专利名称：红花苷a在脑保护方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及红花苷A在神经保护方面的应用，具体地涉及红花苷A在脑保护方面的应用。
背景技术：
随着人口老龄化进程的加速，脑血管疾病、老年性神经系统疾病(老年性痴呆、血管性痴呆、帕金森症等)已成为一个全球性的健康问题，但是目前尚未找到完美的治疗药物以及治疗手段，以前对于此类疾病的治疗着重于受损脑区的治疗，近年研究发现，脑组织继发性损伤、二次损伤是导致死亡、预后差的更重要因素；因此，如何使损伤区周围区域的神经元恢复活力，免受损伤尤为重要。神经保护治疗是针对脑血管病的病理机制，对脑损伤的生化和代谢紊乱通过药物或其他等手段阻断细胞坏死不同环节，增加正常和受损细胞存活能力，促进神经功能恢复。
红花苷A是从传统活血化瘀中药红花中分离提取得到的单体成分，在CN96109651.9中将其称为红花素A，我们通过大量实验研究发现红花苷A具有神经保护作用。
红花苷A结构发明内容本发明提供了红花苷A在神经保护方面的应用。
本发明提供了红花苷A在脑保护方面的应用。
本发明提供了红花苷A在NMDA诱导神经细胞损伤保护方面的应用。
本发明提供了红花苷A在脑缺血所致大鼠神经细胞损伤保护方面的应用。
本发明提供了红花苷A在脑缺血再灌注所致小鼠血管性痴呆保护方面的应用。
本发明提供了一种红花苷A的制备方法。
本发明所述的红花苷A可单独使用或以药物组合物形式使用。药物组合物包括作为活性成分的红花苷A及药用载体。可通过静脉、口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜等途径给药，可以以注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖浆的形式存在。本发明所提供的各种药物剂型均可以以药学常规方法制备而成。
本发明通过下列试验证实了红花苷A具有神经保护作用。试验所用的红花苷A可以按CN96109651.9的方法制备，优选按本发明提供的方法制备。
本发明提供的红花苷A的制备方法，包括如下步骤(1)红花水提一次或多次，合并提取液，过滤，浓缩；(2)上大孔树脂，有机溶剂洗脱，收集洗脱液；(3)洗脱液上聚酰胺柱，有机溶剂洗脱，收集洗脱液，回收有机溶剂，浓缩液干燥即得。
本发明提供的红花苷A的制备方法，优选为(1)红花水提一次或多次，合并提取液，过滤，浓缩；(2)加入醇进行沉淀，滤过，浓缩滤液，回收醇；(3)滤液水稀释后上大孔树脂，醇溶液洗脱，收集洗脱液；(4)洗脱液上聚酰胺柱，不同浓度醇溶液洗脱，收集高浓度醇洗脱液，回收醇，浓缩液干燥即得。
本发明提供的红花苷A的制备方法，更优选为(1)干燥红花80℃下水提3次，合并提取液；过滤，滤液减压浓缩至密度为1.05；(2)加乙醇至浓度为80％，4℃下沉淀24小时，滤过；滤液减压回收醇至无醇味；(3)加至10倍水稀释后上DM-130大孔树脂，用5％乙醇洗脱4个柱体积，收集洗脱液；(4)洗脱液上聚酰胺柱，先50％乙醇洗脱3个柱体积，弃去；继续用95％乙醇洗脱8个柱体积，收集洗脱液于60℃减压回收乙醇，浓缩液冷冻干燥即得。
具体实施例方式制备例制备红花苷A取干燥红花，80℃下水提3次，水量依次为20倍、15倍、15倍，合并提取液；过滤，滤液减压浓缩至密度为1.05(80℃)，加乙醇至醇浓度为80％，于4℃下沉淀24小时，滤过；滤液于60℃减压回收乙醇至无醇味，加至10倍水稀释后上处理好的DM-130大孔吸附树脂，上样量(生药量)与树脂用量的比例为1∶1(w/v)，用5％乙醇洗脱4个柱体积，收集洗脱液。洗脱液上样于处理好的聚酰胺柱，上样量(生药量)与树脂用量的比例为3∶1(w/v)，先50％乙醇洗脱3个柱体积，弃去；继续用95％乙醇洗脱8个柱体积，收集洗脱液于60℃减压回收乙醇，浓缩液冷冻干燥即得。
试验例1红花苷A对N-甲基-D-门冬氨酸所致大鼠神经细胞损伤的保护作用1材料红花苷A按制备例方法制备，用时以生理盐水稀释至合适浓度。
多聚赖氨酸为Sigma公司产品。DMEM培养基为Gibco公司产品；其余试剂均为分析纯。
实验动物普通级Sprague Dawley大鼠18只，♂，体重250g-280g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
