专利名称：羟基马桑毒素在制备癫痫动物模型所用致痫药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及羟基马桑毒素(tutin)的用途，特别是在制备实验性癫痫动物模型所用致痫药物中的应用。
背景技术：
癫痫是发病原因复杂、表现形式多样的脑疾病，全世界大约有超过5千万人患此疾病。利用不同的癫痫动物模型对癫痫发生机制进行研究、对治疗癫痫病的药物进行筛选是进一步阐明癫痫病因、治疗人类癫痫的重要途径之一。
癫痫动物模型所用的致痫药物通常为匹罗卡品(pilocarpine)、红藻氨酸(kanic acid，KA)，虽然它们引起动物癫痫状态的表现大致相同，但各自的致痫原因、癫痫发生过程以及致痫机制却不相同。匹罗卡品可致典型的癫痫状态行为和脑电惊厥，兴奋性氨基酸NMDA受体拮抗剂MK-801抑制匹罗卡品所致癫痫动物发作性行为惊厥、脑电惊厥，表明兴奋性氨基酸NMDA受体激活是该种癫痫模型形成的重要因素，此外，抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)受体功能异常是匹罗卡品导致动物惊厥的另一原因(见OrmandyGC，Jope RS，Snead OC.Anticonvulsant actions of MK-801 on the lithium-pilocarpinemodel of status epilepticus in rats.Exp Neurol 1989；106172-180.)。红藻氨酸(kanic acid，KA)所致的癫痫状态是另一种癫痫模型，当GABA-A受体拮抗剂、MK-801和腺苷受体拟似剂共同作用于红藻氨酸所致的惊厥动物时，可对红藻氨酸引起的兴奋毒性产生明显的神经保护作用(见MacGregor DG，Graham DI，Stone TW.The attenuation ofkainate-induced neurotoxicity by chlormethiazole and its enhancement by dizocilpine，muscimol，and adenosine receptor agonists.Exp Neurol 1997；148110-123.)。提示不同的递质受体系统参与了红藻氨酸所致的惊厥。
上述实验表明，只有不断开发新的致痫药物制备不同类型的癫痫动物模型，才能满足治疗癫痫病的需要。
马桑内酯(coriaria lactone，CL)作为致痫剂也有所报道。马桑内酯是从中草药马桑寄生中提取的混合液，其组分主要有马桑毒素、羟基马桑毒素、马桑亭及其它倍半萜内酯，由于马桑内酯是一种混合物，发挥作用的有效组分不明，所以阻碍它成为一种公认的致痫工具药。
羟基马桑毒素(tutin)是从马桑内酯混合液中分离纯化获得的一种纯化学物质，其结构式如下 周华等对羟基马桑毒素(tutin)的初步研究显示，不同浓度(40μg/ml、30μg/ml和20μg/ml)的羟基马桑毒素(tutin)灌流大鼠海马脑片，均可显著增高由顺向刺激海马Schaffer侧支所诱发的CA1区锥体神经元群体锋电位(population spike，PS)的幅度(周华，郑煜，唐玉红；羟基马桑毒素所致的大鼠海马锥体细胞痫样放电活动；生理学报，June 25，2004；56(3)341-346)。该现象提示羟基马桑毒素(tutin)可能具有致痫作用，但不能由此推论羟基马桑毒素(tutin)在动物整体情况下能引发癫痫样行为和癫痫样脑电，从而作为制备癫痫动物模型的一种致痫药物。因为，在实验科学领域，人们一致认为，不能简单地把离体实验中得到的结果直接用来推测或解释其在完整机体中的功能或所起的作用(姚泰，绪论，姚泰主编生理学，人民卫生出版社，2000，北京，1-6)。
发明内容
本发明的目的是为制备癫痫动物模型提供一种新的致痫药物，促进癫痫发生机制的研究和癫痫病治疗药物的筛选。
本发明通过实验证明用人工脑脊液(ACSF)将羟基马桑毒素(tutin)配制成浓度为10.0～30.0μg/μl的注射液，以成年大鼠制备动物模型，从大鼠侧脑室给药，给药的剂量为5μl/只，给药后全部大鼠产生了典型的癫痫状态行为发作，脑电图记录到棘波、多棘波群、棘慢综合波、成簇发放的多棘慢综合波以及阵发性高波幅节律等痫样脑电波。因此，羟基马桑毒素(tutin)可作为一种新的致痫化学工具药，用于制备实验性癫痫动物模型。
