专利名称：治疗头痛的药物和方法
交叉引用本申请是2004年2月26日提交的申请系列号10/789,180的部分继续申请，该申请的所有内容通过引用的方式纳入本说明书。
背景技术：
本发明涉及治疗疼痛的方法。具体地说，本发明涉及肉毒毒素在治疗和预防头痛，以及治疗一种急性疼痛缓解药物的病症中的应用。本发明还包括用曲坦(triptan)类药物与肉毒毒素治疗头痛的改进的方法，以及提高曲坦类药物治疗头痛如偏头痛的有效性的方法。
很多情况下(若不是大多情况下)的身体不适导致疼痛。当皮肤以及某些内部组织中组成疼痛受体的游离神经末稍受到机械、热、化学或者其他有害刺激时，通常就感受到疼痛。这些疼痛受体能沿着传入神经元进入中枢神经系统然后到脑部传递信号。
产生疼痛原因可包括炎症、损伤、疾病、肌肉痉挛和神经性疾病或综合征的发病阶段。经受疼痛的人若得不到有效治疗，会因此产生功能限制、活动性降低、睡眠糟糕、严重影响生活质量。
肌肉痉挛能导致刺激力敏感疼痛受体因而引起痛觉。所以疼痛能由肌肉痉挛引起或者归因于此。另外，痉挛能通过挤压血管，引起组织缺血；组织缺血转而又释放引发疼痛的物质，这些物质刺激疼痛受体导致痛觉，从而痉挛能够间接刺激疼痛受体。而且，肌肉痉挛能导致局部pH降低，pH的降低能够作为疼痛信号被感知或者产生疼痛信号。所以疼痛可能是肌肉痉挛或肌肉高张力的继发效应。
当组织由于手术或者物理、化学或热的不良事件或者生物因素的感染受损伤时会产生炎性疼痛。当组织受到损伤时，大量内源性引发疼痛的物质会从损伤组织释放出来，如缓激肽和组胺。这些引发疼痛的物质能够与感觉神经末稍的受体结合从而开始传入疼痛信号。
此外，引发疼痛的物质会从伤害性传入末梢释放，并且从感觉末梢释放的神经肽能增强炎症反应应答。因此，在炎症过程中伴随有肽能外周纤维的萌发以及肽含量的增加，同时许多纤维表现出P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)共存。P物质能诱使内皮细胞收缩，这样转而导致血浆外渗使得其他物质(缓激肽、ATP、组胺)到达损伤部位和传入神经末梢。感觉神经末梢释放的P物质也能使肥大细胞脱颗粒。由于像组胺和5-羟色胺等炎症介质和催化生成缓激肽的蛋白水解酶的释放，上述过程被认为是神经源性炎症中的一个重要因素。CGRP很明显并不导致血浆外渗，但它是很强的血管扩张因子，并且还与SP以及其他炎症介质协同作用增强血浆外渗。以上列举的炎症介质能使伤害感受器敏化或者产生疼痛。
在初级感觉传入神经元活化后，感觉信号传导接下来的步骤是投射神经元的活化，投射神经元通过脊髓丘脑束将信号传送到中枢神经系统的更高部分如丘脑核。这些神经元(除了与颅神经有关的神经)胞体位于脊髓背角。在这个部位还会发现在初级传入神经元和投射神经元之间的突触。背角由一系列层叠排列的层构成，第I层位于最背侧，接着是第II层，等等。不同类型的初级传入神经在不同的层形成突触。对于皮肤传入神经而言，C纤维在第I和II层形成突触，δ纤维在第I、II和V层，β纤维在第III、IV和V层。更深的层(V-VII，X)被认为涉及从如肌肉和内脏的深层组织到达的感觉通路。
初级传入神经元和投射神经元间突触的神经递质主要有P物质、谷氨酸、CGRP和神经肽Y。通过下行通路以及脊髓内的局部中间神经元可以改变这些突触的传递效率。这些调节神经元能释放大量或者具有抑制作用(如阿片样肽、甘氨酸)或者具有激动作用(如一氧化氮、胆囊收缩素)的介质，这为感觉的增强或者减弱提供了一种机制。
尽管在损伤组织得到修复或是除去引发疼痛的刺激时，炎性疼痛通常是可逆转并且消退的，然而现有治疗炎性疼痛的方法存在许多缺陷和不足。因此用典型的口服、肠胃外或局部给止痛药物来治疗疼痛症状或是例如由抗生素治疗引起炎性疼痛的因素，能够导致药物广泛地全身分布和不希望有的副作用。此外，炎性疼痛的现有疗法面临药效维持时间短的问题，这样需要多次重复给药，由此可能伴有耐药性、抗体产生和或药物依赖性和成瘾性，这些情况的发生都是无法令人满意的。而且频繁给药增加了患者的用药花费，并且需要患者记住坚持服药安排。
治疗炎症和肌肉疼痛的例子包括非甾体抗炎药(NSAID)和阿片类物质，非甾体抗炎药如阿司匹林和布洛芬，阿片类物质如吗啡。
NSAID通过抑制损伤组织释放的前列腺素的产生来缓解疼痛。像在关节炎疾病中，显示前列腺素是疼痛和炎症的外周介质，降低它们的浓度为患者提供了一种缓解途径。已有人提出前列腺素参与调节脊髓和脑部疼痛，这或许解释了NSAID在某些不涉及炎症和外周组织损伤的疼痛状况下的镇痛作用。然而，前列腺素只是多种疼痛介质中的一种。所以，NSAID的活性是有限度的，在限度之上再增加剂量也不会进一步减轻疼痛了。而且它们的副作用限制了它们的应用。例如NSAID能引起胃肠道刺激，长期使用可能会导致胃肠广泛溃疡的发生。这尤其易发生在经常使用NSAID治疗关节炎疾病的年老患者身上。
阿片样物质的治疗作用发生在脊髓。阿片样物质抑制初级感觉传入神经元(主要是C纤维)和投射神经元间神经传递效率。它们通过引起这些突触的两部分长时间超极化而达到以上目的。使用阿片样物质可有效减缓多种急性疼痛和慢性恶性疼痛。然而许多慢性恶性疼痛对阿片样物质的镇痛作用部分或完全耐受，在压迫神经的情况下尤其如此，如肿瘤的形成。很遗憾，阿片样物质还有一些不想要的副作用，包括(1)抑制呼吸系统，(2)便秘，(3)包括镇静和欣快的精神作用。产生这些副作用的剂量与产生镇痛作用的剂量接近，所以限制了对患者的给药剂量。另外，像吗啡和海洛因这样的阿片样物质是著名的导致精神依赖性的滥用药物，这也会引起耐受性增加。由于耐受性增加，产生相同镇痛作用的药物剂量随时间增加。由于先前所述的副作用，这样可能使缓解疼痛的需要剂量威胁到生命。
尽管炎症和肌肉痉挛引起的疼痛是从初级感觉神经元游离末梢的机械或化学刺激开始的，但神经性疼痛不需要外周游离的神经末梢的初始刺激。神经性疼痛是一种由于对神经系统、外周神经、背根神经节、背根或者中枢神经系统的损伤导致的持续或慢性疼痛综合征。
神经性疼痛综合征包括异常性疼痛，多种神经痛如疱疹后神经痛、三叉神经痛，幻痛以及复杂局部疼痛综合征如交感神经反射性营养不良和灼性神经痛。灼性神经痛通常是以自然烧伤疼痛、痛觉过敏和异常性疼痛联合为特征的。
很不幸，由于现在神经性疼痛的治疗方法仅仅是试图帮助患者通过心理或职业疗法来应付，而不是减轻或者消除遭受的疼痛，因此目前还没有充分地、可预测地、特异地治疗已有的神经性疼痛的方法(Woolf C.et al.，Neuropathic PainAetiology，Symptoms，Mechanisms，andManagement，Lancet 1999；3531959-64)。
例如，治疗神经性疼痛的现行方法包括靶向阻断触发点、外周神经、神经丛(plexi)、背根和交感神经系统的局部麻醉给药。然而这些治疗只是具有抗疼痛的短期效果。此外，更长时间的持续镇痛方法，如通过注射酚阻断或者冷冻疗法，具有增加不可逆功能性损伤的很大的危险性。而且长期进行像可乐定、甾体、阿片类物质或咪达唑仑的硬膜外给药或鞘内给药(总称为“脊柱内”给药)具有明显副作用和可疑的作用。
头痛头痛是指头部疼痛，如头皮、脸部、前额或颈部。头痛可以是原发性头痛或者继发性头痛。原发性头痛是指不是由其它疾病引起的疼痛。相反，继发性头痛是由疾病或身体不适引起的，如生病、感染、受伤、中风或其它异常。所以在继发性头痛的背后潜伏一些产生头痛的病症，头痛只是潜在病症的一个症状。紧张型头痛是原发性头痛最普遍的类型，它约占了所有头痛的90％。紧张型头痛常发生在前额，头和颈的后部，或者这两个部位都有。它被形容为是一种像是头被钳住的紧压感。肩部和颈部的疼痛常见。紧张型头痛伴有恶心不常见。
偏头痛是反复发作的头痛，它可以是单侧或者双侧的。偏头痛的发作可以有也可以没有前驱症状。偏头痛的先兆可能包括一些神经性症状，如眩晕、耳鸣、暗点、畏光或是视觉闪烁(如明亮的之字形线)。没有先兆的偏头痛是最普遍的，占到所有偏头痛的80％以上。
大约10-20％的人患有偏头痛。在美国6％的男性和15-17％的女性患有偏头痛。偏头痛在女性中最为普遍，女性对男性的比例为3∶1。
大约所有头痛的2％属于继发性头痛。例如颈源性头痛就是因为颈部问题导致的头痛，如颈部肌肉异常，它是由于持续的不良姿势、关节炎、脊柱高位受伤，颈部脊柱疾患引起的。窦性头痛是另一种继发性头痛，它可由鼻旁窦内的炎症和/或感染导致。
药物过度使用性头痛症每天或者几乎每天的头痛会影响到某些人群的5％，据信，该现象的一半是由于长期过度使用头痛药物。在此包括所有单纯的镇痛药，以及可能的非甾体抗炎药、麦角胺和曲坦类药物。曲坦类药物是用于治疗头痛的色胺药物家族。曲坦类通过与颅内血管(引起它们的收缩)中的5-羟色胺5-HT1B和5-HT1D受体结合，然后抑制促炎神经肽的释放起作用。因此曲坦类药物是5HT(1B/1D)受体激动剂，通常用于偏头痛的处方治疗。舒马曲坦(Sumatriptan(Imitrex，Imigran))、佐米曲坦(zolmitriptan(Zomig))、那拉曲坦(naratriptan(Amerge，Naramig))、利扎曲坦(rizatriptan(Maxalt))、阿莫曲坦(almotriptan(Axert))、夫罗曲坦(frovatriptan(Frova))和依来曲坦(eletriptan(Relpax))都是曲坦类药物。
药物过度使用性头痛对女性的影响高于男性(5∶1的比例)和某些儿童。有人提出药物过度使用性头痛的定义为，每天常规服用三片或三片以上的止痛片或者一周两天以上麻醉药或麦角胺以控制或者缓解头痛。药物过度使用性头痛中一个普遍并且可能关键的因素是在头痛前而不是头痛时超前使用药物。当常规服用镇痛药用于其它适应症，像慢性背痛或风湿性疾病时，通常不会发生药物过度使用性头痛，也就是说，头痛必须存在才可能进一步发展。
药物过度使用性头痛的推定性诊断是以症状和详细的用药史包括非处方药的用药史为基础的。许多药物过度使用性头痛症的患者使用大量药物在一项研究中平均一周服用35个剂量和6种不同的药。这样的患者迟早要寻求具有更强作用的药物处方，这将引起医生的普遍关注。然而，当停止服药后症状得到改善时，才典型地被证实患有药物过度使用性头痛。这种头痛令人难以忍受，发生于早上醒来的时候，并且通常在这时情况最糟。这种头痛在身体劳累过后会加剧。很少表示伴随有恶心和呕吐。典型的头痛史是从用镇痛药或是其它急性药物治疗的早期阵发性头痛开始直到多年累积(偏头痛常多于紧张型头痛)。一段时间后随着服用药物，头痛发作越来越频繁，直到每天吃药每天头痛。在最后的阶段，整天持续头痛，并随每隔几小时地反复服药而波动，不是每个患者都会达到这种阶段。该进程在几星期或者更长的时间内发生，这在很大程度上取决于服用的药物但不仅仅取决于此。
国际头痛学会(the International Headache Society)将药物过度使用性头痛(MOH)定义为服用镇痛药或者麦角后(每个月15次以上，至少3个月)的慢性头痛(头痛频率每个月＞15天)，它在治疗停止后消失。已将它描述成一个自持的、有节律的、头痛药物循环，该循环是以每天或几乎每天的头痛，和不可抗拒地并且可预料地使用具有即刻缓解病痛的药物为特征的。医学文献中广泛出版了支持MOH的存在根据。
MOH的致病机理还没有得到充分阐释。一些证据显示出5-羟色胺受体的上调和相继的5-羟色胺水平降低起到作用，该水平在停止长期使用镇痛药后正常化。MOH的发展进程中还涉及到以下情形内啡肽抑制、中枢阿片受体损伤，已经被部分抑制或异常的抗疼痛系统损伤性抑制或下调，突触后神经元受体的密度和功能的改变，位于促进疼痛反射性应答的髓质腹侧的疼痛性″on-cells″的活化。一位具有有先兆或没有先兆的阵发性偏头痛史的患者，抱怨头痛频率增加和发作间期的紧张型头痛发展，最终转变成每天或几乎每天长期持续的头痛，这是一个普遍的现象。在此期间患者可能会在偏头痛和紧张型头痛间转换。行为和精神疾病可能同时存在并且成为复杂的因素。患者会普遍低估他们镇痛药的使用，同时他们还使用多种类型的药物。起初，疼痛解除只是负性强化，在某些情况下由于使用含巴比妥和咖啡因的镇痛药改变了心情而成为正性强化，这样会导致过多使用这些药物。耐受性是以以下内容为特征的增加用药量而不考虑潜在不良结果，突然中止用药后出现戒断症状，常接着发生的结果是头痛频率和严重程度的增加以及镇痛疗效的降低。当患者使用过量的治疗性药物时，同时使用预防性的药物是相对无效的，而应该选择完全停用头痛药物作为治疗手段。脱毒常在多达8到12周的时间内缓慢进行，最严重的情况可能要住院治疗。
近来人们认为，药物过度使用以治疗头痛是发表在supplement 1，Cephalgia 200424卷，94-95页中的国际头痛症分类法(International Classification of Headache Disorders)第二版的一种独特的病症诊断，其中据称当患有MOH症的患者过度使用急性疼痛药物时，他们对其它预防性药物几乎没有反应。
肉毒毒素梭状芽孢杆菌属(Clostridium)根据形态和功能分类包括有127个以上的菌种。革兰氏阳性厌氧菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生强力的多肽神经毒素——肉毒毒素，它引起人或动物的神经性麻痹疾病，称为肉毒梭菌中毒。肉毒梭菌的芽孢存在于土壤中，能生长在家庭罐头工厂未适当消毒和封口的食物容器内，这是许多例肉毒梭菌中毒的原因。在吃了肉毒梭菌培养物或芽孢污染的食物后一般18到36小时，肉毒毒素的作用就会呈现出来。肉毒毒素能毫无削弱地明显穿过肠道壁并攻击外周运动神经元。肉毒毒素中毒的症状逐渐从行走、吞咽、说话困难发展到呼吸肌麻痹和死亡。
A型肉毒毒素是人类所知最具有致命力的天然生物毒素。商业提供的A型肉毒毒素(纯化的神经毒素复合物)1对小鼠的LD50约是50皮克(即1个单位)。一个单位BOTOX约含有50皮克(约56阿托摩尔)的A型肉毒毒素复合物。有趣的是，同样是1摩尔，A型肉毒毒素的致死力比白喉强约18亿倍，比氰化钠强约6亿倍，比眼镜蛇毒素强约3000万倍，比霍乱强约1200万倍。Singh，Critical Aspects of BacterialProtein Toxins，Natural Toxins II的63-84页(第四章)，B.R.Singh et al.主编，Plenum Press，New York(1976)(其中校正了所称的A型肉毒毒素的LD50为0.3ng等于1U的说法，实际上1U约等于0.05ng)。肉毒毒素一个单位(U)的定义是腹腔注射每只重约18到20克的雌性Swiss Webster小鼠的LD50。
七种常规免疫性不同的肉毒神经毒素已被鉴定出来，它们分别为A、B、C1、D、E、F和G血清型肉毒神经毒素，通过与各型的特异性抗体的中和来区分每种血清型。不同血清型的肉毒毒素在它们所影响的动物物种和它们引起的麻痹的严重性和持续时间方面是不同的。例如通过测定大鼠麻痹产生率计算出A型肉毒毒素效力比B型肉毒毒素强500倍。此外测出B型肉毒毒素以480U/kg的剂量用在灵长类动物身上是无毒的，这个剂量是A型肉毒毒素对灵长类动物LD50的大约12倍。“Therapy WithBotulinum Toxin”，Jankovic，J.et al.主编(1994)，Marcel Dekker，Inc.第六章，71-85页Moyer E et al.，Botulinum Toxin Type BExperimental and Clinical Experience。肉毒毒素与胆碱能运动神经元明显高亲和结合，转移至神经元内并且阻断乙酰胆碱的释放。此外通过低亲和受体以及吞噬和胞饮的方式可以额外摄取毒素。
尽管血清型不同，毒素中毒的分子机制似乎是相似的，并且至少涉及到三个步骤或三个阶段。在过程的第一步中，毒素通过重链(H链)和细胞表面受体间特异的相互作用与靶神经元的突触前膜结合；认为该受体对肉毒毒素和破伤风毒素的每个类型都不同。H链的羧基末端片段(HC)似乎对于毒素靶向于细胞表面很重要。
1由California Irvine的Allergen公司提供，商标为BOTOX，每瓶100个单位。
在第二步中，毒素穿过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体调节的细胞内吞作用被细胞吞食，并且形成一个含有毒素的内涵体。然后毒素脱离内涵体进入细胞质。这一步骤被认为是通过H链氨基末端(HN)调节的，它引发适应pH约为5.5或以下的毒素构象改变。已知内涵体有能够降低内涵体内pH的质子泵。构象变化暴露出毒素的疏水残基，这样使得毒素将自身嵌入内涵体膜上。然后毒素(或者至少其轻链)穿过内涵体膜转移至细胞质中。
肉毒毒素活性机制的最后一步表现出涉及还原连接重链(H链)和轻链(L链)的二硫键。肉毒毒素和破伤风毒素的整个毒性活性都包含在全毒素的L链上；L链是一种锌(Zn++)内肽酶，它能够选择性地裂解蛋白，这些蛋白对于识别含有神经递质的囊泡，将其停靠在质膜的细胞质侧表面，以及将囊泡与质膜融合都是必要的。破伤风神经毒素和B、D、F、G型肉毒毒素引起一种突触体膜蛋白，突触小泡蛋白(也叫囊泡相关膜蛋白(VAMP))的降解。这些裂解作用中的任何一种都能除去大多存在于突触囊泡的细胞质表面的VAMP。A和E血清型肉毒毒素裂解SNAP-25。C1血清型肉毒毒素最初被认为是裂解突触融合蛋白的，但是后来发现裂解突触融合蛋白和SNAP-25。每种肉毒毒素特异性地裂解不同的键，除了B型肉毒毒素(和破伤风毒素)是裂解相同的键。每种裂解都阻断了囊泡-膜的停靠过程，由此阻止囊泡内容物的出胞。
肉毒毒素在临床上已用于治疗以骨骼肌机能亢进为特征的神经肌肉障碍(即运动障碍)。A型肉毒毒素复合物在1989年被美国食品药品管理局批准治疗睑痉挛、斜视、侧面面肌痉挛。相继地，A型肉毒毒素又被美国食品药品管理局批准治疗颈部肌张力失常和眉间皱，并且B型肉毒毒素被批准用于治疗颈部肌张力失常。非A型的肉毒毒素血清型与A型肉毒毒素相比明显效能较低并且/或者活性维持时间较短。外周肌内A型肉毒毒素的临床效果通常在其注射一星期内即可见。尽管已有报道其治疗活性发挥的时间明显更长，但距A型肉毒毒素单次肌内注射到症状缓解的典型持续时间平均约为三个月。