2方法2.1神经细胞原代培养怀孕15d大鼠水合氯醛麻醉，75％乙醇消毒胸腹部，在无菌条件下取出胎鼠，剥出，分离两侧皮层组织，用手术刀切成糜状，移入含0.125％胰蛋白酶的磷酸缓冲液中消化30min(37℃)后弃去消化液，加入含10％胎牛血清，10％马血清，100μ/ml青霉素，100μ/ml链霉素的DMED培养液，用小口径吸管反复吹打分散，200目细胞筛过滤后，以DMEM调整细胞浓度至106个/ml，接种至预先涂有0.01％多聚赖氨酸的35mm培养皿中，每皿2ml，置CO2培养箱中37℃孵育，于培养第3天在培养液中加入细胞分裂抑制剂阿糖胞普储备液(6μl/皿)以抑制非神经元细胞的过度增殖，作用48h后换新鲜培养液，以后每周换液2次，每次更换半量液。
2.2NMDA诱导神经细胞损伤细胞培养至d14后，随机分正常对照组，NMDA 50μmol·L-1组，红花苷A组(10、100μmol·L-1)；各组换以含不同药物的低血清DMEM(5％胎牛血清，5％马血清，30mmol·L-1HEPES)继续培养6h，再加50mmol·L-1NMDA，孵育12h后按文献阎超华，冯亦璞.丁基苯酞对低糖低氧诱导的大鼠皮层神经细胞损伤的保护作用.药学学报.1998，33(7)486-492.所述方法观察细胞形态，计算细胞死亡率。
2.3统计学处理数据用x±SD表示，组内给药前后、组间均以参比差值法(ANOVA)进行统计学处理。
3结果3.1对培养神经细胞形态变化的影响正常神经细胞培养至d14时，生长良好，胞体呈锥形、梭形或三角形，突触粗而长，呈树根状交织成网；当细胞在含50μmol·L-1NMDA的培养基中孵育12h时，细胞出现肿胀、轮廓模糊，神经元突触断裂、消失、甚至细胞崩解；如细胞同时与10、100μmol·L-1红花苷A孵育，则细胞损伤程度明显减轻，细胞形态基本保持完整，但细胞密度有所降低，仍可见突触断裂等现象；表明红花苷A对NMDA诱导的大鼠神经细胞损伤有显著的保护作用。
3.2对培养神经细胞死亡率的影响神经细胞在含50μmol·L-1NMDA的培养基中孵育12h后，台盼蓝染色着色细胞明显增多(NMDA 50μmol·L-1组86％vs正常对照组10％，P＜0.001)，提示细胞死亡率增加；于培养基中同时加入10、100μmol·L-1红花苷A(分别为38％、24％)可明显降低细胞死亡率，与NMDA50μmol·L-1组相比有显著差异。
试验例2红花苷A对局部脑缺血所致大鼠神经细胞损伤的保护作用1材料红花苷A按制备例制备，用时以生理盐水稀释至合适浓度。尼莫地平注射液，山东新华制药股份有限公司产品，规格10mg/50ml，批准文号国药准字H10950302，批号030602。TUNEL试剂盒南京建成生物工程开发公司。
实验动物普通级Sprague Dawley大鼠60只，♂，体重250g-280g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106005号。
2方法2.1局部脑缺血模型制作动物随机分为假手术组(NS)，模型对照组(NS)，尼莫地平组(Nim，1mg/kg)，红花苷A 5mg/kg组、50mg/kg组、100mg/kg组，每组10只。禁食16小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成右侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。各组动物手术完成30min后分别给予相应药物。
2.2神经行为评分24小时后按文献刘小光等.一种能评价溶栓和抗栓药的大鼠大脑中动脉血栓模型，药学学报，1995，30(9)662-667.所述方法观察并记录大鼠的行为障碍(1)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(2)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(3)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(4)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
2.3TTC染色测定梗死面积行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。
2.4病理观察经TTC染色后的脑片置10％福尔马林中固定，经脱水、浸蜡、包埋、切片等步骤后，制成8um厚的组织切片，甲苯胺蓝染色，在光学显微镜下进行检查，并进行细胞计数。计数的方法选择每只大鼠视交叉与漏斗柄连线中点处的病理切片，以固定范围的皮层下基底节为观察对象，以细胞核消失、细胞体暗染的坏死神经元为计数对象，用细胞计数器，计算坏死神经元数占总神经元数的百分比。
