甲萘氢醌二磷酸酯钠片及其制备方法

专利名称：甲萘氢醌二磷酸酯钠片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种甲萘氢醌二磷酸酯钠片及其制备方法，属于药物制剂领域。
背景技术：
甲萘氢醌二磷酸酯钠分子式为C11H8Na4O8P2·6H2O，分子量为530.17，化学名称为2-甲基-1，4-萘氢醌双(二氢磷酸酯)四钠盐六水合物，英文名为2-Methyl-1，4-naphthalenediolbis(dihydrogen phosphate)tetrasodium salt，hexahydrate，其化学结构为 甲萘氢醌二磷酸酯钠为维生素K3的人工合成品，在体内转变为甲萘醌(维生素K3)。它与自然界存在的维生素K相同，维生素K为肝脏合成凝血酶原(因子II)的必需物质，还参与因子VII、因子IX和因子X合成。缺乏维生素K可致上述凝血因子合成障碍，影响凝血过程而引起出血。此时给予维生素K可达到止血作用。适用于下列病症 由于限制维生素K吸收或合成的因素，如阻塞性黄疸、胆瘘、慢性腹泻、溃疡性肠炎、区域性肠炎、腹腔炎症、胃肠手术、胆囊纤维变性和抗生素治疗等引起的低凝血酶原血症； 由于服用香豆素类、水杨酸盐、奎宁、奎尼丁等引起的凝血酶原过低症； 用于胆石症、胆道蛔虫症引起的胆绞痛； 也可用于肝功能的检测。
据文献报道，本品为维生素K的活性药物，在临床上用于患有与胆功能相关的胆道或肝脏疾病，部分患者患有与维生素K缺乏相关的胃肠道功能紊乱或者是严重的败血症，将本品用于41例患者，其中21名患者每天使用10mg剂量的本品，20人在出血处皮下注射本品，在经皮下注射的部分病人中，10人还同时使用了5谷的胆汁盐，一小部分病人在注射10mg本品后，每小时抽样测定凝血酶原的水平，以测定病人在用药后血液中凝血酶原水平的提高速度，研究结果表明1.每天注射或局部使用10mg本品，可在24-48小时内使凝血酶水平提高到正常范围内，有许多患者在停用此药后仍然继续维持正常水平24-72小时。
2.部分黄疸症恶化的患者，使用本品可能会引起给药期间的凝血酶原水平被动，产生药物所致的滞后和波动的反应，有时还可能发生高烧、呕吐或饥饿等症状。
3.在患有肝损伤的病人当中，给药后凝血酶水平的上升有明显的滞后，个别病例如同时被感染的肝病患者，一直未能达到100％的水平，个别病例一旦停药，其凝血酶水平便无法继续维持，有幽门障碍或结肠造口手术后以及有严重败血症和饥饿患者的病人，表现出与肝脏功能障碍患者同样的用药反应。
4.在很多患者有黄疸并有败血症的病例中，凝血酶原水平只有在96小时后才能达到正常水平，但在这些病例中也出现在停药后仍然维持正常凝血酶原水平在48小时的现象。
由上述研究结果说明凝血酶原水平低下的程度，肝组织所呈现的状态，胃肠系统的状态和吸收机能对任何具有类似于维生素K活性药物的止血作用都有具有重要的影响，一般情况下，由无并发症的胆功能障碍引起的维生素K缺乏症患者对每日注射或局部使用10mg的本品反应迅速，而对于有肝损伤和由于干扰维生素K贮存和使用引起的疾病，以及败血症和胃肠功能病变的病例。他们对维生素的吸收功能有障碍，对药物反应不迅速，不完全，而且持续时间较短。
然而只要肝功能的整体性未受严重破坏，在某些胃肠道疾病和败血症中所见的维生素K吸收上的障碍引起低凝血酶症状仅在这种障碍持续一段时间以后才会发生，多数情况下，患有结肠炎并发性消化道溃疡等常能导致维生素K的长期缺乏，但由于患者长期从食物中摄取了微量该物质，因此他们的凝血酶水平仍能接近正常，然而在肝组织损伤的病例中，几乎经常发现凝血酶原水平明显降低的情况。在败血症伴有肝损伤和败血症伴有肝功能障碍的病例中更是能发现极低的凝血酶原水平。
自然界中脂溶性维生素K是从胃肠道运用胆汁吸收的，但合成的水溶性类似物却不同。正常人每天所需维生素K由小肠中的细菌产生，尽管人体每天对维生素K的需求量还不太清楚，但Hardwicke估计每日0.5到5μg的维生素K可以预防新生儿低凝血酶症。Dam发现母乳中含有少量甚至不含有维生素K，只有极少量的定量维素K储存于肝脏中，其余的部分随粪便排出体外。现在维生素K广泛用于治疗新生儿出血症，它对凝血时间的影响也得到认同。

发明内容
本发明的目的在于提供一种甲萘氢醌二磷酸酯钠片。
本发明的另一目的在于提供一种甲萘氢醌二磷酸酯钠片的制备方法。
本发明产品以2-甲基-1，4-萘二酚为原料，通过以下过程，得到2-甲基-1，4-萘氢醌双(二氢磷酸酯)四钠盐六水合物(D)然后按照药剂学上的常用方法，制备甲萘氢醌二磷酸酯钠片。
以反应物A为原料，将其还原，得到物质B，冷却二氯甲烷和三氯氧磷的混合液至-5℃，其中二氯甲烷与三氯氧磷的体积比为10∶3-10∶5，在搅拌下，同时滴加B、三乙胺和二氯甲烷的混合液，其用量分别为0.1-0.2g/mL的B、0.3-0.5g/mL的三乙胺、2倍体积的二氯甲烷；温度控制在-5℃～5℃，滴加完毕后，继续搅拌10-30分钟，加入5-10倍体积的pH为3的盐酸水溶液洗涤，分液，水层用二氯甲烷萃取，弃有机层，水层用异丁醇萃取，合并异丁醇层，干燥后浓缩，加石油醚，析出固体后过滤得固体C；产物D溶于3倍重量的水中，搅拌下滴加饱和碳酸钠溶液，至pH为7，继续加入3倍体积的丙酮，待不再析出固体时，过滤，滤饼用甲醇溶解，过滤后用无水硫酸钠干燥，蒸除甲醇后，固体用丙酮-水(丙酮与水的体积比为3∶7)重结晶，得产物D。
