促凝血化合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供蛋白酶可活化的促凝血化合物，其包含促凝血多肽例如促凝血肽和/或凝血因子，和含有蛋白酶可切割的底物(例如，合成的凝血酶底物)和自分解性间隔子(例如，氨基甲酸对氨基苄酯)的接头。在蛋白酶可切割的底物被蛋白酶(例如，凝血酶)切割时，自分解性间隔子将其自身从促凝血多肽上切割以使该多肽是未衍生的活性形式。还提供药物组合物、使用本发明的化合物用于治疗出血病症的方法、增强促凝血多肽的体内功效的方法、增加包含促凝血多肽的化合物的蛋白水解切割功效的方法、使促凝血多肽活化的方法和从异源部分诸如PEG释放促凝血多肽的方法。
【专利说明】促凝血化合物
[0001] 背景 发明领域
[0002] 本发明涉及用于治疗出血疾病或病症的促凝血化合物。
[0003] 背景
[0004] 凝血途径部分涉及在血小板表面上形成因子VlIIa(FVIIIa)和因子IXa(FIXa) (X 酶复合物）的酶复合物。如没有其辅因子FVIIIa，FIXa是具有相对弱催化活性的丝氨酸蛋 白酶。X酶复合物将因子X(FX)切割成因子Xa(FXa)，其进而与因子Va(FVa)相互作用以切 割凝血酶原并产生凝血酶。血友病A是通过导致FVIII活性缺陷的因子VIII (FVIII)基因 突变和/或缺失而引起的出血病症（Peyvandi等，2006)。血友病B(也称为克雷司马斯病 (Christmas disease))是全世界最常见的一种遗传性出血病症。它导致体内和体外凝血活 性的降低并且在受影响个体的整个生命期间要求广泛的医疗监视。
[0005] 血友病的治疗是通过靶向凝血活性恢复的替代治疗。存在血浆源性的和重组的 凝血因子产品，可以用于按需治疗出血发作或通过预防性治疗来防止出血发作的发生。基 于这些产品的半衰期，治疗方案需要频繁的静脉内施用。此类频繁施用是疼痛的且不方 便。延长凝血因子半衰期的策略包括聚乙二醇化（Rostin J,等，Bioconj.Chem.2000; 11:387-96)、糖聚乙二醇化（Stennicke HR,等，Thromb. Haemost. 2008;100:920-8)、用 聚乙二醇化的脂质体配制（Spira J,等，Blood 2006;108:3668-3673, Pan J,等，Blood 2009 ; 114:2802-2811)和用白蛋白偶联（Sc hulte S.,Thromb. Res. 2008 ; 122 增刊 4:S14-9)。然而，用半衰期延长的部分（例如，PEG)修饰凝血因子和促凝血肽以及其它延 长它们半衰期的类似策略可导致活性降低。为了拯救其活性，在目标蛋白或肽及其改性剂 之间可以插入可切割的接头。所选择的可切割的接头必须被蛋白酶（例如，参与凝血级联 的蛋白酶）有效且快速地切割。为许多凝血因子活性剂的凝血酶是最普遍的选择。然而， 由天然氨基酸组成的所有已知的底物序列（例如，LVPR，ALRPR(SEQ ID NO:7)，等）并不是 最理想的底物。此外，可切割的接头与凝血因子或促凝血肽的共价结合可导致可防止有效 酶切反应的空间位阻（例如，由于氨基酸诸如脯氨酸、异亮氨酸或精氨酸C-末端在切割位 点的存在）。 发明概要
[0006] 本发明提供包含蛋白酶可切割的底物（例如，合成的凝血酶底物）和与促凝血多 肽（例如，凝血因子或促凝血肽）连接的自分解性（self-immolative)间隔子（例如，PABC) 的促凝血化合物。因此，在一些实施方案中，本发明提供具有下式的促凝血化合物：
[0007] (Het2) - (Pep2) - (Hetl) - (L) -Zy-Bx-Pepl (式 I)
[0008] 其中，
[0009] Hetl是第一异源分子，为不存在或存在的；
[0010] Het2是第二异源分子，为不存在或存在的；
[0011] L是接头，为不存在或存在的；
[0012] Zy是蛋白酶可切割的底物；
[0013] Bx是自分解性间隔子；
[0014] P印1是多肽；并且，
[0015] P印2是多肽，为不存在或存在的；
[0016] 其中，P印1或P印2包含凝血因子或其片段，或合成的促凝血肽。
[0017] 在一些实施方案中，在对蛋白酶可切割的底物进行酶切后，本发明的促凝血化合 物的自分解性间隔子经历1，4消除。在一些实施方案中，在对蛋白酶可切割的底物进行酶 切后，本发明的促凝血化合物的自分解性间隔子经历1，6消除。在一些实施方案中，自分解 性间隔子是氨基甲酸对氨基苄酯（PABC)、对氨基苄基醚（ΡΑΒΕ)或碳酸对氨基苄酯。在某 些实施方案中，自分解性间隔子包含芳基。在一些实施方案中，芳基选自苄基、肉桂基、萘基 和联苯基。在一些实施方案中，芳基是杂环的。在其它实施方案中，芳基包含至少一个取代 基。在一些实施方案中，至少一个取代基选自F、C1、I、Br、0Η、甲基、甲氧基、Ν0 2、ΝΗ2、Ν03+、 NHC0CH3、N (CH3) 2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯、 磺酸酯或其任意组合。在其它实施方案中，芳基中至少一个C被N、0或C-R 1取代，其中Ri 独立地选自 H、F、CI、I、、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH 3、N (CH3) 2、NHCOCF3、烷基、 卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