癫痫行为观察采用摄像机录像记录，并与Racine点燃模型的分级标准(Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure.Electroencephalography and Clinical Neurophysiology 1972b；32281-294)和癫痫状态(status epilepticus，SE)的发作类型(参照Brandt(Brandt C，Glien M，Potschka H，VolkHolger and Lscher W.Epileptogenesis and neuropathology after different types of statusepilepticus induced by prolonged electrical stimulation of the basolateral amygdale in rats.Epilepsy Res 2003；5583-103)〕进行对照比较。
痫样脑电活动变化采用脑电图(electroencephalogram，EEG)记录电极、记录装置和生物机能实验系统记录、显示、贮存和分析，并与常见痫波的脑电图(解学孔，癫痫的脑电图表现，解学孔主编癫痫病学。人民卫生出版社，1995，北京，350-385)进行对照比较。
本发明具有以下有益效果1、本发明为已知物质羟基马桑毒素发掘了新的用途，开拓了一个新的应用领域。
2、本发明为制备癫痫动物模型提供了一种新的致痫药物，此种致痫药物不仅致痫作用较强，而且动物死亡率较低。
3、经侧脑室单次微量注射羟基马桑毒素(tutin)液可制成一种新的大鼠急性癫痫状态模型，有利于癫痫发生机制的研究和癫痫病治疗药物的筛选。
4、对实验大鼠注射羟基马桑毒素液时采用侧脑室局部给药，不仅给药量小，而且可避免血脑屏障对药物进入脑脊液的阻碍作用。
图1是实验大鼠侧脑室微量注射人工脑脊液(ACSF)前、后的脑电波图，其中，A为注射人工脑脊液(ACSF)前的脑电波图，B为注射人工脑脊液(ACSF)后的脑电波图，他们均为正常脑电波，未见痫样放电。
图2是实验大鼠注射浓度为12.5μg/μl的羟基马桑毒素液后5～10分钟所出现的棘波放电脑电图，其中，A为注射羟基马桑毒素前的正常脑电波型图，B1为常见的癫痫大鼠棘波放电的脑电波型图(箭头所指)，B2为连续、反复出现的单个棘波图(线段所示)，B3为连续出现的多棘波群图(箭头所指)。
图3是实验大鼠注射羟基马桑毒素液后处于癫痫状态I型发作阶段的形态图。
图4是实验大鼠注射浓度为12.5μg/μl的羟基马桑毒素液后10～20分钟出现的肌阵挛性惊厥发作的脑电波变化图，其中，A为频率3～4Hz的连续性棘慢综合波图(线段所示)，B为弥漫性棘慢综合波图(箭头所示)，C为较低幅度的多棘慢综合波图(线段所示)，D为较高幅度的多棘慢综合波图(线段所示)，E为多棘慢综合波反复、成簇发放图(箭头所示)。
图5是实验大鼠注射羟基马桑毒素液后处于癫痫状态II型发作阶段的形态图。
图6是实验大鼠注射浓度为25.0μg/μl的羟基马桑毒素液后15～30分钟后出现的高幅阵发性痫性脑电波图，其中，A为频率8Hz(图左侧)和频率3Hz(图右侧)的节律放电图，B为A中图右侧脑电波被扩展后所显示的波形变化图。
图7是实验大鼠注射羟基马桑毒素液后处于癫痫状态III型发作阶段的形态图。
具体实施例方式
1.材料和方法1.1实验动物及药品羟基马桑毒素(tutin)由原华西医科大学药厂生产，人工脑脊液(ACSF)组成(mmol)124NaCl，5KCl，1.25NaH2PO4，2MgSO4，2CaCl2，24NaHCO3，10Glucose。Sprague-Dawley(SD)大鼠15只，体重190～210g，雌雄不限，由四川大学华西实验动物中心提供。将动物随机分成对照组(5只)和实验组(10只)，实验组又分成两个浓度组羟基马桑毒素浓度25.0μg/μl组(n＝5)和羟基马桑毒素浓度12.5μg/μl组(n＝5)。实验组经埋置在侧脑室的给药导管分别注射5μl不同浓度的羟基马桑毒素液，羟基马桑毒素液用羟基马桑毒素和人工脑脊液(ACSF)配制而成；对照组侧脑室注射同体积容量的人工脑脊液(ACSF)；羟基马桑毒素液和人工脑脊液(ACSF)的pH值均为7.35～7.4。