产物D按照药剂学上的常用方法，加入辅料，经后处理，得到片剂。
反应物A还原至B可按照费塞尔·LF，威廉森·KL.有机实验[M].北京高等教育出版社，1986.370.提示的方法进行。
经检验，甲萘氢醌二磷酸酯钠得率可达到92.5％，纯度可达99.7％，完全适用后续的药物制备。
根据本品的理化性质，不存在吸收上的问题。注射给药后发现其存在于研究的所有组织中，并且没有证据表明某一器官(除膀胱外)能长时间地聚集维生素。
本品主要在肾脏代谢，17小时后，尿液中排泄率为43％，粪便中排泄率为4％。
本品转化为维生素K后能够通过胎盘屏障。
本品为维生素K类合成药物，通过微生物回复突变试验、CHL细胞染色体畸变试验和小鼠口服给药的微核试验，以及对妊娠大鼠在致畸敏感期皮下注射甲萘氢醌二磷酸酯钠进行生殖毒性试验的实验结果表明其不产生致畸、致突变性，亦无生殖毒性。
本品供口服。
成人每天最低用量为0.03μg/Kg，婴幼儿每天为1-5μg/Kg。通常推荐治疗剂量为成人每次5一15mg，一日1次或2次；儿童每次5-10mg，每日1次或2次。
成人在使用大剂量的维生素K后，可能会发生磺溴酞滞留和凝血酶原时间的延长；婴幼儿(尤其是刚出生的婴儿)过量服用维生素K可能会在出生初期导致胆红素血症，从而引发核黄疸症。但足月的婴儿比初生婴儿对药物耐受性增强很多。
对于血液细胞遗传性缺乏葡糖-6-磷酸脱氢酶的人群，使用本品会导致红血球溶血。
对有严重肝功能损伤的患者，大剂量的本品能加重对肝功能的抑制；治疗由于肝胆功能障碍引起的低凝血酶原血症，而过量使用本品后可能导致凝血素浓度的降低。
出生未满1个月的婴儿禁止使用本品；本品不得用于临产期妇女预防生理性低凝血酶原血症或新生儿出血症；对本品过敏者慎用。
本品为水溶性维生素K类药物，它对口服抗凝剂引起的低凝血酶原血症无效，同样，本品也不能抵消肝素的抗凝血作用。
由于本品由于有效剂量范围较大，未发现人体过量反应。对动物实验时，过量使用本品会产生贫血症，红细胞增多症，脾肿胀，肾和肝脏损伤甚至死亡。
Allison在1955年强调了维生素K对红细胞的作用，他发现早产儿使用大剂量的维生素K后容易发生红血球融解症状。Moore和Sharman同年提出缺乏维生素E的大鼠在使用大剂量的维生素K后会产生血红蛋白疾病，与此同时，Laurence观察到早产儿在超量使用维生素K后容易增加患核黄疸的概率。Crosse、Meyer和Genard总结后发现早产儿发生核黄疸疾病的稳定升高的几率可能与使用高剂量的维生素K有关。所有的这些发现趋于证实Gasser在1953提出的观点，他设想维生素K可能是发生在14个早产儿中的溶血性贫血的原因。
由于早产儿不具有同种免疫功能，其核黄疸疾病据报道与其血清中的胆红素水平有关。肌注大剂量的本品对足月生婴儿和早产儿都能引起血清胆红素水平的提升。这对于有肝功能不足的早产儿，本品的作用能使血清胆红素到足够高的水平而导致核黄疸疾病。
本品的作用方式可能是增加红细胞中红血球的融解，这能增加循环系统中胆红素数量。因此，与未使用本品的婴儿相比，在使用本品后经过输血的婴儿的核黄疸疾病发生率无明显变化。大剂量的本品可能只具有肝毒性，或者伴有溶血和肝毒性作用。


图1为重复低剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠对红细胞数目的影响；箭头指示每天的剂量，D代表死亡。
图2为重复高剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠对红细胞数的影响；箭头指示每天的剂量，半高箭头代表在两只兔中使用了一半剂量。
具体实施例方式
实施例1 以反应物A为原料，按照费塞尔·LF，威廉森·KL.有机实验[M].北京高等教育出版社，1986.370.提示的方法，进行还原反应，得到物质B；冷却二氯甲烷和三氯氧磷的混合液至-5℃，其中二氯甲烷与三氯氧磷的体积比为10∶3，在搅拌下，同时滴加B、三乙胺和二氯甲烷的混合液，其用量分别为0.1g/mL的B、0.5g/mL的三乙胺、2倍体积的二氯甲烷；温度控制在-5℃～5℃，滴加完毕后，继续搅拌10分钟，加入5倍体积的pH为3的盐酸水溶液洗涤，分液，水层用二氯甲烷萃取，弃有机层，水层用异丁醇萃取，合并异丁醇层，干燥后浓缩，加石油醚，析出固体后过滤得固体C；产物D溶于3倍重量的水中，搅拌下滴加饱和碳酸钠溶液，至pH为7，继续加入3倍体积的丙酮，待不再析出固体时，过滤，滤饼用甲醇溶解，过滤后用无水硫酸钠干燥，蒸除甲醇后，固体用丙酮-水(丙酮与水的体积比为3∶7)重结晶，得产物甲萘氢醌二磷酸酯钠。
甲萘氢醌二磷酸酯钠得率为90.0％，纯度为99.1％。
甲萘氢醌二磷酸酯钠按照药剂学上的常用方法，加入硬脂酸镁，压制成片，甲萘氢醌二磷酸酯钠含量为5mg/片。
实施例2
