专利名称：栀子有效成分在α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物、有效部位和有效成分，具体地说是涉及桅子有效成分西红花苷I和西红花酸作为a_葡萄糖苷酶抑制剂及其提取方法。
背景技术：
根据国际糖尿病联盟报告，目前全球糖尿病人数已逾I亿，预测2025年将突破3亿，主体为 2 型糖尿病(Asian-Pacific Type 2 Diabetes Policy Group.Type 2 diabetespractical targets and treatments 2005, fourth edition6_7:25)。我国糖尿病患病率逐年增高，从1979年的0.67%上升到1997年的3.6%，估计现已有糖尿病患者2000万以上，居世界第2位(丁学屏主编.《中西医结合糖尿病学》人民卫生出版社.2004.3第I版，I，52)，其 中2型糖尿病亦占到90%。因此，预防和治疗糖尿病极为紧迫。糖尿病前期即葡萄糖调节受损(impaired glucose regulation, IGR),其包括空腹血糖受损(impaired fasting glucose, IFG)和葡萄糖耐量缺损(impairedglucosetolerance IGT)。而发展成糖尿病，几乎都要经过IGT阶段(Alice Y.YCheng, GeorgeFantus.0ral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetesmellitus CMAJ.2005:172 (2) =213-226.)。我国有近IGT 3000万人，(卫生部疾病控制司，中华医学会糖尿病学分会，中国慢性病预防与控制2004; 12 (6):283.)他们是最重要的2型糖尿病高危人群，每年约有8% 11%进展为2型糖尿病，其转化的危险性居世界前列。对于IGT和2型糖尿病早期患者，均表现为餐后高血糖，而餐后高血糖对机体的危害远远超过空腹高血糖，(卫生部疾病控制司，中华医学会糖尿病学分会.中国慢性病预防与控制2004; 12 (6): 283.)餐后高血糖的糖毒作用，不仅极易诱发大血管、微血管、周围神经等多组织的病变，引起各种并发症，(BellDS.1mportance of postprandialglucose control.Southern med J 2001:94 (8):804-809.)还与冠心病和糖尿病的总死亡率之间相关性大于空腹高血糖，所以降低餐后血糖是预防2型糖尿病的发生，减少其并发症和降低死亡率的重要措施之一。因此，a-葡萄糖苷酶抑制剂，被亚太地区2型糖尿病政策组，制订的2005年第四版《2型糖尿病实用目标与治疗》一书中，仍然推荐为降餐后血糖的一线药物(Asian-Pacific Type 2 Diabetes Policy Group.Type 2diabetespractical targets and treatments 2005, fourth edition 6-7: 25)。a-葡萄糖苷酶抑制剂是通过抑制小肠上皮细胞表面a-葡萄糖苷酶的活性，延迟和减少单糖在其上部的吸收，明显降低餐后高血糖(Coutinho M, Gerstein HC, WangY，etal.The relationship between glucose and incident cardiovascular events.Ametaregression analysis of published data from 20 studies of 95, 783 individualsfollowed forl2.4 years.Diabetes Care 1999:22 (2):223-240.),来治疗葡萄糖耐量降低和 2 型糖尿病的(DECODE Studty Group.The European Diabetes EpidemiologyGroup.Glucose tolerance and cardiovascular mortality: comparison of fastiog and2-hour diagnostic criteria.Arch Intern Med.2001, 161 (3): 397-405.).上个世纪七十年代先后从微生物发酵产生的三种a-葡萄糖苷酶抑制剂，即阿卡波糖(拜唐苹)、伏格列波糖(倍欣)和米格列醇己被广泛应用于临床。STOP-NIDDM (2003年公布有9个国家40个研究中心参加，用拜唐苹IOOmg, tid,干预人群平均3.6年))研究已证实(Chiasson JI,Josse RG,Gom is R,etal.Acarbose treatment and the risk of cardiovasculardisease and hypertension in patients with impaired glucose tolerance theSTOP-NIDDM trial JAMA, 2003，290 (4):486-494.)，阿卡波糖可使 IGT 转化为 2 型糖尿病的危险下降36%,还可明显减少其心血管疾病发生的危险性。