1.2侧脑室给药导管和脑电图(EEG)记录电极的埋置SD大鼠经3％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定在立体定位仪上，常规消毒，暴露颅骨顶部，按鼠脑图谱选定侧脑室坐标为前囟后1mm(P1.0)，中线旁开1.8mm(RL1.8)，硬膜下3.5mm(H3.5)，埋置外径为0.8mm的不锈钢管作为侧脑室给药导管。脑电图(electroencephalogram，EEG)记录电极安放坐标为前囟后5mm(P5.0)，中线左侧旁开3mm(LL3.0)和前囟后5mm(P5.0)，中线右侧旁开3mm(RL3.0)，钻孔后，将两根铜芯电极分别埋置到该两点颅骨下硬膜外表面，互为记录电极和参考电极，供记录脑电图(electroencephalogram，EEG)用。注射导管及脑电图记录电极全部用牙托粉和502胶水固定。手术完毕后，肌肉注射丁胺卡拉霉素，共三天。
上述手术后第三天，进行实验观察。微量注射器(针头直径0.4mm)经埋置在侧脑室的给药导管给实验组中两个不同浓度组的动物分别注射浓度为12.5μg/μl和浓度为25.0μg/μl的羟基马桑毒素液5μl，2min推注完，留针2min，缓慢取出注射针；对照组动物每只注射5μl人工脑脊液(ACSF)，时间过程同实验组。
1.3脑电图描记由引导电极和参考电极引导的电信号先经RM-6000多导生理记录仪(Kohden，Japan)生物放大器放大后，输入计算机，采用BL-410生物机能实验系统(成都泰盟科技股份公司)显示、贮存、分析。动物侧脑室注射羟基马桑毒素液或人工脑脊液(ACSF)前，先记录15min脑电波活动，作为脑电图记录的基础脑电。给药后，连续描记脑电图2h，记录动物癫痫发作的潜伏期和发作程度。以注射羟基马桑毒素液到脑电图首次出现特征性癫痫波形所需的时间为癫痫出现的潜伏期。
1.4癫痫行为观察侧脑室注射羟基马桑毒素液后，对大鼠的癫痫典型发作行为进行录象记录，并与Racine点燃模型的分级标准和癫痫状态(status epilepticus，SE)的发作类型进行对照比较。
癫痫行为的严重程度按照Racine点燃模型的标准(Racine RJ.Modification ofseizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure.Electroencephalography andClinical Neurophysiology 1972b；32281-294)将动物惊厥发作的行为表现分为5级。I级须动，头面部抽搐；II级节律性咀嚼及点头；III级前肢或后肢抽搐；IV级四肢节律性抽搐；V级全身强直抽搐，伴有甩尾或翻滚、跌到。III级或III级以下者为轻型发作，IV～V级为重型发作。
癫痫状态(status epilepticus，SE)的发作类型参照Brandt(Brandt C，Glien M，Potschka H，Volk Holger and Lscher W.Epileptogenesis and neuropathology after differenttypes of status epilepticus induced by prolonged electrical stimulation of the basolateralamygdale in rats.Epilepsy Res 2003；5583-103)分为三型，连续部分惊厥为I型SE，动物主要表现为不动或伴面部的自主活动；连续部分惊厥与间歇性全身性发作为II型SE，动物以部分惊厥表现为主，偶然出现躯干或四肢间歇性抽搐；全身性惊厥为III型SE，动物全身及四肢肌肉强直阵挛，原地打转、跳跃、奔跑、翻滚倒地。
1.5脑电波检测侧脑室注射羟基马桑毒素液后，同步记录脑电图变化，并与常见痫波的脑电图进行对照比较。