以反应物A为原料，按照费塞尔·LF，威廉森·KL.有机实验[M].北京高等教育出版社，1986.370.提示的方法，进行还原反应，得到物质B；冷却二氯甲烷和三氯氧磷的混合液至-5℃，其中二氯甲烷与三氯氧磷的体积比为10∶4，在搅拌下，同时滴加B、三乙胺和二氯甲烷的混合液，其用量分别为0.15g/mL的B、0.4g/mL的三乙胺、2倍体积的二氯甲烷；温度控制在-5℃～5℃，滴加完毕后，继续搅拌15分钟，加入10倍体积的pH为3的盐酸水溶液洗涤，分液，水层用二氯甲烷萃取，弃有机层，水层用异丁醇萃取，合并异丁醇层，干燥后浓缩，加石油醚，析出固体后过滤得固体C；产物D溶于3倍重量的水中，搅拌下滴加饱和碳酸钠溶液，至pH为7，继续加入3倍体积的丙酮，待不再析出固体时，过滤，滤饼用甲醇溶解，过滤后用无水硫酸钠干燥，蒸除甲醇后，固体用丙酮-水(丙酮与水的体积比为3∶7)重结晶，得产物甲萘氢醌二磷酸酯钠。
甲萘氢醌二磷酸酯钠得率为90.2％，纯度为99.7％。
甲萘氢醌二磷酸酯钠按照药剂学上的常用方法，加入硬脂酸镁，压制成片，甲萘氢醌二磷酸酯钠含量为5mg/片。
实施例3 以反应物A为原料，按照费塞尔·LF，威廉森·KL.有机实验[M].北京高等教育出版社，1986.370.提示的方法，进行还原反应，得到物质B；冷却二氯甲烷和三氯氧磷的混合液至-5℃，其中二氯甲烷与三氯氧磷的体积比为10∶5，在搅拌下，同时滴加B、三乙胺和二氯甲烷的混合液，其用量分别为0.2g/mL的B、0.3g/mL的三乙胺、2倍体积的二氯甲烷；温度控制在-5℃～5℃，滴加完毕后，继续搅拌20分钟，加入8倍体积的pH为3的盐酸水溶液洗涤，分液，水层用二氯甲烷萃取，弃有机层，水层用异丁醇萃取，合并异丁醇层，干燥后浓缩，加石油醚，析出固体后过滤得固体C；产物D溶于3倍重量的水中，搅拌下滴加饱和碳酸钠溶液，至pH为7，继续加入3倍体积的丙酮，待不再析出固体时，过滤，滤饼用甲醇溶解，过滤后用无水硫酸钠干燥，蒸除甲醇后，固体用丙酮-水(丙酮与水的体积比为3∶7)重结晶，得产物甲萘氢醌二磷酸酯钠。
甲萘氢醌二磷酸酯钠得率为92.5％，纯度为98.4％。
甲萘氢醌二磷酸酯钠按照药剂学上的常用方法，加入硬脂酸镁，压制成片，甲萘氢醌二磷酸酯钠含量为5mg/片。
实施例4 以反应物A为原料，按照费塞尔·LF，威廉森·KL.有机实验[M].北京高等教育出版社，1986.370.提示的方法，进行还原反应，得到物质B；冷却二氯甲烷和三氯氧磷的混合液至-5℃，其中二氯甲烷与三氯氧磷的体积比为10∶3，在搅拌下，同时滴加B、三乙胺和二氯甲烷的混合液，其用量分别为0.2g/mL的B、0.3g/mL的三乙胺、2倍体积的二氯甲烷；温度控制在-5℃～5℃，滴加完毕后，继续搅拌10-30分钟，加入7倍体积的pH为3的盐酸水溶液洗涤，分液，水层用二氯甲烷萃取，弃有机层，水层用异丁醇萃取，合并异丁醇层，干燥后浓缩，加石油醚，析出固体后过滤得固体C；产物D溶于3倍重量的水中，搅拌下滴加饱和碳酸钠溶液，至pH为7，继续加入3倍体积的丙酮，待不再析出固体时，过滤，滤饼用甲醇溶解，过滤后用无水硫酸钠干燥，蒸除甲醇后，固体用丙酮-水(丙酮与水的体积比为3∶7)重结晶，得产物甲萘氢醌二磷酸酯钠。
甲萘氢醌二磷酸酯钠得率为89.0％，纯度为99.0％。
甲萘氢醌二磷酸酯钠按照药剂学上的常用方法，加入硬脂酸镁，压制成片，甲萘氢醌二磷酸酯钠含量为5mg/片。
实验例1本实验例为实施例1产品的生殖毒性试验资料，通过对妊娠Sprauge-Dawley大鼠在妊6至15天口服甲萘氢醌二磷酸酯钠，观察受试药对妊鼠产生的毒性反应及程度，以及对胚胎可能所致的毒性作用。
试验结果表明，在本试验条件下，剂量24、12及6mg/kg/天时，对母体的毒性反应主要见于24mg/kg/天，影响其体重及活动；对胚胎无明显毒性，胎鼠的外观，内脏未见畸形。各项指标同对照组相比，差异均无显著性意义。骨骼检查见对照组及受试药各组均有骨化不全，组间无差异，因此不能说明为药物影响。
结果提示，甲萘氢醌二磷酸酯钠口服给药，各剂量组对大鼠均无致畸作用，在24mg/kg时对亲代母鼠有一定毒性，对胎儿发育有轻微影响。对母体及胎儿的安全剂量为12mg/kg/天。
一、试验材料及方法1.供试药物实施例1产品。
2.受试动物及饲养条件试验所用Sprauge-Dawley大鼠，初始10周龄，经检疫及2周驯化饲养后，选用一般状态良好的动物供试。
动物饲养于本动物中心饲养室，动物饲养环境为室温23±2℃，湿度50±10％，照明12小时/日(7∶00-19∶00)，排气扇换气。
妊娠动物每笼饲养约4只。妊娠末期每笼饲养1只动物。
雌雄动物饲养至12周龄时，动物初始体重雄性290～310g，雌性230～260g。一对一雌雄配对同笼饲养，每日早晨检查阴道栓或阴道分泌物中有无精子，以确认交配是否成功，确认成功当天为妊娠第0天。以妊娠第0天的体重为基准，将动物分组，每组20只，各组体重均等。妊娠第0天的体重范围为244～273g。
定量予固体饲料，常规全价颗粒饲料由动物房提供。自由摄取自来水。笼底垫料为刨花木屑与谷壳，更换垫料后，笼具经洗净、消毒后再用，平均每隔2～3日更换一次。除给药及更换垫料时外，不触动孕鼠。
3.试剂乙醇、甲醛、二甲苯均为市售分析纯；苦味酸(广东介山化工厂)，配制Bouin氏固定液苦味酸39克加至3000ml水中，搅拌过夜，加入甲醛及冰醋酸，混匀，然后加入尿素。茜素红(上海化学试剂采购供应站经销)，配制0.1％茜素红水溶液(每100ml含12％KOH1ml)。甘油，配制各级含甘油的KOH液。
