冬凌草促凝血有效成分及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了冬凌草促凝血有效成分及其制备方法和应用。其中，有效成分为冬凌草甲素、迷迭香酸、水杨酸或阿魏酸。本发明通过体外实验证明，与维生素K1相比，冬凌草甲素、迷迭香酸缩短血浆复钙时间没有显著性差异（P>0.05），可见冬凌草甲素、迷迭香酸具有促凝血作用；与空白组、维生素K1和灯盏花素组相比，水杨酸、阿魏酸对血浆复钙时间均有显著性差异，但是，水杨酸、阿魏酸对血浆复钙时间大于维生素K1，小于空白组，说明水杨酸、阿魏酸具有一定的促凝血作用。因此冬凌草有效成分冬凌草甲素、迷迭香酸、水杨酸或阿魏酸均具有促凝血作用。
【专利说明】冬凌草促凝血有效成分及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及冬凌草促凝血有效成分，同时还涉及该有效成分的制备方法和应用，属于中药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]冬凌草性味苦、甘、微寒，具有良好清热毒、活血止痛、抑菌、抗肿瘤作用，主治咽喉肿痛、扁桃体炎、感冒头痛、气管炎、慢性肝炎、关节风湿痛、蛇虫咬伤。其主要成分有挥发油和二萜类、冬凌夏草甲素、乙素、丙素、丁素、戊素、辛素以及α-香树脂醇，还有5个未知结构成分。冬凌草同时含有无机元素铁、锌、硒等。研究表明，冬凌草全株对食管癌、乳腺癌、直肠癌等均有缓解作用。冬凌草的煎剂和醇剂可有效地抑制甲型、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等，从而提高机体抵抗力，迅速降低因炎症引起的白血球增高。冬凌草与化疗、其它抗癌药物配合治疗癌症有明显地增效作用，这是一般抗癌药物所不及的。目前对于冬凌草的研究较多，但是对于其促凝血的作用未见报道。
[0003]血液为人体重要的物质，临床上各种原因引起的出血较为常见。如不及时有效的制止，致使血液耗损，将造成机体衰弱，有时甚至会危及生命。一些临床病症均会造成血液从伤口不停流出，无法有效止血，如①先天性缺陷症:凝血因子珊、ΙΧ、ΧΙ先天性缺乏或蛋白分子异常症、凝血因子VD、X、V先天性缺乏症或蛋白分子异常症、纤维蛋白原或凝血酶原先天性缺乏症或蛋白分子异常症获得性缺乏症:严重肝病使凝血因子合成减少，如重症肝炎、慢性肝炎、肝硬化；维生素K缺乏或利用障碍，如吸收不良综合症、脂肪泻、阻塞性黄疸、广谱抗生素治疗、口服抗凝剂；消耗过多，如原发性或继发性纤溶亢进；③循环抗凝物增加或肝素治疗等导致血浆复钙时间延长。目前临床主要采用能促进血液凝固而使出血停止的药物，即止血药促进出血口愈合。止血药可通过收缩小动脉及毛细血管，或增强血小板功能，或加速、加强血液凝固过程，或抑制血块溶解过程而产生止血作用。常见的药物如云南白药中就含有止血药物，传·统的止血药物还有维生素K、氨甲环酸、卡巴克络等，部分生化药物也可以起到促凝血的作用，如从动物血中提取的凝血酶、从动物器官中提取的抑肽酶，但是使用这些药品可能会发生过敏、出现血清肌酐过性增高等不良反应。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供冬凌草促凝血有效成分。
[0005]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供冬凌草促凝血有效成分，所述有效成分为冬凌草叶阴干粉碎后，用乙醇浸泡，回收溶剂，得到乙醇总浸膏；然后将乙醇总浸膏用硅胶拌样，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇洗脱，回收溶剂后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位；再将乙酸乙酯部位和甲醇部位分别通过反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、高效液相制备色谱、重结晶分离即得。
[0006]所述有效成分为冬凌草甲素、迷迭香酸、水杨酸或阿魏酸。
[0007]本发明的目的还在于提供一种冬凌草促凝血有效成分的制备方法。[0008]本发明所采用的技术方案还在于提供一种冬凌草促凝血有效成分的制备方法，包括以下步骤:
[0009](I)冬凌草叶阴干粉碎后，用70%乙醇室温浸泡2次，每次3d，合并浸泡液，减压回收溶剂得到70%乙醇总浸膏；
[0010](2)将70%乙醇总浸膏用硅胶搅样，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇洗脱，回收溶剂后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位；