(Van de Laar FA, LucassenPL, etal.Alpha-glucosidase inhibitors for type 2 diabetes mellitus.ACP JClub.2005;143(3):66.)阿卡波糖明显降低糖化血红蛋白；空腹和负荷后血糖以及负荷后胰岛素水平；并使体重指数降低。但是，上述这类抑制剂市场价格都比较贵，要满足低收入患者长期用其干预IGT、2型糖尿病早期的餐后高血糖，延缓2型糖尿病的发生或减轻胰岛B细胞功能的衰竭，是件不容易坚持的事。从天然产物、中药中筛选更多、更便宜的a_葡萄糖苷酶抑制剂，近年来有不少报道，有多糖、黄酮、鞣质、皂甙、生物碱或提取物等各种类型。但是，根据文献检索，利用体外a -葡萄糖苷酶抑制活性筛选模型，对西红花苷I和西红花酸进行a -葡萄糖苷酶抑制活性的体外筛选试验尚未见报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种a -葡萄糖苷酶抑制剂桅子有效成分及其提取方法。1、桅子药用
桅子为菌草科(Rubiaceae)植物桅子Gardeniajasminoides Ellis的干燥成熟果实，化学成分主要包括环烯醚萜苷类、二萜类(西红花苷类)、有机酸酯类以及其他类化合物。《本草纲目》曾记载桅子具有解五种黄病，利五淋，通小便，解消渴，明目的功效，其中“解消渴”与糖尿病的临床相关症状有关。因此，这一治则为从桅子中筛选治疗糖尿病的a-葡萄糖苷酶抑制剂奠定了理论基础。2、桅子成分分析
主要包括环烯醚萜苷类、二萜类(西红花苷类)、有机酸酯类以及其他类化合物。单職苷类已报道有20余种，主要是桅子苷(gardenoside),京尼平苷(geniposide) (2),京尼平-10-龙胆双糖苷(genipin -1 ^ -gentiobioside)等。二職类化合物主要包括藏红花酸(croceic acid),藏红花素-二 P _D_龙胆二糖苷(Crocin I)等。有机酸酯类主要有绿原酸(chlorogenic acid), 3，4_ 二 _0_ 咖啡酞基奎宁酸(3,4-d1-0-caffeoyl quinic acid)等。还有三萜酸类，熊果酸。本发明的目的由以下的技术方案来实现
一种a -葡萄糖苷酶抑制剂--桅子有效成分，其特征在于该提取物为西红花苷I和西红花酸。上述桅子有效成分的提取方法如下: (I)西红花苷I的提取制备:
将桅子粉碎得粗粉，然后50%乙醇渗漉得渗漉液，减压回收溶剂，得桅子提取物浸膏；取桅子提取物浸膏上大孔吸附树脂，用70%乙醇洗脱，得有效部位桅子黄色素；取桅子黄色素上硅胶柱层析，再经氯仿:甲醇(5:2)的混合溶液洗脱，得西红花苷I。(2)西红花酸的提取制备:
将桅子粉碎得粗粉，然后50%乙醇渗漉得渗漉液，减压回收溶剂，得桅子提取物浸膏；取桅子提取物浸膏上大孔吸附树脂，用70%乙醇洗脱，得有效部位桅子黄色素；取桅子黄色素上硅胶柱层析，再经氯仿:甲醇(25:1)的混合溶液洗脱，得西红花酸。取上述的桅子提取物、桅子黄色素、桅子有效成分西红花苷I和西红花酸均可在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂中应用。有益效果
经实验研究结果表明桅子提取物5、10、50、100mg/ml相当生药的四个不同浓度，以及100mg/ml阿卡波糖作阳性药对照，分别加入测定体系，阿卡波糖对a-葡萄糖苷酶的抑制率为66.40%，桅子提取物的抑制率分别为0.80,9.33,61.47,83.20%。桅子黄色素类5、10、50、100mg/ml相当生药的四个不同浓度，以及100 mg/ml阿卡波糖作阳性药对照，分别加入测定体系，阿卡波糖对a -葡萄糖苷酶的抑制率为66.40%，桅子提取物的抑制率分别为20.80,29.60,78.13,96.93%。西红花苷I和西红花酸1.56、3.13、6.25、12.50、25.00 mg/ml相当于生药的五个不同浓度，以及25mg/ml阿卡波糖作阳性药对照，分别加入测定体系，阿卡波糖对a -葡萄糖苷酶的抑制率为66.00%,西红花苷I的抑制率分别为5.69,27.94,27.05,83.19、99.24% ;西红花酸的抑制率分别为 57.02,90.27,100.00,99.62,94.18%。因此，实验表明桅子中抑制a -葡萄糖苷酶活性的有效成分为西红花苷I和西红花酸。
具体实施例方式 实施例1:一种a-葡萄糖苷酶抑制剂一桅子有效成分西红花苷I和西红花酸的提取方法如下:
(I)西红花苷I的制备:将桅子粉碎得粗粉，然后50%乙醇渗漉得渗漉液，减压回收溶剂，得浸膏;取浸膏上大孔吸附树脂，用70%乙醇洗脱得有效部位桅子黄色素；取桅子黄色素上硅胶柱层析再经氯仿:甲醇(5:2)的混合溶液洗脱，得西红花苷I。(2)西红花酸的制备:将桅子粉碎得粗粉，然后50%乙醇渗漉得渗漉液，减压回收溶剂，得浸膏；取浸膏上大孔吸附树脂，用70%乙醇洗脱得有效部位桅子黄色素；取桅子黄色素上硅胶柱层析再经氯仿:甲醇(25:1)的混合溶液洗脱，得西红花酸。实施例2:桅子有效成分西红花苷I和西红花酸对a -葡萄糖苷酶的抑制作用: (一)材料