4.仪器电子天平(TCS-2000A型，武汉自动化仪器研究所)，光学显微镜(GalenTMIII，江南光学仪器厂)，分析天平(TG-328A，国产)，架盘天平(JPT-1型，国产)，扭力天平(国产)，解剖显微镜(XTL-II型，北京电子学学设备厂)，千分尺(国产)等。
5.剂量设定剂量设置理由临床拟用剂量为5-30mg/天，按体重计约0.083mg/k-0.5mg/kg，取中间值为0.25mg/kg，以0.25mg/kg的临床剂量的3-5倍设生殖毒性低剂量，约为1.2mg/kg，若按100倍设高剂量，约为25mg/kg。为计量方便，高、中、低剂量分别设为24、12和6mg/kg/天。
6.供试药液的配制、给药方法及给药期间临用前，将供试药物用注射用水溶解，配制成浓度为1.2％、0.6％、0.3％的药液。对照组给予注射用水。
给药途径为口服。于每日上午9时给药，给药30min以后喂食。给药期间为妊娠第6至第15日共10天，每天1次。大鼠按每1009体重注射给药0.2ml(2ml/kg)，高、中、低三剂量配制不同浓度等容量给药。按时间表称体重，根据体重变化调控给药量。
7.观察及检查方法1)母鼠一般状态观察，给药期间每天给药前后各1次，其它期间每天1次。观察动物活动情况，行为情况，摄食量、毛色及清洁状况；泄物情况，死亡动物数及死亡率等。体重测定，妊娠第0、3、6、8、10、12、14、16、18、20、22天测体重，据体重调整给药量。妊娠第0、3、6、10、14、18、22天测饲料量变化。
体重骤降，阴道流血。流产动物数及百分率。黄体数解剖时将双侧卵巢置于生理盐水中，快速计数。计算黄体均数。
各组20只母鼠于妊娠第21天乙醚麻醉放血处死，剖腹取出胎儿。
2)胎儿妊娠第22天行剖腹产后，检查妊娠黄体数、着床数、死亡胎儿数及存活胎儿数，计算着床率((着床数/妊娠黄体数)×100)、胎儿死亡率((死亡胎儿数/着床数)×100)。死胎数及活胎数解剖时经刺激胎儿不动者为死胎；具自主呼吸或轻触有反应者为活胎。早期死胎及晚期死胎均计为死胎数。
存活胎儿检查外表有无异常(包括口腔内)，判定性别，测定体重及胎盘重量。1窝中约1/2左右胎儿进行内脏检查，其余约1/2制作骨骼透明标本，进行骨骼检查。
作骨骼检查者固定于95％乙醇。样本处理方法为(1)脱水95％乙醇4天，然后100％乙醇4天；(2)脱水胎儿去脏器；(3)脱非钙化组织2％KOH浸泡24～35小时；(4)茜素红染色；(5)各级含甘油的KOH液脱水，退染及干燥；(6)肉眼观察骨骼发育情况如骨化程度、变异及畸形。颅骨骨化程度分为0-VI级；胸骨主要检查骨节缺失及骨化不全，并观察是否有多肋、少肋、肋骨分叉、短小、融合等畸形；四肢骨以骨的粗短、多指少指为主；尾椎骨的骨化数多少、缺失、畸形等。
8.统计学处理体重，摄食量、妊娠黄体数、着床数、存活胎儿数、胎儿体重以t检验，着床率、活胎率、受孕率、胎儿死亡率、性比，用x2检验。形态异常发生率及骨化数，用非参数统计。
二、结果1.对母鼠的影响一般状态未见异常。受试期内未发现各受试组动物死亡。对照各组动物未见异常反应，皮毛、二便及活动均正常，无母体有流产现象。24mg/kg/天组给药局部有硬结。12mg/kg/天及以下剂量组无明显反应。妊娠期间母体体重变化结果见表1，24mg/kg/天组后期增长缓慢，少量动物有体重不增现象，妊娠20天体重差异具显著性意义。
2.对胎儿的影响妊娠黄体数、着床数、死亡胚及死亡胎儿、存活胎儿数及胎儿体重未见显著差异。表2。
胎儿外表无异常。表3。骨骼检查发现，骨化进展度指标，前后中趾骨、前后肢基节骨、及骶尾椎骨，其骨化数皆未见显著意义。
内脏检查结果均未发现有异常及各种畸形的发生。表4。
表1 甲萘氢醌二磷酸酯钠对孕鼠体重的影响

各组n＝20。Student T检验，*p≤0.05，**p≤0.01，与对照组比较。
表2 甲萘氢醌二磷酸酯钠对胚胎发育的影响

X2检验，*p≤0.05，**p≤0.01，与对照组比较。
表3 甲萘氢醌二磷酸酯钠对胎儿外观的影响

X2检验，与对照组比较。
表4 甲萘氢醌二磷酸酯钠对胎儿内脏的影响

X2检验，与对照组比较。
在本试条件下，甲萘氢醌二磷酸酯钠皮下注射给药剂量24、12及6mg/kg/天时，对母体的毒性反应主要见于24mg/kg/天，影响其体重及活动；对胚胎无明显毒性。胎鼠的外观，内脏等各项指标与对照组相比，差异均无显著性意义。结果提示，在本试验条件下，甲萘氢醌二磷酸酯钠皮下注射给药，各剂量组对大鼠均无致畸作用，在24mg/kg时对亲代母鼠有一定毒性，对胎儿发育有轻微影响。对母体及胎儿的安全剂量为12mg/kg/天。
实验例2本实验例为本发明产品长期毒性试验。
一、试验方法分别对小鼠、大鼠和兔每天口服不同剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠，观察它们在体重、色素沉着、血液学、微观病理学等方面的变化。
二、试验结果(一)体重1.大鼠对大鼠每天注射不同剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠(实施例2)和2-甲基-1，4-萘氢醌亚硫酸盐(MNSS)，所得的数据列于表5中。
表5 长期使用药物对大鼠体重的影响

*由于药品短缺，第6和第7天未进行注射。
