一种制备具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取物的制备方法，更具体的，涉及一种山楂叶提取物的制备方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病(Diabetes melIitus1DM)是一种人体血液中胰岛素含量不足而引发的内分泌代谢性紊乱的疾病。随着生活水平的提高，国内外糖尿病患者日益增多，据WHO的统计，到2030年，糖尿病患者将会有3.66亿之多，因此降低餐后血糖是预防糖尿病，减少其并发症的重要措施。
[0003]α-葡萄糖苷酶抑制剂(a-Glucosidase Inhibitor)通过竞争性抑制抑制小肠上的α -葡萄糖苷酶的活性，降低碳水化合物的分解速度，延缓人体对葡萄糖的吸收，从而有效的降低用餐后血糖浓度的峰值。由于α-葡萄糖苷酶抑制剂具有安全、高效的优势，已被医学界列为第3类口服降糖药物。目前临床应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂有阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)和米格列醇(miglitol)，这三种物质结构类似葡萄糖，除此之外，通过文献研究，萜类、黄酮类、生物碱类、酚类等化合物均具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性。从药用植物中分离纯化出的活性成分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用大都比市场上的降糖药物强，如阿卡波糖、野尻毒素等。然而由于分离纯化技术的限制，这些成分还不能大规模生产，该类产品产量低、价格高，因此需要研究创新技术运用到工业化中生产质优价廉的降糖产品。
[0004]山楂叶为山楂属植物(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥叶，具有活血化瘀、理气通脉的功效。随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，人们逐步认识到山楂叶良好的药理功效，越来越关注山楂叶产品的开发利用，目前市场上的山楂叶保健产品包括复合袋泡茶、山楂叶绿茶等。现代药理研究发现山楂叶提取物可以明显降低小鼠血糖水平，改善脂质异常，具有明显的降糖作用；Wang等研究发现山楂叶总黄酮可以调节血糖和脂质代谢，能够显著抑制小鼠对碳水化合物和甘油三酯的吸收，具有较好的降糖效果。
[0005]目前市售的具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的降糖药物主要为化学合成药物，如阿卡波糖，0-4，6-双脱氧-4[[(1S, 4R, 5S, 6S)4, 5，6-三羟基_3_(羟基甲基)_2_环己烯]氨基]-(-D-吡喃葡糖基(I — 4)-O-)-D-吡喃葡糖基(I — 4)-D-吡喃葡萄糖，非天然，只用作药物使用，无法作为保健食品等使用。
[0006]而天然植物产品多为直接作为茶叶等冲泡饮品等，无针对功效成分的提取，酶活抑制低。
[0007]本发明以天然山楂叶为原料，通过超声辅助醇提-萃取-层析等技术进行分离纯化获得一种具有高α-葡萄糖苷酶抑制作用的山楂叶提取物制备方法。该提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用为阿卡波糖2.15?4.30倍(阿卡波糖是一种新型口服降糖药。在肠道内竞争性抑制小肠的α葡萄糖苷酶。降低多糖及蔗糖分解成葡萄糖，使糖的吸收相应减缓，因此可具有使饭后血糖降低的作用。一般单用，或与其它口服降血糖药，或胰岛素合用。配合餐饮，治疗胰岛素依赖型或非依赖型糖尿病)。该发明为以山楂叶资源作为降糖保健食品或药品开发奠定基础。
[0008]因此，采用山楂叶这种天然资源为原料制备具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物，具有绿色、安全的特点；在食品和药品等领域中都具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0009]本发明的一个目的，在于提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的山楂叶提取物的制备方法。
[0010]本发明的一个目的，在于提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的提取物。
[0011]本发明提供一种具有高α -葡萄糖苷酶抑制作用的山楂叶提取物制备方法，其包括如下步骤:
[0012]步骤1、将山楂叶干燥粉碎，制备得到山楂叶粉；
[0013]步骤2、采用超声辅助法制备山楂叶提取液；
[0014]步骤3、将山楂叶提取液进行减压浓缩以去除乙醇获得浓缩提取液；
[0015]步骤4、向浓缩提取液添加水，震荡使悬浮物充分溶解，将该溶液减压抽滤得到水不溶物；
[0016]步骤5、将水不溶物经聚丙烯胺层析，以甲醇溶液为洗脱液，获得流出液经减压浓缩干燥为目标提取物。
[0017]优选的，步骤I中山楂叶干燥粉碎80-120目。
[0018]优选的，步骤2中，按山楂叶粉:乙醇=1:20?40 (w/v)的比例提取粗液，单次提取时间40?50分钟，超声功率400?600瓦，乙醇浓度60?85% ;将所提取粗液经超滤获得滤液；优选的，反复提取并超滤2-3次后，将反复提取并超滤所得到的所述滤液合并为山楂叶提取液。
[0019]优选的，步骤3中采用减压蒸馏法进行减压浓缩，浓缩温度为60度。
[0020]优选的，步骤4中按提取液:水=1:15 (v/v)向浓缩提取液添加水。
[0021]优选的，步骤5中甲醇溶液的浓度为65?85%。
[0022]本发明还提供一种具有α -葡萄糖苷酶抑制作用的山楂叶提取物，其由上述方法制得。
[0023]优选的，对α葡萄糖苷酶的IC5。值分别为0.64?1.28毫克/毫升(mg/mL)，该提取物对α -葡萄糖苷酶抑制效果为阿卡波糖的2.15?4.30倍。
[0024]本发明还提供一种对α -葡萄糖苷酶抑制率的测定方法，其包括步骤:
[0025]取25微升不同浓度样品溶液于96孔酶标板中，加入50微升α -葡萄糖苷酶溶液(0.2酶活性单位/毫升)，混匀，37度恒温条件下放置10分钟后，加入5毫摩尔/升的PNPG50微升，混勾后于37度丨旦温条件下放置20分钟，最后加入150微升I摩尔/升的Na2CO3溶液终止反应，于405纳米波长处测定吸光度。
[0026]优选的，所采用的酶活抑制率计算公式如下:
[0027]酶活抑制率=[Α空白_ (Α样品-A背景)]/A空白X 100 %
[0028]其中，Aae:不加待测样品反应后的吸光值；
[0029]A样品:加入待测样品反应后的吸光值；
[0030]A背景:只加待测样品的吸光值。
[0031]本发明技术方案带来如下的有益效果:
[0032]1、分离提取制备方法较为简单可行，具有工业化制备的潜力；
[0033]2、酶活抑制率高于现有市售阿卡波糖；
[0034]3、原料为山楂落果后的山楂叶，来源广泛，廉价易得，属副产物综合利用。
【具体实施方式】
[0035]为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
[0036]下述实施例中的制备方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂厂商购买得到。
[0037]实施例1
[0038]具有山楂叶高α -葡萄糖苷酶抑制作用的山楂叶提取物制备方法如下:
[0039]步骤1、山楂叶干燥粉碎100目，制备山楂叶粉
[0040]步骤2、采用超声辅助法，按山楂叶粉:乙醇=1:35 (w/v，质量体积比，本实施例例如单位选取克:毫升，山楂叶粉:乙醇=I: 35 (w/v)为I克山楂叶粉:35毫升乙醇)比例提取粗液，单次提取时间40分钟，超声功率480瓦，乙醇浓度70% ;再将所提取粗液经超滤获得滤液；反复共提取并超滤3次(再将滤渣按照上述过程再重复提取2次)，将3次反复提取并超滤所得的所述滤液合并为山楂叶提取液。
[0041]步骤3、将山楂叶提取液进行减压浓缩(减压蒸馏法，使用真空旋转蒸发仪以抽真空的方式来降