尽管所有的肉毒毒素血清型在神经肌接头处明显抑制神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过侵袭不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点裂解这些蛋白而实现的。例如A和E型肉毒毒素都裂解25千道尔顿(KD)突触体相关蛋白(SNAP-25)，但是它们靶向蛋白内的不同的氨基酸序列。B、D、F、G型肉毒毒素作用于囊泡相关蛋白(VAMP，也叫突触小泡蛋白)，不同的血清型裂解该蛋白的不同位点。最后，C1型肉毒毒素显示裂解突触融合蛋白和SNAP-25。这些作用机制的不同可能影响不同的肉毒毒素血清型的相对效能和/或作用持续时间。很明显，在各种不同的细胞类型中都能找到一种肉毒毒素的底物。见例如Biochem J1；339(pt 1)159-651999，以及Mov Disord，10(3)3761995(pancreatic islet B cells contains at least SNAP-25 andsynaptobrevin)。
对于七种已知的肉毒毒素血清型来说，肉毒毒素蛋白分子的分子量大约为150kD。有趣的是，梭状芽孢杆菌释放的肉毒毒素是包括150kD的肉毒毒素蛋白分子和与之结合的非毒素蛋白的复合物。因此，梭状芽孢杆菌产生的A型肉毒毒素复合物包含900kD、500kD和300kD的形式。B和C1型肉毒毒素明显是仅以700kD或500kD的复合物产生的。D型肉毒毒素是以300kD和500kD复合物产生的。最后，E和F型肉毒毒素是仅以约300kD的复合物产生。这些复合物(即分子量大于约150kD)被认为含有一种非毒素血凝素蛋白和一种非毒素与无毒性非血凝素蛋白。这两种非毒素蛋白(它们与肉毒毒素分子一起构成有关的神经毒素复合物)可能起到为肉毒毒素分子防止变性而提供稳定性，并且保护毒素在被摄取时抵抗消化酸的作用。此外，也可能大一些(比约150kD分子量大)的肉毒毒素复合物会使得它从肌内注射肉毒毒素复合物的位点扩散率减慢。
体外研究表明，肉毒毒素抑制钾离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织原代培养中释放。此外，已有报道，肉毒毒素抑制从脊髓神经元原代培养中引发释放甘氨酸和谷氨酸，并且它在脑部突触体的标本中抑制神经递质乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素(Habermann E.，etal.，Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins InhibitNoradrenaline Release From Cultured Mouse Brain，J Neurochem51(2)；522-5271988)、CGRP、P物质和谷氨酸(Sanchez-Prieto，J.，etal.，Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From GuineaPig Cerebral Cortical Synaptosomes，Eur J.Biochem165；675-6811897.)的释放。因此当应用足够浓度时，肉毒毒素阻断刺激引发的大多数神经递质的释放。见如Pearce，L.B.，PharmacologicCharacterization of Botulinum Toxin For Basic Science andMedicine，Toxicon 35(9)；1373-1412 at 1393；Bigalke H.，et al.，Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic SynapticTransmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture，BrainResearch 360；318-3241985；Habermann E.，Inhibition by Tetanusand Botulinum A Toxin of the release of [3H]Noradrenaline and[3H]GABA From Rat Brain Homogenate，Experientia 44；224-2261988，Bigalke H.，et al.，Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin InhibitRelease and Uptake of Various Transmitters，as Studied withParticulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 316；244-2511981，和；Jankovic J.et al.，Therapy With Botulinum Toxin，Marcel Dekker，Inc.，(1994)，第5页。
A型肉毒毒素可通过在发酵罐中建立和培养生长肉毒梭菌培养物，然后根据已知步骤收获并纯化发酵混合物来获得。所有血清型的肉毒毒素最初都是以非活性单链蛋白形式合成的，这些蛋白须经蛋白酶裂解和切割形成神经活性形式。产生A和G血清型肉毒毒素的菌株具有内源性蛋白酶，因此A和G血清型可以从细菌培养物中主要以其活性形式回收。相反，C1、D和E血清型肉毒毒素是由非蛋白水解菌株合成的，所以从培养物中回收时通常没有活性。B和F血清型可由蛋白水解菌株和非蛋白水解菌株产生，因此可以获得它们的活性形式或者非活性形式。然而，产生像B型肉毒毒素的蛋白水解株只裂解所产生的毒素的一部分。切断的和未切的分子的精确比例取决于孵育时间和培养温度。因此，已知的B型肉毒毒素比A型效力明显要低，这很可能归因于制备得到的是一定比例的像B型这样很可能是非活性形式的肉毒毒素。临床制剂中非活性肉毒毒素分子的存在增加了制剂的总体蛋白负荷(protein load)，而不增加功效，其中蛋白负荷又与抗原性增加有关。另外已知，在同样的肌肉注射剂量水平上，B型肉毒毒素的活性持续时间比A型肉毒毒素短，效力也较A型弱。
高质量结晶A型肉毒毒素可由肉毒梭菌Hall A株产生，其性质为≥3×107U/mg，A260/A278小于0.60，凝胶电泳呈现明显条带。结晶A型肉毒毒素用已知的Shantz过程获得，如Shantz，E.J.，et al，Properties and use of Botulinum toxin and Other MicrobialNeurotoxins in Medicine，Microbiol Rev.56；80-991992所述。通常，A型肉毒毒素复合物可从在合适的培养基中培养的A型肉毒梭菌的厌氧发酵中分离纯化。一旦分离出非毒素蛋白，已知的过程同样可以应用于获得纯肉毒毒素，例如纯化的A型肉毒毒素，分子量大约150kD，特异性效价为1-2×108LD50U/mg或以上；纯化的B型肉毒毒素，分子量大约156kD，特异性效价为1-2×108LD50U/mg或以上；以及纯化的F型肉毒毒素，分子量大约155kD，特异性效价为1-2×107LD50U/mg或以上。
肉毒毒素和/或肉毒毒素复合物可从List BiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，California；the Centre for AppliedMicrobiology and Research，Porton Down，U.K.；Wako(Osaka，Japan)，Metabiologics(Madison，Wisconsin)以及Sigma Chemicalsof St Louis，Missouri获得。纯的肉毒毒素也可用于制备药物组合物。
同多数酶一样，肉毒毒素(细胞内肽酶)的生物活性依赖于，或者至少部分依赖于其三维构象。因此，A型肉毒毒素经加热、各种化学物质的表面拉伸和表面干燥而失去毒性。此外已知，经已知的培养、发酵和纯化后用于药物组合物制剂的毒素浓度降低很多，除非有合适的稳定剂存在，否则毒素迅速去毒。将毫克量的毒素稀释到每毫升含纳克量的溶液中存在很大的困难，因为在这多倍的稀释中会迅速失去其特异性毒性。既然毒素可能在制成含毒素的药物组合物后数月或数年使用，毒素可通过如白蛋白和明胶这样的稳定剂稳定。
市售的含肉毒毒素的药物组合物是以BOTOX为商标出售的(由Allergan，Inc.，of Irvine，California提供)。BOTOX由纯化的A型肉毒毒素复合物、白蛋白和氯化钠组成，包装成灭菌的真空干燥的形式。A型肉毒毒素由生长于含N-Z胺和酵母提取物的培养基中的肉毒梭菌Hall株培养物制得。A型肉毒毒素复合物从一系列酸沉淀到由高分子量活性毒素蛋白和相关血凝素蛋白组成的晶状复合物而从培养液中得到纯化。晶状复合物再次溶解在含有盐和白蛋白的溶液中，过滤除菌(0.2微米)然后真空干燥。真空干燥的产品贮存于-5℃或以下的冷冻柜。肌内注射前，BOTOX可用灭菌不含防腐剂的盐水配制。每瓶BOTOX含有不含防腐剂的无菌真空干燥形式的约100单位(U)纯化的A型肉毒梭菌神经毒素复合物，0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠。
用不含防腐剂的灭菌生理盐水(0.9％氯化钠注射液)，通过在适当尺寸的注射器内汲取合适的稀释量，以重新配制真空干燥的BOTOX。由于BOTOX会因起泡或者类似地剧烈搅拌变性，所以将稀释液轻轻注射到小瓶内。由于灭菌的原因，最好在小瓶从冷冻柜拿出来重配后四小时内给药。在这四小时内重配的BOTOX置于约2到8℃冰箱保存。已有报道，重配后冷藏的BOTOX能维持其效价至少大约两周。Neurology，48249-531997。
据已报道，A型肉毒毒素应用于临床的情况如下(1)每肌肉注射(多块肌肉)约75-125单位的BOTOX治疗颈部肌张力失常；(2)每肌肉注射5-10单位BOTOX治疗眉间线(眉沟)(肌肉注射5单位到降眉间肌和10单位到每条皱眉肌)；(3)脊柱内注射耻骨直肠肌约30-80单位的BOTOX治疗便秘；(4)通过每肌肉1-5单位的BOTOX肌肉注射上眼睑和下眼睑侧面睑板前眼轮匝肌，治疗睑痉挛。
(5)眼外肌肌肉注射1-5单位BOTOX治疗斜视，此用量基于注射的肌肉的大小和肌肉需麻痹的程度变化(即所需矫正的屈光度)。
(6)对如下五个不同的上肢屈肌进行BOTOX肌肉注射治疗中风后的上肢肌痉挛(a)跖深屈肌7.5U到30U(b)跖浅屈肌7.5U到30U(c)尺侧腕屈肌10U到40U(d)桡侧腕屈肌15U到60U(e)肱二头肌50U到200U。以上所示的五种肌肉每种都在同一疗程注射，所以通过肌肉注射，在每个疗程患者上肢屈肌得到了90U到360U的BOTOX。
(7)颅骨膜注射(对称地注入眉间肌、额间肌、颞肌)25U的BOTOX治疗偏头痛，已证实具有非常有益的偏头痛的预防治疗效果，与赋形剂相比，BOTOX在25U注射后的三个月内降低了偏头痛的发病率、最大严重程度、所伴随的呕吐以及所使用的急性药物治疗。
此外，肌肉注射肉毒毒素已用于治疗帕金森疾病患者的震颤，尽管其结果并不十分明显。Marjama-Jyons，J.，et al.，Tremor-Predominant Parkinson’s Disease，Drugs & Aging16(4)；273-2782000。
据悉，当A型肉毒毒素用于治疗腺体如多汗症，其具有达12个月的效果(European J.Neurology 6(Supp 4)S111-S11501999)，并且在某些情况下长达27个月。见如Bushara K.，Botulinum toxin andrhinorrhea，Otolaryngol Head Neck Surg 1996；114(3)507，和TheLaryngoscope 1091344-13461999。然而通常Botox肌肉注射典型持续时间大约为3到4个月。
A型肉毒毒素对于治疗多种临床疾病的成功，引起了人们对其它肉毒毒素血清型的兴趣。两种商业提供用于人的A型肉毒毒素制剂——BOTOX由Allergan，Inc.，of Irvine，California提供，和Dysport由Beaufour Ipsen，Porton Down，England提供。一种B型肉毒毒素制剂(MyoBloc)由Elan Pharmaceuticals of San Francisco，California提供。
肉毒毒素除了在外周部位有药理作用外，其对于中枢神经系统也具有抑制作用。Weigand等人(Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1976；292，161-165，和Habermann，Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1974；281，47-56)的研究表明肉毒毒素能经逆行运输上升到脊柱区域。照这样，在外周一个部位注射一种肉毒毒素，例如肌肉注射，它能逆行运输到脊髓。
美国专利5,989,545公布的修饰梭菌神经毒素或其片段，优选化学聚合或与特定的靶向部分重组融合的肉毒毒素，能用来通过脊髓给药治疗疼痛。
已有报道，使用肉毒毒素治疗多种痉挛性肌肉疾病，在减轻肌肉痉挛的同时，能减轻抑郁和焦虑。Murry T.，et al.，Spasmodic dysphonia；emotional status and botulinum toxin treatment，Arch Otolaryngol1994 Mar；120(3)310-316；Jahanshahi M.，et al.，Psychologicalfunctioning before and after treatment of torticollis withbotulinum toxin，J Neurol Neurosurg Psychiatry 1992；55(3)229-231.此外，德国专利申请DE 101 50 415 A1讨论了肌肉注射肉毒毒素治疗抑郁和相关情感障碍(affective disorders)。
肉毒毒素还被建议用来或已用来处理皮肤创伤(美国专利6,447,787)、多种自主神经功能障碍(美国专利5,766,605)、紧张型头痛(美国专利6,458,365)、偏头痛(美国专利5,714,468)、窦性头痛(美国专利申请系列号429069)、术后疼痛和内脏疼痛(美国专利6,464,986)、神经痛(美国专利申请系列号630,587)，毛发生长和毛发停滞(美国专利6,299,893)、牙齿相关疾病(美国临时专利申请系列号60/418,789)、纤维肌痛(美国专利6,623,742)、多种皮肤病症(美国专利申请系列号10/731973)、运动病(美国专利申请系列号752,869)、银屑病和皮炎(美国专利5,670,484)、肌肉损伤(美国专利6,423,319)、多种癌症(美国专利6,139,845)、平滑肌病症(美国专利5,437,291)、唇角下垂(美国专利6,358,917)、神经卡压综合征(美国专利申请20030224019)、多种冲动障碍(impulsedisorders)(美国专利申请系列号423,380)、痤疮(WO 03/011333)和神经源性炎症(美国专利6,063,768)。控释的毒素埋植剂(见如美国专利6,306,423和6,312,708)已知是肉毒毒素经皮给药(美国专利申请系列号10/194,805)。
A型肉毒毒素已用于治疗一类局部运动癫痫——持续性局限性癫痫(epilepsia partialis continua)。Bhattacharya K.，et al.，Noveluses of botulinum toxin type Atwo case reports，Mov Disord 2000；15(Suppl 2)51-52。
据悉，肉毒毒素能用来弱化嘴的咀嚼肌或咬肌使得自身造成创伤、导致的溃疡能愈合(Payne M.，et al，Botulinum toxin as a noveltreatment for self mutilation in Lesch-Nyhan syndrome，Ann Neurol2002 Sep；52(3 Supp 1)S157)；使得良性囊损伤(cystic lesions)或肿瘤的有机会康复(Blugerman G.，et al.，Multiple eccrinehidrocystomasA new therapeutic option with botulinum toxin，Dermatol Surg 2003 May；29(5)557-9)；治疗肛裂(Jost W.，Ten years′experience with botulinum toxin in anal fissure，Int J ColorectalDis 2002 Sep；17(5)298-302)；以及治疗某些种类的特应性皮炎(Heckmann M.，et al.，Botulinum toxin type A injection in thetreatment of lichen simplexAn open pilot study，J Am AcadDermatol 2002 Apr；46(4)617-9)。
此外，肉毒毒素可能对减轻在大鼠福尔马林模型中诱导的炎症疼痛有效。Aoki K.，et al，Mechanisms of the antinociceptive effectof subcutaneous BotoxInhibition of peripheral and centralnociceptive processing，Cephalalgia 2003 Sep；23(7)649.而且，已有报道，肉毒毒素神经阻断能引起表皮厚度减少。Li Y，et al.，Sensory and motor denervation influences epidermal thickness inrat foot glabrous skin，Exp Neurol 1997；147452-462(见第459页).最后，据了解，对足部进行肉毒毒素给药以治疗足部多汗(Katsambas A.，et al.，Cutaneous diseases of the footUnapprovedtreatments，Clin Dermatol 2002 Nov-Dec；20(6)689-699；Sevim，S.，et al.，Botulinum toxin-A therapy for palmar and plantarhyperhidrosis，Acta Neurol Belg 2002 Dec；102(4)167-70)、痉挛性脚趾(Suputtitada，A.，Local botulinum toxin type A injectionsin the treatment of spastic toes，Am J Phys Med Rehabil 2002Oct；81(10)770-5)、原发性脚趾行走(Tacks，L.，et al.，Idiopathictoe walkingTreatment with botulinum toxin A injection，Dev MedChild Neurol 2002；44(Suppl 91)6)，以及足部张力失常(Rogers J.，et al.，Injections of botulinum toxin A in foot dystonia，Neurology 1993 Apr；43(4 Suppl 2))。