[0018] 在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物中的蛋白酶可切割的底物包含凝血 级联蛋白酶底物。在一些实施方案中，凝血级联蛋白酶选自凝血酶、凝血激酶、因子Va、 因子Vila、因子Villa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa或其任意组合。在其它 实施方案中，凝血级联蛋白酶底物是凝血酶底物。在一些实施方案中，凝血酶底物是合 成的凝血酶底物。在其它实施方案中，合成的凝血酶底物包含D-Phe-Pip-Arg序列。在 一些实施方案中，凝血酶底物选自 D-Phe-Pro-Arg、D-Ala-Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 17)、Ala-Leu-Val-Pro-Ar g(SEQ ID NO: 17)、Leu-Val-Pr〇-Arg(SEQ ID NO: 18)或 Ala-Leu-Arg-Pro-Arg(SEQ ID NO:90)。
[0019] 在一些实施方案中，蛋白酶可切割的底物包含选自以下的蛋白酶的切割位点：中 性溶酶（CALLA或⑶10)、甲拌磷寡肽酶（TOP)、白三烯A4水解酶、内皮缩血管肽转化酶、 ste24蛋白酶、溶神经素、线粒体中间肽酶、间质胶原酶、胶原酶、溶基质素、巨噬细胞弹性 酶、基质溶解因子、明胶酶、跨膜肽酶（meprins)、前胶原C-内肽酶、前胶原N-内肽酶、 ADAM和ADAMT金属蛋白酶、髓磷脂相关的金属蛋白酶、釉质溶素（enamelysin)、肿瘤坏死 因子α-转换酶、胰岛素溶酶（insulysin)、nardilysin、线粒体处理肽酶、magnolysin、 dactylysin样金属蛋白酶、嗜中性粒细胞胶原酶、基质金属蛋白酶、膜型基质金属蛋白酶、 SP2内肽酶、前列腺特异性抗原（PSA)、纤溶酶、尿激酶、人成纤维细胞活化蛋白质（FAPa)、 胰蛋白酶、糜蛋白酶、降I丐蛋白酶（caldecrin)、胰弹性蛋白酶、胰内肽酶、肠肽酶、白细胞 弹性蛋白酶、成髓细胞、糜蛋白酶类（chymase)、类胰蛋白酶、粒酶、角质层糜蛋白酶、顶体蛋 白酶、激肽释放酶、补体成分和因子、替代补体途径c3/c5转换酶、甘露糖结合蛋白相关的 丝氨酸蛋白酶、凝固因子、凝血酶、蛋白c、u和t型纤溶酶原活性剂、组织蛋白酶G、肝丝酶 (hepsin)、丝氨酸蛋白水解酶（prostasin)、肝细胞生长因子活化内肽酶、枯草杆菌蛋白酶 /kexin型前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、前蛋白转化酶、脯氨酰肽酶、酰基氨基酰基肽酶、肽 基-glycaminase、信号肽酶、η-末端亲核试剂氨基水解酶、20s蛋白酶体、γ -谷氨酰转肽 基酶、线粒体内肽酶、线粒体内肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶（matriptase)、位点1蛋白 酶、天冬酰胺内肽酶（Iegumain)、组织蛋白酶、半胱氨酸组织蛋白酶、钙蛋白酶、泛素异肽酶 T、胱天蛋白酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白转酰胺基酶、癌症促凝血剂、激素原硫醇蛋白酶、Y-谷 氨酰基水解酶、博莱霉素水解酶、成纤维细胞活化蛋白（seprase)、组织蛋白酶D、胃蛋白酶 (pepsin)、凝乳酶（chymosyn)、胃亚蛋白酶（gastricsin)、肾素、酵母天冬酶（yapsin)和/ 或memapsin、前列腺特异性抗原（PSA)或其任意组合。
[0020] 在一些实施方案中，P印1和P印2是不同的。在其它实施方案中，P印1和P印2是 相同的。在一些实施方案中，P印1是凝血因子或其片段。在其它实施方案中，其中P印2是 凝血因子或其片段。在某些实施方案中，P印1和P印2均是凝血因子或其片段。
[0021] 在一些实施方案中，P印1是凝血因子的重链，并且P印2是凝血因子的轻链。在其 它实施方案中，凝血因子选自FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXa、vWF或其任意组合。在其它 实施方案中，Pepl是合成的促凝血肽。在其它实施方案中，Pep2是合成的促凝血肽。在一 些实施方案中，P印1和P印2均是合成的促凝血肽。
