专利名称：古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素在制备抗炎、抑制胃痉挛、胃痛药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，涉及古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素的医药新用途。具体涉及古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素在制备预防和治疗急慢性炎症、胃痉挛、胃痛药物中的应用。
背景技术：
各种炎症性疾病是目前危害人类健康的常见多发病，涉及面广，危害性大。纵观当前对急慢性炎症的治疗，用以抗生素、激素为主的治疗虽然多能收到良好的效果，但因耐药菌株的不断增加，有越来越多的病例，尽管用抗生素治疗，病情却得不到及时控制，而且抗生素在临床应用中产生副作用的病例是屡见不鲜，部分因病毒感染所致，抗生素基本无效。因此，近年来世界上对于抗炎药理的筛选将目光转向中草药中寻找。
近年来，中药的抗炎免疫作用已受到广泛的关注。临床及实验证实很多中药具有很好的抗炎作用，且多无严重的毒副作用。目前认为中药有多种抗炎作用机制，有些对下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能产生影响，有些通过影响炎症介质的产生和分泌来实现的。近年来，随着对炎症认识的深入，在中药抗炎作用与一氧化氮(NO)的关系方面也有了一定的认识。我国中医药学具有悠久的历史，在这些中草药有效成分中，推测极有可能存在抗炎活性的物质，所以，从天然产物中筛选具有抗炎活性的先导化合物不失为一理想途径；进而通过进行先导化合物的结构修饰及全合成，再从一系列衍生化合物中筛选活性较强的单体，并结合抗炎活性的构效关系研究，最终发现具有临床应用前景的药物。
金果榄为防己科青牛胆属植物青牛胆(Tinospora sagittata(Oliv.)Gagnep.)或金果榄(Tinospora capillipes Gagnep.)的干燥块根，又名九牛胆、金银袋(广西)、地苦胆(四川)、九牛子(江西)、地蛋(湖南)。为中国药典历版所收载，有清热解毒、利咽止痛之功效。用于咽喉肿痛，痈疽疔毒，泄泻，痢疾，脘腹热痛。(中国药典(一部.2005年版)150-151.北京化学工业出版社)。
金果榄胶囊经临床验证270例，其中上呼吸道感染76例，急性扁桃腺炎10例，咽喉炎78例，急性胃肠炎24例，肺炎40例，气管炎42例，治愈136例，占50.4％；有效120例，占44.4％；无效14例，占5.25％；总有效率为94.8％。金果榄酒精浸物外敷治疗输液性静脉炎78例，治愈64例，占82.2％；好转12例，占15.2％；无效2例.占2.6％；总有效率为97.4％。与对照组硫酸镁相比，治愈率和有效率经统计学处理均有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)。
虽然金果榄有如此好的临床应用效果，但由于对其化学成分研究不深入，药理筛选不足，导致活性成分不明确以及没有可行的质量标准。我们通过对金果榄药材进行系统的化学成分分离、纯化、结构鉴定，发现金果榄中主要含有大量的二萜内酯及原小檗碱型生物碱，进一步的药理活性筛选证明，二萜内酯中主要为古伦宾(columbin)、异古伦宾(isocolumbin)、去氧黄藤苦素(fibleucin)，是其抗炎、抑制胃窦平滑肌节律、镇痛的活性成分。
发明内容
本发明的目的在于提出古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素在制造用于预防和治疗急慢性炎症、胃痉挛、胃痛及相关疾病药物中的应用。
本发明所说的古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素的结构式为 古伦宾结构式 异古伦宾结构式去氧黄藤苦素结构式本发明提出的古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素可从金果榄药材或其他植物中提取，经分离纯化得到，也可以是经化学合成的方法制备得到。
发明人实验研究证明，古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素具有抗炎，镇痛，抑制胃窦平滑肌痉挛，保护胃粘膜急性损伤的作用。
古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素中的一种或多种可以作为制备预防和治疗急慢性炎症、胃痉挛、胃痛及相关疾病的药物的有效成分。
古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素加上一种或多种药学上可以接受的载体可以制备成临床治疗的药物，用于治疗急、慢性炎症，如上呼吸道感染，扁桃腺炎，咽喉炎，胃肠炎，肺炎，气管炎，静脉炎等，治疗胃痉挛、胃痛等疾病。
上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠，吸收促进剂如季铵化合物，表面活性剂如十六烷醇，吸附载体如高岭土或皂粘土，润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、镁或聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素的制剂可以通过口服，经皮、鼻吸入，直肠、肠胃外、静脉或肌肉给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂。
古伦宾、异古伦宾和去氧黄藤苦素可以从金果榄药材中提取分离制备而得。具体提取方法如下金果榄药材粉碎后以70％浓度以上的乙醇溶液回流提取2～3次，每次1～3小时，合并提取液，减压浓缩，得浸膏；用水分散浸膏，用氯仿萃取2～4次，减压浓缩萃取部位，得粗品；将粗品用甲醇加热至溶解，再过滤；将滤液置于4℃冰箱中冷藏过夜，析出古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素组合物晶体；取组合物上硅胶柱，以石油醚—氯仿系统梯度洗脱，合并含有相同成分的洗脱液，减压浓缩至干，即得到古伦宾、异古伦宾和去氧黄藤苦素单体。
我们对古伦宾、异古伦宾和去氧黄藤苦素进行了药理学实验，证实其具有抗炎、抑制胃痉挛、胃痛的作用。具体实验过程和结果如下一、古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素的镇痛作用(一)醋酸扭体模型1实验动物Swiss种小鼠，雄性，体重20-24g。
2.实验模型和测试方法取小鼠80只，随机分成8组，按表1所示的剂量灌胃给药3d，于末次给药后1h，腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只。观察20min内小鼠扭体次数，计算疼痛抑制率。
3统计分析全部实验结果均以均数±标准误表示。用student t-检验比较两组间数据的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。
4试验结果表1.古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素的镇痛作用
b与空白对照比较，p＜0.01，c与空白对照比较，p＜0.001.