破伤风毒素及其衍生物(即具非天然靶向部分)、片段、杂合体和嵌合体也都有治疗用途。破伤风毒素与肉毒毒素具有很多相似性。因为两者都是由相近的梭菌属种(分别是破伤风梭菌(Clostridium tetani)和肉毒梭菌)产生的多肽。另外，破伤风毒素和肉毒毒素均是由一条轻链(分子量约50kD)经一根二硫键与一条重链(分子量约100kD)共价结合组成的双链蛋白。所以，破伤风毒素和七种肉毒毒素(非复合形式)的每一种的分子量约为150kD。而且，对于破伤风毒素和肉毒毒素，轻链上都具有抑制细胞内生物(蛋白酶)活性的结构域，而重链均包含受体结合(免疫原性)和细胞膜转位域。
而且破伤风毒素和肉毒毒素均显示出与突触前胆碱能神经元表面的神经节细胞受体的高度、特异的亲和力。经外周胆碱能神经元的受体介导的破伤风毒素细胞内吞作用导致轴突逆行运输、阻断抑制性神经递质从中枢突触释放和痉挛性麻痹。相反，经外周胆碱神经元的受体介导的肉毒毒素细胞内吞作用的结果是，即便有逆行运输也极少地抑制从中毒的外周运动神经元进行细胞内吞乙酰胆碱和迟缓性麻痹。
最后，破伤风毒素和肉毒毒素彼此在生物合成和分子结构上都相似。因此，破伤风毒素和A型肉毒毒素的蛋白序列有总体34％的一致性，对于某些功能性结构域来说，序列一致性高达62％。Binz T.et al.，TheComplete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A and Comparisonwith Other Clostridial Neurotoxins，J Biological Chemistry265(16)；9153-91581990。
乙酰胆碱通常在哺乳动物神经系统中，每一种神经元仅释放一种类型的小分子神经递质，但有证据表明，几种神经调质可由相同的神经元分泌。神经递质乙酰胆碱由很多脑区中的神经元分泌，但特异性地由下述神经元分泌运动皮层的大锥体细胞、基底神经节中几种不同的神经元、支配骨骼肌的运动神经元、自主神经系统(交感神经和副交感神经)的神经节前神经元、肌梭纤维的袋1纤维(bag 1 fiber)、副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的某些神经节后神经元。基本上，只有通向汗腺、竖毛肌(piloerector muscle)和少数血管的神经节后交感神经纤维是胆碱能性的，而交感神经系统的大部分神经节后神经元分泌的神经递质是去甲肾上腺素。在多数情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。然而，已知乙酰胆碱在某些外周副交感神经末梢具有抑制作用，例如通过迷走神经抑制心率。
自主神经系统的传出信号通过交感神经系统或副交感神经系统传递到身体中。交感神经系统的神经节前神经元延伸自位于脊髓中间外侧角(intermediolateral horn)中的神经节前交感神经元细胞体。从细胞体延伸出来的神经节前交感神经纤维与位于脊椎旁的交感神经节中或椎骨前神经节中的神经节后神经元形成突触。由于交感神经系统和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能性的，因此对神经节应用乙酰胆碱将刺激交感和副交感神经节后神经元。
乙酰胆碱活化两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。毒蕈碱受体发现存在于所有由副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的神经节后胆碱能神经元所刺激的效应细胞中。烟碱受体发现存在于肾上腺髓质以及自主神经节中，即在神经节后神经元的细胞表面上，所述神经元在交感和副交感神经系统的神经节前与神经节后神经元之间的突触中。烟碱受体还发现存在于很多非自主性神经末梢中，例如神经肌接点处的骨骼肌纤维的膜中。
当小而透明的细胞内小泡与突触前神经元细胞膜融合时，乙酰胆碱即从胆碱能神经元中释放出来。多种非神经元分泌细胞，如肾上腺髓质(以及PC12细胞系)和胰岛细胞分别从大致密核心小泡中释放儿茶酚胺和副甲状腺激素。PC12细胞系是大鼠嗜铬细胞瘤细胞的克隆，被广泛用作研究交感肾上腺发育的组织培养模型。肉毒毒素经渗透(如电穿孔一样)或直接注射到去神经细胞中后，将在体外抑制两种类型的化合物从两种类型的细胞中的释放。还已知肉毒毒素阻断神经递质谷氨酸从皮质突触小体细胞培养物中的释放。
神经肌肉接点是通过轴突接近肌肉细胞而在骨骼肌中形成的。通过神经系统传递的信号引起末端轴突处的作用电位，并活化离子通道，导致神经递质乙酰胆碱在例如神经肌肉接点的运动终板处从神经元内的突触小泡中释放出来。乙酰胆碱穿过细胞外间隙与乙酰胆碱受体蛋白在肌肉终板的表面上结合。一旦发生了足够的结合，肌肉细胞的作用电位即引起特异性的膜离子通道变化，从而导致肌肉细胞收缩。然后乙酰胆碱从肌肉细胞中释放出来并通过胆碱脂酶在细胞外间隙中代谢。代谢产物回收到末端轴突中以再加工为乙酰胆碱。
因此所需的是一种预防头痛和治疗药物过度使用性病症的有效方法。还需要一种增加曲坦类药物治疗头痛的有效性的方法，如一种使得曲坦类用药剂量减少的方法。
发明内容
本发明通过局部给予梭菌毒素满足这些要求并且提供有效预防头痛、治疗疼痛和药物过度使用性病症(MOD)的方法。我们的发明还提供一种增加曲坦类药物治疗头痛有效性的方法。
根据我们的发明，可实行一种对MOD患者给予梭菌毒素的方法。所用的梭菌毒素优选肉毒毒素(作为复合物或者纯物质[即约150kD的分子])，如A、B、C、D、E、F或G型肉毒毒素。可以通过经皮途径进行梭菌毒素给药(即应用于乳膏、贴片或洗液赋形剂中的梭菌毒素)，真皮下途径(即皮下或肌肉)，或真皮内途径给药。
如以下详细解释，一个我们的发明疗效的假设生理原因是减少、抑制或消除从外周向中枢系统(包括向脑部)的感觉输入(传入)，此感觉传入被患者感觉为疼痛，并且或者引发药物过度使用性病症的发展。这种疼痛感觉输入可通过低剂量梭菌毒素靶向皮下感觉神经元减弱或者消除。
依据本发明，所用梭菌毒素的剂量少于梭菌毒素(如肉毒毒素)用于麻痹肌肉的用量，因为依照本发明的一种方法的目的不是为了麻痹肌肉而是减少从位于肌肉内或肌肉上，或者皮肤内或皮肤下的感觉神经元的疼痛感觉输出。
在此应用以下定义“大约”意思是大致或几乎，并且，在文中提及数值或范围时是指例举或要求的数值或范围的±10％。
“缓解”是指头痛或者MOD症状的疼痛发生的减少。因此，缓解包括一些减少，明显减少，几乎完全减少，和完全减少。一种缓解效果可能在临床上对患者行梭菌毒素给药后1到7天内不能显现。
“肉毒毒素”是指一种纯毒素形式或复合物形式的肉毒神经毒素，不包括像细胞毒性肉毒毒素C2和C3的不是神经毒素的肉毒毒素。
“局部给药”是指肌肉或真皮下位置或其附近或者患者头部的非全身途径用药方法(即表皮下、肌内、真皮下或透皮的途径)。因此局部给药不包括全身(即进入血液循环系统)给药途径，例如静脉注射或口服给药。外周给药是指相对于内脏或肠道(即到内脏)给药的外周(即到患者的四肢、躯干或头部上或它们内部的位置)给药方法。
“治疗”是指暂时或永久缓解(或消除)疼痛(如头痛)或MOD的至少一个症状。
给予梭菌神经毒素的治疗有效量来缓解疼痛，以预防头痛或治疗MOD的症状。一种合适的梭菌神经毒素可以是由细菌产生的神经毒素，如从肉毒梭菌、酪酸梭杆菌(Clostridium butyricum)、巴氏梭菌(Clostridium beratti)得到的神经毒素。在发明的某些实施方案中，通过给患者肌肉(面部)注射肉毒毒素来治疗疾患。肉毒毒素可以是A、B、C1、D、E、F或G型肉毒毒素。肉毒毒素缓解疼痛和/或MOD的效果可能维持大约1个月到5年。肉毒菌神经毒素可以是重组的肉毒菌神经毒素，如由大肠杆菌(E.coli)产生的肉毒毒素。此外或或者，肉毒菌神经毒素可以是被修饰的神经毒素，即与天然肉毒神经毒素相比至少有一个氨基酸缺失、修饰或替换的肉毒神经毒素，或者，修饰的肉毒神经毒素可以是一种重组产生的肉毒神经毒素或其衍生物或片段。
依据本发明治疗MOD的一种方法可包含对MOD患者行肉毒毒素局部给药的步骤来缓解MOD。肉毒毒素可选自A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。A型肉毒毒素是优选的肉毒毒素。肉毒毒素给药量约1到约3000单位，缓解MOD能持续约1个月到约5年。肉毒毒素可在病人经受或易受疼痛处或邻近处局部给药。或者，可通过肌肉注射，或对像以前额为代表的患者感到出现疼痛位置的真皮下进行局部给药。
我们的发明的另一个实施方案是，对过度使用曲坦类药物的病人头痛的治疗方法。该方法包括对过度使用曲坦类药物的患者施以肉毒毒素的局部给药步骤，由此既治疗由于曲坦类药物的过度使用引起的头痛加剧，又减少患者的曲坦类药物的使用以治疗头痛。
我们的发明的进一步的实施方案是一种增加曲坦类药物治疗头痛的有效性的方法。该方法包括给予曲坦类药物治疗头痛并且局部施予肉毒毒素。
以下提供图示以帮助理解本发明的各方面和特征。
图1是表示用BOTOX特别治疗偏头痛实施的临床研究结果(每三十天期间内头痛次数的平均变化)的曲线图，表明在施予BOTOX后患者头痛更少。在所有图显示的所有资料中，患者在0、90和180天给予BOTOX。
图2是表示用BOTOX特别治疗偏头痛实施的临床研究结果(当患者每三十天同时服用急性头痛缓解药物的天数的平均变化)的曲线图，表明用BOTOX后的患者用急性头痛缓解药物的天数更少。
图3是表示一个三十天周期内用麻醉药物控制急性头痛的患者百分比比较(一部分用BOTOX和一部分用安慰剂)的曲线图。图3表明用BOTOX治疗的患者麻醉药物的使用减少。
图4表示在施予BOTOX后的一个三十天周期内，过度使用急性头痛药物的患者百分比下降的结果曲线图。
图5表示在施予BOTOX后一个三十天周期内，过度使用曲坦类急性头痛药物的患者百分比下降的曲线图。
图6-16中的星号(*)表示有统计学显著性的数据点，X轴下方的竖直箭头表示注射BOTOX的时间。
图6包括两幅表示施予BOTOX后，在一个三十天周期内经受头痛的患者数目的平均变化曲线图，此处或者病人未患药物过度使用性病症(“没有MOU”)(左边的曲线图)，或者病人患有药物过度使用性病症(右边曲线图)。“≥15天和≥2天/星期”是用来衡量病人患有药物过度使用性(“MOU”)病症的标准。MOU和MOD是同义语。如果患者每月15天或以上服用一种急性药物，并且在他们历经急性疼痛的周内至少一周两次，根据定义即为一位患有MOU症的患者。
图7包括两幅表示患者的混合群体，在基线时使用(曲线A)或不使用(曲线B)预防性头痛药物的患者，每30天周期头痛频率相对基线的平均变化曲线图。Y轴代表每30天周期的头痛次数的平均变化。“n”是指评价的患者样本中的患者数目。
图8包括两幅表示施予BOTOX后一个30天周期内，患者经受头痛的次数的平均变化曲线图，在此，或者患者不同时用另一种头痛预防处理(左边曲线图)，或者患者不同时用另一种头痛预防处理且患有药物过度使用性病症(右边曲线图)。该预防方法被患者用于预防头痛，并且被患有或不患头痛的患者每天使用。急性药物只用来按需要治疗头痛。MOU只和患者使用急性药物的频率相关。
图9包括两幅表示在施予BOTOX后一个三十天周期内，患者经受头痛次数的平均变化曲线图，此处，患者不同时用另一种头痛预防处理并且未患药物过度使用性病症(左边曲线图)，或者患者不同时用另一种头痛预防处理且患有药物过度使用性病症(右边曲线图)。
图10是表示施予BOTOX后一个三十天周期内，同时使用阿片类急性头痛药物控制头痛患者的百分比直方图。
图11包括两幅施予BOTOX后一个三十天周期内，患者经受头痛的次数的平均变化曲线图，此处患者或者是过度使用曲坦类药物的患者(左边的曲线图)，或者患者不是过度使用曲坦类药物的患者(右边的曲线图)。
图12包括两幅表示患者使用急性头痛(镇痛)药物的天数相对基线(用BOTOX后)的平均变化的曲线图，此处，或者患者是过度使用曲坦类药物的患者(左边曲线图)，或者不是过度使用曲坦类药物的患者(右边曲线图)。
图13包括，左边的，人肌肉解剖结构的肩部以上的一个左侧概览，和图13右边的，背部或躯干(包括颈部)一个概览，图13中的两个视图显示了除去覆盖皮肤的肌肉解剖结构和布局。
图14包括两幅表示每30天的阶段，安慰剂无反应者(曲线图A)和安慰剂反应者(曲线图B)的头痛频率相对基线的平均变化曲线图。
图15是表示患者混合群体，每个30天的阶段，相对基线的头痛频率的平均变化曲线图。
图16包括两幅表示患者混合群体中，每个30天的阶段，在基线使用(曲线A)和不使用(曲线B)预防性头痛药物的患者使用急性镇痛头痛药物的天数，相对基线的平均变化曲线图。
具体实施例方式
本发明是基于这样一种发现，即肉毒毒素可用于治疗过度使用疼痛缓解药物以治疗其疼痛(如头痛)的患者，以减少(a)患者经受头痛的次数(见图1)和(b)患者急性头痛药物的每天使用(图2)。尤其，我们发现(见图3)肉毒毒素可用来减少患者麻醉性疼痛药物的使用。药物过度使用来治疗头痛(“MOH”)是一种可识别的病症。
另外我们发现，对过度使用疼痛缓解药物的患者应用肉毒毒素使其在肉毒毒素治疗后，这些药物的使用显著减少(见图4)。我们同样发现，在过度使用曲坦类药物的患者中，曲坦类药物的服用显著减少(见图5)。
我们的发明还用作戒毒方法(detoxification protocol)的一部分，由此，停止使用急性疼痛药物的患者通过合并使用肉毒毒素促进达到该目的。我们的发明也用来治疗其它慢性疼痛疾病(如背痛、神经性疼痛、异常性疼痛、纤维肌痛等)，包括过度使用急性药物尤其是麻醉药和曲坦类药物的患者。
根据我们的发明，药物过度使用性病症可通过局部给予治疗有效量的肉毒毒素进行治疗。因此可向患者经受疼痛部位内或其邻近处注射(即肌内注射)一种肉毒毒素(如A、B、C1、D、E、F或G血清型肉毒毒素)，由此抑制疼痛或者防止它的发生。还有一种，对真皮内或真皮下疼痛感觉神经元给予肉毒毒素，由此抑制或治疗这种药物过度使用性病症。
我们的发明优选实施对患者经受或易受疼痛的部位直接行肉毒毒素给药。不愿拘于理论，可提出一种针对本发明疗效的生理机制。已知肌肉具有神经支配和感觉输出复合系统。因此，位于脊髓灰质前角的每个部分的前端运动神经元产生传出α运动神经元和传出γ运动神经元，这些运动神经元经前根离开脊髓，以支配骨骼(肌梭外)肌纤维。α运动神经元导致肌梭外骨骼肌纤维收缩，同时γ运动神经元支配骨骼肌肌梭内纤维。受到这两类传出前运动神经投射刺激的同时，另外还有传入感觉神经元，从肌梭和高尔基氏肌腱器投射并起到向脊髓、小脑和脑皮层传递多种肌肉状态参数信息的作用。这些从肌梭承接感觉信息的传入运动神经元，包括Ia型和II型感觉传入神经元。见如Guyton A.C.etal.Textbook of Medical Physiology，W.B.Saunders Company 1996，第九版的686-688页。
肉毒毒素能起到衰减来自Ia型肌肉传入神经元的感觉信息的作用，这一点已经很重要地得到明确。Aoki，K.，Physiology andpharmacology of therapeutic botulinum neurotoxins，in Kreyden，O.，editor，Hyperhydrosis and botulinum toxin in dermatology，Basel，Karger；2002；30pages 107-116，at 109-110。并且已有假说，肉毒毒素对肌细胞感觉传入具有直接作用，并且能修改从这些传入神经元向中枢神经系统传送的信号。见如Brin，M.，et al.，Botulinumtoxin type Apharmacology，in Mayer N.，editor，Spasticityetiology，evaluation，management and the role of botulinum toxin，2002；pages 110-124，at 112-113；Cui，M.，et al.，Mechanisms ofthe antinociceptive effect of subcutaneous BOTOXinhibition ofperipheral and central nociceptive processing，NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol 2002；365(supp 2)R17；Aoki，K.，et al.，Botulinum toxin type A and other botulinum toxin serotypesa comparative review of biochemical and pharmacological actions，Eur J.Neurol 2001(suppl 5)；21-29。因此，说明肉毒毒素能引起从肌肉到CNS和脑部的感觉输出改变。
很重要的一点，依据本发明的一种方法抑制来自感觉神经元传入信号输出，该感觉神经元不需位于肌肉上或肌肉内，但可在真皮内或真皮下的位置。
因此，疼痛可归因于来自传入面部神经元的感觉输入。对面部肌肉或皮肤施予肉毒毒素能减弱来自肌肉的感觉输出，使疼痛得到缓解和预防。