[0022] 在一些实施方案中，接头（L)是肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含至少两个 氨基、至少三个、至少四个、至少五个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少 50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。在其它实施方 案中，肽接头包含至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700 个、至少800个、至少900个或至少1000个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含具有式 [(Gly) x-Sery]z的肽，其中X为1至4，y为0或1，并且z为1至50。在一些实施方案中，接 头（L)包含非肤接头。
[0023] 在一些实施方案中，接头（L)由非肽接头组成。在其它实施方案中，非肽接头选自 MC、MP、MPEG、SMCC、MBS、SMPT、LC-SPDP、SMPB 或其任意组合。
[0024] 在一些实施方案中，异源部分包含半衰期延长的部分。在其它实施方案中，半衰期 延长的部分是低复杂度的多肽。在其它实施方案中，半衰期延长的部分包含白蛋白、白蛋白 结合多肽或脂肪酸、Fc、转铁蛋白、PAS、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C-末端肽（CTP)、 聚乙二醇（PEG)、羟乙基淀粉（HES)、白蛋白结合小分子、vWF、XTEN或其任意组合。在一些实 施方案中，半衰期延长部分包含清除受体或阻断促凝血化合物与清除受体结合的其片段。 在一些实施方案中，清除受体为LRPl。
[0025] 在一些实施方案中，异源部分包含能够使促凝血化合物或其片段可视化或定位的 肽或多肽。在一些实施方案中，可视化或定位能够在体外、体内、离体或其任意组合中。在 一些实施方案中，能够可视化或定位的肽或多肽选自生物素受体肽、硫辛酸受体肽、荧光蛋 白、用于连接双砷染料或用于偶联亚稳锝的含有半胱氨酸的肽、用于基于荧光共振能量转 移（FRET)的邻近测定（proximity assay)的用于偶联铕包合物的肽、或其任意组合。
[0026] 在一些实施方案中，荧光蛋白选自6--、1^\￥--』6--』￥--或其任意组合。在一 些实施方案中，双砷染料为4'，5'-双（1，3, 2-二硫代砷杂环戊烷（dithi〇ars〇lan)-2-基） 荧光素（FlAsH)。在一些实施方案中，生物素受体肽促进基于抗生物素蛋白的试剂和基于链 霉亲和素的试剂的偶联。在一些实施方案中，硫辛酸受体肽促进硫醇反应性探针与结合的 硫辛酸偶联或直接连接荧光性硫辛酸类似物。
[0027] 在一些实施方案中，异源部分包含非肽活性剂。在一些实施方案中，非肽活性剂是 促凝血分子。在一些实施方案中，非肽活性剂是小分子药物。在一些实施方案中，异源部分 包含靶向部分或配体结合部分。在一些实施方案中，异源部分包含锚或支架分子。在一些 实施方案中，锚或支架分子是脂质、碳水化合物或巯基。
[0028] 在一些实施方案中，本发明的促凝血化合物包含式Het-L-Zy-Bx-Pepl,其中：
[0029] Het是半胱氨酸，
[0030] L是肽接头；
[0031] Zy是合成的凝血酶底物，
[0032] Bx是自分解性间隔子，并且
[0033] P印1是促凝血肽。
[0034] 在一些实施方案中，肽接头包含GGGG氨基酸序列，合成的凝血酶底物包含序列 DPhe-Pip-Arg，自分解性间隔子是PABC，并且促凝血肽包含序列：
[0035]
【权利要求】
1. 一种促凝血化合物，其具有下式： (Het2)-(P印2)- (Hetl) - (L)-Zy-Bx-P印1 其中， Hetl是第一异源分子，为不存在或存在的； Het2是第二异源分子，为不存在或存在的； L是接头，为不存在或存在的； Zy是蛋白酶可切割的底物； Bx是自分解性间隔子； P印1是多肽；并且， P印2是多肽，为不存在或存在的； 其中，P印1或P印2包含凝血因子或其片段，或合成的促凝血肽。
2. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子在对蛋白酶可切割 的底物进行酶切后经历1，4消除。
3. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子在对蛋白酶可切割 的底物进行酶切后经历1，6消除。
4. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子是氨基甲酸对氨基 苄酯（PABC)、对氨基苄基醚（ΡΑΒΕ)或碳酸对氨基苄酯。
5. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子包含芳基。
6. 根据权利要求5所述的促凝血化合物，其中所述芳基选自苄基、肉桂基、萘基和联苯 基。
7. 根据权利要求5所述的促凝血化合物，其中所述芳基是杂环基。
8. 根据权利要求5至7中任一项所述的促凝血化合物，其中所述芳基包含至少一个取 代基。
9. 根据权利要求8所述的促凝血化合物，其中所述至少一个取代基选自F、C1、I、Br、 OH、甲基、甲氧基、N02、NH2、NO3+、NHCOCH3、N (CH3) 2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-CiJ^基卤化 物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
10. 根据权利要求7所述的促凝血化合物，其中所述芳基中的至少一个C被N、0或C-R i 取代，其中 R1独立地选自 H、F、C1、I、Br、0H、甲基、甲氧基、NO 2, NH2、NO3+、NHC0CH3、N(CH3) 2、 NHC0CF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
11. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述蛋白酶可切割的底物包含凝血级 联蛋白酶底物。
12. 根据权利要求11所述的促凝血化合物，其中所述凝血级联蛋白酶选自凝血酶、凝 血酶原、因子Va、因子Vila、因子Villa、因子IXa、因子Xa、因子XIa和因子Xlla。
13. 根据权利要求11所述的促凝血化合物，其中所述凝血级联蛋白酶底物是凝血酶底 物。
14. 根据权利要求13所述的促凝血化合物，其中所述凝血酶底物是合成的凝血酶底 物。
15. 根据权利要求14所述的促凝血化合物，其中所述合成的凝血酶底物包含序列 D-Phe-Pip-Arg0
16. 根据权利要求13所述的促凝血化合物，其中所述凝血酶底物选自 D-Phe-Pro-Arg、D-Ala-Leu-Val-Pro-Arg、Ala-Leu-Val-Pro-Arg、Leu-Val-Pro-Arg 和 Ala-Leu-Arg-Pro-Arg0
17. 根据权利要求1至10中任一项所述的促凝血化合物，其中所述蛋白酶可切割的底 物包含选自以下的蛋白酶的切割位点：中性溶酶（CALLA或CD10)、甲拌磷寡肽酶（TOP)、白 三烯A4水解酶、内皮缩血管肽转化酶、ste24蛋白酶、溶神经素、线粒体中间肽酶、间质胶原 酶、胶原酶、溶基质素、巨噬细胞弹性酶、基质溶解因子、明胶酶、跨膜肽酶、前胶原C-内肽 酶、前胶原N-内肽酶、ADAM和ADAMT金属蛋白酶、髓磷脂相关的金属蛋白酶、釉质溶素、肿瘤 坏死因子ct -转换酶、胰岛素溶酶、nardilysin、线粒体处理肽酶、magnolysin、dactylysin 样金属蛋白酶、嗜中性粒细胞胶原酶、基质金属蛋白酶、膜型基质金属蛋白酶、SP2内肽酶、 前列腺特异性抗原（PSA)、纤溶酶、尿激酶、人成纤维细胞活化蛋白质（FAPa)、胰蛋白酶、 糜蛋白酶、降钙蛋白酶、胰弹性蛋白酶、胰内肽酶、肠肽酶、白细胞弹性蛋白酶、成髓细胞、糜 蛋白酶类、类胰蛋白酶、粒酶、角质层糜蛋白酶、顶体蛋白酶、激肽释放酶、补体成分和因子、 替代补体途径c3/c5转换酶、甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶、凝固因子、凝血酶、蛋 白c、u和t型纤溶酶原活性剂、组织蛋白酶G、肝丝酶、丝氨酸蛋白水解酶、肝细胞生长因子 活化内肽酶、枯草杆菌蛋白酶/kexin型前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、前蛋白转化酶、脯氨酰 肽酶、酰基氨基酰基肽酶、肽基-glycaminase、信号肽酶、η-末端亲核试剂氨基水解酶、20s 蛋白酶体、Y-谷氨酰转肽基酶、线粒体内肽酶、线粒体内肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶、 位点1蛋白酶、天冬酰胺内肽酶、组织蛋白酶、半胱氨酸组织蛋白酶、钙蛋白酶、泛素异肽酶 T、胱天蛋白酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白转酰胺基酶、癌症促凝血剂、激素原硫醇蛋白酶、Y-谷 氨酰基水解酶、博莱霉素水解酶、成纤维细胞活化蛋白、组织蛋白酶D、胃蛋白酶、凝乳酶、胃 亚蛋白酶、肾素、酵母天冬酶和/或memapsin，和前列腺特异性抗原（PSA)。
18. 根据权利要求1至17中任一项所述的促凝血化合物，其中P印1和P印2是不同的。
19. 根据权利要求1至17中任一项所述的促凝血化合物，其中P印1和P印2是相同的。
