专利名称：冬凌草甲素在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及冬凌草甲素的用途，尤其涉及其在制药领域中的应用。
背景技术：
髓性白血病包括急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)。急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一种异质性的恶性血液肿瘤，也是发生在成人中最普遍的急性白血病种类。据资料记载，仅2003年就有大约11,000个美国人被诊断为AML，其中大约75％的病人最终由于该病死亡。而在中国，每年新增急性白血病患者达四万名之多。AML病人表现为造血细胞的正常分化以及凋亡途径受阻，骨髓造血祖细胞增殖异常，导致骨髓及外周血中不成熟的原始细胞大量积累，影响了正常血细胞的生成与功能，导致患者出血、贫血并易发感染，而且白血病细胞会在肝、脾等其它脏器浸润、播散，最终使器官功能衰竭而导致病人死亡。
在过去的二十年间，人们对于AML在生物学、分子生物学和细胞遗传学等方面的认识取得了很大的进展，尤其是发现染色体易位参与白血病的发生。例如，1982年在M2b型AML病人中发现特异的t(8；21)易位，约10年后，断裂点及受累基因被发现。而另外一种白血病，急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)也是一种常见的血液恶性肿瘤，占急性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的10-15％，临床表现为粒细胞分化被阻滞于早幼粒细胞阶段，法-美-英(FAB)分类为M3型。Larson RA及Hogge DE等于1984年发现该型白血病含有特异的t(15；17)染色体易位，并提出该易位与骨髓细胞分化阻滞于早幼粒细胞阶段有关，1990-1991年数个研究小组几乎同时报道了t(15；17)所致的PML-RARα融合基因，随后又证明了其致白血病潜能。人们对AML取得巨大认识的同时，对于AML病人的治疗也取得了长足进步。例如以往对APL的治疗一直采用传统的细胞毒性化疗为主，该方法容易导致8-46％的病人发生致死性的颅内出血。直到1988年，全反式维甲酸(all-transretinoid acid，ATRA)分化疗法的发现使得该病的治疗有了重大突破。上海市血液学研究所的科研小组发现单用ATRA即可使含有t(15∶17)易位的APL病人获得完全缓解。随后对其分子机制的研究发现，ATRA可与PML-RARα中的RARα部分结合，使核共抑制物解离，从而恢复了RARα的转录功能，下游靶基因得以转录，使细胞重新进入分化程序。Raelson等发现，ATRA处理可以特异地降解PML-RARα融合蛋白，从而使PML-RARα对野生型PML和RARα的显性负的抑制作用被解除。1996-1997年间，我国学者再次令世界医学界震惊，他们发现三氧化二砷(As2O3)不仅可以诱导APL细胞系NB4细胞凋亡，而且能够特异地降解PML-RARα融合蛋白。更有意思的是，低剂量As2O3可部分诱导APL细胞分化，而高剂量可诱导凋亡。临床实验表明As2O3可使APL初发病人及ATRA治疗后复发的APL患者获得完全缓解。而且ATRA和As2O3联合使用不但在APL小鼠模型中取得良好效果，而且在临床上治疗APL初发病人也取得了比单独使用ATRA及As2O3更好的治疗效果。ATRA及As2O3作为靶向治疗的典型已被广泛接受。目前，ATRA和蒽环类化合物，或与三氧化二砷的联合治疗应用，使得APL这一含特异的t(15；17)染色体易位的M3型AML在大多数患者可被治愈。虽然阿糖胞苷和含蒽环类化合物化疗的应用以及先进的支持治疗，使得其它类型AML的预后也逐渐得以改善，并使约75-80％的AML病人得到临床缓解，但大部分病人仍会复发。干细胞移植过于昂贵且供体有限、移植相关死亡亦达25％-30％，故难以推广。而且，对年纪大的AML患者而言，大剂量化疗的效果仍然不理想。因此，有必要开发新的药物以治疗该类疾病。由于凋亡是多细胞动物用于排除有害细胞的重要机制，并在发育、免疫系统成熟、组织动态平衡和衰老中起着重要作用，因而发展选择性诱导白血病细胞凋亡的药物也已成为治疗AML的一种可行的途径。
冬凌草甲素及香茶菜属二萜类化合物抗肿瘤研究进展香茶菜属植物是我国民间广泛使用的草药，它们大都具有清热解毒、活血化淤、抗菌消炎，抗肿瘤等功效。特别是河南等省产的冬凌草，除用于抗菌消炎外，还应用于食道癌、贲门癌等癌症。这类植物富含二萜化合物，特别是结构独特的对映-贝壳杉烷类二萜化合物。冬凌草甲素(oridonin)是从唇形科香茶菜属植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类(ent-kau-renediterpenoid)天然有机化合物，该化合物中的α-亚甲基环戊酮结构和抗肿瘤活性相关，也有报道该分子中的7β-OH和14β-OH亦被认为与肿瘤细胞中特殊酶的结合位点而起着增强抗癌活性的作用。冬凌草甲素为无色棱柱状结晶，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂。以前人们对冬凌草甲素多种生物学活性有了初步的认识，如免疫调节、抗病毒、抗炎、抗肿瘤活性。最近的实验室和临床前实验研究数据提示了冬凌草甲素具有强烈的抗肿瘤活性，对多种实体肿瘤有效，如前列腺癌，乳腺癌，非小细胞肺癌以及肝癌、食管癌、胰腺癌等。
M2b型白血病的发病机制概述急性髓系白血病(acute myeloidleukemia，AML)是因转化的骨髓干、祖细胞增殖而形成的恶性血液疾病，而染色体易位是导致造血祖细胞恶性转化的最常见的原因。其中t(8；21)(q22；q22)易位的白血病约占10-15％，在M2b型白血病中更是占到了40％-80％以上。在形态学上含有t(8；21)易位的白血病90％以上属于M2b亚型。另外在部分FAB M4型白血病中也含有t(8；21)。t(8；21)易位所累及的基因AML1和ETO，易位后形成AML1-ETO融合基因，它对M2b型白血病的形成有很重要的作用。大量研究发现，AML1(acute myeloidleukemia 1)也是许多其他类型人类白血病中染色体重排的靶基因，如t(1；21)、t(16；21)、t(12；21)，分别产生融合基因AML1-EVI-1、AML1-MTG16和TEL-AML1。inv(16)通过产生CBFβ-MYH11融合基因，破坏了与AML1形成异源二聚体的伙伴CBFβ，而间接影响了AML1的功能。可见AML1在造血过程中具有非常重要的作用。编码AML1的基因位于21号染色体长臂22区。AML1在正常情况下只在造血组织和髓系分化时表达，也在神经组织、骨胳肌和再生组织中表达。目前已知AML1蛋白有三种异构体，分别为AML1a(250aa)、AML1b(453aa)和AML1c(480aa)(又称AML1B)。AML1B有如下重要结构域。1)Runt同源的DNA结合结构域(Runt Homology DNA-binding Domain，RHD)。由AML1中间约118个氨基酸组成，因与果蝇的Runt蛋白同源而得名。它与DNA结合的一致序列为TGT/cGGT。此外，AML1也通过此结构域与CBFβ形成异源二聚体，共同调节基因表达。2)PST区含有可被磷酸化的位点。3)核基质结合位点(Nuclear Matrix Attachment Sequence，NM)可能和AML1的核定位有关。4)两个转录激活结构域(Transcriptional Activation Domain，TA)作用较强的一个位于AML1的C端，较弱的一个则包含PST和NM。5)可能的转录抑制结构域(Repression Domain，RD)有两个，一个紧靠RHD的C端，另一个位于NM和TA之间。此外，在AML1的C末端存在着由5个氨基酸组成的保守序列VWRPY，可与转录共抑制物Groucho/TLE1-4结合，抑制靶基因的转录。AML1主要通过与CBFβ形成异源二聚体而行使其功能。CBFβ不具有结合DNA的能力，但可稳定AML1与DNA的结合。受AML1调控的造血相关基因很多，如GM-CSFR、M-CSFR、IL-3、MPO、TCRβ、NE以及NP-3等。近年来的研究发现，单有AML1的结合位点还不足以使基因的启动子有活性，许多基因的启动子上，与AML1结合位点毗邻的常有其它转录因子的结合位点，如Myb、Ets、AP1以及C/EBP等。因此，有人认为AML1/CBFβ是作为转录组织者起作用。AML1/CBFβ通过与一些基因的增强子序列结合后，可募集其它转录因子，形成与激活复合物共同起作用，可能通过P300/CBP等共激活因子的组蛋白乙酰化酶活性，使染色质组蛋白乙酰化，从而导致染色质结构松散，以利于转录。AML1在造血中的中枢调节作用已被AML1基因敲除鼠证实。AML1-/-鼠是胚胎致死的，首先是死于神经组织出血，其次是造血缺陷。AML1+/-鼠显示正常的形态，并有卵黄囊来源的原始红细胞。但在卵黄囊和胎肝中缺乏永久的造血祖细胞。AML1杂合子动物髓系和红系的祖细胞减少，另一个等位基因的失活占AML的2％。曾有两例病人的两个AML1等位基因同时突变，结果产生M0型的AML。