脑神经元发作性的超同步化放电称为癫痫性放电，这种放电表现在脑电图中的脑电波形态称为癫痫波形或痫波，常见的痫波有以下七种(解学孔，癫痫的脑电图表现，解学孔主编癫痫病学，人民卫生出版社，1995，北京，350-385)。(1)散发性棘波棘波(spike)是癫痫性放电最具特征性的表现之一。其波幅多在100μV以上，周期在80ms以内。棘波的出现表明脑部有刺激性病灶。(2)散发性尖波尖波(sharp)是常见的癫痫性放电特征波形之一。典型的尖波周期在80～200ms之间，波幅常在100～200μV之间，它可能是由较大的癫痫灶中多数神经元棘波放电的不完全同步化形成的。(3)棘慢综合波(spike and wave complex)或尖慢综合波(sharp and wave complex)由棘波或尖波与周期为300～400ms的慢波结合在一起的痫波称为棘慢波或尖慢综合波，其频率前者为2.5～3.5Hz，后者为1.5～2.5Hz。(4)多棘波群(multiple spikes)为2～6个棘波成簇地单独出现，当棘波连续出现时，多为大发作的表现。(5)多棘慢综合波(multiplespikes and slow waves)由几个棘波和一个慢波所组成，常为成串连续出现或不规则出现，棘波波幅高低不一，是肌阵挛性癫痫最具特征的波形之一。(6)发作性节律(slowwaves burst)在脑电图近似基础波的背景上出现阵发性高波幅节律，突然出现，突然消失。(7)高度节律紊乱(hypsarrhythmia)高波幅的棘波、尖波、多棘波或多棘-慢综合波与慢波杂乱而不规则地结合呈现出的波形。
1.6资料的统计学处理给药前后的资料用配对t检验处理；发生率和死亡率用卡方检验；浓度组之间的数据比较用单因素方差分析进行。P＜0.05为差异有显著性。
2.结果2.1侧脑室注射人工脑脊液(ACSF)对大鼠脑电和行为的影响手术后第三天，大鼠头部埋置的给药导管和脑电图(EEG)记录电极无松动，伤口无渗出物，动物清醒，自由活动。首先描记一段正常脑电图，正常脑电图主要表现为α波或β波，即基础波，其脑电频率在6～12Hz之间，平均8.25±1.49Hz，波幅在10±80μV之间，平均41.17±12.93μV(见图1A)。对照组大鼠侧脑室注射5μl人工脑脊液(ACSF)后，开始在鼠笼内较快地来回爬动，约2～3min后，安静、伏地，偶有爬动，行为如常；脑电图波形与注射前相似，脑电频率6～12Hz，平均8.78±1.48Hz，波幅在10～90μV之间，平均51.99±20.42μV(见图1B)。与注射前的基础波相比，其频率和波幅均无显著性改变(P＞0.05，n＝5)，亦未见特征性的癫痫波。
2.2侧脑室注射羟基马桑毒素(tutin)对大鼠脑电图(EEG)的影响经预先埋置的给药导管给实验组10只大鼠(两组羟基马桑毒素液的浓度分别为25.0μg/μl和12.5μg/μl，每组5只)侧脑室注射5μl羟基马桑毒素液。两组动物注射羟基马桑毒素液前，描记的脑电图均正常，未见痫波(见图2A)。在注射羟基马桑毒素液后5～10分钟，动物脑电图出现棘波，一种特征性癫痫脑电波(见图2B1～B3)，其波宽常在40～80ms，波幅50～150μV大小不等，平均103.53±36.81μV。棘波发放的样式既可是散在单个痫波(图2B1)或反复连续发放(图2B2)，亦可是由3～5个低幅棘波构成的短段痫波(图2B3)，呈阵发或连续发放。散在单个棘波发放(图2B1)常出现在癫痫行为发作的潜伏期，棘波成段发放时(图2B3)，动物多伴有节律性咀嚼、眨眼、须动等痫样行为。
连续性棘慢综合波(见图4A)和弥漫性棘慢综合波(见图4B)常出现于失神发作型癫痫，其频率为3～4Hz，平均幅度为293.53±41.62μV；另一种主要由数个棘波构成的棘波群或多个棘波中夹有慢波的多棘慢综合波，阵发性出现之初，表现为低幅(82.57±4.7μV)、高频(9.12±1.09Hz)发放，每段波群持续时间平均为11.20±1.63s，发作间隔时间平均为50.93±7.72s，波群反复出现6次(见图4C)。再次发作时，波幅增加为202.20±12.94μV，频率为10.03±1.58Hz，每段波群持续时间平均减少为4.39±0.42s，发作间隔时间平均缩短到21.43±2.49s，波群反复出现8次(见图4D)，成簇发放(见图4E)，这种波型被认为是肌阵挛性癫痫最具特征的波形之一。这种癫痫脑电波发放时，动物除了有头面部发作表现(如眨眼、须动、耳抖、咀嚼等)外，常伴有肢体肌肉阵挛性收缩。
脑电记录的阵发性高波幅节律有两种，先是频率为8Hz，幅度为555.54±98.23μV的放电波(见图6A左段)，紧随其后的是频率为3Hz，幅度为667.74±127.24μV的慢波节律(图6A右段，图6B)，发作持续时间为60.02±10.34s，伴随高幅阵发性脑电活动，动物行为表现出全身强直痉挛、跳跃、奔跑、旋转、跌倒等重度发作的症状.