20. 根据权利要求1至19中任一项所述的促凝血化合物，其中P印1是凝血因子或其片 段。
21. 根据权利要求1至20中任一项所述的促凝血化合物，其中P印2是凝血因子或其片 段。
22. 根据权利要求1至21中任一项所述的促凝血化合物，其中P印1和P印2是凝血因 子或其片段。
23. 根据权利要求1至22中任一项所述的促凝血化合物，其中P印1是凝血因子的重 链，并且P印2是所述凝血因子的轻链。
24. 根据权利要求20至23中任一项所述的促凝血化合物，其中所述凝血因子选自 FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXa 和 vWF。
25. 根据权利要求1至19中任一项所述的促凝血化合物，其中P印1是合成的促凝血 肽。
26. 根据权利要求1至19中任一项所述的促凝血化合物，其中P印2是合成的促凝血 肽。
27. 根据权利要求1至19中任一项所述的促凝血化合物，其中P印1和P印2均是合成 的促凝血肽。
28. 根据权利要求1至27中任一项所述的促凝血化合物，其中所述接头是肽接头。
29. 根据权利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接头包含至少两个氨基、至少 三个、至少四个、至少五个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少 60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。
30. 根据权利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接头包含至少200个、至少300 个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000 个氨基酸。
31. 根据权利要求28所述的促凝血化合物，其中所述肽接头包含具有式[(Gly) X-Sery] z的肽，其中X为1至4,y为0或1,并且Z为1至50。
32. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述接头包含非肽接头。
33. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述接头由非肽接头组成。
34. 根据权利要求30或31所述的促凝血化合物，其中所述非肽接头选自MC、MP、MPEG、 SMCC、MBS、SMPT、LC-SPDP 和 SMPB。
35. 根据权利要求1至34中任一项所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包括半衰 期延长部分。
36. 根据权利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延长部分是低复杂度的多 肽。
37. 根据权利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延长部分包含白蛋白、白 蛋白结合多肽或脂肪酸、Fc、转铁蛋白、PAS、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C-末端肽 (CTP)、聚乙二醇（PEG)、羟乙基淀粉（HES)、白蛋白结合小分子、vWF或其任意组合。
38. 根据权利要求35所述的促凝血化合物，其中所述半衰期延长部分包含清除受体或 阻断促凝血化合物与清除受体结合的其片段。
39. 根据权利要求38所述的促凝血化合物，其中所述清除受体是LRPl。
40. 根据权利要求1至39中任一项所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包含能够 使促凝血化合物或其片段可视化或定位的肽或多肽。
41. 根据权利要求40所述的促凝血化合物，其中所述可视化或定位能够在体外、体内、 离体或其任意组合中。
42. 根据权利要求41所述的促凝血化合物，其中所述能够可视化或定位的肽或多肽选 自生物素受体肽、硫辛酸受体肽、荧光蛋白、用于连接双砷染料或用于偶联亚稳锝的含有半 胱氨酸的肽、用于基于荧光共振能量转移（FRET)的邻近测定的用于偶联铕包合物的肽、及 其任意组合。
43. 根据权利要求42所述的促凝血化合物，其中所述荧光蛋白选自GFP、RFP、YFP、 EGFP、EYFP及其任意组合。
44. 根据权利要求42所述的促凝血化合物，其中所述双砷染料为4'，5'-双（1，3, 2-二 硫代砷杂环戊烷-2-基）荧光素（FlAsH)。
45. 根据权利要求42所述的促凝血化合物，其中所述生物素受体肽促进基于抗生物素 蛋白的试剂和基于链霉亲和素的试剂的偶联。
46. 根据权利要求42所述的促凝血化合物，其中所述硫辛酸受体肽促进硫醇反应性探 针与结合的硫辛酸偶联或直接连接荧光性硫辛酸类似物。
47. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包含非肽活性剂。
48. 根据权利要求47所述的促凝血化合物，其中所述非肽活性剂是促凝血分子。
49. 根据权利要求47所述的促凝血化合物，其中所述非肽活性剂是小分子药物。
50. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包含靶向部分或配体结 合部分。
51. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中所述异源部分包含锚或支架分子。
52. 根据权利要求51所述的促凝血化合物，其中所述锚或支架分子是脂质、碳水化合 物或疏基。
53. 根据权利要求1所述的促凝血化合物,包含式Het-L-Zy-Bx-Pepl,其中： Het是半胱氨酸， L是肤接头； Zy是合成的凝血酶底物， Bx是自分解性间隔子，并且 Pepl是促凝血肽。
54. 根据权利要求53所述的促凝血化合物，其中所述肽接头包含GGGG氨基酸序列，所 述合成的凝血酶底物包含序列DPhe-Pip-Arg,所述自分解性间隔子是PABC，并且所述促凝 血肽包含序列
55. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其包含式Zy-Bx-P印1，其中： Zy是合成的凝血酶底物， Bx是自分解性间隔子，并且 Pepl是凝血因子。
56. 根据权利要求55所述的促凝血化合物，其中所述合成的凝血酶底物包含序列 DPhe-Pip-Arg，所述自分解性间隔子是PABC，并且所述凝血因子是因子Xa或FVIIa。
57. 根据权利要求1所述的促凝血化合物，其中使用选自以下的方法来测量所述促凝 血活性：活化部分凝血活酶时间（aPTT)测定、改进的活化部分凝血活酶时间（aPTT*)测定、 凝血酶生成测定（TGA)和ROTEM测定。
58. -种药物组合物，包含根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物和药学 上可接受的载体。
59. -种用于治疗、改善或预防受试者中出血疾病或病症的方法，其包括给所述受试者 施用有效量的根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物或根据权利要求58所述 的药物组合物。
60. 根据权利要求59所述的方法，其中所述出血疾病或病症由凝血障碍引起。
61. 根据权利要求60所述的方法，其中所述凝血障碍选自血友病和血管性血友病 (vffD) 〇
62. 根据权利要求61所述的方法，其中所述凝血障碍是血友病A或血友病B。
63. 根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述出血疾病或病症选自关节积 血、肌肉出血、口腔出血、流血、流血到肌肉、口腔流血、创伤、头部创伤、消化道出血、颅内流 血、腹腔内流血、胸内流血、骨折、中枢神经系统出血、咽后区出血、腹膜后隙出血和骼腰肌 鞘出血。
64. -种治疗、改善或预防哺乳动物受试者中至少一种凝血因子缺乏的方法，其中所述 凝血因子选自FV、FVII、FVIIa、FVIII、FIX、FX、FXI和vWF，所述方法包括给所述受试者施 用有效量的根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物或根据权利要求58所述的 药物组合物。
65. 根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
66. 根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物或根据权利要求58所述的药 物制剂用于治疗患有凝血障碍的受试者。
67. 根据权利要求66所述的促凝血化合物，其中所述受试者是人受试者。
68. 根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物或根据权利要求58所述的药 物制剂用于生产用于治疗、预防或改善凝血障碍的药物的用途。
69. -种制备根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物的方法，所述方法包 括使用固相肽合成。
70. 根据权利要求69所述的方法，其包括使用正交固相肽合成。
71. -种增强促凝血多肽的体内功效的方法，所述方法包括使所述多肽与自分解性间 隔子偶合，其中所述自分解性间隔子与蛋白酶可切割的底物部分偶合。
72. 根据权利要求71所述的方法，其中所述自分解性间隔子包含PABC基团。
73. 根据权利要求71所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的底物部分包含合成的凝血 酶底物。
74. 根据权利要求71所述的方法，其中所述促凝血多肽是凝血因子或促凝血肽。