2.5统计学处理数据用x±SD表示，组内给药前后、组间均以参比差值法(ANOVA)进行统计学处理。
3结果3.1对神经行为障碍、脑梗死面积的影响结果如表1所示，缺血24小时后，大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血坏死区，达到全脑的25％左右；给予不同剂量的红花苷A(5mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)，动物行为障碍有不同程度的减轻，大鼠脑缺血区也有明显缩小。
表1红花苷A对局部脑缺血大鼠神经行为、脑梗死面积损伤的影响(x±SD，n＝10)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.013.2病理检查结果MCAO后24h，模型对照组的大鼠患侧半球MCA供血区苍白、无光泽，脑病理切片显示，于MCA闭塞侧脑组织有严重损伤的坏死中心区和轻中度损伤的半影区及其以外的外周区，其中半影区对缺血性变化较为敏感，在模型对照组大鼠表现为大量神经元周围间隙扩大，出现散在的暗染神经元，神经细胞出现不同程度的皱缩。对侧脑组织未见病理改变。给予红花苷A组动物有不同程度的减轻。我们以相同切面的脑片半影区来进行细胞计数。由表2可见，红花苷A治疗组皮层、纹状体神经元坏死百分比明显减少，与模型对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。
表2红花苷A对局部脑缺血大鼠神经元坏死百分比的影响(x±SD，n＝10)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01试验例3红花苷A对血管性痴呆小鼠的神经保护作用1材料红花苷A按制备例制备，用时以生理盐水稀释至合适浓度。跳台实验自动记录仪，中国医学科学院药物所仪电室产品；荧光分光光度计，日本HITACHI公司产品；酶标仪，美国Molecula产品。
实验动物清洁级昆明种小鼠，♂，体重20g-22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106003号。
2方法2.1红花苷A对脑缺血再灌注小鼠学习记忆功能障碍的改善作用动物随机分为假手术组(NS)，模型对照组(NS)，红花苷A 5mg/kg组、50mg/kg组、100mg/kg组，每组10只。禁食16小时后，按文献任德成，杜冠华，张均田.总丹酚酸对脑缺血再灌注损伤的保护作用.中国药理学通报.2002，18(3)275-7.方法建立小鼠缺血再灌注所致痴呆模型，具体操作如下小鼠以戊巴比妥钠(60mg/kg，ig)麻醉后，仰卧位固定。颈正中切口，分离双侧颈总动脉，并穿以零号丝线。双侧颈总动脉阻断血流10min，然后恢复血流10min，如此重复3次，缝合皮肤。然后置小鼠于正常饲养条件。假手术组只分离双侧颈总动脉。缺血再灌注后10min，尾静脉注射药物，缺血再灌注24h后，第2次给药。给药半小时后进行跳台实验。将待测小鼠放入跳台仪中，适应环境3min，然后向底部栅板通电，观察小鼠跳上高台时间(反应时间)和5min内小鼠由高台跳下受到电击的次数(训练期错误次数)。24h后，再次给药，然后进行第2次跳台实验测定记忆获得功能。将小鼠放于实验仪高台上，底部栅板同时通电，记录小鼠跳下高台的时间(潜伏期)和5min内受到电击次数(重测期错误次数)。
2.2红花苷A对脑缺血再灌注小鼠脑SOD活性、MDA和GSH含量的影响小鼠缺血再灌注方法和给药方式同上，缺血再灌注完成后，断头处死，于0℃下取出大脑用磷酸缓冲液制成匀浆，邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性，TBA法测定MDA的含量，DTNB法测定GSH的含量。考马斯亮蓝定量蛋白质。
3结果3.1红花苷A对脑缺血再灌注小鼠学习记忆功能障碍的改善作用结果如表3所示，重复脑缺血再灌注可以使小鼠出现明显的学习记忆障碍，反应时间延长，错误次数增加，潜伏期缩短。红花苷A对缺血再灌注引起的学习记忆障碍有改善作用，减少反应时间，延长潜伏期，减少测试期和重测期错误次数，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。