ETO的功能ETO(Eight-Twenty-One)基因位于8号染色体长臂22区，编码一种604个氨基酸的核磷蛋白。主要在脑和CD34+造血细胞中表达，其具体功能还不十分清楚，只是从序列分析中，发现它与果蝇的Nervy基因同源。目前已知ETO有四个重要的结构域。1)与果蝇TAF110转录因子同源区。2)疏水七价重复序列(Hydrophobic Heptad Repeat，HHR)。3)Nervy同源域。4)C端的两个锌指结构域，后一个锌指也称MYNY结构域。也有人将以上四个结构域命名为NHR1-4，NHR2可形成两亲性螺旋，介导同源或异源二聚化，且这种结合很稳定。NHR4的两个锌指结构域可与SMRT和N-CoR作用。包含NHR2及其两侧(236-432aa)的一段称为CRD(Core Repressor Domain)，与mSin3A有强烈作用。目前还没有证据表明ETO可以和DNA结合。但已证实ETO可以通过和N-CoR、SMRT、mSin3A等共抑制物结合，募集组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，使组蛋白去乙酰化，染色体结构变紧密，从而抑制基因的转录。
AML1-ETO融合基因导致白血病的可能机制t(8；21)异位产生的AML1-ETO融合蛋白AML1的N端部分(177aa)和几乎全长的ETO(C端575aa)，因此可以和CBFβ形成异源二聚体，并可与DNA结合，而且AML1-ETO与CBFβ的亲合力比野生型大。据此提出了AML1-ETO融合蛋白是AML1显性抑制物的假说，而且也有实验证明了AML1-ETO可以抑制AML1对TCRβ增强子、IL3和GM-CSF启动子的激活作用，但不影响这些启动子本底水平的表达。另外，AML1-ETO杂合子小鼠是胚胎致死的，与AML1基因敲除小鼠表型几乎相同，表现为中枢及外周神经出血及胎肝造血受阻。关于AML1-ETO的转录抑制机制也提出了几种假说，如竞争DNA结合位点、与周围其它因子作用、与共抑制物作用或与本底转录机器作用等。AML1-ETO部分删除实验表明，ETO的C端序列(含HHR和MYND domain)是其抑制功能所必需的。且MYND domain中的两个锌指结构中任何一个单位点突变都会使其抑制功能丧失，提示AML1-ETO可能通过与其它因子作用，来介导转录抑制。如前所述，ETO部分可与N-CoR、SMRT及mSin3A等共抑制物结合，形成一高分子量的抑制复合物，利用其组蛋白去乙酰化酶活性，导致染色质组蛋白去乙酰化，使染色质的结构紧缩，从而使一些与造血细胞增殖、分化密切相关的基因的转录被抑制，最终使造血细胞分化受阻、增殖异常而致白血病。HDAC的抑制剂削弱AML1-ETO介导的转录抑制，似可支持这一观点。另外的研究发现，AML1-ETO可和AML1协同作用，激活M-CSFR，已检测到Kasumi-1细胞系表达M-CSFR比单核细胞系U937高，而M-CSFR是由原癌基因c-fms编码的受体酪氨酸激酶。来自M2型病人的骨髓也比正常骨髓的M-CSFR水平高。M-CSFR的信号传导可通过诱导G1/S过渡而促进细胞的增殖。AML1-ETO还可以激活Bc1-2的启动子，所以它也有可能通过促进细胞增殖、抑制凋亡而致白血病。
然而，在AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，AML1-ETO的表达并不引起白血病；在造血重建实验中，受致死量照射的小鼠接受表达AML1-ETO的造血干/祖细胞后也不能发生白血病。这些结果提示了AML1-ETO单独表达不能引起白血病，须与其他的基因突变协同才能引起AML的发生。一些实验证实了这些推测。在AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，应用化学诱变剂ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)诱导产生新突变后使AML1-ETO阳性小鼠发生了AML。有证据显示t(8；21)白血病的发生是逐步发生的，AML1-ETO融合蛋白的产生是第一步，是基础的遗传学的改变，而C-KIT途径的激活是第二步，也是发展成完全白血病关键的一步。在此模型中，前者阻碍了细胞正常的分化途径，而后者则授予造血细胞增殖和/或抗凋亡的能力，这二者的协同作用可能是白血病形成的原因。
虽然目前关于冬凌草甲素的研究很多，但迄今为止，还没有关于冬凌草甲素在制备治疗急性白血病药物中的应用的研究报道。
在中国专利申请号2004100168916，公开了一种降解AML1-ETO融合蛋白的方法及所用试剂。在该件专利申请只是概括性地描述了冬凌草甲素可以降解AML1-ETO融合蛋白，没有记载冬凌草甲素对一些适应症的动物模型或临床实验数据。
发明内容
本发明的目的在于(1)提供冬凌草甲素在制备治疗急性白血病药物中的应用。
(2)提供冬凌草甲素在制备治疗慢性粒细胞性白血病药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的首先，进行冬凌草甲素对具有t(8；21)染色体易位白血病细胞作用的研究，包括对Kasumi-1细胞株、转染AML1-ETO的U937细胞(称为U937-A/E细胞)、从M2b型，进行冬凌草甲素对其他白血病细胞作用的研究；然后，建立两种t(8；21)白血病小鼠模型，再用冬凌草甲素进行治疗，以观察冬凌草甲素在动物水平的抗白血病作用。
冬凌草甲素对具有t(8；21)染色体易位白血病细胞作用的研究分以下几部分首先，进行冬凌草甲素诱导具有t(8；21)染色体易位白血病细胞凋亡的体外研究。发现冬凌草甲素在体外可以诱导t(8；21)白血病细胞凋亡。
其次，进行冬凌草甲素诱导t(8；21)白血病细胞凋亡分子机制研究。在冬凌草甲素诱导具有t(8；21)染色体易位白血病细胞凋亡的体外研究的基础上试图找寻冬凌草甲素是如何在体外诱导t(8；21)白血病细胞凋亡的。结果显示冬凌草甲素可以诱导Kasumi-1细胞线粒体跨膜电位的崩解和细胞色素C从线粒体中释放，同时使caspase-3和caspase-9的活化，证明在冬凌草甲素诱导Kasumi-1细胞凋亡的过程中存在内源凋亡通路的激活。同时发现了凋亡过程中存在AML1-ETO融合蛋白降解。
再次，进行AML1-ETO融合蛋白上的caspase-3切割位点的研究。在研究冬凌草甲素诱导Kasumi-1细胞及其他AML1-ETO融合蛋白阳性细胞(U937-A/E)凋亡过程中发现了AML1-ETO融合蛋白的降解这一现象，而AML1-ETO融合蛋白在白血病的发病中起着关键的作用。在对AML1-ETO融合蛋白降解机制的研究中发现了AML1-ETO融合蛋白的降解是通过活化的Caspase-3切割的，并且首次确定了一个重要的Caspase-3切割位点Asp188。
最后，进行冬凌草甲素对t(8；21)染色体易位相关移植性白血病小鼠治疗作用及其机制研究。在我们建立了截短型AML1-ETO(ΔAE)移植小鼠模型和Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型后，在这两个模型中均证明了冬凌草甲素具有治疗作用。确认了冬凌草甲素可以延长ΔAE移植小鼠的生存时间，并且可以在体内诱导发病鼠脾脏细胞的凋亡。我们还比较了冬凌草甲素与阿糖胞苷对Δ-AE移植性白血病小鼠模型的疗效，发现冬凌草甲素在2.5mg/kg/d的剂量下对Δ-AE移植小鼠治疗10天产生的疗效与阿糖胞苷25mg/kg/d治疗5天(小剂量阿糖胞苷)的疗效相当，7.5、15mg/kg/d冬凌草甲素的疗效优于小剂量阿糖胞苷；25mg/kg/d阿糖胞苷治疗10天(大剂量阿糖胞苷)虽然对部分白血病小鼠(4/9)的疗效较冬凌草甲素好，但却引起其他小鼠(5/9)的早期死亡(生存时间仅为18天)。与大剂量阿糖胞苷不同，冬凌草甲素在2.5-15mg/kg/d的剂量下并不引起小鼠骨髓抑制或体重减轻。因而冬凌草甲素在白血病的治疗中有疗效确切、毒副作用小的特点。在Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型，冬凌草甲素可以显著抑制皮下移植瘤的增长，也显示了冬凌草甲素的体内抗白血病作用。