在整个注射过程中，VI、VII、VIII和IX组表现得比平时呆滞，这几组的大鼠都有体重上的减轻，特别是与体重升高的对照组第IV组比较时更加明显。相反，第II、III组大鼠在注射两种药物仅5mg/kg后，体重增加到比控制组第I组更高的程度，虽然两组的体重都有升高，但明显没有对照组升高得显著。
2.小鼠小鼠在每天剂量达到300mg/kg之前没有发生体重的减轻。
3.兔兔在每天剂量为65mg/kg时体重减轻不大，而在剂量为200mg/kg时发生减轻。在对兔注射以进行血液学研究时，发现体重无明显减轻，除非剂量增加到足以发生贫血时，既使如此，所得的结果也是无规则的。有一只兔在每天注射100mg/kg的甲萘氢醌二磷酸酯钠，持续20个剂量(5星期剂量)后，体重上没有减轻，只是在生长速度上稍微放慢，并形成了贫血症；另一只兔在做了9个星期的对照后，注射了四个150mg/kg的剂量，发生了体重上的轻微减轻，这种情况多发生在注射停止之后，并且贫血也得到完全恢复时。
(二)色素沉着1.大鼠实验中大鼠的毛发形成了奇特的黄褐色色素沉着，这种现象在实验的末期变得明显，并在实验结束后的一到三周颜色加深，在此后研究的10周内未发现变化。色素沉着分布得比较分散，主要发生在面部，背部和胸部的毛发，但分界清楚，且有对称迹象。
2.兔和小鼠兔和小鼠也会发生色素沉着，所有的大鼠和几乎所有的兔子在使用足够的剂量后都会发生，但小鼠不易显色。三种动物的显色是相同的，通常呈不连续的补丁状并近乎对称。所有动物的颜色只持续数月，最终消失。
3.讨论兔子发生色素变化的事实表示这种现象源于甲萘醌自身的性质，其磷酸酯钠盐产生更大的影响，可能是由于它们溶解度增大的缘故，色素形成的机理仅能靠推测。每天对毛发使用甲萘氢醌二磷酸酯钠的浓溶液却无影响，这说明着色可能是不成熟的毛发细胞代谢过程中受到的直接或间接地影响而形成的色素，维生素可能是其影响因素；分布上的对称和不连续表明了与毛色混杂动物着色机制的关系，或是表示了与神经和血管供应的关系。所有的动物在五个月后都褪色，进行该研究的色素沉着兔子褪色速度比血液学研究中的兔子快一些。
(三)微观病理学1.使用甲萘氢醌二磷酸酯钠的剂量为5mg/kg时，大鼠的肝、肾和肾上腺切片没有表现出任何变化；2.使用20mg/kg和100mg/kg的剂量进行1次，5次和10次三个系列试验，大鼠在单剂量试验后一天和另两个系列试验后的三天处死，未发现这些大鼠在肝和肾上的显著变化；3.两只兔子在注射4天150mg/kg剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠后未发现整体和微观上的明显变化，其中一只兔子被处死并解剖，发现红细胞数目达到1,570,000；另一只兔子在抽搐死亡后立即解剖，红细胞数为1,160,000；另两只兔子在使用相同剂量后死亡，稍后的解剖中只发现了很小的一些变化。
重复低剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠对红细胞数目的影响见图1，箭头指示每天的剂量，D代表死亡。
(四)血液学研究1.红细胞每天甲萘氢醌二磷酸酯钠的给药剂量范围从10到200mg/kg，当剂量高于100mg/kg时产生的效果比较明显，兔子在使用较高的剂量后会产生严重的再生障碍性贫血，其中一些死亡，另外一些在停药后康复，第350号兔子在四次注射150mg/kg，停药后的第三天血液红细胞数降低到1,310,000，但仍能康复，且康复后能恢复到正常的红细胞水平，每周对红细胞的计数结果见图20-a和20-b。第361号兔子在注射100mg/kg十次剂量后血红细胞数降低到2,900,000，但在注射停止后迅速恢复；第357号兔子在注射的前三个星期表现出红细胞数的增加；第360号兔子在注射150mg/kg四次后接着再注射130mg/kg一个星期，由图20-b可见存在一个短暂的恢复过程，之后继续恢复。
重复高剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠对红细胞数的影响见图2，箭头指示每天的剂量，半高箭头代表在两只兔中使用了一半剂量。除第360号兔外，所有试验中总共剂量为600mg/kg，第360号兔另外使用了130mg/kg的剂量，由对应第二周的垂直线标出。
2.白细胞和血色素它们在试验过程中没有明显的变化，除了在高剂量引起严重贫血症情况外，这些动物通常有多形核白细胞数增多现象，但是对嗜曙红细胞、嗜碱细胞或单核细胞没有影响，贫血症康复后白细胞图象恢复正常。
实验例3本实验例为本发明产品一般药理学研究试验。
一、致死剂量小鼠口服给药的LD50为500mg/kg，而腹腔给药为75mg/kg；对刚出生的小鸡腹腔给药的致死剂量小于100mg/kg，对该药物70％致死剂量100mg和90％致死剂量150mg在对数概率纸上作图，计算出来的LD50值为76mg/kg。
小鼠静脉给药的LD50为450mg/kg，腹腔给药同样也为450mg/kg。
对20只鸡皮下注射给药的LD50估计为200mg/kg。兔子在静注200mg/kg后致死，而在给药100mg/kg后无严重症状并能恢复正常。而致死剂量远远大于止血剂量，对于鸡雏的止血CD50与LD50比值约为1∶30,000。