在我们的假说中，在用肉毒毒素治疗偏头痛情况中，由在肌肉组织(即，肌梭纤维和肌肉疼痛纤维)内或组织上的或者在皮肤或真皮下作为感觉结构的一部分的传入疼痛神经传输的信号诱发痛觉。也就是说，来自肌肉或皮肤结构的传入信号向脑部提供感觉信息，之后导致产生疼痛。所以对在肌肉或其邻近的肌梭纤维、疼痛纤维或其它感受器进行局部肉毒毒素给药能起到改变自这些肌肉到脑部的神经信号传入的输出并由此减轻痛觉的作用。
我们的发明的重要要素是，首先是低剂量肉毒毒素局部给药的实施。所选的低剂量不会导致肌肉麻痹。第二，可通过对引发痛觉的肌肉或肌肉群进行低剂量肉毒毒素局部给药来实施本发明。
根据在所公开的发明的范围内的一种方法，梭菌毒素的给药量随所治疗的疼痛的具体特征变化，包括其严重性和其它各种患者参数包括尺寸、重量、年龄和对治疗的反应。为引导实施者，每个患者疗程，典型的给药量是，每个注射位点(即每个注射的肌肉部分)，不少于约1单位和不多于约25单位的A型肉毒毒素(如BOTOX)给药量。对于一种像DYSPORT的A型肉毒毒素，每个患者疗程，每个注射位点进行不少于约2单位和不多于约125单位的A型肉毒毒素给药。对于像MYOBLOC的B型肉毒毒素，每个患者疗程，每个注射位点进行不少于约40单位和不多于约1500单位B型肉毒毒素给药。少于约1、2或40单位(分别为BOTOX，DYSPORT和MYOBLOC的)不能达到期望的疗效，而多于约25、125或1500单位(分别为BOTOX，DYSPORT和MYOBLOC的)能导致显著的肌肉低张力、无力和/或麻痹。
更优选地，每个患者疗程，每个注射位点分别对于BOTOX不少于约2单位和不多于20单位的A型肉毒毒素；对于DYSPORT，不少于约4单位和不多于约100单位，和；对于MYOBLOC，不少于约80单位和不多于约1000单位进行给药。
最优选地，每个患者疗程，每个注射位点分别对于BOTOX不少于约5单位和不多于15单位的A型肉毒毒素；对于DYSPORT，不少于约20单位和不多于约75单位，和；对于MYOBLOC，不少于约200单位和不多于约750单位进行给药。应特别注意，每个患者疗程在治疗期间可以有多个注射位点(即注射的分布形式)。
通常，根据发明公开的方法，适于患者的BOTOX、DYSPORT或MYOBLOC给药总量，每个疗程分别不应超过约300单位、约1500单位或约15000单位。
虽然，已提供了给药途径和剂量的实施例，但合适的给药途径和剂量通常由主治医师根据具体情况确定。这些确定方法是现有技术中的常规方法(见如Harrison’s Principles of Internal Medicine(1998)，Anthony Fauci et al.主编，第14版，McGraw Hill出版)。例如依据本公开发明的一种神经毒素的给药途径和剂量，可基于像所选神经毒素的溶解性特征和所感受疼痛的强度之类的标准进行选择。
本发明是基于梭菌毒素局部给药能显著和长期减轻和预防疼痛以及治疗药物过度使用性病症这一发现。此处依照本发明使用的梭菌毒素，能抑制涉及疼痛发生的两个选择的神经元型间化学或电信号的传递。梭菌毒素优选地对与其接触的细胞不具有细胞毒性。梭菌毒素能通过减少或阻止来自暴露于梭菌毒素的神经元的神经递质胞吐作用来抑制神经传递。或者所用的梭菌毒素能通过抑制暴露于毒素的神经元动作电位的产生减少神经传递。梭菌毒素的头痛和头痛的预防和缓解作用能维持相对长期的时间，如两个月以上，并很有可能几年。
本发明范围内的梭菌毒素实例包括由肉毒梭菌、酪酸梭菌和巴氏梭菌产生的神经毒素。此外，发明方法中使用的肉毒毒素，可以选自A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。在发明的一个实施方案中，给予患者的肉毒毒素是A型肉毒毒素。A型肉毒毒素因其对于人类的高效能、容易获得性、以及在局部肌肉注射时治疗骨骼肌和平滑肌障碍的已知用途成为理想选择。本发明还包括(a)经细菌培养、毒素提取、浓缩、保存、冻干、和/或重配，获得或加工的梭菌神经毒素；和/或(b)修饰或重组的神经毒素，即通过已知化学/生化氨基酸修饰过程或通过已知宿主细胞/重组载体重组技术，有目的地将一个或多个氨基酸或氨基酸序列缺失、修饰或替代的神经毒素以及这样制得的神经毒素的衍生物或片断的用途。这些神经毒素的变异体保留了抑制神经元间神经传递的能力，并且它们中的一些与天然的神经毒素相比，可能抑制效应的持续时间增加，或者可能与暴露于神经毒素的神经元的结合特异性增强。可利用常规分析方法鉴别具有预期抑制神经传递生理作用的神经毒素筛选变异体，由此选出这些神经毒素变异体。
依据本发明，待用的肉毒毒素可以冻干、真空干燥的形式贮存于真空压力下的容器内或以稳定液态贮存。冻干前，肉毒毒素可与药用的赋形剂、稳定剂和/或载体如白蛋白联合。冻干的物质可用盐水或水重配，得到用于患者给药的含肉毒毒素的溶液或者组合物。
虽然该组合物可仅含有单独一种神经毒素，如A型肉毒毒素作为抑制神经传递的活性成分，但其他治疗组合物可包括两种或多种类型增强头痛治疗的神经毒素。例如，施用于患者的组合物可包括A型肉毒毒素和B型肉毒毒素。施予含两种不同的神经毒素的单一组合物可使得每种神经毒素的有效浓度比如果给患者用单独一种神经毒素低，同时仍达到期望的疗效。这种给予患者的组合物还可含有与这(些)神经毒素联合的其他药用活性成分，如蛋白质受体或离子通道调节剂。这些调节剂有助于减少各种神经元间神经传递。例如，一种组合物可包含γ氨基丁酸(GABA)A型受体调节剂，它增强由GABAA受体介导的抑制作用。GABAA受体通过有效分流跨细胞膜的电流来抑制神经元活性。GABAA受体调节剂可增强GABAA受体的抑制效应并且减少来自神经元的电或化学信号传递。GABAA受体调节剂实例包括苯并二氮卓类，如地西泮(diazepam)、奥沙西泮(oxaxepam)、劳拉西泮(lorazepam)、普拉西泮(prazepam)、阿普唑仑(alprazolam)、哈拉西泮(halazeapam)、氯氮平(chordiazepoxide)和氯氮卓盐。组合物还可包括降低由谷氨酸受体介导的激动效应的谷氨酸受体调节剂。谷氨酸受体调节剂的实例包括抑制电流通过AMPA、NMDA和/或红藻氨酸盐(kainate)型谷氨酸受体的试剂。组合物还可包括调节多巴胺受体的试剂，如抗精神病药物、去甲肾上腺素受体和/或5-羟色胺受体。组合物还可包括影响经过电压门控钙离子通道、钾离子通道和/或钠离子通道的离子流的试剂。因此用于治疗头痛的组合物可以包括一种或多种神经毒素如肉毒毒素，以及可减少神经传递的离子通道受体调节剂。
神经毒素可按照主治医师确立的任意的合适的方法给药。给药方法允许将神经毒素局部给药至所选的靶组织。给药方法包括一种包含神经毒素的溶液或组合物的注射，如上所述，并且包括可控地向靶组织释放神经毒素的控释系统的植入。这种控释系统减少了重复给药的需要。一种肉毒毒素在一组织中的生物活性的扩散似乎是剂量的函数，并能逐渐进行。Jankovic J.，et al Therapy With Botulinum Toxin，MarcelDekker，Inc.，(1994)，第150页。因此，肉毒毒素的扩散能被控制，以减少不期望的可能影响患者认知能力的潜在副作用。例如，进行神经毒素给药，使得神经毒素主要影响被认为是涉及疼痛和/或炎症产生的神经系统，并且对其他神经系统没有消极的不良反应。
一种聚酐聚合物，Gliadel(Stolle R&D，Inc.，Cincinnati，OH)，即一种比例为20∶80的多聚羧基苯氧基丙烷和癸二酸共聚物已被用于制造植入剂，并且已进行颅内植入治疗恶性神经胶质瘤。聚合物和BCNU可共溶于二氯甲烷，并喷雾干燥成微球。将这些微球经压模压成直径1.4cm和厚度1.0mm的碟片，氮气下包装在铝铂袋中，并由2.2兆拉德γ射线灭菌。尽管聚合物要花一年以上大部分降解，但它使得卡莫司丁在2-3周内释放。Brem，H.，et al，Placebo-Controlled Trial ofSafety and Efficacy of Intraoperative Controlled Delivery byBiodegradable Polymers of Chemotherapy for Recurrent Gliomas，Lancet 345；1008-10121995。
实施此处公开的方法所用的植入物可通过需要量的稳定的神经毒素(如非重配的BOTOX)混入溶于二氯甲烷的合适的聚合物溶液中制得。溶液可在室温下制得。然后将溶液转入培养皿中，并在真空干燥器内蒸干二氯甲烷。根据植入物所需大小和由此而得的神经毒素混合量，将合适量的混入神经毒素的干燥植入物在模子中以约5秒8000p.s.i.或者17秒3000p.s.i.压缩成包封神经毒素的埋植片。见如Fung L.K.etal.，Pharmacokinetics of Interstitial Delivery of Carmustine4-Hydroperoxycyclophosphamide and Paclitaxel From aBiodegradable Polymer Implant in the Monkey Brain，CancerResearch 58；672-6841998。
梭菌毒素如肉毒毒素的局部给药，可提供较高的、局部治疗水平的毒素。一种能长期向靶肌肉局部递送梭菌毒素的控释聚合物允许有效确定靶组织的药量。一个合适的植入物，如美国专利号6,306,423题为“神经毒素植入物”中提出的，可以将化疗试剂由控释聚合物直接引入靶组织。所用的这种植入物聚合物优选疏水性的，以阻止毒素释放至靶组织环境前，混入神经毒素的聚合物的水诱导分解。
依据本发明，通过注射或植入靶组织进行肉毒毒素的局部给药比起患者全身给药来缓解疼痛和治疗如MOH的一种MOD来说是另一种更好的选择。
根据本公开发明，靶组织局部给药所选择的梭菌毒素的量，可基于如疼痛严重性或所治疗的头痛或MOD的类型，治疗的肌肉组织的范围，所选的神经毒素的溶解性特征，以及患者的年龄、性别、重量和健康状况等标准而变化。例如，人们认为所影响的肌肉组织区域范围与注射的神经毒素的体积成比例，同时对于大多剂量范围，认为抑制作用大小与给予梭菌毒素的浓度成比例。确定合适的给药途径和剂量的方法通常由主治医师根据具体情况而确定。这种确定方法是本领域中很常规的一种技能(见如，Harrison’s Principles of Internal Medicine(1998)，Anthony Fauci et al.主编，第14版，McGraw Hill出版)。
重要的是，在本发明范围内的一种方法能改善患者机能。“改善患者机能”可以定义为，通过如减轻的疼痛、卧床时间减少、离床活动增加、健康的态度、更多样化的生活方式和/或由于正常肌肉健康状况使得康复的诸因素测得的一种改善。改善患者机能就是有一个改善的生活质量(QOL)。QQL可用如已知的SF-12或SF-36健康调查评分步骤进行评估。SF-36评估一个患者在躯体功能、由于生理问题的角色限制、社会功能、躯体疼痛、整体心理健康、由于情绪问题的角色限制，活力状况和总体健康感八个方面的生理和心理健康状况。得到的评分可与普通人和患者人群的公布值进行比较。
实施例以下非限制性实施例为本领域技术人员提供了治疗本发明范围内的疾病的特别优选的方法，并没有限制本发明范围的意思。在以下的实施例中，可施行一种梭菌神经毒素的多种方式非全身给药。例如通过肌肉注射、皮下注射或控释植入物的埋植。
实施例1用于头痛和药物过度使用性头痛病症治疗的A型肉毒毒素研究摘要施行包括抱怨头痛和频繁服用急性疼痛药物如麻醉药和曲坦类药物，来控制疼痛的患者的临床研究。这些患者中一些被诊断为药物过度使用性头痛(MOH)病症。在临床研究期间的0天、90天、180天三次给予研究中的患者一种肉毒毒素(BOTOX)。BOTOX注射是在三段注射时期的每个时期，对每位患者进行平均20次不连续注射进行肌内给药。BOTOX给药至最高达七个不同的肌肉(即总20次注入7块肌肉)。
在三个疗程的每个疗程给予每位患者从105到260单位的BOTOX。发现患者在(a)这些患者经历的头痛次数(图1)，和；(b)这些患者急性头痛药物的每天使用情况(图2)，这两方面均有减少。特别发现(图3)肉毒毒素能用来减少这些患者使用麻醉性疼痛药物。
此外，发现在过度使用疼痛缓解药物的患者中使用肉毒毒素使得他们在用肉毒毒素治疗后这些药物的使用显著减少(见图4)。还发现在过度使用性患者中曲坦类药物的摄入显著减少(图5)。因此，这个临床研究出人意料地表明了肉毒毒素能用来治疗药物过度使用性头痛病症(MOH)。
如上所述，施行的研究表明肉毒毒素对治疗药物过度使用性患者(以下称MOU，意思是药物过度使用性患者)的头痛是有效的。重申并如图6所示，使用肉毒毒素使得基线时(即研究开始)的过度使用药物的群体头痛次数显著降低。
研究还表明(见图7)肉毒毒素在无论任何药物过度使用性情况下，不同时进行头痛预防性治疗(即BOTOX单一疗法)的患者中更有效。
此外，同样的研究表明(见图8和9)，肉毒毒素对不同时进行头痛预防性治疗(“没有预防”)(即一种肉毒毒素(即BOTOX单一疗法))并且过度使用药物的患者(即“MOU”患者)更有效。与用肉毒毒素单一疗法治疗患者或者用其它头痛预防药物措施治疗他或她头痛的事实无关，肉毒毒素都能用来治疗过度使用急性药物的患者的头痛，这是对我们的发现的一个补充发现。
而且，关于患者急性药物使用(不是过度使用，而是任何使用)，研究表明用肉毒毒素治疗头痛使得这些患者的麻醉药物的使用显著减少(见如图10中210天)。
最后，研究还明显显示(见图11和12)用肉毒毒素(如BOTOX)治疗后，与未过度使用曲坦类药物的患者相比，基线时(即研究开始时)过度使用曲坦类头痛药物的患者的头痛频率以及需要急性镇痛药物的天数大幅降低。这表示曲坦类药物在与肉毒毒素联合应用治疗头痛时更有效。因此通过用曲坦类药物和肉毒毒素同时治疗头痛，来施行一种增加曲坦类药物治疗头痛有效性的方法。
众所周知，曲坦类药物不能预防头痛的发生。取而代之的是，它们仅作用于治疗与患者所经受的头痛相关的疼痛。见如Gladstone JP.，etal.，Newer formulations of the triptansadvances in migrainemanagement，Drugs.2003；63(21)2285-305.临床上，与由于正常使用曲坦类药物使得头痛缓解相反，曲坦类药物过度使用似乎事实上引起或加剧头痛。见如Relja G.，et al.，Headache induced by chronicsubstance useanalysis of medication overused and minimum doserequired to induce headache，Headache.2004 Feb；44(2)148-53.所以，如图11和12所示，我们意外地发现，给予肉毒毒素有利于预防患有头痛、由于过度使用曲坦类药物而头痛更加频繁或加剧的患者人群的头痛。这个发现通过我们的研究结果和患者观察得以证实，它们表明，曲坦类药物MOU患者在肉毒毒素给药后，需要较少的曲坦类药物。
详细研究说明本实施研究是对于慢性头痛群体中预防性头痛治疗的一个多中心、双盲、随机、安慰剂对照、平行组的BOTOX(A型肉毒毒素纯化的神经毒素复合物)多重治疗研究。
术语缩写和定义AGN 191622肉毒毒素，A型纯化神经毒素复合物ANOVA 方差分析ANCOVA协方差分析ATC 解剖学-治疗学-化学药物词典(Anatomical-Therapeutic-Chemical drug thesaurus)基线期患者进入筛选期第一个30天周期(第-60天到第-30天)BOTOXBOTOX(A型肉毒毒素)纯化的神经毒素复合物bpm 每分钟心跳次数CDH 慢性每日头痛CFR 美国联邦法规(Code of Federal Regulations)CGRP 降钙素基因相关肽COSTART 不良反应术语库代码符号(Coding symbols for thesaurusof adverse reaction terms)CRF 病例报告表CSR 临床研究报告CTTH 慢性紧张型头痛FDA 美国食品药品管理局GCP 药品临床试验管理规范
GLP药品非临床研究质量管理规范HCG人绒毛膜促性腺素HIQ头痛影响调查表持续性半侧颅痛 罕见的，以连续但而波动的中重度单侧头痛为特征的吲哚(Hemicrania美辛反应性头痛症continua)HPSQOL 头痛特异性生活质量调查表(Headache Pain SpecificQuality of Life Questionnaire)ICHD 国际头痛疾病分类IEC独立伦理委员会IHS国际头痛学会IVRS 交互式语音应答系统(Interactive Voice Response System)IRB机构审查委员会(Institutional Review Board)LD50半数致死量MIDAS 偏头痛致残评估(Migraine Disability Assessment)Month 30天周期MS-QOL 偏头痛特异性生活质量测评(Migraine-SpecificMeasure of Quality of Life)NA 未获得；不适用新症每日持续性头 无CTTH或偏头痛史的不断持续的头痛的急性发作痛(New dailypersistentheadache)NOS不作另外指定说明(Not otherwise specified)NSAIDs 非甾体抗炎药QOL生活质量RBC血红细胞安慰剂导入期 当所有患者接受安慰剂治疗，第-30天到第-1天(Run-in period)SD 标准差SGOT 清谷草转氨酶SGPT 清谷丙转氨酶转换性偏头痛 从阵发性偏头痛演变而来的慢性每日性头痛(Transformedmigraine)治疗1 接受安慰剂注射并进入安慰剂导入期的患者的访视时间，也叫第-30天(访视2)
治疗2患者随机接受BOTOX或安慰剂的访视时间，也叫第0天(访视3)治疗3患者接受第二次BOTOX治疗或第三次安慰剂治疗的访视时间，也叫第90天(访视6)治疗4患者接受的第三次BOTOX治疗或第四次安慰剂治疗的访视时间，也叫第180天(访视9)U单位(1U相当于计算的小鼠腹膜内半数致死量[LD50])WBC 血白细胞WHO 世界卫生组织引用参考文献如下Aoki KR. Evidence for antinociceptive activity of botulinum toxin type A in painmanagement.Headache 2003；43 Suppl 1S9-15.