75. 根据权利要求71所述的方法，其中所述促凝血肽是合成的。
76. -种增加可操作地连接至促凝血肽或凝血因子的蛋白酶底物的切割功效的方法， 所述方法包括使自分解性接头与所述促凝血多肽偶联，其中将所述自分解性接头插入在所 述蛋白酶底物和所述促凝血肽或凝血因子之间。
77. -种使促凝血肽活化的方法，其包括使根据权利要求1至57中任一项所述的促凝 血化合物与对所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶接触，其 中所述活化的促凝血肽在对所述蛋白酶可切割的底物部分进行蛋白水解切割时释放。
78. -种使凝血因子活化的方法，其包括使根据权利要求1至57中任一项所述的促凝 血化合物与对所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物部分特异性的蛋白酶接触，其 中所述活化的凝血因子在对所述蛋白酶可切割的底物部分进行蛋白水解切割时释放。
79. -种从异源部分释放促凝血肽的方法，其包括使根据权利要求1至57中任一项所 述的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物特异性的蛋白酶接 触，其中所述活化的促凝血多肽在对所述蛋白酶可切割的底物进行蛋白水解切割时释放。
80. -种从异源部分释放凝血因子的方法，其包括使根据权利要求1至57中任一项所 述的促凝血化合物与对所述促凝血化合物中所述蛋白酶可切割的底物特异性的蛋白酶接 触，其中所述活化的凝血因子在对所述蛋白酶可切割的底物进行蛋白水解切割时释放。
81. 根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物，其中当与具有所述相同序列 但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，所述促凝血化合物被对所述蛋白酶可 切割的底物部分特异性的蛋白酶切割快至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、 至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
82. 根据权利要求1至81中任一项所述的促凝血化合物，其中当与具有所述相同序列 但不具有自分解性接头的参考促凝血化合物相比时，所述促凝血化合物被对所述蛋白酶可 切割的底物部分特异性的蛋白酶切割快至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少 60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
83. 根据权利要求1至57中任一项所述的促凝血化合物，其中所述自分解性间隔子包 含外部位结合肽。
84. -种蛋白酶可切割的多肽，其包含凝血因子的轻链、所述凝血因子的截短的重链 (〃tHC〃）和蛋白酶切割位点，其中所述蛋白酶切割位点连接所述凝血因子的截短的重链和 所述凝血因子的轻链。
85. 根据权利要求84所述的蛋白酶可切割的多肽，其还包含在所述蛋白酶切割位点和 所述凝血因子的轻链之间的细胞内加工位点。
86. 根据权利要求84或85所述的蛋白酶可切割的多肽，其还包含通过任选的接头与所 述凝血因子的截短的重链的C-末端连接的异源部分。
87. 根据权利要求86所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述异源部分包含半衰期延长 部分。
88. 根据权利要求87所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述半衰期延长部分包含白蛋 白、白蛋白结合多肽或脂肪酸、Fc、转铁蛋白、PAS、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C-末端 肽（CTP)、聚乙二醇（PEG)、羟乙基淀粉（HES)、白蛋白结合小分子、清除受体或阻断所述促 凝血化合物与清除受体结合的其片段、或其任意组合。
89. 根据权利要求86至88中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述异源部分包 含Fc区。
90. 根据权利要求86至89中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述异源部分包 含通过接头融合的两个Fc区。
91. 根据权利要求84至90中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是 因子VII或因子X。
92. 根据权利要求84至90中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中与所述凝血因子 的所述野生型重链相比，所述凝血因子的截短的重链在所述重链的N-末端不包含一个或 多个氨基酸。