上述研究显示1、冬凌草甲素在制备治疗急性白血病药物中的应用。
2、冬凌草甲素在制备治疗含有AML1-ETO融合基因的急性髓性白血病药物中的应用。
3、冬凌草甲素在制备治疗不含有AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病药物中的应用。
4、冬凌草甲素在制备治疗急性单核细胞性白血病药物中的应用。
5、冬凌草甲素在制备治疗急性早幼粒细胞性白血病药物中的应用。
6、冬凌草甲素在制备治疗慢性粒细胞性白血病药物中的应用。
7、冬凌草甲素治疗不引起骨髓抑制或体重减轻，因而是一种相对安全的抗白血病药物。
本发明所公开冬凌草甲素在制药中的应用，其优点表现在(1)本发明对冬凌草甲素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
(2)本发明的冬凌草甲素安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
(3)冬凌草甲素在体外可以诱导t(8；21)白血病细胞凋亡。
(4)冬凌草甲素诱导kasumi-1细胞凋亡的过程中存在内源凋亡通路的激活。同时在凋亡过程中存在AML1-ETO融合蛋白的降解。
(5)我们发现了冬凌草甲素对AML1-ETO融合蛋白的降解是通过活化的caspase-3切割的，并且首次确定了一个重要的caspase-3切割位点Asp188。
(6)我们建立了Δ-AE移植小鼠模型和Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型。从Δ-AE小鼠脾脏分离出的白血病细胞，在体外培养时加入冬凌草甲素可诱导其凋亡。进一步体内实验研究显示冬凌草甲素能延长Δ-AE移植鼠的生存时间，抑制Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，而且在这两种小鼠模型中可显著减少肝脏、脾脏及骨髓中白血病细胞的浸润。提示冬凌草甲素有很强的抗白血病效果。
图1冬凌草甲素的化学结构(C20H28O6)。
图2A冬凌草甲素诱导t(8；21)白血病细胞凋亡。用冬凌草甲素处理Kasumi-1细胞后进行瑞氏染液染色，并在显微镜下进行形态学观察，显示细胞出现了凋亡特征性的改变。
图2BAnnexin V/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡。
图2C用冬凌草甲素处理后Kasumi-1细胞发生凋亡的比例(AnnexinV阳性的比例)。
图3冬凌草甲素可以使Kasumi-1细胞PI(-)Rh123阳性细胞明显减少，说明其可诱导粒体跨膜电位的崩解，这种作用呈时间和剂量依赖性。
图4WB中显示了冬凌草甲素处理的Kasumi-1细胞4小时后就出现了细胞色素C释放以及Casapse-3，Casapse-9的活化，也显示了Casapse-3的底物PARP发生了降解，这些变化在24小时最显著，并且具有时间依赖性。
图5(A)WB检测显示冬凌草甲素可以引起Kasumi-1细胞内的融合蛋白AML1-ETO的降解。(B)WB检测显示冬凌草甲素可以引起诱导表达AML1-ETO融合蛋白的U937细胞系(U937-A/E)的AML1-ETO蛋白的降解。
图6Caspase-3特异抑制剂Z-DQMD-FMK阻止了冬凌草甲素引起的AML1-ETO融合蛋白的降解。箭头所指为降解片段。
图7瞬时转染含有Asp188Ala突变的pFLAG-CMV4-A/E质粒的U937细胞中没有见到AML1-ETO融合蛋白的降解片段。而在转染野生型和含有Asp171Ala或Asp192Ala突变的pFLAG-CMV4-A/E质粒的U937细胞，冬凌草甲素仍可引起AML1-ETO融合蛋白存的降解。箭头所指为降解片段。
图81％F68(pluronic)进行增溶的冬凌草甲素(ori/P)对Kasumi-1的细胞毒作用和DMSO溶解的冬凌草甲素(ori)一致。
图9Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤病理检测显示其中布满了大小不等的瘤细胞。
图10Kasumi-1细胞移植瘤小鼠脾脏、肝脏、骨髓在有无冬凌草甲素作用下的病理学检测。示冬凌草甲素可明显减轻白血病细胞的浸润、播散，使受到破坏的脾脏、肝脏、骨髓结构恢复正常。
图11冬凌草甲素可以抑制Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。
图12AΔAE移植鼠的外周血及骨髓和正常的C57小鼠相比，充斥着大量不成熟细胞。
图12BΔ-AE移植鼠的肝、脾有大量异常细胞的浸润。
图13体外经冬凌草甲素处理24小时后，Δ-AE移植鼠脾脏分离出来的白血病细胞出现了大量的凋亡细胞。
图14A组织切片显示，经冬凌草甲素治疗的Δ-AE移植鼠的肝脏、脾脏白血病细胞浸润情况明显得到改善。
图14B与对照组相比，经冬凌草甲素治疗的Δ-AE移植鼠的脾脏肿大明显得到改善。
图14C外周血涂片显示，对照组Δ-AE移植鼠中有大量的原始细胞存在，而冬凌草甲素治疗组上述细胞明显减少。
图15冬凌草甲素治疗明显延长Δ-AE移植鼠的生存时间。其中对照组(control)n＝11，冬凌草甲素2.5mg/kg/d组(ori2.5)组n＝8，冬凌草甲素7.5mg/kg/d组(ori7.5)组n＝12，冬凌草甲素15mg/kg/d组(Ori15)n＝8，大剂量阿糖胞苷组(Ara-C-H)n＝9，小剂量阿糖胞苷组(Ara-C-L)n＝6。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1冬凌草甲素诱导t(8；21)白血病细胞凋亡体外研究一、材料和方法1.试剂和仪器冬凌草甲素纯度为98％-99.8％。应用DMSO(Sigma)溶解制备成10-2mol/L浓度的储存液储存在-20℃。碘化丙碇(Propidium Iodide，PI)为美国Sigma公司产品，碘化丙碇用三蒸水配成250μg/mL的储存液，4℃避光保存。胎牛血清购自美国Hyclone公司。Annexin V检测试剂盒(ApoAlert Annexin-V kit)购自美国BD Biosciences公司。流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品。荧光显微镜(Olympus，BX60)及相差显微镜(Olympus，IMT)均购自日本Olympus公司。细胞涂片仪cytospin购自英国Shandon公司。
2.细胞培养和处理，细胞形态学观察人类t(8；21)白血病细胞株Kasumi-1(购自美国生物资源中心，ATCC)，以2×105/ml的起始浓度接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液中，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下常规培养。Kasumi-1细胞在指数生长期时，细胞密度调整到3×105/ml，应用冬凌草甲素处理，具体应用0.5μM，2μM，5μM三个浓度，在5μM浓度下选择0h，4h，8h，12h，24h时间点。对照组加入DMSO，浓度为冬凌草甲素处理组相应的最高DMSO浓度。处理结束后应用Cytopro甩片仪甩片后晾干，瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态。
3.Annexin V方法检测细胞凋亡按照Annexin-V检测试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下(1)收获10×105Kasumi-1细胞经预冷的1×PBS洗涤两次后用试剂盒自带的Binding Buffer洗涤1次，重悬于100μL Binding Buffer中；(2)加入5μL Annexin V FITC试剂和5μL的PI，轻轻混匀，避光室温孵育15-20分钟；(3)加入400μL Binding Buffer，1小时内流式细胞仪测定。