[0011](3)乙酸乙酯部位用40-80目硅胶拌样，经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯体积比40:1-1:1进行梯度洗脱，将石油醚-乙酸乙酯体积比1:1洗脱下来的馏分经硅胶柱层析色谱用石油醚-丙酮体积比20:1-1:1梯度洗脱，其中石油醚-乙酸乙酯体积比8:2洗脱下来的懼分经Sephadex LH-20柱层析色谱用石油醚_氯仿_甲醇体积比9:9:2洗脱,重结晶，得到阿魏酸；
[0012]甲醇部位经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体积比80:1-1:1进行梯度洗脱，其中， [0013]氯仿-甲醇体积比40:1洗脱下来的馏分经S印hadex LH-20柱层析色谱用丙酮洗脱，重结晶，得到水杨酸；
[0014]氯仿-甲醇体积比20:1洗脱下来的馏分经硅胶柱层析色谱用氯仿-甲醇体积比50:1-10:1梯度洗脱后,经Sephadex LH-20柱层析色谱用氯仿-甲醇-水体积比9:9:2洗脱，重结晶，得到迷迭香酸；
[0015]氯仿-甲醇体积比10:1洗脱下来的懼分经Sephadex LH-20柱层析色谱用氯仿-甲醇体积比1:1洗脱，重结晶，得到冬凌草甲素。
[0016]本发明的目的还在于提供一种冬凌草促凝血有效成分在促凝血方面的应用。
[0017]本发明所采用的技术方案还在于提供一种冬凌草促凝血有效成分在促凝血方面的应用。
[0018]本发明的目的还在于提供一种冬凌草促凝血有效成分在制备促凝血药物方面的应用。
[0019]本发明所采用的技术方案还在于提供一种冬凌草促凝血有效成分在制备促凝血药物方面的应用。
[0020]本发明中冬凌草有效成分具有较好的促凝血作用，体外实验表明，与维生素K1相t匕，冬凌草甲素、迷迭香酸缩短血浆复钙时间没有显著性差异(P>0.05)，可见冬凌草甲素、迷迭香酸具有促凝血作用；与空白组、维生素K1和灯盏花素组相比，水杨酸、阿魏酸对血浆复钙时间均有显著性差异，但是，水杨酸、阿魏酸对血浆复钙时间大于维生素K1，小于空白组，说明水杨酸、阿魏酸具有一定的促凝血作用。因此冬凌草有效成分冬凌草甲素、迷迭香酸、水杨酸或阿魏酸均具有促凝血作用。
[0021]本发明以传统中药冬凌草为原料，来源广泛，其中的有效成分取自冬凌草中，具有相对安全和价格低廉的优点，为促凝血药物的开发提供了新的途径。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
[0023]本实施例为冬凌草有效成分的制备方法，包括以下步骤:
[0024](I)冬凌草叶阴干粉碎后，用70%乙醇室温浸泡2次，每次3d，合并浸泡液，减压回收溶剂得到70%乙醇总浸膏；
[0025](2)将70%乙醇总浸膏用硅胶搅样，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇洗脱，回收溶剂后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位；
[0026](3)乙酸乙酯部位用40-80目硅胶拌样，经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯体积比40:1-1:1进行梯度洗脱，将石油醚-乙酸乙酯体积比1:1洗脱下来的馏分经硅胶柱层析色谱用石油醚-丙酮体积比20:1-1:1梯度洗脱，其中石油醚-乙酸乙酯体积比8:2洗脱下来的懼分经Sephadex LH-20柱层析色谱用石油醚_氯仿_甲醇体积比9:9:2洗脱,重结晶，得到化合物I ;
[0027]甲醇部位经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体积比80:1-1:1进行梯度洗脱，其中，
[0028]氯仿-甲醇体积比40:1洗脱下来的馏分经S印hadex LH-20柱层析色谱用丙酮洗脱，重结晶，得到化合物2;
[0029]氯仿-甲醇体积比20:1洗脱下来的馏分经硅胶柱层析色谱用氯仿-甲醇体积比50:1-10:1梯度洗脱后,经Sephadex LH-20柱层析色谱用氯仿-甲醇-水体积比9:9:2洗脱，重结晶，得到化合物3;
[0030]氯仿-甲醇体积比10:1洗脱下来的馏分经S印hadex LH-20柱层析色谱用氯仿-甲醇体积比1:1洗脱，重结晶，得到化合物4。
[0031]实施例2 [0032]本实施例为冬凌草中四种化合物促凝血作用的实验。
[0033]方法:家兔体外血浆复钙时间