在2h脑电波记录过程中，动物的脑电图在各段连续痫样放电之间主要呈现出分散的棘波，尖波或棘慢波，少部分在发作间期为基础脑电变化。
2.3侧脑室注射羟基马桑毒素(tutin)对大鼠行为的影响侧脑室注射羟基马桑毒素(tutin)液后，大鼠先后出现癫痫发作。两组大鼠10只在给药后全部出现部分性惊厥发作，动物表现为凝视、不动或头面部发作症状，如须动，咀嚼，眨眼、耳抖、点头等，伴有呼吸加快，耳朵血管扩张(I型SE，见图3A、图3B)。大多数动物(9只)除了上述症状外，还出现短时间的前肢阵孪、直立、前肢抬起不断扑动或全身肌肉阵挛性收缩(II型SE，见图5A、图5B)。6只达到IV级及以上发作程度(III型SE，见图7A、图7B)，表现为四肢抽搐，全身肌肉阵挛性收缩，原地打转，跳跃、奔跑、翻滚倒地、强直阵挛；其中一只在给药后，经历短暂的I型发作后，表现为反复发作的强直阵挛，翻滚倒地，张口呼吸，每次发作持续10s到5min不等，在给药28min后死亡。
2.4不同浓度羟基马桑毒素(tutin)液对癫痫发生率、潜伏期及发作程度的影响经侧脑室注射人工脑脊液(ACSF)的5只大鼠无任何癫痫行为，癫痫发生率为零，无死亡。侧脑室注射羟基马桑毒素(tutin)液的10只大鼠(25.0μg/μl，n＝5；12.5μg/μl，n＝5)均出现了程度不同的癫痫发作。注射浓度25.0μg/μl羟基马桑毒素(tutin)液的5只大鼠，给药5.10±0.66min后，先出现短暂的部分性癫痫发作(I型和II型SE)，随后，1只表现为II型SE发作，该型发生率20％，4只达到3型重度发作程度(III型SE)，该型SE发生率为80％，癫痫发生率为100％。重度发作的大鼠中，1只经过反复的四肢抽搐，全身肌肉阵挛，翻滚倒地等惊厥发作，于给药28min后死亡，死亡率20％。注射浓度12.5μg/μl羟基马桑毒素(tutin)液的5只大鼠，给药后8.05±2.79min，动物出现部分性癫痫发作(I型SE)，发作潜伏期明显长于高浓度组(P＜0.05)，该型癫痫状态发生率为20％，2只为II型SE发作，发生率为40％，2只达到III型SE发作，重型癫痫发生率为40％，该组癫痫发生率100％，无死亡。两组癫痫发生率、各型比例及死亡率无显著性差异(P＞0.05)，如表1所示。
表1.侧脑室微量注射不同浓度羟基马桑毒素(tutin)液的结果比较
*P＜0.05compared with 25μg/μl concentration group从上述实验结果可以看出，在侧脑室注射羟基马桑毒素(tutin)液后，10只大鼠全部表现SE部分性惊厥发作，6只为SE全身性惊厥发作；脑电图记录到棘波、多棘波群、3Hz棘慢综合波，9～10Hz成簇发放的多棘慢综合波和阵发性高波幅节律等痫样脑电波，同时动物伴有头面部肌肉抽搐，四肢阵挛，全身强直痉挛，旋转，跌倒等不同程度发作的症状。实验大鼠产生的癫痫行为和癫痫脑电波充分证明了羟基马桑毒素(tutin)是一种致痫药物，经侧脑室单次微量注射羟基马桑毒素(tutin)液可制成一种新的大鼠急性癫痫状态模型。
权利要求
1.羟基马桑毒素在制备癫痫动物模型所用致痫药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于致痫药物用羟基马桑毒素和人工脑脊液配制，羟基马桑毒素的浓度为10.0～30.0μg/μl。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于动物癫痫模型为成年大鼠模型时，若从大鼠侧脑室给药，给药的剂量为5μl/只。
全文摘要
本发明公开了羟基马桑毒素(tutin)在制备癫痫动物模型所用致痫药物中的应用。实验表明用人工脑脊液(ACSF)将羟基马桑毒素(tutin)配制成浓度为10.0～30.0μg/μl的注射液，以成年大鼠制备动物模型，从大鼠侧脑室给药，给药的剂量为5μl/只，给药后全部大鼠产生了典型的癫痫状态行为发作，脑电图记录到棘波、多棘波群、棘慢综合波、成簇发放的多棘慢综合波以及阵发性高波幅节律等痫样脑电波。因此，羟基马桑毒素(tutin)可作为一种新的致痫化学工具药，用于制备实验性癫痫动物模型。
文档编号A61K49/00GK1861196SQ20061002069
公开日2006年11月15日 申请日期2006年4月12日 优先权日2006年4月12日
发明者周华, 郑煜, 唐玉红 申请人:四川大学