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这是研究者在美国13个地点的一个多中心研究。头痛可能在临床实践中是最普遍的神经学症状(Castillo et al，1999)。在美国一年内，人群多数将患有头痛，并且超过5％的将寻求医疗救助(Silberstein andSilberstein，1990)。头痛可以是阵发性的(每月少于或等于15天头痛)或者是慢性的(每月多于15天头痛)(Silberstein and Lipton，2001)。反复头痛是慢性原发头痛症的症状。
慢性每日性头痛(CDH)是一种影响4％到5％的普通人群的异质性病症(Castillo et al，1999；Scher et al，1998；Wang et al 2000)。慢性每日性头痛是在头痛专门诊所里见到的最普遍的头痛(Silberstein et al，1994)。即使不包括在国际头痛学会(IHS)的分类中(国际头痛学会头痛分类小组委员会，1998，2004修订)，CDH的概念也得到了很好的认识(Silberstein and Lipton，2000)。一些研究者建议修订IHS分类以包括一个确定的CDH实体(Manzoni et al，1995；Silberstein et al，1994)。
多于90％的CDH患者开始报告阵发性头痛(Silberstein and Lipton，2000)。阵发性偏头痛发展为慢性每日性头痛的患者被叙述为患有“转换性偏头痛”(Silberstein et al，1994)。Mathew et al(1987)报告，患有从最初阵发性偏头痛演化的CDH的病人，在异常的个性、增高的抑郁评分、可识别的压力、药物过度使用以及高紧张性方面与只患有阵发性头痛的病人不同。患有CDH的多数病人报告他们的角色功能和健康状态频繁严重受损(Holroyd et al，2000)，突出了这类头痛在生活质量的重要性(Monzon and Lainez，1998；Wang et al，2001)。极少的研究评价了CDH患者的头痛预防性治疗(Saper et al，2002；Slivestriniet al，2003；Spira et al，2003)。迄今为止，还没有一种用于CDH患者偏头痛预防的药物得到管理部门的批准。在这个虚弱的患者群体中显示出未满足的医疗需求。
报告说BOTOX疗法缓解伴有或不伴有肌肉过收缩的与多种疾病有关的疼痛(Aoki，2001)。这包括颈部张力失常(Brin et al，1987)、痉挛(Wissel et al，2000)、紧张相关头痛(Smuts et al，1999)、慢性颈部扭伤相关的颈部疼痛(Freund和Schwartz，2002)，肌筋膜疼痛(Cheshire et al，1994)、偏头痛预防(Blumenfeld et al，2004)和背部疼痛(Foster et al，2001)。已知此毒素抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌接头处的释放，由此抑制横纹肌收缩。在多数研究BOTOX的疼痛综合征中，抑制肌肉痉挛是其活性的一个重要组成部分。然而，疼痛的减少常常发生在肌肉收缩减轻之前，显示BOTOX具有比最初的假设更复杂的作用机制(Aoki，2003)。发表的资料提出BOTOX减轻疼痛的作用独立于其神经肌肉活性。BOTOX显示出对感觉神经的外周(直接的)和中枢(间接的)都有作用。BOTOX对神经递质如谷氨酸(cui et al，2004)、CGRP(降钙素基因相关肽)(Purkiss et al，2000；Welch et al，2000)和P物质(Durham et al，2004)的抑制支持其介导外周抗疼痛活性的假设。用福尔马林激发的大鼠模型研究即刻早期基因c-fos的刺激的研究，证实其间接减轻中枢致敏的作用。在这些研究中，c-fos基因的活化和其蛋白质产物Fos.的表达，表明了对刺激的快速神经放电反应。BOTOX疗法以剂量依赖性福尔马林激发后，减少Fos的表达，证实其在减轻疼痛的间接中枢作用(Cui et al，2004)。
此研究的目的是评价作为慢性头痛的人群中头痛的预防性疗法的BOTOX多重治疗与安慰剂相比的安全性和有效性。
这是一个多中心、双盲、随机、安慰剂对照、平行组，与安慰剂治疗相比的慢性每日性头痛患者BOTOX多重治疗临床研究。研究对于每位患者的总持续时间是11个月。在第-60天时筛选患者(基线期)。在这段时间内，用电子电话日志每天收集关于患者头痛发作的详细特征和头痛药物使用情况的数据，共收集30天。基线期后，患者在第-30天返回，进入安慰剂导入期(治疗1)。在这次访视中，达到选入或排除标准的患者单盲注射安慰剂，再次用电子日志记录他们30天头痛发作的详细特征。治疗1的注射取决于疼痛的位置和严重程度，最少在6个肌肉区域，以及在表9.4.1和图9.4.1中详细说明的这些区域的23到58个注射位点(见9.4.1部分)。如果患者在咬肌经受疼痛，研究者还可选择注射至该肌肉。
30天后(在第0天)，患者返回进行随机治疗2。随机选择之前，在所有患者使用安慰剂期间用日志收集的信息，若他们有＜16头痛天数或头痛天数频率相对基线的减少≥30％，将患者归为安慰剂反应者。其它所有患者被认为是安慰剂无反应者。每组的患者(反应者和无反应者)在第0天时被随机接受BOTOX或者安慰剂。
患者在第90天(治疗3)和第180天(治疗4)接受额外治疗。患者在每次治疗后以30天的时间间隔返回进行随访，直至第270天。如果一名患者在第270天(出口)前的任一次访视时退出研究，所有的退出手续和评价在那次访视中完成。对于治疗2、3和4，患者在与治疗1中相同的肌肉区域和位点被注入相同剂量和体积的BOTOX或安慰剂。研究访视和测量安排如表2所示。
研究设计包括良好对照的临床试验的识别要素，临床试验对无偏性的疗效评价是必要的。研究是随机双盲的，以减少研究者和患者的偏好。研究药物的药瓶在外观上相似，并且需要每个研究中心的没有涉及其它研究的个人配制研究药物和填装注射用的注射器，由此保证盲法。安慰剂对照和平行组设计，消除了在其它研究设计中固有的混淆作用的可能性。此研究设计与国际头痛学会(IHS)为偏头痛预防疗法中的研究建议总体上一致(IHS偏头痛临床试验委员会，1991)。
为评估BOTOX在成人慢性每日性头痛群体的头痛预防中的潜在益处实施本研究。慢性每日或慢性几乎每日性头痛的术语用来指非常频繁的头痛(即一个月16天或以上头痛)，与结构性或全身性疾病无关(Silberstein and Lipton，2001)。进入当前研究的主要条件是有每月≥16天头痛史以及在基线期电子日志证实的原发性头痛。头痛症可包括阵发性/慢性紧张型头痛，有/没有先兆的偏头痛，和/或偏头痛(按IHS标准定义[IHS头痛分类小组委员会，1988，2004修订]，和/或由Silberstein and Lipton，2001定义的慢性每日性头痛)的任意混合。
与用于先前阵发性偏头痛人群临床研究的固定位点/固定剂量的治疗方法截然不同，参与本研究的医师允许使用一种依患者头痛位置而定的更个人化或针对患者制定的治疗方法。具体地说，医师在试验方案指定范围内，有机会决定头和颈部指定的前部和后部肌肉区域给药的注射位点数目和剂量，这些区域的注射位点和剂量的确定依患者头痛的位置和严重性而定。因为增加了更大的、后颅骨膜和颈部肌肉的注射，本研究允许的最大剂量水平也高于先前研究所用剂量。
由于在先前的研究中所见的安慰剂高反应率，本研究中实行全部患者接受安慰剂治疗阶段，将患者分为两个组(安慰剂反应者和安慰剂无反应者)。在全部患者接受安慰剂治疗期间，患者不被告知他们是否被注入BOTOX或安慰剂。而且，因为基于临床医师的临床经验，需要多重治疗来证明这种治疗的益处，研究试验方案经修订后包括3个双盲治疗周期。像痉挛和眉间皱等的其他疾病的治疗显示在重复注射BOTOX患者上的益处增加。此外，预计在一段时间和多重治疗后安慰剂反应将稳定或减小。
疗效标准如下。对于主要参数，认为BOTOX和安慰剂之间在第180天每个月无头痛日的频率相对基线的平均变化，3个无头痛日的差异是临床显著的。
整个研究中，任何可能的时候都由相同的研究者进行注射和评价。如果对既定的患者不能用相同的研究者，那么在研究者之间注射和评价将随时可能重叠至少一次访视。
本研究的临床假设是，通过每个月无头痛日频率相对基线的变化的组间不同测量得到，BOTOX比安慰剂更有效，并且BOTOX具有可取的安全性。
在本研究中数据库封闭后作了几种补充的分析以进一步了解和评价BOTOX的疗效。这些分析许多是基于头痛分类的更新信息和对在国际头痛疾病分类(ICHD)(IHS头痛分类小组委员会，2004)中规定的头痛患者同时给药的更好理解/定义。
本研究中招募的所有患者至少达到以下包含标准·男性或女性，年龄在18到65岁·每月≥16天头痛原发性头痛史，并在基线期由日志证实，可以包括有先兆或无先兆的偏头痛、阵发性/慢性紧张型头痛、和/或偏头痛(由IHS 1988定义的标准)(IHS头痛分类小组委员会，1988)的任意组合·愿意且能给出书面知情同意书·稳定的身体状况·稳定的长期药物治疗，包括刚在第-60天之前至少3个月非急性、预防性偏头痛用药·愿意且能够在研究过程中维持当前药物·愿意且能够完成整个研究过程且遵守研究指令，包括日志电话系统本研究中包含的患者，因他们的诊断达到IHS(HIS头痛分类委员会，1988)提出的头痛定义，并且他们的基线头痛特征足以检测到接下来的治疗的变化，而适于研究目的。
除了枕肌的剂量是固定，注入每个肌肉区域的剂量范围单位是规定的。在每个指定的肌肉区域(6到7个肌肉区域)内的注射位点的数目(注射位点的总数在23到58)和注射剂量(105U到260U)由医师根据疼痛分布的形式和疼痛在特定肌肉区域的严重性确定。患者至少注射6个肌肉区域，包括额/眉间肌、枕肌、颞肌、半棘肌、头夹肌和斜方肌，见表1和图13说明。咬肌是任意选择的。患者在治疗1、2、3和4中在同一肌肉区域位点注射相同剂量。
表1研究药物剂量和注射位点
注患者在指定肌肉注射由研究者确定剂量的BOTOX或安慰剂。
a随机分到安慰剂组的患者接受0U的BOTOX每瓶BOTOX(Allergan，Irvine，California)含有不含防腐剂的灭菌真空干燥的100单位A型肉毒梭菌毒素、0.5mg白蛋白(人)和0.9mg氯化钠。1U相当于计算所得小鼠腹膜内半数致死量(LD50)。每瓶安慰剂含有不含防腐剂的灭菌真空干燥的0.9mg氯化钠。
药瓶在使用前贮存于-20℃和-5℃间的冷柜。试验方案提供用稀释剂即0.9％灭菌盐水(不含防腐剂)注射液重配的说明。每瓶BOTOX或安慰剂用2.0mL盐水重配，使得浓度为50U/mL。没有涉及其它研究的个人重新配制研究药物并填装注射器。不立即使用的重配的研究药物存放于冰箱(2℃到8℃)不超过4个小时。
在第-60天时，每位患者给定一个筛选数字用于电子日志和所有文件的患者识别直至第0天。在第0天，安慰剂导入期之后，若他们报告，基于在此期间收集的日志信息，＜16头痛日或头痛频率下降≥30％，患者被归为安慰剂反应者。所有其他患者归为安慰剂无反应者。用分组的随机化方法，患者在各组内(安慰剂无反应者或安慰剂反应者)随机接受治疗2(BOTOX或安慰剂)。第0天给定的患者编号由通过中心验证的交互语音应答系统(IVRS)随机给出。在以后的所有文件中使用这个编号。
随机的试验安排是通过使用Allergan开发验证的程序(SAS软件中的PLAN程序8.2版)产生的。患者以按4个组以1∶1的比例随机接受BOTOX或安慰剂。
随机化数字指定患者接受BOTOX(没有确定的剂量水平)或者安慰剂。尽管一名患者的总剂量只需2瓶，独立工作人员(不知道治疗性质的人)重新配制3瓶研究药物并将研究药物抽入注射器用于给药。
与以前研究所用的固定位点/固定剂量的治疗方法截然不同，在本研究中允许医师用更个人化或者针对病人的治疗方法。具体地说，是在每个指定肌肉区域(6到7个肌肉区域)内的注射位点的数目(23到58个注射位点)和注射剂量(总剂量105到260U)，由医师根据患者通常的疼痛分布形式和在特定肌肉区域的疼痛严重性来确定。所用的总剂量水平比以前研究所用剂量水平高，因为注射了更多单位并且增加了另外的肌肉(后颅骨膜肌、颈部肌肉斜方肌、半棘肌和头夹肌)。预计这种方法和临床实践中报道的方法更接近。在本研究中使用较高剂量的选择进一步支持了在治疗颈部张力失常中发现BOTOX剂量达360U是安全有效的这一早期研究结果。
随着本研究继续，从临床专家和文献报告(如Troost 2004)中收集的信息指出一个事实可能要花几个治疗周期才能观察到BOTOX的临床益处。由于这种考虑，试验设计方案修订后包括了总的3个治疗周期(安慰剂导入期后)，并且对于安慰剂无反应者，原先的终点改到第180天。到这些修订实施时，许多受试者在计划的第120天时间点已经退出最初研究。因此，招募扩大到能保证至少用于第180天分析的90名安慰剂未反应患者(每个治疗组45人)的范围。
基于从先前的2期研究获得的信息，认为每4个月的给药间隔可能太长。此外，对于其它的BOTOX的肌肉相关的适应症，表明3个月的治疗间隔是最佳的。因此在当前研究中，治疗周期缩短到每3个月。因为根据医师的临床经验，预计需要多重治疗来证明对此治疗的好处，所以包括了总的3个双盲治疗周期。在重复注射BOTOX的患者中观察到益处增加的痉挛和眉间皱研究支持这种假设。
安慰剂导入是单盲治疗，其间研究者而非患者知道所给的处理是安慰剂。从第0天开始，成为双盲研究，研究者和患者都不知道在第0天、90天和180天给哪种处理。为保持盲法，没有其它研究职责的个人重新配制研究药物并且填装注射器用于注射。盲法治疗还通过对研究的随机化组的大小不作描述进行保护。
如果对安全性和患者的正确治疗有必要，研究者可进行非盲法患者治疗分配，以确定患者接受并开始恰当的随访护理。
任意药物的并用(如处方或非处方药包括草药)以及服用这些药物的原因在患者的CRF上都有记录。此外，患者用于治疗他或她的头痛的药物从第-60天的7天前开始记录在合适的药物治疗CRF上。在研究期间，患者将使用电子电话日志报告任意为治疗头痛的药物并用。
采用共同疗法的患者要在研究中维持稳定的剂量和给药方案，特别是关于非急性，预防性偏头痛药物的使用。认为对患者福利有必要的药物，研究者可以慎重给予。所有药物的施予都在CRF中报告。
在研究过程中，患者不服用或接受氨基糖苷类抗生素、胆碱能拮抗剂、箭毒样试剂或者可能干扰神经肌肉功能的试剂。偶尔在研究者的慎重考虑下，使用肌松剂是允许的。然而，在进入研究前3个月内和/或研究期间，患者不可长期服用肌松剂。最后，除非是治疗需要，患者在研究过程中将不改变他们的长期使用药物。
以参与研究者的安全为根本考虑来决定应用禁止药/治疗。研究者对每位患者进行研究药物肌肉注射给药。
疗效测定疗效测定是由患者在研究期间用验证的使用电话语音交互应答(IVRS)的电子头痛日志的记录信息和源于CRF的患者对治疗的反应的全面评价而得的参数。电子日志贯穿于整个研究要每天完成。患者记录开始/停止头痛的时间、最大和平均头痛严重程度、头痛的位置和类型、对身体活动的影响、有无先兆、有无头痛伴随症状(恶心、呕吐、畏光/恐响)，和使用的头痛药物和剂量。
主要的疗效测定是在一个30天周期内无头痛日频率相对于基线的变化。主要确定疗效的访视是在第180天，此时作出反映之前30天周期的评价。疗效测定的基线定义为在筛选期第一个30天的无头痛日的频率。BOTOX和安慰剂之间在第180天时每30天无头痛日的频率相对基线的平均变化达3个无头痛日的差异，就被认为是临床显著的。
次要疗效测定是在第180天时每30天周期的头痛日频率相对基线下降50％或以上的患者比例。
其它疗效参数包括以下·每30天周期的头痛频率相对基线下降50％或以上的患者比例。
·任何严重程度的头痛频率(每30天周期)·任何严重程度的偏头痛频率(每30天周期)
·每30天周期的偏头痛频率相对基线下降50％或以上的患者比例。
·每30天周期的偏头痛相对基线下降2次或以上的患者比例。
·中重度偏头痛的频率(每30天周期)·相对基线对治疗应答的患者全面评价，如下-4＝非常显著地恶化(约100％或更大程度地恶化)-3＝显著恶化(约75％地恶化)-2＝中度恶化(约50％地恶化)-1＝轻度恶化(约25％地恶化)0＝无变化+1＝轻度改善(约25％地改善)+2＝中度改善(约50％地改善)+3＝显著改善(约75％地改善)+4＝征候和症状消失(约100％地改善)·每30天周期无偏头痛天数·最大和平均头痛严重程度(无、轻微、中度、严重)·在研究期间使用急性头痛药物的天数·在研究期间急性头痛药物使用(摄入)的次数其它参数包括以下方面治疗评估问卷调查问卷为从患者收集关于他们认为他们接受的治疗(BOTOX或安慰剂)的信息而设计。问卷在第90天(请患者指出他们认为他们在第-30天和第0天接受的是什么治疗)、第180天(请患者指出他们认为他们在第90天接受的是什么治疗)和在第270天或患者退出研究时(请患者指出他们认为他们在第-180天接受的是什么治疗)施行。