(二)热板模型1实验动物昆明种小鼠，雌性，体重18-22g。
2.实验模型和测试方法取一只2000ml大烧杯放置于55±0.5℃恒温水浴箱中，预热10min.每次1只小鼠放在热板上，小鼠自放在热板上至出现舔后足所需时间(秒)作为该小鼠的痛阈值。凡舔后足时间小于5s或大于30s或跳跃频繁者弃之不用。取合格小鼠80只，随机分成8组，重复测其正常痛阈值，取两次正常痛阈值的平均值作为该鼠给药前的痛阈值。按表2所示的剂量灌胃给药，测定给药后30min内小鼠痛阈值并计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)/用药前平均痛阈值×100％。
4试验结果表2.古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素的镇痛作用
a与空白对照比较，p＜0.05.b与空白对照比较，p＜0.01以上实验结果表明，古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素对醋酸扭体模型和热板模型动物呈阳性结果，提示具有显著的镇痛作用。
二、古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素的抗炎作用(一)小鼠耳肿胀模型1实验动物Swiss种小鼠，雄性，体重20-24g。
2.实验模型和测试方法取小鼠80只，随机分成8组，按表3所示的剂量灌胃给药3d，于末次给药后1h，用0.05ml的二甲苯将小鼠左耳致炎，用直径为7mm的打孔器将双耳重叠打孔，将打下的圆片在扭力天平(灵敏度为万分之一)上称量，用鼠耳两圆片的重量差表示其肿胀度。
3统计分析全部实验结果均以均数±标准误表示。用student t-检验比较两组间数据的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。
4试验结果表3.古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素的抗炎作用
a与空白对照比较，p＜0.05.b与空白对照比较，p＜0.01.
(二)大鼠角叉菜胶足肿胀模型1实验动物SD大鼠，雌雄兼用，体重180-220g。
2.实验模型和测试方法取大鼠80只，随机分成8组，按表4所示的剂量灌胃给药4d，于末次给药前测量致炎前容积；末次给药后30min，于大鼠右后肢足跎皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎。分别于致炎后2、4、6h测量右踝关节以下容积。
3统计分析全部实验结果均以均数±标准误表示。用student t-检验比较两组间数据的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。
4试验结果表4.古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素对大鼠角叉菜胶足肿胀的影响
a与空白对照比较，p＜0.05.b与空白对照比较，p＜0.01.
(三)小鼠腹腔毛细血管通透性试验1实验动物NH系小鼠，雌雄兼用，体重18-22g。
2.实验模型和测试方法取大鼠80只，随机分成8组，按表5所示的剂量灌胃给药1h，尾静脉注射2％依文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g体重，随即腹腔注射0.8％醋酸生理盐水溶液0.20ml/只，20min后脱颈椎处死小鼠，用5ml生理盐水分数次洗涤腹腔，3000转/分，离心15min；取上清液用酶标仪于570nm比色测定其光密度(OD)值3统计分析全部实验结果均以均数±标准误表示。用student t-检验比较两组间数据的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。
4试验结果表5古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
a与空白对照比较，p＜0.05.