[0034]仪器和材料:TGL_16高速离心机(江苏金坛中大仪器厂)、秒表计时器、LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)、注射生理盐水(山东齐都药业有限公司，2012053107)、维生素K1注射液(天津药业集团新郑股份有限公司，1109051)、注射用灯盏花素(湖南恒生制药有限公司，20110202)、38g/L枸橼酸钠溶液、2.775g/L氯化钙溶液。
[0035]实验动物:獭兔，雄性，体重2.0-2.5kg。
[0036]( I)化合物I促凝血作用的实验
[0037]称取化合物I lmg，加入溶剂(乙醇:丙二醇:生理盐水=1:1:3) lmL，混悬，超声至溶解或分散均匀，备用。
[0038]取家兔耳缘静脉取血3.6mL,加入至38g/L枸橼酸钠的溶液400 μ L中，混匀，1000r/min离心15min,取上清液备用。实验分为3组,样品组、对照组和空白组。样品组加入血浆0.1mL及化合物I溶液0.1mL,对照组加入血浆0.1mL及药品溶液(维生素K1注射液和注射用灯盏花素)0.lmL，空白组加入血浆0.1mL及空白溶剂(注射生理盐水)0.1mL,于37°C温育Imin后分别向每管加入2.775g/L CaCl2溶液0.1mL,计时，直到检测到弥漫性蛋白颗粒时停止计时，空白组、对照组重复3次，样品组重复6次，求算术平均值和标准差，即为血浆复钙时间。结果采用平均值和标准差表示，采用SPSS17.0软件单因素方差分析法(One-Way AN0VA)进行统计学分析。测定结果见表1。
[0039]表1化合物I对家兔体外血浆复钙时间的影响
[0040]
【权利要求】
1.冬凌草促凝血有效成分，其特征在于，所述冬凌草促凝血有效成分为冬凌草叶阴干粉碎后，用乙醇浸泡，回收溶剂，得到乙醇总浸膏；然后将乙醇总浸膏用硅胶拌样，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇洗脱，回收溶剂后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位；再将乙酸乙酯部位和甲醇部位分别通过反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、高效液相制备色谱、重结晶即得。
2.根据权利要求1所述的冬凌草促凝血有效成分，其特征在于，所述有效成分为冬凌草甲素、迷迭香酸、水杨酸或阿魏酸。
3.—种如权利要求1所述的冬凌草促凝血有效成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)冬凌草叶阴干粉碎后，用70%乙醇室温浸泡2次，每次3d，合并浸泡液，减压回收溶剂得到70%乙醇总浸膏； (2)将70%乙醇总浸膏用硅胶搅样，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇洗脱，回收溶剂后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和甲醇部位； (3)乙酸乙酯部位用40-80目硅胶拌样，经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯体积比40:1-1:1进行梯度洗脱，将石油醚-乙酸乙酯体积比1:1洗脱下来的馏分经硅胶柱层析色谱用石油醚-丙酮体积比20:1-1:1梯度洗脱，其中石油醚-乙酸乙酯体积比8:2洗脱下来的馏分经SEhadex LH-20柱层析色谱用石油醚-氯仿-甲醇体积比9:9:2洗脱，重结晶，得到阿魏酸； 甲醇部位经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇体积比80:1-1:1进行梯度洗脱，其中， 氯仿-甲醇体积比40:1洗脱下来的馏分经S印hadex LH-20柱层析色谱用丙酮洗脱，重结晶，得到水杨酸； 氯仿-甲醇体积比20:1洗脱下来的馏分经硅胶柱层析色谱用氯仿-甲醇体积比50:1-10:1梯度洗脱后,经Sephadex LH-20柱层析色谱用氯仿-甲醇-水体积比9:9:2洗脱，重结晶，得到迷迭香酸； 氯仿-甲醇体积比10:1洗脱下来的馏分经S印hadex LH-20柱层析色谱用氯仿-甲醇体积比1:1洗脱，重结晶，得到冬凌草甲素。
4.一种如权利要求1所述的冬凌草促凝血有效成分在促凝血方面的应用。
5.一种如权利要求1所述的冬凌草促凝血有效成分在制备促凝血药物方面的应用。
【文档编号】C07C69/732GK103626653SQ201310353422
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】康文艺, 王培卿, 顾海鹏 申请人:河南大学