疼痛图表患者在基线和退出时完成疼痛图表，说明他们头痛开始和停止的肌肉区域。
兴痛计数回忆在第30天开始的每次访视时，患者报告他们认为他们在最近30天经历了多少次头痛。此信息在不能提供电子日志的情况下用来作为支持数据。
健康结果测定在询问患者的健康或疾病状况之前，以及在进行任何实验程序之前，将问卷交给患者，使其在尽可能安静的区域完成。指示患者完成时在每份问卷的最后一页提供的空白处签字并注明日期。研究点的工作人员检查问卷以保证完整性，并且如果有无意中遗留未完成的，要求患者完成任何没有回答的问题。
偏头痛致残评估(Migraine Disability Assessment)(MIDAS)MIDAS在第-60、90、180和270天发放。问卷收集之前3个月头痛对生产能力和活动能力的影响的信息。
头痛特异性生活质量问卷在第-60、0、90、180和270天发放问卷。这一系列问题原改编自医学结果信度患者评估问卷(Stewart et al，1992)。这些问题以前已用于偏头痛患者(指疼痛，不是特指偏头痛)以评估在4周时间内疼痛对患者的生活四个领域(即日常活动、精神健康、体格健康和工作)的干预程度(Solomon et al，1995)。这些问题按5个程度级别衡量(完全不、一点、中度、较大、非常)。
SF-36健康调查在第-60、0、90、180和270进行调查。SF-36是普通健康相关生活质量问卷，包括8个方面躯体功能、躯体角色、躯体疼痛、总体健康、活力状况、社会功能、情感角色和心理健康。SF-36可用上述方面或者2个简要级别(躯体组成级别和精神组成级别)进行报告。
头痛影响问卷(HIQ)HIQ3.0.1版本是为收集来自患者关于偏头痛可能怎样影响他们生活的各方面的信息而设计的。从2个方面收集资料资源利用患者报告由于偏头痛症状和治疗的资源利用频率(如看医生的频率，挂急诊的频率和住院的频率)。资源利用只在第-60天进行评估。
患者满意度患者对治疗的各个方面(即急性和预防性药物的综合疗效，对症状频率和严重性的治疗效果，避免和应付症状的能力，和治疗花费)按5个程度级别(很满意、有些满意、中立、有些不满意，很不满意)对满意度进行评价。在第-60、0、90、180和270天或退出时评价满意度。
原发性慢性每日性头痛评估在第180天时，研究者用判断慢性每日性头痛亚型的Silberstein诊断标准(Silberstein and Lipton，2001)，通过选择患者经受的4种原发性慢性每日性头痛(即转换性偏头痛、慢性紧张型头痛、新症每日持续性头痛、持续性半侧颅痛)中的1种，对患者作出主要诊断。
评估方案研究访视的频率和时间安排与测定方法在表2中列出。为确保在研究过程中患者的安全性和健康时有必要作额外检查。
表2评估方案
测定方法的适用性本研究中所用的疗效测定方法已用于其它头痛预防治疗(包括BOTOX)研究，并且认为将其用于CDH患者研究是合适的。通过不良事件、生命指征、和临床实验室测试评估安全性是2期研究中的标准实施应用。
主要疗效变量(Primary Efficacy Variable)主要终点是在第180天安慰剂无反应组一个30天周期内无头痛日频率相对基线变化。
统计分析用于作安全性和有效性分析的“作为被治疗”的群体包括在第0天作第二次注射的所有患者(随机化/治疗2)，而不管是否进行后续注射。根据第二次注射(即0天/治疗2)接受的治疗，分析随机化和治疗的患者以比较所有的参数。按由基线和安慰剂导入期指出的反应者/非反应者组分析患者，不考虑随机化时将他们分配在哪个组。
主要疗效变量是相对30天基线期(第-60天到第-31天)无头痛日频率的变化。每个30天周期无头痛日由电话电子日志记录的数据确定。日志记录的数据包括头痛开始的日期和时间和头痛终止的日期和时间，和以下的头痛特征一般的头痛(轻微、中度、严重)；最恶性的头痛(轻微，中度，严重)；头痛侧(单侧/双侧)；疼痛类型(搏动/抽动或者按压/挤压)；和躯体活动对疼痛的影响(恶化，不恶化)。它还包括头痛症状先兆(有或无)；影响活动(有或无)；和其它症状(恶心、呕吐、对光敏感[畏光]、对噪声敏感[恐响])。日志数据还包括因头痛服用急性药物(是/否)和药物的名称和剂量。
头痛发作通过在日志中记录头痛开始和/或停止的时间和/或头痛特征，头痛症状和/或因头痛服用药物确定。为了计算头痛持续时间，缺少的开始和/或停止时间按以下方法估算·如果记录了开始时间而没有对应的停止时间，停止时间设为第二天的6AM，沿用上一次记录中的头痛特征、头痛症状或头痛药物的使用。
·如果记录了停止时间而没有对应的开始时间，开始时间设为当天的6AM。如果停止时间在开始时间之前(即停止时间在6AM之前)，停止日期重设为开始日期后一天。
·如果既没有记录头痛开始时间也没有停止时间，根据前述的两个规则设定开始和停止时间。这样的头痛通过任意头痛特征、头痛症状或头痛药物使用记录来指明。
对于偏头痛，一个优先规则是如果对于两次相邻的偏头痛，在第一次头痛的停止时间和第二次头痛的开始时间之间少于24小时时，认为他们是一次连续性偏头痛。
头痛日的定义是在从当天开始的午夜(包括)到这一天结束的午夜(不包括)的24小时期间内头痛发作，并不与当天头痛发作的频率有关。与上面对于偏头痛的24小时规则无关，进行头痛日计数(以及因此，无头痛日)。
无头痛日定义为没有头痛的一天。如果一位持续的患者某天的日志数据缺失，在应用了上述的缺失头痛时间规则之后仍然缺失，这一天就假定是无头痛日。若患者进入一个30天周期研究，记录至少10天但少于30天的日志，就相应地按比例计算30天周期无头痛日的频率并凑成一个整数。例如，如果一患者的基线期是26天，无头痛日的频率就乘以30/26。如果在一个30天周期内患者延续记录的日志数据少于10天，该患者就不包括在这个30天周期内的简表里。如果在筛选访视和安慰剂导入注射间的基线期超过30天，那么基线期只包括前30天。同样的惯例适用于其它30天周期。
主要疗效变量是在一个30天周期内的无头痛日频率相对基线的变化。主要评价时间是在第180天。主要兴趣在于在无反应者组中BOTOX和安慰剂的比较。主要分析使用了“观察”数据，并按以上缺失头痛时间规则和按比例计算头痛日频率的规则修改。
基本无效假设是，按在第180天结束的30天周期无反应者组无头痛日的频率变化测得的结果，BOTOX治疗和安慰剂是等效的。双侧的备择假设是BOTOX和安慰剂不等效。类似的假设适用于其它疗效参数。
所有的假设检验是双侧的。对于在第90天的过渡分析，仅在p值＜0.005才声明主要变量具有统计学显著性。用O’Brien-Fleming成组序贯方法进行多重比较校正，设第180天的基本分析的显著性水平为0.048。在第270天的探索性最终分析不作多重性校正。除了分组治疗的交互作用在0.10的水平进行检验外，所有其它假设检验用α＝0.05的I型错误决定统计学显著性。
对于无反应者组基线的无头痛日频率及其相对基线的变化，用Wilcoxon秩和检验(Siegel，1956)作治疗组间的比较。如果在治疗组间主要变量中有显著的基线差异，在进行变量等级协同变量分析时，此变量的基线值还应包括为协同变量。
为证明多个临床点的混合数据合理，对主要疗效变量(每30天周期无头痛日频率相对基线的变化)的分析进行治疗-临床点交互作用影响检查。该分析使用方差分析(III型平方和)进行，将反应看作临床点、治疗和它们的相互作用的函数。在这种分析中，如果反应者组或无反应者组的最后30天周期的分析(第90、180或270天)中少于6名患者，就将临床位点集中(作为一个伪中心)。不管集中后中心大小如何，将所有的小中心集中。然而，在一些研究者探索性的附表中，将小中心从分析中排除。
对年龄、性别、种族、自疾病始发的时间、慢性每日性头痛亚型、基线经行头痛(menstrual beadache)、基线MIDAS总天数评分、基线预防性治疗、基线β阻断剂的使用、基线钙通道阻断剂的使用、基线抗惊厥剂的使用和基线抗抑郁剂的使用进行相似的分析，评价治疗-亚组相互作用。
反应者组的治疗组比较是分析的次要目的。补充分析包括对组间混合数据，以及伴有和不伴有头痛预防性治疗的混合数据进行分析。
次要终点包括在每个组，从基线到其它时间点(第30、60、90、120、150、210、240和270天)的每30天周期的无头痛日频率的变化。用来分析这些其它时间点的统计学方法和主要时间点相同。
除了“观察病例”分析，用缺失值的推算数据进行补充分析。关于怎样推算缺失数据的详细方法包括在分析计划的5.3.1部分(附录16.1.9)。
对与每次访视相关的每30天周期日志，总结1个次要疗效变量即在第180天安慰剂无反应者组每30天周期头痛日相对基线下降50％或以上的患者比例。该参数用观察数据以Pearson′s χ2检验进行分析。对于此次要疗效参数，像对主要疗效变量一样，用缺失值的推算数据作补充分析。在反应者组的治疗组间比较是分析的次要目的。补充分析包括对组间合并的数据，以及治疗相互作用(包括伴有和不伴有头痛预防性治疗)的亚组间合并的数据进行分析。
对每个30天周期总结其它连续的试验计划特定的疗效参数，包括以下方面任何严重程度的头痛频率、任何严重程度的偏头痛频率、中度到重度(按“最严重的”头痛而不是“一般的”头痛严重性确定的)偏头痛频率、最恶劣的头痛严重性(轻微、中度严重)、一般的头痛严重性(轻微、中度严重)，无偏头痛的天数、使用急性头痛镇痛药物的天数，和患者对治疗应答的全面评价。连续参数对基线的变化的分析同对普通参数描述的分析。
对每30天周期的以下试验计划特定的疗效参数也进行分析头痛相对基线下降50％或以上的患者比例、偏头痛相对基线下降50％或以上的患者比例、和偏头痛相对基线下降2次或以上的患者比例。如同对头痛频率相对基线下降至少50％中的分析，对头痛次数、头痛日，偏头痛次数和中重度偏头痛次数下降30％、40％、60％、70％、80％、90％和100％进行独立分析。
此外，分析头痛日频率相对基线持续下降50％的患者比例。在一个治疗周期内，如果患者在此循环的2个连续的30天周期内至少下降50％，则认为该患者是持续反应者。在研究中的持续下降，意味着在每个随机化后治疗周期内有一个持续的下降。
患者比例的分析同名义参数所述。
对无头痛日频率、头痛日、头痛频率、偏头痛日、偏头痛频率、偏头痛或可能偏头痛日、偏头痛或可能偏头痛频率、头痛日(非预防组)、基线预防组的头痛频率、偏头痛或可能偏头痛日(非预防组)、偏头痛或可能偏头痛的频率(非预防组)、使用急性镇痛头痛药物天数(非预防组)以及使用急性镇痛头痛药物(非预防组)作评价治疗-亚组相互作用的分析。另外的结果分析按下述内容进行。
为检测相对基线平均变化3.0或以上无头痛日治疗间的不同，在安慰剂无反应组每个治疗需要大约45例患者。这个估计假设了一般双侧α＝0.05错误水平和80％的范围。还考虑到了无头痛日的5个单位的标准差。用nQuery Advisor软件(Elashoff，2000)计算。
在7到15个研究点筛选大约494例患者，以达到在安慰剂无反应组将接受第三次治疗(第180天)的最少90例患者(每组45例患者)。在这494例患者中，据估计大约40％将从第-60到0天中途退出，15％将在第0天和90天间中途退出。第90天和180天间的中途退出率也预计达到15％。依据这些中途退出率，据估计在第-60天进行筛选的494例患者将有296例在研究的第0天留下来，在第90天有252例，在第180天有129例。在第180天留下来的患者中，预计90例将是安慰剂无反应者，每个治疗组45例。在第180天余下的39例预计是安慰剂反应者。
在第-60到-30天的基线期筛选和评价的571例患者中，355例在第0天录入/随机化。在安慰剂导入期结束时(0天)，279例患者被分为安慰剂无反应者和76例安慰剂反应者。继而，患者在每个组内(安慰剂无反应者和安慰剂反应者)随机化接受BOTOX或者安慰剂治疗。在安慰剂无反应者组内，134例患者接受BOTOX和145例患者接受安慰剂。在安慰剂反应者组内，39例患者接受BOTOX和37例患者接受安慰剂。患者总数的76.9％(273/355)完成研究，包括132例完成仅需要一个随机化后治疗的最初试验计划的患者。早期中断的患者中(22.8％[81/355])5.1％(18/355)因为缺乏有效性，1.4％(5/355)因为不良反应，0.3％(1/355)因为不能遵循研究指令，1.1％(4/355)因为私人原因，2.8％(10/355)因为无法随访。
用“作为被治疗的”群体作所有的安全性和有效性分析，该群体由所有在第0天接受治疗(治疗2)的患者组成。根据实际接受的治疗(第0天)，而不是他们随机化接受的治疗来分析患者。“作为被治疗的”的群体包括所有355例随机化的患者。
从人口统计特征来看，治疗组间没有显著性差异。总地来说，患者年龄在19到65岁(平均43.5岁)，84.5％(300/355)为女性，以及87.9％(312/355)为白种人。
从基线特征来看，治疗组间没有显著性差异(表3)。距离最初慢性每日性头痛发病的平均时间为14.5年，疾病始发的平均年龄为28.4岁。MIDAS基线平均分为57.6(说明严重致残)和抑郁自评量表评分为7.8(说明没有临床抑郁)。研究者划分的头痛诊断亚型对于大约一半的患者没有记录，因为这是从整个研究中间开始的试验计划修订的一部分。在那些记录的患者中，多数常见的亚型是转换性偏头痛。基于电话资料，35.8％(127/355)的患者使用头痛预防性治疗。没有患者报告主要是月经相关的头痛。
表3基线特征(作为被治疗的群体)
SD＝标准差，NA＝不适用，MIDAS＝偏头痛致残评估aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较的P值bPearson’s X2检验或Fisher’s精确检验进行处理组间比较的P值如基线时患者所报告的，头部疼痛历来开始和停止的最常见的部位如表4所示。
表4基线期报告的头痛历来开始和停止的部位(患者数(％))
除了头痛，基线时访视记录对于所有患者最常见的医疗史发现是偏头痛(61.4％[218/355])，、妇科病症(女性的58.7％[176/300])、肌肉骨骼疾患(44.8％[159/355])、精神障碍(43.9％[156/355])、胃肠道病症(34.1％[121/355])、耳鼻喉疾患(33.5％[119/355])、过敏(31.8％[113/355])、和药物敏感(23.7％[84/355])(表14.1-4.1)。治疗组间的医疗史没有统计学显著性差异。
在基线访视时报告用BOTOX治疗的患者的32.4％(56/173)和用安慰剂治疗的39.0％(71/182)在进入研究前使用预防性头痛药物(表14.1-3.4)。在用BOTOX治疗的患者52.6％(91/173)和用安慰剂治疗的42.3％(77/182)中见到急性镇痛药物的过度使用(每30天周期≥15天和≥2天/周)(表14.2-76.3)。处理组间没有统计学显著性差异。
试验计划规定了在相关主要时间点(第180天)和组(安慰剂无反应者)的每30天周期内头痛日相对基线降低50％或以上的患者数作为次要疗效参数。对一些其它的试验计划指定的疗效参数进行检查，以确定哪个患者人群对用BOTOX的治疗最有应答性和哪个(些)疗效参数最好地证明了BOTOX比安慰剂更好的疗效(每30天周期总结一次)。
次要终点每30天周期头痛日相对基线下降50％或以上。
在安慰剂无反应组，每30天周期的头痛日频率相对基线至少下降50％的百分比，在180天BOTOX显著要高于(p＝0.027)安慰剂患者(32.7％对15.0％)。
其它次要和探索性分析在每30天周期头痛频率的分析中，观察到在30、60、150、180、210、240天安慰剂无反应者和180天安慰剂反应者的每30天周期的头痛频率变化具有统计学显著性变化(表5)。图14显示安慰剂反应者和安慰剂无反应者每30天头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化。
表5安慰剂反应者和安慰剂无反应者每30天头痛频率的基线平均值和相对基线平均变化(标准差)
来源表14.2-12.3和14.2-12.4。
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较。
在其它试验计划指定的疗效参数分析中，安慰剂无反应者和安慰剂反应者组中BOTOX和安慰剂间具有统计学显著性差异。此外，确定分组患者持续地对BOTOX比对安慰剂有更好的应答性。
作为鉴定对治疗有持续应答性患者过程的一部分，为确定治疗的显著相互作用效应和各种患者基线特征而进行分析。将安慰剂无反应者和安慰剂反应者组混合，分析混合后的资料以比较BOTOX和安慰剂(混合群体)。在以下部分，所示的分析仅针对混合群体。
