反射，转基因动物表现出一致的、较强的凝固反应。单因子方差分析显示，1小时的早期凝固反应在两组动物间不存在明显的差异，训练后1天和3天则表现出明显的差异，posthoc分析显示在转基因动物和野生型动物间存在显著的差异(P＜0.05)。
最后，我们使用水迷宫实验方法测试了转基因动物的空间学习能力，这个过程需要海马中的NMDA受体的激活(Tsien et al.，Cell 1996；Morris et al.，Nature 297，681-3，1982)。随着训练过程的延续，转基因和对照组动物逃到平台的时间(称为潜伏期)逐渐缩短，然而，在整个过程中，两组动物间都存在着明显的组间差异，提示转基因动物的空间学习记忆能力要好于野生型动物。
我们用转基因技术，在大鼠的大脑特异部位，包括海马和前脑皮层等高量表达NR2B受体。这些转基因模式大鼠表现出海马部位LTP增强、学习记忆能力提高。本发明的重要之处在于，改变了一个相同基因(与NR2B转基因小鼠相同)，也能够对不同种的动物——大鼠产生同样的效应。这一结果充分证明了，在动物的大脑内改变一个基因的表达量，能够提高动物的学习记忆能力。
权利要求
1.一种增强学习与记忆能力的方法，其特征在于通过修饰大脑神经突触的NMDA受体，从而使NMDA受体的突触可塑性或活性增强，即受体通道开放时间的延长或波峰的增加，最终提高学习与记忆能力。
2.一种改善与学习和记忆相关的神经退行性异常的方法，其特征在于通过修饰异常大脑内神经突触的NMDA受体，使NMDA受体的功能增强，最终改善学习与记忆的能力。
3.如权利要求1所述的增强学习与记忆能力的方法，其特征在于修饰大脑神经突触的NMDA受体的方法是通过遗传操作改变人类或者动物大脑内神经突触NMDA受体，从而增强NMDA受体的功能。
4.如权利要求1所述的增强学习与记忆能力的方法，其特征在于通过转基因技术使大脑内能表达转入的NR2B基因，本发明中的动物是大鼠。
5.一种鉴定具有通过增强NR2B基因表达从而增强学习与记忆能力的化合物的方法，其特征在于在NR2B基因的启动子上连接一段报告基因，再加入可能促进NR2B启动子表达的化合物，然后测定报告基因的表达，如果表达增强则说明该被试化合物可通过促进NR2B基因的表达来增强学习与记忆功能。
6.如权利要求5所述的鉴定具有通过增强NR2B基因表达从而增强学习与记忆能力的化合物的方法，其特征在于采用的是离体鉴定的方法，具体指方法一a.两组离体培养的细胞，一组细胞转入能编码NR2B的外源DNA分子，另一组不转入；b.在未转化组细胞中加入可能促进NR2B表达或提高NMDA受体活性的化合物；c.比较加入化合物而未被转化的细胞与转化细胞，如果加入化合物而未被转化的细胞中NMDA受体功能与转化细胞NMDA受体功能一致，则说明被试化合物能通过影响NMDA受体功能来增强学习与记忆能力。或者方法二a.将离体培养的经NR2B基因转化的细胞分成两组；b.一组细胞中加入可能会增强NMDA受体功能的被试化合物；c.直接或间接地测定两组细胞中NMDA的功能以确定被试化合物对NMDA受体的影响。
7.如权利要求5所述的鉴定具有通过增强NR2B基因表达从而增强学习记忆能力的化合物的方法，其特征在于采用的在体鉴定的方法，具体指方法三原理同权利要求6种的方法一，只是将培养细胞换成转基因和未转基因两组动物。或者方法四原理同权利要求6种的方法二，只是以转基因动物代替细胞。
8.一种鉴定影响NMDA受体介导的学习与记忆过程中的基因或基因产物的方法，其特征在于a.将动物或离体培养的细胞分成两组，其中一组转入能编码NR2B的外源DNA分子，另一组不转入；b.比较转基因和非转基因组动物或细胞的基因表达情况或蛋白质修饰情况；c.将在转基因动物或细胞中表达发生变化的一种或多种基因，或修饰发生变化的一种或多种基因产物分离出来；d.鉴定分离出来的基因或基因产物。
9.一种鉴定影响NMDA受体介导的学习记忆能力的基因或基因产物的方法，其特征在于a.培养带有NMDA受体的细胞并分成两组；b.在其中一组直接或间接地激活NMDA受体；c.比较两组细胞中基因表达或蛋白质修饰情况；d.将在被激活组受体中表达发生变化的一种或多种基因，或者修饰发生变化的一种或多种基因产物分离出来；e.鉴定分离出来的基因或基因产物。
全文摘要
本发明涉及一种增强学习记忆能力的方法，通过提高N－甲基－D－天冬氨酸(NMDA)2B受体的表达增强学习记忆能力的方法，属于神经生物学技术领域。本发明运用转基因、功能基因组学、化学遗传学等方法，研究学习记忆的分子机制，明确在学习记忆中起关键作用的基因；并在此基础上，提出提高个体学习与记忆能力的方法；提出可缓解与学习记忆相关的神经退行性疾病的方法；提出筛选调节学习记忆能力的新化合物的方法；提出鉴定在与学习记忆相关的生物过程中起作用的基因的方法。
文档编号A61P25/00GK1762497SQ20051003019
公开日2006年4月26日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者钱卓, 梅兵, 曹晓华, 胡应和 申请人:华东师范大学