二、结果和讨论冬凌草甲素可以诱导Kasumi-1细胞凋亡，并且这种作用具有剂量和时间依赖性。冬凌草甲素处理过的Kasumi-1细胞形态学上表现出了显著的凋亡特征，如染色质凝聚，细胞核破裂而细胞膜保持完整。细胞凋亡过程中，细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏，发生磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)由内层向外层的翻转，暴露在外表面的磷脂酰丝氨酸可被周围的吞噬细胞识别、吞噬，从而使凋亡细胞得以被清除。Annexin V为一种磷脂结合蛋白，可特异性地识别细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸，所以经常被用于细胞凋亡检测。PI是一种能结合DNA的红色荧光染料，但只有在细胞经历坏死，细胞膜破裂的情况下才可透过细胞膜与DNA结合。所以Annexin V-FITC/PI双染色的流式细胞仪分析，是检测悬浮细胞凋亡最敏感和最特异的方法。Annexin V-FITC/PI双标结果显示，Annexin V(+)/PI(-)细胞和冬凌草甲素作用密切相关，呈时间依赖性。处理4小时之后，Annexin V(+)/PI(-)细胞就已出现(图2B)。随后，在8小时之后出现了坏死样细胞，表现为Annexin V(+)/PI(-)(图2B)，且这种细胞随着时间的延长而增多。
1972年Kerr JF最早提出凋亡(apoptosis)这一概念，在古希腊语表示像秋天的树叶一样凋落的死亡方式。他发现结扎大鼠肝的左、中叶门静脉后，其周围细胞发生缺血性坏死，但肝动脉供应区的实质细胞仍存活，只是范围逐渐缩小，其间一些细胞不断转变成细胞质小块，不伴有炎症发生，与细胞坏死不同。细胞凋亡时，形态上早期细胞核固缩、染色质聚集在核膜内侧呈新月形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高，细胞体积变小；线粒体正常或轻微肿胀；细胞膜皱摺、卷曲，早期细胞膜的完整性未破坏；细胞膜出泡(blebbing)、芽，生成膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies)，内含完整的细胞器和核碎片，常迅速被邻近的细胞吞噬，周围组织中无炎症反应。随后的研究发现，细胞凋亡是一种普遍存在的现象，它是多细胞生物清除体内不需要的及受损伤细胞的一种天然机制，比如在两栖类胚胎发育过程中尾和腮的消失及非哺乳期乳腺的退化过程中，都会发生细胞凋亡。正常情况下，磷脂在细胞膜上的分布是不均匀的，卵磷脂(Phosphatidylcholine)和鞘磷脂(sphingomyelin)主要分布在细胞膜的外层，而磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)和磷脂酰丝氨(phosphati dylserine)则分布在内膜。Tanaka Y等和McEvoy L等发现，受损及老化的红细胞表面存在PS外翻，可被巨噬细胞特异地识别、吞噬。Fadok VA等于1992年发现，凋亡淋巴细胞的磷脂不对称分布被破坏，从而被巨噬细胞清除。随后发现PS外翻是凋亡细胞共有的特征。Annexin V是一种Ca2+离子依赖的磷脂结合蛋白，Andree HA等发现Annexin V优先结合带负电荷的PS。Koopman G等于1992年首次报道了用FITC耦联的AnnexinV标记凋亡细胞表面外翻的PS，然后经流式细胞仪检测的方法。他们发现，碘化丙啶，一种能透过破损的细胞膜而与DNA结合的荧光染料，仅能标记部分Annexin V阳性细胞，说明PS外翻是凋亡的早期事件，随后才会发生细胞膜的破裂。现在，Annexin V-FITC/PI双标法已成为检测细胞凋亡的常规方法。我们的结果表明，冬凌草甲素作为一种二萜类化合物，可以诱导Kasumi-1细胞进入自杀程序。形态学观察发现，冬凌草甲素处理过的Kasumi-1细胞表现出核固缩、碎裂而细胞膜保持完整等凋亡特征，同时应用Annexin V/PI双染检测，也证实冬凌草甲素可以诱导Kasumi-1细胞凋亡，并且这种作用呈时间依赖性。
实施例2冬凌草甲素诱导kasumi-1细胞凋亡分子机制研究一、材料和方法1.试剂和仪器冬凌草甲素、碘化丙碇、胎牛血清见实施例1“材料和方法”。罗丹明(Rhodamine，Rh123)为美国Sigma公司产品，罗丹明用三蒸水配成10μg/mL的储存液，4℃避光保存。Caspase-3特异抑制剂Z-DQMD-FMK为美国Sigma公司产品，使用前溶解于DMSO保存于-20℃。多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP[adenosinediphosphate]-ribose)polymerase，PARP)抗体，抗ETO抗体购自美国Santa Cruz Biotech公司，抗Caspase-3，Caspase-9抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，以及免疫印记显色系统购于美国Cell Signaling公司。Actin抗体购于美国Sigma公司，细胞色素C释放凋亡分析试剂盒(Cytochromec Releasing Apoptosis AssayKit)为BioVision公司产品。硝酸纤维素膜为英国Amarsham Biosciences公司产品。PonasteroneA为美国Invitrogen公司产品。流式细胞仪，细胞涂片仪见实施例1“材料和方法”。
2.细胞培养和处理Kasumi-1细胞培养同实施例1，实验过程中，细胞以2-4×105/ml的密度接种培养，应用1μM，2μM，5μM三个浓度的冬凌草甲素，对照组应用处理组中应用最大体积的DMSO处理Kasumi-1细胞24-48小时后行线粒体跨膜电位的检测；应用5μM浓度的冬凌草甲素，处理Kasumi-1细胞0，4，8，12，24小时时间点后收获细胞，收获细胞总蛋白行免疫印迹实验；应用2μM，5μM两个浓度的冬凌草甲素并在有/无50μM Caspase-3特异性抑制剂Z-DQMD-FMK的情况下一起进行孵育观察细胞形态。诱导表达AML1-ETO融合蛋白的U937稳定转染细胞系(U937-A/E)培养同Kasumi-1，在冬凌草甲素处理前应用Ponasterone A(PA)5ul/ml处理12小时诱导AML1-ETO融合蛋白表达，冬凌草甲素处理0，4，8，12，24，48小时时间点后收获细胞，收获细胞总蛋白行免疫印迹实验。用细胞涂片仪收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。
3.流式细胞仪分析细胞线粒体跨膜电位的变化线粒体跨膜电位的检测应用Rh123(10μg/mL)检测细胞线粒体跨膜电位，具体操作步骤如下(1)收获1×106-2×106个kasumi-1细胞经预冷1×PBS洗涤两次后加入100μL Rh123，轻轻混匀，避光37℃孵育30分钟；(2)预冷1×PBS洗涤两次后加入5μL的PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟；(3)加入400μL 1×PBS，流式细胞仪测定。
4.细胞色素C释放分析应用细胞色素C释放凋亡分析试剂盒，具体步骤如下(1)600g，5分钟，4℃条件下收获5×107细胞，预冷1×PBS洗涤1次；(2)用加入DTT和蛋白酶抑制剂的1×Cytosol Extraction BufferMix 1ml重悬细胞，冰上放置10分钟；(3)应用预冷的组织匀浆破碎细胞，保证细胞膜破碎细胞核完整，大致30-50次；(4)把匀浆转移至1.5ml离心管中，700g，4℃离心10分钟；(5)收集上清到一个新的1.5ml离心管中，10000g，4℃离心30分钟；(6)收集上清为无线粒体细胞浆组分；用加入DTT和蛋白酶抑制剂的Mitochondrial Extraction Buffer Mix 0.1ml重悬沉淀，震荡混匀10秒钟为线粒体组分；
(7)应用10μg的无线粒体细胞浆组分和线粒体组分进行常规的免疫印迹实验(选择12％聚丙烯酰胺凝胶电泳；应用试剂盒中提供的抗细胞色素C抗体)5.免疫印迹(westen blot，WB)主要操作步骤如下(1)收获细胞，用预冷1×PBS洗涤2次，每1×106个细胞加入80μL蛋白裂解液(1×SDS蛋白上样缓冲液)，轻轻混匀，沸水煮5-8分钟，上样或分装冻存在-20℃；(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，根据目的蛋白分子量的不同选择合适的凝胶浓度(8％-12％)，常规电泳条件(80V电压溴酚兰至分离胶后改用120V)；(3)应用湿转方法将凝胶中的蛋白质转移到0.22μm硝酸纤维素膜上；(4)硝酸纤维素膜用5％脱脂奶粉-TBS封闭过夜；(5)抗体孵育一抗孵育，选用多克隆或单克隆特异性抗体孵育硝酸纤维素膜，室温，2小时，70rpm震摇；用TBS-Tween(0.1％)洗膜15分钟，两次；二抗孵育，选用对应的二抗孵育硝酸纤维素膜，室温，1.5小时，70rpm震摇；用TBS-Tween(0.1％)洗膜15分钟，两次；(6)显色，应用带有辣根过氧化物酶底物的显色系统显色；(7)X线片感光，显影，定影。