二、中毒症状1.兔子静注50mg/kg能引起呼吸急促，瞳孔明显缩小，灵敏度增加和耳温升高，瞳孔在15分钟内恢复正常，呼吸急促现象仍维持一段时间。
2.静注100mg/kg后，其灵敏性有更显著提高，在笼中四处走动并十分激动，有烦躁和惊惧现象，3到4分钟后安静下来，伏在角落上，瞳孔只有针尖大小，这种现象维持了1小时，在2小时后恢复正常。
3.兔子静注了200mg/kg药物后，表现得比之前的兔子更加暴躁，注射七分钟后发出尖叫声，持续了15分钟，几分钟后反复，30分钟后产生抽搐，并在注射35分钟后死亡。使用小的剂量，呼吸没有加速，但在开始几分钟后，兔在俯卧过程中呼吸很慢也很吃力，并发生了明显的流涎现象。尸体解剖后，无异常发现，只发现不太明显的中等程度的血淤和呼吸停止后颈动脉血液颜色的加深。
4.小鸡的明显特征为呼吸急促，鸡嘴张开，瞳孔缩小，开始时中度兴奋，最后俯卧死亡，但未发生流涎现象。
5.小鼠的症状基本上与鸡和兔相同，开始时兴奋性和受刺激性通常更强烈，偶尔发生流涎现象。
三、刺激性对试验中的猪皮下注射5％的甲萘氢醌二磷酸酯钠溶液，剂量为50到150mg/kg时未曾发现暴躁现象；对鸡和小鼠使用致死剂量范围内的任一剂量，也未发现刺激性现象。
四、循环和呼吸猫用烯丙异丙巴比妥麻醉的猫在用药5或10mg/kg后，收缩压和舒张压都有升高现象，总计达50-60mm汞柱，再用药以后血压变化逐渐变缓，这种现象维持10-15分钟后，升高的血压恢复正常，脉搏大体上能从微弱恢复至中强水平。该药品对用醚麻醉的猫血压的影响比对用烯丙异丙巴比妥麻醉的猫影响较弱，脉搏受影响较弱。该药对呼吸系统的影响比较明显，10mg/kg通常能对呼吸速率和深度产生强烈影响，这种现象在2到5分钟后恢复接近正常，最后彻底康复。在起始阶段小剂量给药2或3次后，对猫每隔5分钟50mg/kg给药一次，直至死亡，使用的总剂量为690mg/kg。
狗将五只狗用戊巴比妥钠麻醉，颈动脉血压用波动曲线记录器跟踪记录，呼吸作用的同步记录通过呼吸记录仪和鼓形柱进行，药物都以每3秒1cc的速度静脉注射。甲萘氢醌二磷酸酯钠在剂量为20mg/kg时，血压无明显改变，当使用剂量为30mg/kg时，在开始注射后1到2分钟血压升高，大约4分钟达到峰值，并在5到10分钟内逐渐降至正常值，且不再发生第二次血压的升高或降低，动脉压的最大升值为40mmHg，在这期间呼吸速率有所下降。40mg/kg剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠能引起狗的血压升高70mmHg，还引起呼吸速率的急剧升高并伴有猛烈的运动，最后从麻醉中苏醒，15秒钟后进行了更深的麻醉，然后恢复正常，在此期间未发生症状上的减轻。
兔另一种对呼吸系统影响的试验是通过对兔使用10mg/kg的吗啡硫酸盐来进行的，我们使用了与肺活量计相连的头套以检测每分钟呼吸气体的体积。10和20mg/kg大体上不产生影响，50mg/kg只是引起每分钟呼吸气量和呼吸频率的微弱增加，随后，每分钟呼吸气量和呼吸频率都有降低。
五、体内分布和代谢对缺乏维生素K的雌性大鼠腹腔注射生理剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠后，发现该化合物及其代谢物存在于研究的所有组织中，并且没有证据表明任何器官能长时间地聚集维生素。除肾脏中可能是由于残留尿液的原因有较高含量外，其余各种软组织中每克的药物含量没有明显的差别。在大多数组织中药物的总量随着时间而降低，同时在粪便和尿液中的排泄量增加。排泄的主要途径是尿液，注射17小时后，43％的活性物质在尿液中被发现，相比之下，粪便中只发现4％。维生素K缺乏的大鼠和正常的大鼠在注射放射性的维生素6小时后处死，结果显示本品的分布情况十分相似。
实验例4本实验例为本发明产品的急性毒性试验。
一、实验方法通过对白色大鼠单次背部注射来测定甲萘氢醌二磷酸酯钠的急性毒性。选取重量范围从155到310克的大鼠，其中雌性略多于雄性。结果如表6所示。
表6 大鼠皮下注射甲萘氢醌二磷酸酯钠的毒性

对这些数据在对数概率纸上作图，计算出甲萘氢醌二磷酸酯钠的LD50值为610mg/kg。
二、试验结果大鼠在注射致死剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠后瞬间通常变得十分兴奋，欲跳跃出笼子，这种兴奋状态可能要持续到抽搐，然后死亡；垂死的大鼠在经过一段时间的抽搐后，尸体变僵硬。大鼠在注射试验剂量的甲萘氢醌二磷酸酯钠后主要表现为自发性活动的减少和呼吸有一些急促，甲萘氢醌二磷酸酯钠在剂量为550和650mg/kg时，大鼠表现出的活动的减少比较明显。注射后的15到30分钟出现症状并持续数小时，然后逐渐恢复或恶化至死亡，整个过程未发现惊厥和过度兴奋现象，偶尔前爪肌肉有麻痹症状，特别是当注射药物分散到肩带区时。
大鼠在使用甲萘氢醌二磷酸酯钠12到70小时内死亡(平均时间30小时)，尸检结果表明鼻分泌物有血迹，血尿，肺有微弱出血瘀点以及脾脏有中度的增大和充血。该药物的作用在显微外观上表现为肾脏的内层细胞和肾小管有明显的恶化，在小管的内腔中积有大量的蛋白质类物质。其中一只大鼠，症状已经发展到肾小管壁的分散性坏死，肾小球和血管外观正常，肝脏和肾上腺也无变化。在注射部位通常有被注射组织血管的中度血瘀，但无坏死现象。