以上实验结果表明，古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素能降低小鼠腹腔毛细血管的通透性，对大鼠耳肿胀模型和角叉菜胶足肿胀模型呈阳性结果，提示具有抗炎作用。
三、古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素对豚鼠胃窦平滑肌自发节律振幅的影响1实验动物Hartley种豚鼠，雄性，体重250～350g。
2.实验模型和测试方法采用离体肌张力测定系统测定受试药物对豚鼠胃窦平滑肌条自发节律振幅的影响。
1)豚鼠胃平滑肌分离方法将豚鼠击昏，断头处死，立即剖腹取出全胃，沿胃小弯剪开，用Krebs液(mMNaCl 118，NaHCO325，KCl 4.7，KH2PO41.2，CaCl22.5，MgSO41.2，葡萄糖11，pH＝7.35-7.45)冲洗干净，再用精细镊子迅速剥离胃窦粘膜，沿环行肌方向剪成2×8mm肌条。固定在含有10ml的充灌5％CO2+95％O2混合气体、温度维持在37℃的Krebs液浴槽中。
2)胃窦平滑肌条自发节律振幅的测定平滑肌肌条的下端固定在浴槽底部，上端连接MLT 0202/D型张力换能器(ADInstrument)，换能器的输出通过PowerLab/4SP生物信号处理系统处理和通过Chart v3.4.6(PowerLab)软件记录、存储和分析。肌条的起始张力调节到0.5g，平衡时间不少于60分钟，每20分钟换液1次，防止代谢产物的累积。当胃平滑肌肌条自发节律规则稳定后开始实验，将受试药物按1、3、10、30、100、300、1000μg/ml的浓度累积加药测试，每次加药间隔10分钟。
3)实验数据表示以加药前肌条平衡后自发节律的幅度为100％，药物对平滑肌张力的影响以(加药后自发节律的幅度/平衡时自发节律的幅度)×100％表示。
4)统计分析全部实验结果均以均数±标准误表示。用student t-检验比较两组间数据的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。
3实验结果表6.古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素对豚鼠胃窦平滑肌自发节律振幅的影响(％，n表示样本数)
*与平衡时平滑肌自发节律振幅比较，p＜0.05以上结果表明，古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素对豚鼠胃窦平滑肌自发节律振幅对豚鼠胃窦平滑肌自发节律振幅即有明显的抑制作用(p＜0.05)，且浓度依赖性地抑制豚鼠胃窦平滑肌自发节律振幅。
四、古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素抗胃损伤效应(一)乙醇急性胃损伤模型1实验模型和测试方法Sprague-Dawley种大鼠禁食不禁水24h，在口服1ml的99.5％乙醇，乙醇处理后1小时，处死动物，切腹取胃，胃内注入1％的福尔马林10ml进行固定。10分钟后，沿胃大弯切开，测量损伤程度。在解剖显微镜(×10)的方型坐标的视野下，计算胃损伤长度(mm)，每个动物损伤长度的总和代表损伤指数。给药的动物在口服乙醇前1小时给药。
2胃形态学观察Sprague-Dawley种大鼠经造模后，处死，切腹取胃，胃内注入1％的福尔马林10ml进行固定。10分钟后，沿胃大弯切开，测量损伤程度。在解剖显微镜(×10)的方型坐标的视野下，计算胃损伤长度(mm)，每个动物损伤长度的总和代表损伤指数。
3统计分析全部实验结果均以均数±标准误或标准差表示。用student t-检验法比较两组间数据的显著性，P值小于0.05，表示具有显著性意义。
4实验结果表7古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素乙醇引起的大鼠胃损伤和酸分泌的影响
a与空白对照比较，p＜0.05.
(二)消炎痛急性胃损伤模型1实验模型和测试方法Sprague-Dawley种大鼠禁食不禁水24h，在口服200mg/kg体重的消炎痛，消炎痛处理后3.5小时，尾静脉内注射0.5ml的5％Evens blue，0.5小时后处死动物，切腹取胃，胃内注入1％的福尔马林10ml进行固定。10分钟后，沿胃大弯切开，测量损伤程度。在解剖显微镜(×10)的方型坐标的视野下，计算胃损伤长度(mm)，每个动物损伤长度的总和代表损伤指数。给药的动物在口服消炎痛前1小时给药。
2胃形态学观察
Sprague-Dawley种大鼠经造模后，处死，切腹取胃，胃内注入1％的福尔马林10ml进行固定。10分钟后，沿胃大弯切开，测量损伤程度。在解剖显微镜(×10)的方型坐标的视野下，计算胃损伤长度(mm)，每个动物损伤长度的总和代表损伤指数。
3统计分析全部实验结果均以均数±标准误或标准差表示。用student t-检验法比较两组间数据的显著性，P值小于0.05，表示具有显著性意义。
4实验结果表8古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素消炎痛引起的大鼠胃损伤和酸分泌的影响
a与空白对照比较，p＜0.05.