二、结果和讨论1.冬凌草甲素诱导Kasumi-1细胞的凋亡过程中，伴有线粒体跨膜电位的崩塌，并且诱导Caspases介导的内源性细胞凋亡途径。
为了阐明冬凌草甲素诱导Kasumi-1细胞凋亡的机制，我们首先通过PI和Rh123双染检测该化合物对于线粒体跨膜电位(Δψm)的作用。Rh123是一种亲脂性阳离子，可发射绿色荧光，它可被线粒体吸收，正常的活细胞因为线粒体Δψm高，所以其摄入的Rh123也高，因此，细胞会发出绿色荧光。而细胞发生凋亡时线粒体Δψm会降低，从而会减低对Rh123的吸收，细胞表现为Rh123低染。当Kasumi-1细胞用冬凌草甲素5uM处理12小时后(图3)PI阴性但Rh123低染的细胞开始出现，并随冬凌草甲素作用时间和剂量逐渐增加。
细胞凋亡是一个相关基因严格调控的细胞死亡过程。根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡通路分成两条外源通路(死亡受体通路)和内源通路(线粒体通路)。这两条通路最后都汇聚于下游的效应Caspase。效应Caspase在细胞凋亡执行阶段能够直接引起细胞重要蛋白质的降解和核酸酶的激活并最终导致细胞凋亡。本实验应用免疫印迹来检测凋亡相关蛋白的变化见图4。可以看到应用5μM浓度的冬凌草甲素处理Kasumi-1细胞0，4，8，12，24小时时间点的Caspase-3的激活和其上游的Caspase-9的激活以及Caspase-3的重要底物的PARP的降解，并且这些改变和冬凌草甲素的作用浓度和时间有显著的相关性。我们同时又检测了细胞线粒体内细胞色素C释放，实验显示冬凌草甲素作用Kasumi-1后线粒体内的细胞色素C释放到了细胞浆中。
2.冬凌草甲素可以引起Kasumi-1细胞和诱导表达AML1-ETO融合蛋白的U937细胞中融合蛋白AML1-ETO的降解。
冬凌草甲素可以引起Kasumi-1细胞AML1-ETO融合蛋白降解，其中全长AML1-ETO融合蛋白大小约94KD，AML1-ETO降解片段(ΔAML1-ETO，Δ-AE)大小约70KD。应用诱导表达AML1-ETO融合蛋白的U937细胞系(U937-A/E)，也观察到了冬凌草甲素对AML1-ETO融合蛋白的作用。
细胞凋亡是一个受到一系列相关基因严格控制的细胞死亡过程。不同的凋亡信号在细胞中引发不同的凋亡信号转导通路。根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡信号转导通路分成两条主要的途经(1)外源通路(死亡受体通路)和内源通路(线粒体通路)。这两条通路最后都汇集于下游的效应分子Caspase。效应Caspase在细胞凋亡执行阶段能够直接引起重要蛋白质的降解和核酸酶的激活并最终导致细胞的凋亡。外源凋亡通路主要指死亡受体通路。在一定的受体诱导信号刺激下，细胞膜上的死亡受体与其细胞外的相应配体结合后，受体与细胞质中的转接蛋白和Caspase-8/-10前体蛋白结合并形成寡聚体，这种寡聚体被称为“凋亡体”。在凋亡体中激活的Caspase-8/-10进而激活下游的效应Caspase(3，6，7)，引起细胞的凋亡。(2)内源通路(线粒体通路)。由于诱变剂，化疗药物和电离辐射造成的细胞内不可修复的基因组损伤会激活凋亡的内源通路，就是线粒体通路。在多种形式的刺激信号作用于线粒体后，将会引起线粒体释放细胞色素C，AIF(apoptosis-inducing factor)，和Caspase前体蛋白(2，3，8，9)等促凋亡因子。细胞色素C从线粒体被释放出来后，与Apaf-1(apoptosisprotease activating factor-1)形成复合体，这个复合体吸引Caspase-9前体加入该复合体，随后Caspase-9被激活，活化的Caspase-9继而作用下游的效应Caspase(-3，6，7)，引起细胞凋亡。然而，内源和外源两条通路并不是孤立存在的，它们之间存在着互相作用。除了以上两条主要的凋亡通路之外，还存在着其他的一些凋亡途径。袁钧英等人发现，内质网是另一个在细胞凋亡执行过程中起着重要作用的细胞器，在某些细胞类型中内质网也是内源凋亡途径的重要成员。如钙离子通路和Caspase-12参与了这个过程。另外，细胞核的损伤也可以导致细胞凋亡。由诱变剂，化疗药物和电离辐射造成的细胞内DNA损伤，进而导致细胞的凋亡。细胞骨架系统也是细胞凋亡的感受器。
Caspases是一类特异的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)。在Caspase蛋白酶当中，有一部分与细胞凋亡无关，而与细胞因子的加工和成熟相关，包括Caspase-1，-4，-5，-11，-12和-13。另一部分则参与细胞凋亡，这部分Caspase又可分为两类，即启动性Caspase(initiators)和效应性Caspase(effectors)。启动性Caspase负责接受来自于上游的凋亡信号，其被激活的过程即为细胞凋亡的启动过程，包括Caspase-2，-8，-9，-10；效应性Caspase位于凋亡信号转导通路的下游，负责执行细胞凋亡过程，包括Caspase-3，-6，-7。Caspase可以被“死亡受体”途径中的多个分子激活。FAS/CD95和TNFR1的凋亡功能直接依赖于Caspase。Caspase也可以经线粒体途径激活。线粒体损伤或其他原因导致线粒体凋亡因子释放，包括细胞色素C，Apaf-1和AIF等。在细胞色素C和ATP存在下，Apaf-1能通过其N端的CARD与Caspase-9相应的同源序列结合，激活Caspase-9而引发凋亡。细胞一旦发生凋亡，往往一系列Caspase被激活。因此Caspase除了上述几种激活形式外，同一种Caspase分子还可以结合成多聚体自我激活，或者依赖于其他激活的Caspase来激活，从而引发一系列的Caspase激活级联反应，引起细胞的凋亡。活化的Caspase的作用主要包括三类其一是降解那些对细胞有保护作用的蛋白质，从而使凋亡抑制蛋白失活。如Caspase可以降解凋亡抑制蛋白Bc1-2/Bc1-x1，使其转变成促凋亡蛋白。第二个途径是通过直接降解凋亡细胞的结构蛋白而使细胞结构遭到破坏。如Caspase可以通过降解核纤层来破坏细胞的结构。核纤层蛋白在核膜下组成核纤层骨架，支撑核膜并且对染色质的结构及核功能也有影响。在凋亡发生时，核纤层蛋白被Caspase切割，导致核骨架崩溃，染色质浓缩等典型的凋亡变化。Caspase第三种特异性的作用方式是切割某些重要的在细胞中具有维持细胞稳态功能核修复功能的靶蛋白。如细胞核DNA修复的蛋白质，DNA复制的蛋白质，mRNA剪切的蛋白质等。
我们的实验结果显示冬凌草甲素作用Kasumi-1细胞24-48小时后细胞内的Caspase-3被激活，伴有caspase-3重要底物的PARP的降解。应用Caspase-3特异抑制剂Z-DQMD-FMK和冬凌草甲素同时作用Kasumi-1细胞后，细胞的凋亡被抑制，说明Caspase-3的激活是诱导细胞凋亡的关键步骤。我们发现细胞在冬凌草甲素处理后伴随凋亡的同时，出现了线粒体跨膜电位的降低和Caspase-9的激活，以及线粒体内细胞色素C释放。Caspase-9的激活是效应Caspase-3激活的上游事件，线粒体中的细胞色素C释放和Caspase-9的激活作用下游的Caspase-3，引起细胞的凋亡，提示冬凌草甲素诱导Kasumi-1细胞凋亡确实是通过内源通路的介导。而在冬凌草甲素诱导Kasumi-1细胞凋亡的过程中是否还存在着其他的凋亡通路或机制仍需要进一步的研究。
我们的实验结果显示，在冬凌草甲素诱导Kasumi-1细胞凋亡的过程中，Kasumi-1细胞中特异的融合蛋白AML1-ETO发生降解。应用诱导表达AML1-ETO融合蛋白的U937细胞系(U937-A/E)，也观察到了冬凌草甲素对AML1-ETO融合蛋白的降解作用(图5)。
实施例3AML1-ETO融合蛋白上的caspase-3切割位点的研究一、材料和方法1.试剂和仪器冬凌草甲素，胎牛血清见实施例1“材料和方法”。Caspase-3特异抑制剂Z-DQMD-FMK见实施例2“材料和方法”。抗ETO抗体购自美国SantaCruz Biotech公司。Actin抗体购于美国sigma公司。定点突变试剂盒QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit为美国Stratagene公司产品。质粒大抽试剂盒Plasmid Maxi Preparation Kit为德国QIAGEN公司产品。Gene Pulser电穿孔仪和Cuvette电转杯为美国Bio-Rad公司产品。