1、试剂 a -葡萄糖苷酶(a-glucosidase), Sigma公司，批号1001134428。4_硝基酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，Sigma公司，批号101027065。还原型谷胱甘肽(Reducedglutathione), Sigma公司，批号1001005780。磷酸二氢钾、磷酸氢二钾,购于广东汕头西陇化工厂，以上均分析纯试剂。2、仪器 BT-224半自 动生化分析仪，意大利产；L550台式低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司JA2103N型电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；ACS型-15C系列电子计重秤，上海华德衡器有限公司。
3、药物与药材阿卡波糖片，拜耳医药保健有限公司，批号BJ07287。成分:阿卡波糖，每片含50毫克阿卡波糖。(二)方法
1.反应体系优化
根据Tremblay等的方法测定a -葡萄糖苷酶活性,在磷酸钾缓冲液(pH6.8)体系中，反应温度37°C，以PNPG为反应底物，加入a -葡萄糖苷酶，以Na2C03为终止液。PNPG溶液无色，但经a -葡萄糖苷酶水解释放出对硝基苯酚(PNP)，PNP在碱性条件下呈黄绿色，在400nm处有最大吸收，当加入a -葡萄糖苷酶抑制剂时，可以抑制a -葡萄糖苷酶的活性，减少PNP的释放，因此可以通过吸光度的变化来测定抑制活性。调整a -葡萄糖苷酶和底物PNPG的浓度，a-葡萄糖苷酶浓度固定后，当底物浓度增加吸光度值无明显变化时确定为最佳反应体系。反应系统为67mmol/L磷酸钾缓冲液(37° C，pH6.8)870 yl，lmg/ml谷胱甘肽溶液25 u L, a-葡萄糖苷酶溶液(0.91,1.82,2.74U/mL) 35 y L，混匀，37 °(:水浴保温 IOmin 后，加入pNPG溶液(5、10、15、20、25、30mmol/L) 70 y L，再置原水浴中继续保温15min后，再加A 4mL 0.lmol/L Na2C03溶液，冷却后，以空白管调零，于波长405nm处测定在酶的作用下释放出对硝基酚(PNP)的吸光度(A)。
2.西红花苷I和西红花酸抑制a-葡萄糖苷酶活性的测定
反应系统为67mmol/L磷酸钾缓冲液(37°C，pH6.8) 870 yl，lmg/ml谷胱甘肽溶液25 u L, 2.74U/mL a -葡萄糖苷 酶溶液35 y L，与IOy L西红花苷I和西红花酸浓度为(1.56,3.13,6.25、12.5、25mg/ml), 10 u L 阿卡波糖(阳性药对照管，100.0 mg/mL);混匀，37°〇水浴保温IOmin后，加入15mmol/L pNPG溶液70 y L，再置原水浴中继续保温IOmin后，加入4mL 0.lmol/L Na2C03溶液，以空白管调零，于波长400nm处测定在酶的作用下释放出对硝基酚(PNP)的吸光度(A)。其他操作同上。a-葡萄糖苷酶管除不加提取物，空白对照管内加a-葡萄糖苷酶，而不加pNPG外，均由蒸馏水补足体积，其他反应同前。中药空白对照管内除不加PNPG外，需加入相应提取物，其浓度、加量与中药管前平行，其他操作同空白管。a-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下:
酶活性抑制率=1 - (A样品一 A背景)]/ (A酶一 A空白)X 100%
(三)结果
PNPG浓度达到10 15mmol/L之间，不同浓度的a -葡萄糖苷酶与pNPG反应均出现拐点，考虑反应敏感度，选择斜率较大的曲线数据，即:2.74U/mL a -葡萄糖苷酶溶液、15mmol/L pNPG溶液。因此确定了 a -葡萄糖苷酶抑制作用试验最佳反应体系为:67mmol/L磷酸钾缓冲液870 yl，lmg/ml谷胱甘肽溶液25 u L，2.74U/mL a-葡萄糖苷酶溶液35 u L，
1 Smmol/T, pNPG 溶液 70 u L, 0.lmol/L Na2CO3 溶液 4mL。见表 I。
权利要求
1.一种桅子有效成分在a-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，其特征在于桅子有效成分为西红花苷I和西红花酸。
2.根据权利要求1所述的桅子有效成分，其制备方法如下: (1)西红花苷I的提取制备: 取从桅子中得到的桅子黄色素上硅胶柱层析，再经5: 2的氯仿:甲醇混合溶液洗脱，得西红花苷I; (2)西红花酸的提取制备: 取从桅子中得到的 桅子黄色素上硅胶柱层析，再经25: 2的氯仿:甲醇混合溶液洗脱，得西红花酸。
全文摘要
本发明公开一种α-葡萄糖苷酶抑制剂——栀子有效成分。经鉴定，其有效成分为西红花苷Ⅰ和西红花酸。经体外实验以阿卡波糖为阳性|对照，观察栀子两个有效成分对α-葡萄糖苷酶活性的影响。结果表明，栀子两个有效成分对α-葡萄糖苷酶均有明显的抑制作用，呈量效关系。
文档编号C07H1/08GK103239462SQ20131021392
公开日2013年8月14日 申请日期2013年6月3日 优先权日2013年6月3日
发明者肖小华, 徐丽瑛, 王丽华, 周艳艳, 丁琦, 李艳, 曾宪仪 申请人:江西省药物研究所