93. 根据权利要求92所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述一个或多个氨基酸在所述 重链的N-末端包含2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基 酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基 酸或15个氨基酸。
94. 根据权利要求92或93所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是因子VII 并且所述一个或多个氨基酸是IVGGKV(SEQIDNO:83)或IVGGKVCPKGE(SEQIDNO:84)。
95. 根据权利要求92或93所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述凝血因子是因子X并 且所述一个或多个氨基酸是IVGGQE(SEQIDN0:85)或IVGGQECKDGE(SEQIDN0:86)。
96. 根据权利要求84至95中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽，其中所述蛋白酶可切 割的位点包含SUMO。
97. -种多核苷酸，其编码根据权利要求84至96中任一项所述的可切割的多肽。
98. -种表达载体，其包含根据权利要求97所述的多核苷酸。
99. 一种宿主细胞，其包含根据权利要求98所述的载体。
100. -种制备可切割的多肽的方法，其包括用根据权利要求97所述的多核苷酸或根 据权利要求98所述的载体转染宿主细胞并且在足以表达所述多肽的条件下培养所述宿主 细胞。
101. -种制备促凝血化合物的方法，其包括在足以切割蛋白酶可切割的位点的条件下 使根据权利要求84至96中任一项所述的蛋白酶可切割的多肽与蛋白酶组合，其中所述蛋 白酶可切割的多肽导致被切割的多肽。
102. 根据权利要求101所述的方法，其还包括向所述被切割的多肽中加入硫酯肽，其 中所述硫酯肽与所述凝血因子的截短的重链的N-末端融合。
103. 根据权利要求101或102所述的方法，其中所述硫酯肽包含蛋白酶可切割的底物 (Zy)。
104. 根据权利要求103所述的方法，其中所述硫酯肽还包含在所述蛋白酶可切割的底 物和所述凝血因子的截短的重链之间的自分解性间隔子（Bx)。
105. 根据权利要求104所述的方法，所述硫酯肽还包含在所述自分解性间隔子和所述 凝血因子的截短的重链之间的一个或多个氨基酸。
106. 根据权利要求104或105所述的方法，其中所述硫酯肽包含式： Zy-Bx-W, 其中Zy是蛋白酶可切割的底物； Bx是自分解性间隔子；并且 W是一个或多个氨基酸。
107. 根据权利要求104或105中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸（W) 与对应于野生型凝血因子的N-末端的所述氨基酸序列相同，其中所述一个或多个氨基酸 和所述凝血因子的截短的重链在融合时产生所述凝血因子的完整重链。
108. 根据权利要求105至107中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸包含 IVGGKV(SEQ ID N0:83)或IVGGKVCPK GE(SEQ ID N0:84)并且其中所述凝血因子包含因子 VII。
109. 根据权利要求104至107中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸包含 IVGGQE(SEQ ID N0:85)或IVGGQECKD GE(SEQ ID N0:86)并且其中所述凝血因子包含因子 X。
110. 根据权利要求103至109中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的底物包 含凝血酶切割位点。
111. 根据权利要求110所述的方法，其中所述凝血酶切割位点包含D-Phe-Pip-Arg。
112. 根据权利要求104至111所述的方法，其中所述自分解性间隔子包含PABC。
113. 根据权利要求100至112中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶可切割的位点包 含 smro。
【文档编号】A61K38/36GK104519897SQ201380036823
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年6月7日 优先权日:2012年6月8日
【发明者】洪吴鹏, 亚当·R·梅祖, 乔·萨拉斯, 罗伯特·彼得斯 申请人:比奥根艾迪克Ma公司