头痛频率，混合群体在多个时间点(30、60、150、180、210和240天)观察到每30天周期头痛频率具有统计学显著性变化(表6)。图15显示每30天的头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化。
头痛频率的分析表明BOTOX和安慰剂间具有统计学显著性差异，BOTOX更好。
表6每30天的头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化(标准差)；混合群体
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较。
如表6和图15所示，第一次治疗组间每30天周期头痛频率具有统计学显著性差异的时间是在安慰剂导入后的第一次治疗后的30天。在此时间点BOTOX和安慰剂间有显著性差异(p＝0.021)，表明作用迅速开始。相对基线的平均变化为BOTOX-4.1和安慰剂-2.7。
在第180和210天，BOTOX比安慰剂每30天头痛频率相对基线下降至少50％的患者百分比显著更大(表7)。在BOTOX组中，至少50％患者在第120天后的所有时间点，每个30天周期头痛频率相对基线至少下降50％。
表7每个30天周期头痛相对基线下降50％或以上的患者数(百分比)；混合群体
aPerson’s X2检验或Fisher’s精确检验进行处理组间比较b有应答的患者数/在时间周期评价的患者数(百分比)BOT0X，在第30天(47.7％对37.4％；p＝0.050)、60天(53.0％对41.0％；p＝0.028)、180天(73.6％对55.7％；p＝0.022)和210天(72.9％对51.9％；p＝0.009表14.2-15.3)，每30天的头痛频率相对基线下降至少30％的患者百分比比安慰剂显著更大。在BOTOX组中，至少有70％的患者在第120天后的所有时间点，每30天头痛频率相对基线下降至少30％。
表8显示在安慰剂导入期后完成治疗2和3周期的患者每30天头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化。完成治疗3周期的138例患者(69例BOTOX，69例安慰剂)对治疗有持续反应。270天治疗期后，对用BOTOX治疗的应答一般继续改善，而对用安慰剂治疗的应答保持相对稳定。
表8在安慰剂导入期后完成第2或3次注射周期的患者每30天头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化(标准差)
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较表9显示每30天周期持续≥4小时和＜4小时头痛次数基线平均值和相对基线的平均变化。270天治疗周期后，每次回访，BOTOX≥4小时持续头痛的头痛数相对基线的变化比安慰剂显著更大(p≤0.044；表14.5-325)。在任何一次回访中，对于＜4小时的持续头痛，组间未见显著性差异。
表9每30天周期≥4小时和＜4小时持续头痛的头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较由此分析发现在基线时不使用预防性头痛药物患者的亚群亚组，在每30天头痛频率分析中的大多时间点，BOTOX与安慰剂相比，统计学显著性具有更强的区分性和保持性(separation and preservation)。在此亚群亚组中，BOTOX和安慰剂间临床上有意义的差异的其它疗效参数包括·每30天周期头痛频率相对基线减少50％·每30天周期头痛频率相对基线减少30％·每30天周期偏头痛或可能偏头痛的频率·每30天周期急性镇痛性头痛药物使用天数和次数在基线时，不使用预防性头痛药物患者的亚群亚组包括67.6％(117/173)随机化并用BOTOX治疗的患者和61.0％(111/182)随机化并用安慰剂治疗的患者。在基线时使用或不使用预防性头痛药物的BOTOX和安慰剂患者的人口统计学特征在表10中给出。对于患者的两个亚组，除了不用预防性头痛药物患者的亚组的性别外(p＝0.025)，关于他们的基线特征，2个治疗组间没有统计学显著性差异。在基线时不使用预防性头痛药物的患者与使用预防性头痛药物的患者相比更年轻(平均年龄，42.4对45.6；p＝.010)，慢性每日性头痛开始发作的年龄更早(平均年龄，26.9对31.1岁；p＝0.005)，抑郁自评量表评分更低(平均分，7.1对9.0；p＝0.004)，并且就其它基线参数而言具有相似性。
表10基线时使用或不使用预防性头痛药物的患者的基线特征；混合群体
SD＝标准差，NA＝不适用，NC＝未计算aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较的p值bPearson’s X2检验或者Fisher’s精确检验进行处理组间比较的p值基线时使用和不使用预防性头痛药物患者头痛频率对于在基线时使用和不使用预防性头痛药物的患者群体，每30天周期头痛日频率的平均基线和从基线到各评估时间点平均变化在表11和图16中显示。在基线时所用预防性头痛药物的类型包括β阻断剂、钙通道阻断剂，抗惊厥剂，和抗抑郁剂(不包括5-羟色胺吸收抑制剂[如Prosac]，因为没有证据表明这类药物在头痛中的任何作用)。
对于基线时使用预防性头痛药物的患者，BOTOX在第120天至第270天期间每30天头痛频率相对基线的平均变化比安慰剂大1.0至2.7次。仅在第180天相对基线的变化具有统计学显著性差异。对于在基线时不使用预防性头痛药物的患者，BOTOX相对基线的平均变化比安慰剂大2.2至4.2次。治疗组间的差异在所有时间点具有统计显著性(p≤0.032)或者接近统计显著性(p≤0.072)。
表11在基线时使用预防性头痛药物，每30天周期头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化(标准差)；混合群体
aWilcoxon秩和检验进行处理间比较与在基线时使用预防性头痛药物的患者相比，在基线时不使用预防性头痛药物的患者相对于基线的平均变化，一般BOTOX治疗的患者较大，安慰剂治疗的患者较小。
通过在基线时使用预防性头痛药物的类型的分析对基线使用β阻断剂、钙通道阻断剂、抗惊厥剂和抗抑郁剂的每30天周期的头痛频率进行分析。
在基线期使用β阻断剂或钙通道阻断剂的患者，在任何时间点的每30天周期头痛频率相对基线的平均变化，在两个治疗组间没有统计学显著性差异。在基线期，37例患者(16例BOTOX，21例安慰剂)使用β阻断剂，27例患者(9例BOTOX，18例安慰剂)使用钙通道阻断剂。在基线时不使用β阻断剂的患者和在基线时不使用钙通道阻断剂的患者的分析，显示在多个时间点治疗组间具有统计学显著性差异，差异水平与基线时不使用预防性头痛药物的较大组的水平相当(表11)。
对在基线时使用抗惊厥剂的患者(23例BOTOX，27例安慰剂)，在除第180天(p＝0.006)外的任何时间点，每30天周期相对基线的头痛频率的变化，两个治疗组间没有统计学显著性差异。从第120天到270天间，BOTOX每30天头痛次数的相对基线下降的平均值大2.2到4.9次。对于基线时不使用抗惊厥剂的患者，在第30、60、180和210天，BOTOX相对基线的变化显著更大(p≤0.026)。在这些时间点每30天头痛次数的平均变化，BOTOX大1.6到3.2次。
对于在基线时使用抗抑郁剂的患者(31例BOTOX，43例安慰剂)，除第210天(p＝0.048)外任意时间点的每30天周期头痛频率相对基线的变化，两治疗组间没有统计学显著性差异。从第120天到270天间，BOTOX每30天周期头痛次数相对基线下降平均值较大，为1.6到3.7次。对于在基线时没有使用抗抑郁剂的患者，从60天到270天，BOTOX每30天周期的头痛次数相对基线下降平均值大1.7到3.6次。BOTOX在第30、60和180天相对基线的变化显著较大(p≤0.020)。
在基线期使用和未使用头痛预防药物，以及同时和不同时进行头痛预防的患者每30天周期头痛次数相对基线下降50％或以上。
在基线时使用和未使用预防性头痛药物的患者，在每个评价时间点，每30天周期头痛频率相对基线至少下降50％的患者百分比(定义为应答者)在表12中给出。
对于基线时使用预防性头痛药物的患者而言，BOTOX和安慰剂间不具有统计学显著性差异。对于基线时未使用预防性头痛药物的患者而言，从第150天到270天间，BOTOX治疗的患者至少50％是应答者。在第150天和210天，BOTOX和安慰剂间有统计学显著性差异。在这些时间点，对BOTOX的应答率至少比安慰剂大20％。
表12在基线时使用预防性头痛药物，每30天周期头痛次数相对基线减少50％或以上的患者数目(百分比)；混合群体
aPerson’s X2检验或Fisher’s精确检验进行处理组间比较b有反应的患者数目/在时间周期评价的患者数目(百分比)在基线时使用和未使用预防性头痛药物的患者，每30天周期头痛相对基线30％或以上的减少表13中给出在基线时使用和未使用预防性头痛药物的患者在每个评价时间点，每30天周期头痛频率相对基线至少减少30％的患者百分比。
对于在基线时使用预防性头痛药物的患者，BOTOX和安慰剂间没有统计学显著性差异。对于基线时未使用预防性头痛药物的患者，从第30天到270天间，至少50％的BOTOX治疗的患者每30天周期头痛频率下降至少30％。在第30天、60天、150天、180天、210天时，BOTOX和安慰剂间具有统计学显著性差异。在这些时间点，对BOTOX的反应率较安慰剂高16.4到26.2％。
表13基线时使用预防性头痛药物每30天周期头痛相对基线下降30％的患者数目(百分比)；混合群体
aPerson’s X2检验或Fisher’s精确检验进行处理组间比较疾病始发的头痛频率(10到20，＞20年)表14给出自疾病始发10到20年和＞20年的患者每30天头痛频率的分析。患者在整个治疗过程中，对BOTOX的应答始终比对安慰剂好。对于疾病发病10到20年的患者，只在第180天具有统计学显著性差异；对于发病＞20年的患者，在30、60和210天具有统计学显著性差异。观察到＞20年的患者亚组对安慰剂的反应与10到20年的患者亚组相比非常且始终较低。
表14从疾病始发时间(10到20年以及＞20年)每30天周期头痛频率的平均基线和相对于基线的平均变化(标准差)；混合群体
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较通过基线头痛日频率分析的头痛频率(每30天周期20到24头痛日和25到30头痛日)通过基线时头痛日的频率，表15总结出每30天周期头痛频率的分析(20到24头痛日和25到30头痛日)。在整个治疗过程中，对BOTOX的应答始终比对安慰剂好，基线头痛日频率为20到24天的患者，在第60和180天具有统计学显著性差异，对于基线头痛日频率为25到30天的患者，在第30、60和180天具有统计学显著性差异。在每个时间点，对于基线时头痛日频率在25到30天的患者，BOTOX和安慰剂间的平均变化的差异较大。
表15基线时每30天头痛日频率为20到24和25到30天的患者每30天周期头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化(标准差)；混合群体
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较基线时过度使用急性镇痛性头痛药物的头痛频率药物过度使用定义为≥15天和≥2天/周使用任意急性镇痛药物。基于此定义，对于基线时没有过度使用急性镇痛药物的患者，任何时间点每30天周期头痛频率相对基线的变化，BOTOX和安慰剂间没有统计学显著性差异(表16)。对于基线时过度使用急性镇痛药物的患者，除了第90天外，BOTOX相对基线下降的程度比安慰剂显著更大。除第90天外，在所有时间点，BOTOX相对基线头痛下降的平均值大2.0到5.6次(表16)。
表16基线时过度使用急性镇痛头痛药物的患者(是或否)每30天周期头痛频率的基线平均值和相对基线的平均变化(标准差)；混合群体
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较通过基线MIDAS中重度评分分析头痛频率极少的患者的基线MIDAS评分很低(8例BOTOX，10例安慰剂)或较低(9例BOTOX，16例安慰剂)。对于基线MIDAS评分中等的患者(21例BOTOX，25例安慰剂)，在所有时间点BOTOX和安慰剂间没有统计学显著性差异。然而，第60天后，BOTOX每30天周期头痛次数相对基线的下降平均值大2.1到5.8次。对于基线MIDAS评分严重的患者(134例BOTOX，131例安慰剂)，BOTOX每30天周期头痛频率的下降，在第30、60、180、210和240天显著较大(p≤0.046)。在这些时间点，BOTOX每30天头痛次数下降的平均值大1.3到3.2次。
头痛的类型每种头痛划分为偏头痛(ICHD 1)或非偏头痛(ICHD 2；如紧张型头痛)。所有患者在基线期至少经受1种偏头痛，说明所有的患者可能实际诊断有偏头痛，即使研究者没有意识到所有患者的这个诊断。未诊断出偏头痛的患者是不正常的(Lipton and Stewart，1998)。在研究期间，患者同时经受偏头痛和非偏头痛。两个治疗组的多数头痛都归为偏头痛(每ICHD标准)。
偏头痛表17显示每30天周期偏头痛(ICHD 1.1or 1.2)或可能偏头痛(ICHD1.5.1)的频率的基线平均值和相对基线的平均变化。在所有时间点，BOTOX相对基线的下降比安慰剂大且在第120、180和210天显著更大(p≤0.048)。在这些时间点BOTOX相对基线头痛次数下降平均值多1.6到2.8次。
表17每30天周期偏头痛和可能偏头痛频率的基线平均值和相对基线变化的平均值(标准差)；混合群体
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较非偏头痛性头痛BOTOX和安慰剂组在基线每30天周期非偏头痛性头痛的平均频率分别为2.3和1.8。BOTOX和安慰剂间在除90天(p＝0.034)外的所有时间点，非偏头痛性头痛的频率相对基线变化没有统计学显著性差异(p≥0.065)。在安慰剂导入期后所有时间点，BOTOX非偏头痛性头痛相对基线的平均下降值比安慰剂大0.3到1.0次。在第90天，BOTOX的下降平均值为1.0，而安慰剂为0.2。
急性头痛药物的使用急性镇痛头痛药物的使用和过度使用在任意30天治疗周期内，两个治疗组间在任意急性头痛药物(如曲坦类、阿片类等)的使用上几乎没有统计学显著性差异。对于各个种类的药物，即麦角胺、曲坦类药物、单纯的镇痛药或止吐剂，两个治疗组间也没有统计学显著性差异。阿片类药物在第210天(11.4％[8/70]，BOTOX，24.7％[19/77]安慰剂；p＝0.038)联合疗法在第210天(34.3％[24/70]BOTOX，18.2％[14/77]安慰剂；p＝0.026)和240天(32.9％[23/70]BOTOX，18.3％[13/71]安慰剂；p＝0.048)在两个治疗组间有显著性差异。
急性药物过度使用定义为任意药物，单纯镇痛药和止吐药的使用≥15天/月和≥2/周，和≥每月10天和≥2/周使用曲坦类、麦角胺类、阿片类药物和急性药物联合使用。对于急性药物的过度使用，两组间对任意急性镇痛药物、麦角胺、曲坦类、阿片类药物，它们联合使用或止吐剂没有统计学显著性意义。使用单纯的镇痛药类，在第90天观察到两组间有统计学显著性差异(BOTOX患者10.1％[15/149]和安慰剂患者3.8％[6/157][p＝0.031])。
急性镇痛头痛药物的使用(天数和使用次数)BOTOX和安慰剂组间，在任意时间点，任意急性镇痛头痛药物的使用的天数或者使用急性镇痛头痛药物的次数，没有统计学显著性差异。两个治疗组在所有时间点，任意急性镇痛头痛药物的使用天数和任意急性镇痛头痛药物使用次数均有下降，BOTOX下降更多。
表18总结出在基线时过度使用和未过度使用急性镇痛头痛药物的患者的基线特征。在基线过度使用急性镇痛头痛药物的患者年龄显著更大(平均年龄，45与41.6岁；p＝0.001)，另外在基线时过度使用者和非过度使用急性镇痛头痛药物的患者的人口统计学特征间没有统计学显著性差异。
表18在基线时过度使用和未过度使用急性镇痛头痛药物的患者基线特征；混合群体