三、讨论偶尔出现的抽搐现象可能是由于血糖过低，因此不适合本实验。对5只大鼠的尾静脉抽取血样(0.2ml)进行血糖测试，然后注射0.9mM./kg.的本品，二十分钟后，4只大鼠发生不自觉的抽搐或伴随尖叫，然后对它们通过心脏穿刺取血。注射前血糖水平的范围是82-102mg./100ml.；注射20分钟后范围是131-199mg./100ml.，未发生抽搐的第五只大鼠在注射后36分钟，血糖从92升至284mg./100ml.。对正常大鼠血样进行加入已知剂量的本品和未磷酸化的2-甲基-1，4-萘氢醌前后的比较试验，发现这两种物质尤其是后者能增加所血糖增加值的大小，但这种影响不足以解释注射后观察到的血糖提高。总之，大鼠的抽搐不是由于血糖降低造成的。
致死剂量的本品可能引起抽搐，说明大脑是其毒性作用的易损器官。在进行半胱氨酸对本品急性毒性保护作用的实验中，可能存在着使用半胱氨酸后大脑氧化-还原作用的增加和使用本品后的降低，而在其它器官中这两种药物都能导致氧化-还原作用的降低。
实验例5本实验例为本发明主要药效学试验。
一.体内药效试验方法试验以低凝血酶的大鼠作为对象。将90只110到230克体重的纯种大鼠进食含有70％粉碎的Purina Dog Checker和30％矿油琼脂食物，运用Quick凝血酶原计时法可以发现，在8到90天内25％存活的大鼠有明显的低凝血酶原现象，其中，32只大鼠由于患感染性中耳炎而死亡，这种炎症在进食30天后广泛传染，另外加入35只大鼠进行短期喂养；在这些大鼠中约50％在38天内凝血时间延长至起始时的两倍或更多。
胆管障碍的实验模型是将40只大鼠用含维生素K较低的饲料喂养32至44天，对其中32只鼠的胆管结扎，并在醚麻醉下切开。在重复进行心脏穿刺和胆管堵塞的23只存活的鼠中，有9％到39％在普通胆管堵塞手术后3到10天表现出明显的低凝血酶症状，在喂养期间没有发现凝血时间上的明显区别。
当凝血酶原时间明显上升(至少是开始时的两倍)时，持续两天或更长时间对大鼠皮下注射2和4微克剂量的六水合2-甲基-1，4-萘氢醌二磷酸酯钠(甲萘氢醌二磷酸酯钠)和2-甲基-1，4-萘氢醌亚硫酸氢钠(MNSS)两种药物，每天检测凝血时间(PT)。控制组注射生理盐水，两种物质都溶于生理盐水中，注射时的体积为0.5或1.0cc。
凝血酶的确定是将大鼠在醚麻醉下，用心脏穿刺法抽取0.45cc的血样，加入到0.05cc的草酸钠溶液(1.34％)中，再加入0.5cc的生理盐水，离心样品。血浆的凝血时间是在38℃下，在0.1cc的草酸化的血浆中加入0.1cc的促凝血酶激酶，再加入0.1cc的氯化钙溶液(0.27％)，用秒表记录下凝血时间，对每一样品至少检测两次。
二、体内药效试验结果研究结果显示，酶缺乏的大鼠在经过注射治疗后得到改善，每只大鼠2到4微克的剂量能引起凝血时间的明显缩短，实验检测了12只大鼠在不同的时间的PT值，结果见表7。在一个系列试验中，任一药物2微克的剂量能使凝血时间恢复正常，而1/4微克是临界剂量。使用药物治疗(约8微克)使凝血时间恢复正常后，治疗停止，凝血时间在5天内重新回复到酶缺乏时的水平。
表7 治疗后低凝血酶症的恢复

三、体外药效实验方法实验中对白色雄性来亨鸡运用Almquist进食法2星期后，许多鸡形成了特征性的出血现象，控制组在2小时内未能凝血，试验样品通过皮下注射或胃管导入。对小鸡进行18小时的治疗检测。
使用1ml结核菌素注射器和半英寸25号注射针头进行静脉穿刺取血，该方法能够减少组织液对样品的污染，注射器中吸入0.25ml的血样，开始的0.20ml慢慢挤入小型疫苗管中。试管立即用蜡封的软木塞塞好，并放进自动倾斜试管架，浸入到38.5℃水浴中，以最近的凝结时间计时，当样品不再流动时计为终点时间。
小鸡在不同的时间选取会表现出反应性上的差别，实验中引进了一套参比标准以获得准确的分析方法，采用甲萘醌作为标准物。试验使用改进的Thayer-Doisy单位作为药效的标准，这一单位定义为能缩短实验条件下半数未使用维生素K小鸡凝血时间在10分钟或以内的止血物质的用量。由于它是一个治疗单位，可用表观上的CD50代替。10分钟的凝血时间虽然不符常规，但比常规更加令人信服，因为它位于剂量-作用曲线的拐弯部分，而不是在剂量变化但凝血时间微小变化甚至不变化的水平部分。
确定CD50的方法是在对2组小鸡进行不同的剂量水平的皮下注射，并在对数概率纸上作剂量与凝血时间在10分钟或更低的试验对象所占百分率的曲线。CD50是50％概率坐标与两数据所连直线的交点。
四、体外药效试验结果表8列出了3套检测甲萘氢醌二磷酸酯钠的数据，甲萘氢醌二磷酸酯钠与甲萘醌(MeNQ)之间的药效比分别为0.52，0.44和0.47，其他的许多检测方法也得到同样的数值，其中不同的检测方法所得的甲萘醌平均CD50值为0.64γ，极值为0.61和0.75γ，这个剂量只是使平均凝血时间在10分钟。甲萘氢醌二磷酸酯钠的8组CD50平均为1.34γ，甲萘醌的平均值为0.48。
表8皮下注射甲萘氢醌二磷酸酯钠(MeNHQ Phos·6H2O)和2-甲基-1，4-萘氢醌(MeNQ)0.2cc水溶液的生物利用度