2.Caspase-3特异性抑制剂Z-DQMD-FMK抑制实验Kasumi-1细胞培养同实施例1，实验过程中，细胞以2-4×105/ml的密度接种培养，应用2μM，5μM两个浓度的冬凌草甲素并在有/无50μMCaspase-3特异性抑制剂Z-DQMD-FMK的情况下一起进行孵育后收获细胞，收获细胞总蛋白行免疫印迹检测。
3.突变表达质粒的构建应用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit进行表达质粒的定点突变。应用含有全长AML1-ETO融合基因的质粒pFLAG-CMV4-AML1-ETO做模板。选择突变点为AML1-ETO融合蛋白中的Asp171，Asp188，Asp192，突变为Asp171Ala，Asp188Ala，Asp192Ala，均为天冬氨酸突变为丙氨酸。
(1)设计引物见下表。
表1定点突变应用引物，下划线为突变的碱基
(2)突变链合成反应按照QuickChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒说明操作，PCR反应条件为95℃ 1分钟95℃ 50秒60℃ 50秒68℃ 8分钟68℃ 7分钟其中95℃ 50秒至68℃ 8分钟三个步骤进行18个循环。
(3)DpnI限制性核酸内切酶消化合成产物。
突变链合成反应产物加入1μL DpnI酶，37℃，水浴1小时。
(4)钙转化质粒，挑菌落，抽质粒测序鉴定，大抽质粒。
a.应用QuickChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒中的XL10-Gold ultracompetent cell为感受态细菌，取45μL上述细菌，加入2μLβ巯基乙醇混合后冰上放置10分钟，随后加入2μL的Dpn I酶处理后的合成产物冰上放置30分钟，然后42℃水浴30秒，冰上放置2分钟，把上述处理后的感受肽细菌加入500μL预热(37℃)的LB液中，37℃，225rpm条件下振摇1小时，铺于氨苄青霉素阳性LB板上，37℃温箱孵育16小时后观察有无菌落长出；b.观察菌落长出后每个板中挑取6个菌落，扩增细菌，抽取质粒并保存菌种，质粒抽提送测序。测序证实突变成功的质粒大抽。
4.突变质粒瞬时表达和检测。
人类白血病细胞株U937，以3×105/ml的起始浓度接种于含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下常规培养。
(1)收获U937细胞，离心200g，5-10分钟；(2)用含0.5％FBS的1640重悬细胞，离心200g，5-10分钟；(3)用转染缓冲液重悬细胞至2×106/ml，取800μl细胞到1.5mlEppendorf离心管中，加入20μg质粒，混匀；(4)把上述细胞悬液于转移到0.4cm电转杯(Gene Pulser Cuvette，Bio-Rad公司产品)，在Gene Pulser电穿孔仪(Bio-Rad公司产品)上转染，电转染条件电压280V，电容1050μF；
(5)电转染后室温放置10分钟；(6)把电转杯中的细胞转移到3ml含10％FBS的RPMI1640中，培养24-48小时检测突变质粒的表达情况。
5.冬凌草甲素作用瞬时转染突变质粒的细胞，观察AML1-ETO融合蛋白降解情况。
瞬时转染含野生型或突变AML1-ETO基因的质粒至U937细胞，培养24小时后，应用5μM冬凌草甲素处理转染后的细胞，每个突变体分处理组和对照组，对照组应用同样体积的DMSO处理，处理组用5μM冬凌草甲素处理。培养24小时后常规收获细胞，提取细胞总蛋白行Western blot检测AML1-ETO融合蛋白的降解情况。
二、结果和讨论1.Caspase-3特异性抑制剂Z-DQMD-FMK抑制实验冬凌草甲素诱导Kasumi-1细胞凋亡可以被Caspase-3特异抑制剂Z-DQMD-FMK抑制，同时Western blot免疫印迹实验显示Z-DQMD-FMK阻止了AML1-ETO融合蛋白的降解(图6)。
2.突变表达质粒的构建。
应用定点突变的方法得到了三个突变表达质粒，为下一步实验奠定了基础。
3.冬凌草甲素处理瞬时表达突变质粒的细胞，观察各个突变体AML1-ETO融合蛋白的降解情况。
冬凌草甲素可以引起瞬时表达AML1-ETO质粒的细胞发生凋亡。Western blot实验显示，在瞬时表达Asp188Ala(D188A)突变质粒的U937细胞(图7，188)及冬凌草甲素作用该细胞中没有见到AML1-ETO融合蛋白的降解；而在表达野生型(图7，AE)、Asp171Ala(图7，171)和Asp192Ala(图7，192)突变体的细胞，冬凌草甲素仍可引起AML1-ETO融合蛋白的降解，而且其剪切片段的大小和Kasumi-1细胞中的AML1-ETO融合蛋白剪切片段的大小一致。
Caspases的水解位点均为天冬氨酸(Asp，D)。在本实验中，具有AML1-ETO融合蛋白的细胞(Kasumi-1、U937-A/E)经冬凌草甲素处理后该蛋白出现降解，应用Caspase-3特异性抑制剂和冬凌草甲素共同作用Kasumi-1细胞，细胞凋亡和AML1-ETO融合蛋白的降解均被阻止，说明AML1-ETO融合蛋白的剪切依赖于Caspase-3的激活，因此我们推论AML1-ETO融合蛋白的降解是Caspase-3介导的。由于94 KDa的AML1-ETO融合蛋白降解后产生一个70KDa的片段(本实验选用的抗ETO抗体是抗ETO蛋白羧基端一小段多肽的抗体)，同时Caspase-3切割位点通常有天冬氨酸的存在，我们选择了三个最有可能的切割位点进行突变体的构建(Asp171，Asp188，Asp192)，突变为丙氨酸残基(Ala)。如果我们选择的三个氨基酸残基中存在Caspase-3的切割位点，其发生突变后冬凌草甲素处理就不能引起AML1-ETO融合蛋白的降解，反之，冬凌草甲素仍可诱导AML1-ETO融合蛋白降解。本实验显示，在表达AML1-ETO的U937细胞中，Asp188Ala突变可阻止冬凌草甲素引起的AML1-ETO融合蛋白降解。然而，野生型和其他两种突变(Asp171Ala、Asp192Ala)则不能阻止AML1-ETO融合蛋白被降解；在表达野生型和Asp171Ala、Asp192Ala突变体的U937细胞，AML1-ETO融合蛋白的降解与产生的剪切片段大小和Kasumi-1细胞中AML1-ETO融合蛋白的降解/剪切方式相同。以上结果说明了Asp188是Caspase-3切割AML1-ETO融合蛋白的关键位点，同时反过来证明了AML1-ETO融合蛋白的剪切是由激活的Caspase-3实施的。
实施例4冬凌草甲素对移植性白血病小鼠的治疗作用及其机制研究材料和方法1.试剂和仪器冬凌草甲素、碘化丙碇、胎牛血清、Annexin V检测试剂盒(ApoAlertAnnexin-Vkit)见实施例1“材料和方法”。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。流式细胞仪、荧光显微镜及细胞涂片仪见实施例1“材料和方法”。酶联免疫检测仪为美国Bio-Tek公司产品。
2.增溶剂增溶的冬凌草甲素细胞毒性实验小鼠实验应用的冬凌草甲素是增溶剂助溶的冬凌草甲素储存液，选用非离子型增溶剂pluronic F68进行增溶，增溶剂浓度为1％，溶剂为双蒸水，冬凌草甲素浓度为2mg/ml，储存于4℃。进行小鼠体内实验前应用MTT法进行增溶剂助溶的冬凌草甲素储存液细胞毒实验，确定冬凌草甲素的细胞毒作用没有受到增溶剂的影响以及增溶剂本身对细胞没有细胞毒性作用。
MTT试验方法具体如下(1)接种细胞Kasumi-1以2×105/ml的起始浓度接种于含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下常规培养至对数生长期，后调至浓度1×105/ml密度，每孔约1×104个细胞接种于96孔板中，每孔体积90μL；(2)冬凌草甲素处理应用DMSO溶解的冬凌草甲素和应用1％pluronic F68进行增溶的冬凌草甲素，设三个浓度(0.5μM，5μM，20μM)以及各自的对照组。每个处理设三复管；(3)培养细胞将培养板在37℃，5％CO2饱和湿度条件下常规培养24小时；(4)呈色培养24小时后，每孔加入CCK-8试剂10μL在37℃，5％CO2饱和湿度条件下常规培养1-4小时，(5)比色选择450-490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定每个孔的光吸收值(OD)，记录结果，计算抑制率。抑制率＝1-OD处理组/OD对照组。