表3红花苷A对脑缺血再灌注小鼠学习记忆功能障碍的影响(x±SD，n＝10)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.013.2红花苷A对脑缺血再灌注小鼠脑SOD活性、MDA和GSH含量的影响结果如表4所示，重复脑缺血再灌注可以使小鼠脑匀浆SOD活性下降，MDA含量升高，GSH含量降低。给予不同剂量红花苷A可抑制缺血再灌注小鼠脑组织MDA的升高，增加GSH的含量，提高SOD的活性，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。
表4红花苷A对脑缺血再灌注小鼠脑SOD活性、MDA和GSH含量的影响(x±SD，n＝10)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01试验例4红花苷A对小鼠闭合性脑外伤的保护作用1材料红花苷A按制备例方法制备，用时以生理盐水稀释。跳台实验自动记录仪，中国医学科学院药物所仪电室；荧光分光光度计，日本HITACHI公司；酶标仪，美国Molecula。
实验动物清洁级昆明种小鼠，♂，体重20g-22g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号鲁动质字200106003号。
2方法与结果取小鼠70只，随机分为正常对照组(NS)，模型对照组(NS)，红花苷A 5mg/kg组、50mg/kg组、100mg/kg组，每组10只。禁食16小时后，按文献，王超云，蒋王林，智红英，等.黄芩苷对脑损伤的保护作用.中草药，2004，35(2)188~190所述方法造成小鼠闭合性脑外伤模型，各组静脉给药，24小时后剥取鼠脑，称量湿重，70℃烘干24小时，称干重，计算脑含水量；脑含水量高于正常值表示脑部水肿。
结果如表5所示，闭合性脑外伤造成小鼠脑严重水肿，给予不同剂量的红花苷A，小鼠脑水肿有不同程度的减轻，且呈剂量依赖性。
表5红花苷A对闭合性脑外伤小鼠脑水肿的影响(x±SD，n＝10)
与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.0权利要求
1.红花苷A在神经保护方面的应用。
2.根据权利要求1所述应用，红花苷A在脑保护方面的应用。
3.根据权利要求1或2所述应用，红花苷A在NMDA诱导神经细胞损伤保护方面的应用。
4.根据权利要求1或2所述应用，红花苷A在大鼠神经细胞损伤保护方面的应用。
5.根据权利要求1或2所述应用，红花苷A在脑缺血再灌注所致小鼠血管性痴呆保护方面的应用。
6.根据权利要求1或2所述应用，红花苷A在小鼠闭合性脑外伤保护方面的应用。
7.一种红花苷A的制备方法，包括如下步骤(1)红花水提一次或多次，合并提取液，过滤，浓缩；(2)上大孔树脂，有机溶剂洗脱，收集洗脱液；(3)洗脱液上聚酰胺柱，有机溶剂洗脱，收集洗脱液，回收有机溶剂，浓缩液干燥即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其优选为(1)红花水提一次或多次，合并提取液，过滤，浓缩；(2)加入醇进行沉淀，滤过，浓缩滤液，回收醇；(3)滤液水稀释后上大孔树脂，醇溶液洗脱，收集洗脱液；(4)洗脱液上聚酰胺柱，不同浓度醇溶液洗脱，收集高浓度醇洗脱液，回收醇，浓缩液干燥即得。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其更优选为(1)干燥红花80℃下水提3次，合并提取液；过滤，滤液减压浓缩至密度为1.05(80℃)；(2)加乙醇至浓度为80％，4℃下沉淀24小时，滤过；滤液于60℃减压回收醇至无醇味；(3)加至10倍水稀释后上DM-130大孔树脂，用5％乙醇洗脱4个柱体积，收集洗脱液；(4)洗脱液上聚酰胺柱，先50％乙醇洗脱3个柱体积，弃去；继续用95％乙醇洗脱8个柱体积，收集洗脱液于60℃减压回收乙醇，浓缩液冷冻干燥即得。
全文摘要
本发明提供了红花苷A在神经保护方面的应用，具体地涉及其在脑保护方面的应用，在脑缺血所致大鼠神经细胞损伤保护方面的应用，在脑缺血再灌注所致小鼠血管性痴呆保护方面的应用。本发明还提供了红花苷A的制备方法。
文档编号A61P25/00GK1827097SQ20051004215
公开日2006年9月6日 申请日期2005年3月2日 优先权日2005年3月2日
发明者田京伟, 傅风华, 刘珂, 李桂生, 马成俊, 张达磊 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司