*以两个剂量水平下鸡数量大体相等进行划分#实际注射剂量为MeNQ每只鸡0.5和1.0γ，MeNHQ Phos·6H2O每只鸡1.0和2.0γ表9列出了两种物质口服和皮下注射的对照结果。很明显，较少的动物用于该实验中所以标准误差较大，通过在对数概率坐标纸上作最适曲线的方法获得CD50的近似值，这条曲线与其它检测方法的斜率一致。甲萘氢醌二磷酸酯钠的口服CD50为1.9γ，甲萘醌为1.5γ，因此，前者的相对强度为0.79。它们的皮下注射的相关值分别为2.2γ和0.9γ，药效比率为0.41。
表9 口服和皮下注射的药效比较(比较实验同时进行)

*这两组中有两例在30分钟内没有凝血，由于取平均值，两例被视为在30分钟凝血五、讨论实验中所用物质甲萘氢醌二磷酸酯钠是含有6当量结晶水的晶体，即含量为20.2％，分子量为530；甲萘醌分子量为172，则比值172∶530为0.325，药效的平均比值为0.48，所以，比较两种物质的分子可以看出磷酸酯比甲萘醌活性更强。这个较高的分子活性比为0.48∶0.325，即1.48，也就是说甲萘氢醌二磷酸酯钠基于分子水平上比甲萘醌活性强50％左右。
两种水溶性的物质甲萘氢醌二磷酸酯钠和2-甲基-1，4-萘氢醌亚硫酸氢钠(MNSS)在剂量范围从每天2到4微克下都能治疗大鼠凝血酶原的缺乏，在这些剂量水平下，两种物质的药效无明显区别(如表10所示)，由于它们分子量之比为530∶276，这就表示甲萘氢醌二磷酸酯钠在分子水平上药效是2-甲基-1，4-萘氢醌亚硫酸氢钠的两倍。
表10 甲萘氢醌二磷酸酯钠和2-甲基-1，4-萘氢醌亚硫酸氢钠(MNSS)治疗效果比较表

权利要求
1.一种甲萘氢醌二磷酸酯钠片，其特征在于，所述甲萘氢醌二磷酸酯钠片以2-甲基-1，4-萘二酚为原料，通过以下方法，得到2-甲基-1，4-萘氢醌双(二氢磷酸酯)四钠盐六水合物，然后按照药剂学上的常用方法，制备甲萘氢醌二磷酸酯钠片；所述方法可以为 以反应物A为原料，将其还原，得到物质B，冷却二氯甲烷和三氯氧磷的混合液至-5℃，其中二氯甲烷与三氯氧磷的体积比为10∶3-10∶5，在搅拌下，同时滴加B、三乙胺和二氯甲烷的混合液，其用量分别为0.1-0.2g/mL的B、0.3-0.5g/mL的三乙胺、2倍体积的二氯甲烷；温度控制在-5℃～5℃，滴加完毕后，继续搅拌10-30分钟，加入5-10倍体积的pH为3的盐酸水溶液洗涤，分液，水层用二氯甲烷萃取，弃有机层，水层用异丁醇萃取，合并异丁醇层，干燥后浓缩，加石油醚，析出固体后过滤得固体C；产物D溶于3倍重量的水中，搅拌下滴加饱和碳酸钠溶液，至pH为7，继续加入3倍体积的丙酮，待不再析出固体时，过滤，滤饼用甲醇溶解，过滤后用无水硫酸钠干燥，蒸除甲醇后，固体用丙酮-水体系重结晶，其中丙酮与水的体积比为3∶7，得产物D；产物D按照药剂学上的常用方法，加入辅料，经后处理，得到甲萘氢醌二磷酸酯钠片。
2.根据权利要求1所述的甲萘氢醌二磷酸酯钠片，其特征在于，所述的甲萘氢醌二磷酸酯钠得率可达到92.5％，纯度可达99.7％。
3.根据权利要求1或2所述的甲萘氢醌二磷酸酯钠片，其特征在于，所述甲萘氢醌二磷酸酯钠片以2-甲基-1，4-萘二酚为原料，通过以下方法，得到2-甲基-1，4-萘氢醌双(二氢磷酸酯)四钠盐六水合物，然后按照药剂学上的常用方法，制备甲萘氢醌二磷酸酯钠片；所述方法可以为 以反应物A为原料，将其还原，得到物质B，冷却二氯甲烷和三氯氧磷的混合液至-5℃，其中二氯甲烷与三氯氧磷的体积比为10∶3-10∶5，在搅拌下，同时滴加B、三乙胺和二氯甲烷的混合液，其用量分别为0.1-0.2g/mL的B、0.3-0.5g/mL的三乙胺、2倍体积的二氯甲烷；温度控制在-5℃～5℃，滴加完毕后，继续搅拌10-30分钟，加入5-10倍体积的pH为3的盐酸水溶液洗涤，分液，水层用二氯甲烷萃取，弃有机层，水层用异丁醇萃取，合并异丁醇层，干燥后浓缩，加石油醚，析出固体后过滤得固体C；产物D溶于3倍重量的水中，搅拌下滴加饱和碳酸钠溶液，至pH为7，继续加入3倍体积的丙酮，待不再析出固体时，过滤，滤饼用甲醇溶解，过滤后用无水硫酸钠干燥，蒸除甲醇后，固体用丙酮-水体系重结晶，其中丙酮与水的体积比为3∶7，得产物D；产物D按照药剂学上的常用方法，加入辅料，经后处理，得到甲萘氢醌二磷酸酯钠片。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应物A还原至B可按照费塞尔·LF，威廉森·KL.有机实验[M].北京高等教育出版社，1986.370.提示的方法进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的甲萘氢醌二磷酸酯钠得率可达到92.5％，纯度可达99.7％。
全文摘要
本发明涉及一种甲萘氢醌二磷酸酯钠片及其制备方法，该片剂以2－甲基－1，4－萘二酚为原料，通过还原、磷酸化等步骤，得到2－甲基－1，4－萘氢醌双(二氢磷酸酯)四钠盐六水合物，然后按照药剂学上的常用方法，制备甲萘氢醌二磷酸酯钠片，经检验，甲萘氢醌二磷酸酯钠得率可达到92.5％，纯度可达99.7％，完全适用后续的药物制备。
文档编号A61K31/661GK1743334SQ20051010579
公开日2006年3月8日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者周卓和 申请人:周卓和