SD＝标准差a过度使用＝≥15天和≥2天/周的使用bWilcoxon秩和检验进行处理组间比较的P值cPearson’s X2检验或Fisher’s精确检验进行处理组间比较的P值两个治疗组间在所有时间点使用急性镇痛头痛药物次数或天数相对基线的变化没有统计学显著性差异。两个治疗组，使用次数和使用天数相对基线是下降的，并且在所有时间点BOTOX治疗患者比安慰剂治疗患者下降更多。
基线时未使用头痛预防药物的患者任意急性镇痛头痛药物的使用基线时未使用预防性头痛药物的患者每30天周期任意急性镇痛头痛药物的使用次数和这些药物使用的天数，分别在表19和图16中总结出。
在所有基线后时间点，BOTOX组急性镇痛头痛药物的使用次数与安慰剂组相比下降更多，并且在90和210天时有统计学显著性差异(p≤0.047)。这在急性镇痛头痛药物使用的平均天数的分析中同样观察到，在第90、180、210和240天，有统计学显著性差异(p≤0.033)。
表19基线时未使用预防性头痛药物的患者每30天周期急性镇痛头痛药物的使用次数和天数的基线时平均值和相对基线变化的平均值(标准差)；混合群体
aWilcoxon秩和检验进行处理组间比较该研究比较了BOTOX和安慰剂，没有活性对照。对BOTOX的使用剂量范围进行了规定(105到260U)，因此确切的使用剂量不固定。注射位点的数目和对于指定的前部和后部肌肉区域的给药剂量，依患者头痛的位置和严重性而定，所以要根据每位患者制定(在规定范围内)。由此不能评价剂量应答效应。在每个后续治疗中重复治疗1中给予的相同的剂量和注射。
总的来说，97.7％(347/355)的患者在研究中接受急性头痛药物，每个治疗组的比例相似BOTOX组98.3％(170/173)的患者和安慰剂组97.3％(177/182)的患者。
研究期间最常同时使用急性头痛药物(＞10％)的类型为选择性的5HT1-受体激动剂(67.0％，238/355)、苯胺(62.3％，221/355)、丙酸衍生物(55.2％，196/355)、所有其它治疗产品(39.4％，140/355)、天然阿片碱类(22.3％，79/355)、未知类别(15.8％，56/355)、唾液酸及衍生物(14.6％，52/355)和安眠药与镇静剂(13.5％，48/355)。BOTOX和安慰剂组间急性头痛药物使用频率或类型没有显著差异。
总的来说，87.6％(311/355)的患者接受并用的药物(除了急性头痛药物)，每个治疗组的比例相似BOTOX组90.2％(156/173)的患者，安慰剂组85.2％(155/182)的患者。
研究期间服用的最普遍的并用药物种类是选择性的5-羟色胺重吸收抑制剂(21.4％，76/355)，非选择性的单胺重吸收抑制(16.9％，60/355)，天然和半合成雌激素(15.2％，54/355)，甲状腺激素(11.5％，41/355)，苯并二氮卓类衍生物(11.3％，40/355)以及孕激素和雌激素/固定联用(11.0％，39/355)。BOTOX和安慰剂组间同时使用药物的类型或频率没有显著差异。
患者35.8％(127/355)的总数在基线期间服用头痛预防性药物。这些包括10.4％(37/355)为β阻断剂、7.6％(27/355)为钙通道阻断剂、14.1％(50/355)为抗惊厥剂和20.8％(74/355)为抗抑郁剂。BOTOX和安慰剂组间，在使用任意上述的头痛预防性药物的患者数目上其差异没有统计学显著性。
有效性结论二期研究中，无反应者组中，每30天周期头痛日相对基线下降50％或以上患者比例的次要终点重合。当对安慰剂无反应者和安慰剂反应者亚群进行分析时，其他试验方案指定的参数(即头痛频率、受试者每30天周期头痛相对基线下降50％或以上的发生率、每30天周期偏头痛的频率)的分析中偶尔发现有统计学显著性差异。对治疗—反应者的相互作用没有统计学显著性，因此，进行反应者/无反应者分组没有必要。
因此，进一步进行区分对BOTOX比对安慰剂治疗最具应答性的患者群的分析·混合的安慰剂非反应性者和安慰剂反应者组(混合群体)。
·基线时未使用预防性头痛药物的患者与基线时使用预防性头痛药物的患者的比较。
·基线时头痛日更频繁的患者(即20到24和25到30个头痛日)与基线时头痛日较不频繁患者间的比较(即＜20个头痛日)。
·慢性头痛疾病多年的患者(即＞20年)与慢性时间较短的患者间的比较(即＜10年和10到20年)。
·基线时急性镇痛药物的过度使用的患者与未过度使用急性镇痛药物的患者间的比较。从由混合患者总体的分析，得出结论·BOTOX治疗的患者与安慰剂治疗的患者相比，在多个时间点的头痛频率具有持续的统计学显著性的下降。BOTOX治疗的患者与安慰剂治疗的患者相比，使用急性镇痛头痛药物的次数和天数伴随下降。
·最能阐述BOTOX疗效好于安慰剂的疗效终点是每30天周期头痛的频率。
在安慰剂导入期间(第一个治疗周期，第-30天到0天)，所有患者在第-30天接收安慰剂。在第0天患者随机接受BOTOX或安慰剂肌肉注射的三个治疗周期。进入研究的355例患者中，173例接受105U到260U的BOTOX，182例接受安慰剂。患者接受的BOTOX的最大剂量根据试验计划为三个治疗周期的每个治疗周期260U，累积总数为780U。
剂量第2、3、4个治疗周期的BOTOX平均总剂量(剂量中位数)分别为190.8U(200U)、190.9U(200U)和190.5(200U)。在第2、3、4个治疗周期注入每个肌肉群的BOTOX平均剂量和剂量中位数在表20给出。对BOTOX和安慰剂两个组少于一半的患者进行任选的咬肌注射给药，这一观测值得注意。
表20每个治疗期注入每个肌肉群的BOTOX剂量平均值(中位数)
注所有患者在治疗1周期期间用安慰剂注射位点的数目BOTOX在第一、二、三治疗周期的注射位点总数的平均值(中位数)分别为32.0(30)，31.6(29)和31.8(29)。在第一、第二和第三次注射中，每个肌肉群BOTOX注射位点数的平均值(中位数)在表21中给出。
表21每个治疗周期每个肌肉群BOTOX注射位点数的平均值(中位数)
注所有患者在治疗1周期期间用安慰剂讨论慢性每日性头痛是指以高频率头痛为特征，常与重要致残相关的一组病症(Welch and Goadsby，2002)。Mathew et al(1987)报道，来自他们诊所的78％的CDH患者是由早先的阵发性偏头痛史演化而成的。根据Holroyd et al(2000)，CDH患者报道他们的角色功能和健康遭到频繁和严重地损伤，突出了该疾病对生活质量的影响(Monzon and Lainez，1998；Wang et al，2001)。对于这些患者，还没有满意的治疗方法(Silvestrini et al，2003)。
病理生理学上的考虑提示从阵发性到慢性头痛转换的可能的基础是中枢疼痛系统活性的进行性改变(Hering et al，1993)。BOTOX已表明具有抗疼痛作用(Cui，2004)。此观测结果可解释已在文献中报道过的其治疗偏头痛的疗效(Binder，et al，2000；Klapper et al，2000；Mathew et al，2003；Mauskop，1999；Ondo et al，2004)。本研究探究了BOTOX治疗在CDH人群中的潜在好处。本研究使用了修改的追踪疼痛的治疗范例。所有患者在最长达3个治疗周期的时间中，每3个月接受至少105U的最少剂量。此最小剂量需按照试验计划以每块指定的肌肉最小剂量注入六块指定肌肉(当合适时为双侧)。允许研究者基于头痛的位置和严重性针对每位患者进行个体化治疗。允许7块指定肌肉的最大剂量为260U(3个治疗周期后总量最大值780U)。试验计划规定了每块肌肉的最大剂量和对于双侧肌肉治疗的最大不平衡量。在本研究中接受的平均总剂量为190U。
由每30天周期头痛频率相对基线变化，观测到BOTOX比安慰剂具有更显著和持久的疗效。这些变化在安慰剂无反应者和安慰剂反应者组、混合资料、无基线头痛预防治疗的亚组的患者中观察到。头痛频率的变化在偏头痛试验中是优选的主要终点(European Agency for theEvaluation of Medicinal Products，2003).最近美国FDA批准的偏头痛预防性治疗也是通过测量头痛频率的变化制定疗效的(Depakotepackage insert，2003)。
基于头痛频率的数据，BOTOX证明了在第一个活性治疗的30天内即开始作用。完成了2或3个注射周期的那些患者在第180天反应类似，在BOTOX组(基线＝14)头痛范围为-7.1到-8.0和安慰剂组(基线＝13)头痛范围为-3.7到-5.4(p＜0.042从第180天到270天)。本研究中患者经受的大多数头痛持续期大于4小时。除了表明不管持续期的长短BOTOX治疗的结果是临床上和统计学上所有头痛显著减少外，另外还表明≥4小时持续期的头痛频率的变化在临床上和统计学上有显著性差异(BOTOX有利)。在第180天那些头痛≥4小时持续期的患者的反应为BOTOX组-4.6次头痛比安慰剂组-2.2次头痛(分别基线＝9.6和9.2；p＝0.005)。在头痛＜4小时的患者中，BOTOX组-2.5次头痛和安慰剂组-1.6次头痛，都有减少(分别基线＝3.9和3.5)。这证明BOTOX治疗减小了实际临床负担的头痛数。
每30天周期头痛频率下降的患者的发病率提供了针对目标人群BOTOX作为头痛预防治疗的有效性的信息。尽管不是进入要求，在本研究中的所有患者在基线期都患有偏头痛(ICHD水平1)，支持了潜在的原发性头痛诊断为偏头痛而不是紧张型头痛。因此实际的研究总体是患有CDH的偏头痛患者。发现组间每30天周期头痛次数相对基线减少50％或以上的患者百分比在第180天(54.2％与38.0％，p＝0.046)和第210天(57.1％与36.4％，p＝0.012)有显著性差异，BOTOX有利。此外每30天周期头痛减少50％的患者百分比在BOTOX组的第150、180、210、240和270天时发生在50％以上的患者中，而安慰剂组只在270天时达到此水平。
在基线不使用预防性头痛药物的患者人群是对BOTOX治疗应答的亚组。对于头痛频率相对基线的平均变化以及其他疗效参数如每30天周期头痛频率相对基线减少50％、每30天周期头痛频率相对基线减少30％、头痛天数和每30天周期急性镇痛头痛药物的使用次数和天数，观察到组间差异有统计学显著性，BOTOX疗效有利。
经常使用镇痛药物是在CDH人群中要考虑的一个重要因素，因为CDH患者可能过度使用急性镇痛药物(Colas et al，2004)。当前头痛研究团体(headache-research community)(Bigal et al，2002；Silberstein et al，1994)和国际头痛学会头痛分类小组委员会(Silberstein[定义药物过度使用IHS标准的小组委员会主席]口头交流，June，2004)正在讨论“镇痛药物过度使用”的定义。最近正考虑的建议定义为≥15天和每周≥2天的任意使用(Silberstein口头交流，2004)。
在本研究中，若研究者认为患者正在过度使用一种镇痛药物，将排除该患者。因此研究≥15天和每周≥2天的定义，患者被分成2组“是”(患者是镇痛药物的过度使用者)或“否”(患者不是镇痛药物的过度使用者)。对于基线时镇痛药物的过度使用，本研究中BOTOX患者总数的52.6％(91/173)和安慰剂患者总数的42.3％(77/182)达到标准。在“是”急性药物过度使用的亚组中，BOTOX每30天周期头痛频率相对于基线的平均减少在除90天以外的所有时间点比安慰剂显著大2.0到5.6次。
经常使用镇痛药已显示出是CDH的一个原因(Linton-Dahlf et al，2000)。然而，某些人提出经常使用镇痛药可能仅仅在头痛频率增加之后(Lipton and Bigal，2003)。无论如何，镇痛药物的过度使用是大幅降低患者生活质量并由于对他们的治疗明显增加社会经济负担的一种疾病(Colas et al，2004；Bigal et al，2002；Schwartz et al，1997)。BOTOX作为偏头痛患者和CDH患者的预防剂可证明在减少头痛频率以及减少镇痛药物使用和可能的镇痛药物过度使用中很重要。
本研究证明BOTOX是有效的，还为CDH偏头痛患者良好耐受，并且为在不良事件高发和严重影响患者顺应性的其他预防性治疗提供了另一种选择。
安慰剂无反应组在第180天达到头痛日频率减少50％或以上的患者发病率的次要终点。在所有的疗效分析中，对BOTOX的治疗都有很强的应答。由此分析几个确定的患者总体，显示用BOTOX治疗好于安慰剂，其差异具有统计学显著性。在基线时不服用头痛预防药物的亚组患者中发现在多个时间点多个疗效参数的统计学显著性结果。关于终点，每30天周期的头痛频率最好地证明了BOTOX比安慰剂有更好的疗效。此外，在用BOTOX治疗的患者比用安慰剂治疗的患者，特别是在基线时不服用头痛预防药物的亚组患者中，急性镇痛头痛药物的使用次数和天数有显著性地更大幅度地减小。当每3个月给药剂量达每个治疗周期260U时，BOTOX在此修改的追踪疼痛的用药法中也显示出安全和良好耐受性。
B，C，D，E，F或G型肉毒毒素可代替以上使用的A型肉毒毒素，如由使用约10000个单位的B型肉毒毒素代替，也就是说，在本研究实施例1中提出的约50倍的A型肉毒毒素使用量。
尽管本发明关于某些优选方法已作了详细的描述，在本发明范围内的其它实施方案、形式和修改是可能的。例如，很多种类的神经毒素可有效用于本发明的方法中。另外，本发明包括局部给药方法以缓解头痛或减少头痛次数，其中同时或连续给予两种或以上的神经毒素如两种或以上的肉毒毒素。例如，行A型肉毒毒素给药直至临床反应消失或产生中和抗体，随后可给予B型肉毒毒素。或者，联用任两种或以上的A-G血清型肉毒毒素局部给药，以控制发病和持续期的期望治疗结果。而且，非神经毒素化合物可在神经毒素给药之前、同时或之后给药以证实辅助作用，如在神经毒素如一种肉毒毒素开始发挥它们的疗效前，加剧地或更迅速地开始去神经。
根据在此公开的发明，一种治疗一种病症的方法有多个益处和优点包括以下方面1头痛可以消除。
2疼痛，如头痛症状可以显著减轻或消除。
3每注射神经毒素疼痛症状可减轻或消除至少约2到6个月，使用控释神经毒素植入物症状可减轻或消除约1年到5年。
4每注射神经毒素可至少消除头痛约2到6个月，并且在约1到5年头痛消除。
5一种药物过度使用的病症，如MOH能得到有效治疗。
6可增加曲坦类药物的疗效。
尽管本发明关于某些优选方法已作了详细的描述，在本发明范围内的其它实施方案、形式和修改是可能的。例如，很多种神经毒素能有效地用于本发明的方法。此外，本发明包括局部给药方法，其中两种或以上的梭菌神经毒素，如两种或以上肉毒毒素可同时或连续给药。例如，A型肉毒毒素可局部给药直至临床反应消失，或产生中和抗体，随后可给予B型肉毒毒素。而且非神经毒素化合物可在神经毒素给药之前、同时或之后局部给药，以提供辅助作用，如在神经毒素(如肉毒毒素)开始发挥它的长期抑制疼痛和MOH的作用之前，增强或更快地开始疼痛抑制作用。
我们的发明在其范围内还包括，神经毒素(如肉毒神经毒素)在制备通过局部给予肉毒毒素，治疗药物过度使用性疾病的药物中的用途。
以上提到的所有参考文献、文章、专利、申请和出版物通过引用的方式完整地纳入本说明书。
相应地，以下权利要求的精神和范围不应局限于以上提出的优选实施方案的叙述。
权利要求
1.一种治疗曲坦类药物过度使用的患者的头痛的药物，包括用于向曲坦类药物过度使用的患者局部给药的肉毒毒素。
2.一种治疗曲坦类药物过度使用的患者的头痛的药物，包括介于约1单位和约1500单位的用于向曲坦类药物过度使用的患者局部给药的A型肉毒毒素。
3.一种提高曲坦类药物治疗头痛的有效性的药物，包括曲坦类药物和肉毒毒素。
4.一种提高曲坦类药物治疗头痛的有效性的药物，包括曲坦类药物和介于约1单位和约1500单位的A型肉毒毒素。
5.权利要求1或2的药物，其中局部给药是由肌内或皮下给药至患者头部上或头部内的一个位置，患者头部上或头部内的一个位置，患者的面部肌肉，患者前额，或患者感到发生疼痛的皮下或肌肉位置。
6.权利要求1或3的药物，其中肉毒毒素选自A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。
7.权利要求1或3的药物，其中肉毒毒素为A型肉毒毒素。
8.权利要求1或3的药物，其中肉毒毒素给药量在约1单位到约10,000单位之间。
全文摘要
一种急性疼痛药物过度使用性病症(如一种药物过度使用性头痛症)可通过肉毒毒素对患者给药治疗。肉毒毒素和曲坦类药物对患者联合给药能更有效地治疗头痛并且/或者增加这种曲坦类药物的有效性。肉毒毒素可以是A型肉毒毒素，并且肉毒毒素可在患者经受或易受疼痛或头痛的部位或其邻近部位给药。
文档编号A61K39/08GK1933849SQ200580006289
公开日2007年3月21日 申请日期2005年2月15日 优先权日2004年2月26日
发明者C·C·特克尔, M·F·布林 申请人:阿勒根公司