(三)胃酸分泌增加模型1实验模型和测试方法Sprague-Dawley种大鼠禁食不禁水24h，腹腔注射300mg/kg组胺，4小时之后，处死动物，打开腹腔，结扎贲门与幽门后将胃取出，收集胃液，经5,000rps离心后，测定pH值和H+含量。给药的动物在注射组胺前1小时给药。
2胃酸的测定通过pH211型pH计(HANNA，USA)测定其pH值，通过Metrohm电位滴定仪(MetrohmCo.，Switzerland)应用pH-stat技术测定灌流液中H+含量。取胃液1ml，用0.1M的NaOH将pH滴定到7.0，进行胃酸的测定。
3统计分析全部实验结果均以均数±标准误或标准差表示。用student t-检验法比较两组间数据的显著性，P值小于0.05，表示具有显著性意义。
4实验结果表9古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素组胺引起的大鼠酸分泌的影响
a与空白对照比较，p＜0.05.
以上结果表明，古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素对乙醇急性胃损伤模型、消炎痛急性胃损伤模型和胃酸分泌增加模型均呈阳性结果，提示古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素具有抗胃损伤效应。
图1古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素对豚鼠胃窦平滑肌自发节律振幅影响的量效曲线(％)。
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
具体实施例方式
实施例1金果榄干燥药材2.5kg，用95％溶液50升回流提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压浓缩得到浸膏120g，用2升水分散后，以6L氯仿分三次萃取；减压浓缩萃取部位，得到粗品20g，将粗品用500毫升甲醇加热溶解，趁热过滤，滤液置4℃冰箱中冷藏过夜，析出古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素组合物结晶，滤纸过滤，干燥，得到组合物12g，取组合物10g，与50g硅胶混合拌样，加到已装好的硅胶柱顶端，以石油醚∶氯仿(20∶1～5∶1)系统梯度洗脱，TLC跟踪，合并含成分相同的洗脱液，减压浓缩至干，得到古伦宾单体200mg，异古伦宾3.7g，去氧黄藤苦素3.0g。
实施例2片剂活性成分(三种单体或组合物)17g乳糖200g玉米淀粉50g硬脂酸镁3g制成1000片制备方法将活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润制成软材，把湿润后的混合物制粒，过20目筛，80℃烘干，加入硬脂酸镁，再过筛，然后将混合物压片，每片重270mg，活性成分含量为17mg。
本发明的活性成分与相关载体结合，还可以制成其他固体制剂，如粉剂、粒剂、胶囊等。这些制剂的工艺已很成熟，这里不一一列举。
实施例3输液活性成分(三种单体或组合物)2g氯化钠 9g注射用水100000ml制成1000瓶制备方法将活性成分和氯化钠溶解于100000ml的注射用水中，加0.01％活性炭吸附，中间体检测，0.45um膜过滤，分装，100ml/瓶，灭菌，检验即得。
本发明的活性成分与相关辅剂结合，还可以制成其他液体制剂，如鼻喷雾剂、注射剂等。
上述这些药物剂型均可有效地用于治疗和预防急慢性炎症及胃痉挛、胃病及相关疾病。
权利要求
1.古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素在制备预防和治疗急慢性炎症及相关疾病药物中的应用。
2.古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素在制备预防和治疗胃痉挛、胃痛及相关疾病药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素从植物中分离纯化得到，或由化学合成。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素为单一化合物或两两组合物或三种的组合物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于急慢性炎症包括上呼吸道感染，扁桃腺炎，咽喉炎，胃肠炎，肺炎，气管炎，静脉炎。
6.用于预防和治疗急性和慢性炎症、胃痉挛、胃痛的药物，其中含有治疗有效量的古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素一种或几种及药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于剂型包括注射剂，片剂，丸剂，胶囊剂，溶液，悬浮液，乳剂的形式。
全文摘要
本发明属医药技术领域，具体为古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素在制备预防和治疗急慢性炎症、胃痉挛、胃痛药物中的应用。研究表明，古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素具有抗炎、镇痛、抑制胃窦平滑肌痉挛、保护胃粘膜急性损伤的作用。因此，以古伦宾、异古伦宾、去氧黄藤苦素为有效成分，配以药学上可以接受的载体，可制成用于治疗急慢性炎症、胃痉挛、胃痛及相关疾病的药物。该药物的剂型包括片剂、粉剂、粒剂、胶囊、输液、注射剂等。
文档编号A61P1/04GK1839825SQ20061002348
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月19日 优先权日2006年1月19日
发明者张卫东, 史琪容, 张川, 苏娟, 柳润辉, 徐希科 申请人:中国人民解放军第二军医大学