3.Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立和冬凌草甲素治疗作用(1)Kasumi-1细胞，培养至对数生长期，细胞记数，记数活细胞数，调整至细胞密度为1.3×108/ml备用。
(2)小鼠的准备BALB/c裸鼠为中科院上海动物中心购买，4-6周龄，均为雌性，在SPF级环境下饲养。
(3)模型建立及冬凌草甲素处理4-6周龄的裸鼠，每只小鼠右颈肩部皮下注射4×107Kasumi-1细胞，观察小鼠移植瘤成瘤情况，当小鼠瘤块可观察到时(约100mm3)，随机分为三组，第一组为对照组，应用溶剂(1％增溶剂Pluronic F68)0.1ml/10g体重腹腔注射；第二组应用冬凌草甲素7.5mg/Kg体重腹腔注射治疗，每天一次，连续应用至成瘤后12天；第三组应用冬凌草甲素15mg/Kg体重腹腔注射治疗，每天一次，连用应用至成瘤后第12天。观察三组间移植瘤的生长情况和瘤体积的大小。处理完成后处死小鼠行移植瘤病理形态学检查，以及脾脏、肝脏、骨髓、肾脏等重要脏器的病理形态学检查明确各组织异常细胞侵润情况。
4.Δ-AE移植小鼠模型建立和冬凌草甲素治疗作用(1)Δ-AE移植小鼠脾脏细胞的制备用逆转录病毒将C-末端缺失200个氨基酸的AML1-ETO融合基因转导入C57小鼠的骨髓单个核细胞，这些细胞作为供体细胞；同时用10cGy的辐射量照射C57小鼠(致死量照射)作为受体鼠。将供体细胞移植至受体小鼠，然后将小鼠饲养在无特定病原体(SPF)的环境中。待小鼠发生白血病后取其脾脏细胞，供下一步实验用。
(2)小鼠的准备C57小鼠从中科院上海动物中心购买，均为雌性，6-8周龄，在SPF级环境下饲养。
(3)Δ-AE转基因发病鼠脾脏细胞移植及传代6-8周龄的C57小鼠经400cGy辐射量照射后，24小时内每只小鼠经尾静脉注射1×106-2×106Δ-AE移植鼠脾脏活细胞(步骤1得到的细胞)，观察小鼠的活动状态，两周后开始每周检测血常规，并观察外周血细胞形态，待小鼠发病后，颈椎脱臼法处死小鼠，取骨髓细胞和脾脏细胞用Cytopro甩片仪甩片后晾干，瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态，用部分脾脏细胞继续传代，剩余骨髓和脾脏细胞液氮冻存备用。第二代移植小鼠建立时每只尾静脉注射细胞数为3×106个。
(4)建立Δ-AE转基因发病鼠移植小鼠，随机分成6组，第一组为对照组，应用溶剂(1％增溶剂Pluronic F68)0.1ml/10g体重腹腔注射；第二组应用低剂量阿糖胞苷(Ara-C-L)，第三组用高剂量阿糖胞苷(Ara-C-H)治疗，第四组用冬凌草甲素2.5mg/kg体重腹腔注射治疗，每天一次，连用5天，间隔2天，连用2周，第五组用冬凌草甲素7.5mg/kg体重腹腔注射治疗，每天一次，连用5天，间隔2天，连用2周，第六组应用冬凌草甲素15mg/kg体重腹腔注射治疗，每天一次，连用5天，间隔2天，连用2周。处理均在移植后的第7天后进行。实验期间观察小鼠一般状况，生存期，体重，外周血等情况。待小鼠发病至垂死状态时处死小鼠取脾脏，观察大小，收取脾脏和骨髓细胞，并行脾脏、肝脏、骨髓、肾脏等重要脏器的病理形态学检查明确各组织异常细胞侵润情况。
结果和讨论1.1％F68(pluronic)进行增溶的冬凌草甲素(2mg/ml)对Kasumi-1的细胞毒作用和DMSO溶解的冬凌草甲素一致，并且1％pluronic F68的溶剂对Kasumi-1的细胞没有毒性(结果未显示)。
2.Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立系采用常规细胞裸鼠皮下移植瘤的方法。Kasumi-1细胞培养至对数生长期调整至细胞密度为1.3×108/ml。应用4-6周龄的BALB/c裸鼠，每只小鼠右颈肩部皮下注射4×107Kasumi-1细胞，观察小鼠移植瘤成瘤情况并计算瘤体积，其中瘤体积＝长×宽2×π/6。当小鼠瘤块可观察到(此时体积在100mm3左右)时将小鼠随机分组。裸鼠成瘤时间为移植后5-16天，成瘤率100％。组织形态学检查和重要脏器组织病理检查，观察到了小鼠瘤体中大量的Kasumi-1细胞(图9)，并且这些细胞在脾脏和肝脏以及骨髓中都可以见到，尤其在脾脏中弥漫着大量的异常细胞，导致了脾脏的正常结构的丧失(图10，CON)。
3.冬凌草甲素可以抑制Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤的生长于小鼠瘤块可观察到时随机分为三组，第一组为对照组，应用溶剂(1％增溶剂Pluronic F68)0.1ml/10g体重腹腔注射，第二组应用冬凌草甲素7.5mg/Kg体重腹腔注射治疗，每天一次，连续应用至成瘤第12天，第三组应用冬凌草甲素15mg/Kg体重腹腔注射治疗每天一次，连续应用至成瘤第12天。病理学检测发现冬凌草甲素治疗组的脾脏中异常细胞比对照组明显减少，肝脏及骨髓中更是少见异常肿瘤细胞(图10，Ori)。观察三组间移植瘤的生长情况，可以看到在治疗组小鼠的移植瘤生长要慢于对照组(图11)。对照组和冬凌草甲素7.5mg/kg组有显著性差别(P＝0.002，n＝10)，对照组和冬凌草甲素15mg/kg组有显著性差别(P＝0.001，n＝10)，冬凌草甲素7.5mg/kg组和冬凌草甲素15mg/kg组没有显著性差别(P＝0.892)。
4.Δ-AE移植鼠模型的建立与正常C57小鼠相比，Δ-AE移植鼠的外周血及骨髓中，充斥着大量不成熟细胞(图12A)，这些细胞体积大，核浆比例高，细胞核多为圆型或椭圆形。此外，患病鼠的脾脏明显增大。脾脏中的侵润现象非常严重，存在大量的白血病细胞，正常的脾小结结构被破坏。肝脏的血管周围及肝血窦内同样可观察到大量侵润的白血病细胞存在(图12B，C57)。
5.冬凌草甲素可以在体外诱导Δ-AE移植鼠脾细胞的凋亡把从Δ-AE移植鼠发病鼠脾脏里分离的白血病细胞在10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中进行体外培养，加入冬凌草甲素5μM后观察其诱导凋亡效应。冬凌草甲素处理24小时后Annexin V/PI双染法显示有57.4％的细胞发生凋亡，而相应的没有用冬凌草甲素处理的细胞体外培养24小时凋亡细胞为36.3％。Annexin V/PI双染法分析表明，尽管脾细胞体外培养对照组也会出发生凋亡，但冬凌草甲素处理组凋亡细胞的比例明显增加。同时，形态学显示，体外经冬凌草甲素处理24小时后，出现了大量的凋亡细胞，其特征为核固缩破裂等早期凋亡表现，部分细胞则呈现继发性坏死(图13)。
6.冬凌草甲素可以延长Δ-AE移植鼠的生存期，并减少白血病细胞的浸润。
Δ-AE移植小鼠随机分成6组，按材料和方法中介绍的方法对小鼠进行治疗。外周血涂片显示，患病的Δ-AE转基因小鼠移植鼠中有大量的原始细胞存在，形态学上表现为细胞体积大，核浆比例高，细胞核未分叶，多呈圆形，而冬凌草甲素处理组中上述细胞较少(图14A)。待小鼠发病致垂死状态，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖对照组和药物处理组小鼠并行病理学检测。发现用药组小鼠的脾脏明显小于患病组(图14B)，肝脏、脾脏病理学检测显示对照组Δ-AE移植鼠肝脏、脾脏内存在大量白血病细胞，而经冬凌草甲素治疗的小鼠肝、脾浸润情况明显改善，其白血病细胞明显减少，肝、脾的正常结构得以恢复(图14C)。
小鼠生存期比较对照组小鼠于22天开始出现死亡，27天全部死亡，平均生存期为23.8天，中位生存期23.0天；冬凌草甲素2.5mg/kg/d组小鼠25天开始出现死亡，31天全部死亡，平均生存期为28.3天，中位生存期28.0天；冬凌草甲素7.5mg/kg/d组小鼠24天开始出现死亡，36天全部死亡，平均生存期为29.8天，中位生存期30天；冬凌草甲素15mg/kg/d组小鼠24天开始出现死亡，36天全部死亡，平均生存期为31.3天，中位生存期32天。不同处理组的生存期在统计学上存在显著差异(P＝0.0001)，表明冬凌草甲素可显著延长Δ-AE移植小鼠的生存时间，因而对白血病有明确而良好的治疗作用。我们还比较了冬凌草甲素与阿糖胞苷对Δ-AE移植性白血病小鼠模型的疗效，发现冬凌草甲素在2.5mg/kg/d的剂量下对Δ-AE移植小鼠治疗10天产生的疗效与阿糖胞苷25mg/kg/d治疗5天(小剂量阿糖胞苷)的疗效相当，7.5、15mg/kg/d冬凌草甲素的疗效优于小剂量阿糖胞苷；25mg/kg/d阿糖胞苷治疗10天(大剂量阿糖胞苷)虽然对部分白血病小鼠(4/9)的疗效较冬凌草甲素好，但却引起其他小鼠(5/9)的早期死亡(生存时间仅为18天)。与大剂量阿糖胞苷不同，冬凌草甲素在2.5-15mg/kg/d的剂量下并不引起小鼠骨髓抑制或体重减轻。因而冬凌草甲素在白血病的治疗中有疗效确切、毒副作用小的特点。
Poloxamer188(Pluronic F68)为聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，是目前用于静脉乳剂极少数合成乳化剂之一，也是一种非离子型增溶剂。本实验选用Pluronic F68来增加冬凌草甲素的溶解度。
通过本发明工作，我们发现香茶菜属二萜类化合物冬凌草甲素能延长Δ-AE移植鼠的生存时间，而该化合物也可以抑制Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，冬凌草甲素同时可以减少这两种模型小鼠肿瘤细胞的浸润；白血病细胞体外培养实验表明，冬凌草甲素可在体外迅速诱导Δ-AE移植鼠白血病细胞凋亡。以上的结果显示该化合物有很强的抗白血病效果。
目前，对白血病的治疗主要以化疗为主，辅以骨髓及脐血移植。全反式维甲酸(ATRA)的分化疗法、As2O3的凋亡疗法及二者的联合使用使人们对APL这种特殊类型的白血病的治疗有了里程碑式的飞跃。而对于其他类型的急性白血病还是以杀伤白血病细胞的化学治疗为主。因此，不断开发新型、安全有效的抗白血病药物仍是摆在广大科研工作者面前的一项迫切任务。
综上研究，冬凌草甲素在Δ-AE移植鼠模型和Kasumi-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型中的治疗效果说明，该化合物有着很好的临床应用前景，有可能成为一种新的抗白血病药物。
实施例5冬凌草甲素对其他白血病细胞作用的研究一、材料和方法1.试剂和仪器冬凌草甲素纯度为98％-99.8％。应用DMSO(Sigma)溶解制备成10-2mol/L浓度的储存液储存在-20℃。碘化丙碇(Propidium Iodide，PI)为美国Sigma公司产品，碘化丙碇用三蒸水配成250μg/mL的储存液，4℃避光保存。胎牛血清购自美国Hyclone公司。Annexin V检测试剂盒(ApoAlert Annexin-V kit)购自美国BD Biosciences公司。流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品。荧光显微镜(Olympus，BX60)及相差显微镜(Olympus，IMT)均购自日本Olympus公司。细胞涂片仪cytospin购自英国Shandon公司。
2.细胞培养和处理，细胞形态学观察不具有t(8；21)染色体易位的AML M2细胞株HL-60、急性单核细胞性白血病U937细胞株、慢性粒细胞性白血病细胞株K562、急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4，以及从不具有t(8；21)染色体易位的AML M2病人、急性早幼粒细胞性白血病和慢性粒细胞性白血病病人原代白血病细胞。
上述细胞株以2×105/ml的起始浓度接种于含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中，在37℃，5％CO2饱和湿度条件下常规培养。上述细胞在指数生长期时，细胞密度调整到3×105/ml，应用冬凌草甲素处理，具体应用8μM，20μM，25μM三个浓度，在5μM浓度下选择0h，4h，8h，12h，24h时间点，对照组应用处理组中加入最大体积的DMSO。处理结束后行流式仪检测细胞。凋亡，应用Cytopro甩片仪甩片后晾干，瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态。
3.Annexin V方法检测细胞凋亡按照Annexin V检测试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下(1)分别收获(5-10)×105HL-60、U937、K562、NB4细胞，细胞经预冷的1×PBS洗涤两次后用试剂盒自带的Binding Buffer洗涤1次，重悬于100μL Binding Buffer中；(2)加入5μL Annexin V-FITC试剂和5μL的PI，轻轻混匀，避光室温孵育15-20分钟；(3)加入400μL Binding Buffer，1小时内流式细胞仪测定。
二、结果和讨论冬凌草甲素可以诱导HL-60、U937、K562、NB4细胞发生凋亡，并且这种作用具有剂量和时间依赖性。冬凌草甲素处理过的细胞形态学上表现出了显著的凋亡特征，如染色质凝聚，细胞核破裂而细胞膜保持完整。细胞凋亡过程中，细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏，发生磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)由内层向外层的翻转，暴露在外表面的磷脂酰丝氨酸可被周围的吞噬细胞识别、吞噬，从而使凋亡细胞得以被清除。Annexin V为一种磷脂结合蛋白，可特异性地识别细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸，所以经常被用于细胞凋亡检测。PI是一种能结合DNA的红色荧光染料，但只有在细胞经历坏死，细胞膜破裂的情况下才可透过细胞膜与DNA结合。所以Annexin V-FITC/PI双染色的流式细胞仪分析，是检测悬浮细胞凋亡最敏感和最特异的方法。Annexin V-FITC/PI双染结果显示，Annexin V(+)/PI(-)细胞和冬凌草甲素作用密切相关，呈时间依赖性。处理4小时之后，Annexin V(+)/PI(-)细胞就已出现。随后，Annexin V(+)/PI(+)细胞随着时间的延长而增多。
冬凌草甲素虽然也可以诱导这些细胞发生凋亡，但需要的浓度较高，为8-25μM。
权利要求
1.冬凌草甲素在制备治疗急性白血病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，冬凌草甲素在制备治疗含有AMLl-ETO融合基因的急性髓性白血病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于白血病细胞1-20×105个细胞/毫升，冬凌草甲素使用量0.5-5μM。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于白血病细胞1-20×105个细胞/毫升，冬凌草甲素使用量2-5μM。
5.根据权利要求1所述的应用，冬凌草甲素在制备治疗不含有AMLl-ETO融合基因的急性髓性白血病药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，冬凌草甲素在制备治疗急性单核细胞性白血病药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，冬凌草甲素在制备治疗急性早幼粒细胞性白血病药物中的应用。
8.根据权利要求5或6或7所述的应用，其特征在于白血病细胞1-20×105个细胞/毫升，冬凌草甲素使用量8-25μM。
9.冬凌草甲素在制备治疗慢性粒细胞性白血病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于白血病细胞1-20×105个细胞/毫升，冬凌草甲素使用量8-25μM。
全文摘要
本发明涉及冬凌草甲素在制备治疗急性白血病药物中的应用；和冬凌草甲素在制备治疗慢性粒细胞性白血病药物中的应用。本发明对冬凌草甲素发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。冬凌草甲素安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。冬凌草甲素在体外可诱导白血病细胞凋亡，在体内可延长t(8；21)白血病小鼠模型的生存期，或延缓肿瘤在体内的生长。冬凌草甲素可激活内源性凋亡通路，使在t(8；21)白血病发生过程中起关键作用的AML1－ETO融合蛋白发生降解。冬凌草甲素对AML1－ETO融合蛋白的降解是通过活化caspase－3产生的。本发明还首次确定了一个重要的caspase－3切割位点。
文档编号A61P35/00GK1994293SQ200610030200
公开日2007年7月11日 申请日期2006年8月18日 优先权日2006年8月18日
发明者陈竺, 周光飚, 陈赛娟, 王振义 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院