测量凝血的方法和装置的制作方法

专利名称：测量凝血的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于执行分析以测定样品中一种或多种分析物的存在、具体为测量凝
血的微流体系统。
背景技术：
凝血是一个复杂的过程，涉及三种相互作用的组分血管，凝血因子和血小板。存 在两种已被很好认识的凝血途径外源性或促凝血酶原激酶控制的、以及内源性或凝血酶 原/纤维蛋白原控制的凝血途径。外源性和内源性途径都导致凝血酶的产生，这是一种催 化纤维蛋白原向纤维蛋白转化的蛋白水解酶。可溶性血浆蛋白纤维蛋白原通过凝血酶的作 用转化成不溶性纤维蛋白，导致测试样品从液体变为凝结的形式。 在临床分析测试中，凝血分析测试测量纤维蛋白凝块形成所需的时间。有许多 类型的凝血分析。它们包括凝血酶原时间(PT)、部分促凝血酶原激酶时间(PTT)、活化的 部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、纤维蛋白原分析、凝血酶凝血时间(TCT)、活化凝血时间 (ACT)和其它。两种最常用的凝血测试是PT和APTT分析。这两种测试都测量凝血时间，以 评估患者的基线止血状态或监测对抗凝剂疗法的反应，以及凝血系统的总体功能和状态。
PT测试用于评估外源性和共同途径凝血系统，并用于监测长期抗凝剂疗法。长期 抗凝剂疗法的常见药物是华法令异丙醇钠笼形包合物，通常所知的商标名为COUMADIN ,由 Bristol Myers Squibb销售。华法令及其类似物通过有效阻断维生素K依赖性凝血因子的 生物合成，来诱导抗凝作用。因为PT测试测量了凝血时间，因此可以测定血液中抗凝剂的 有效量。 第二种常规使用的分析是APTT测试，广泛用于监测肝素疗法，以筛查包含在源性 和共同凝血系统中的凝血因子的缺陷。肝素通过与被称为抗凝血酶III的血浆辅因子结合 并形成复合物，来发挥其抗凝作用。 除了上述之外，FDA已经批准了几种蛋白C分析进行临床应用，它们广义上可以分 成三种类型抗原性，发色性/酰胺水解性，和凝血测量。抗原性分析包括ELISA、EIA和RIA 类型的测试。这些分析不确定蛋白是否具有功能，因为抗体不针对与功能活性有关的表位。
发色性/酰胺水解活分析依靠酶的活性位点裂解小的合成底物以释放出色彩鲜 明的产物的能力。在活化的蛋白C对合成底物的活性与对天然生物学底物的活性之间可能 存在差异。此外，合成底物没有测试酶的其它功能特征(即辅因子相互作用)。
凝血测量分析需要在样品分析前产生标准曲线。样品需要首先稀释，进行温育以 活化蛋白C，然后启动凝血级联。使用凝血时间与蛋白C活性之间的标准曲线来内推未知样 品的蛋白C活性。尽管在实验室程序中存在差异，但当打开新的试剂批次、或当对照不在其 规定的范围内时，常规要对被测试的每组患者样品重复制作标准曲线。
在这些方法的使用中存在许多缺点。例如，试剂对热敏感，在使用前需要冷藏。一 旦将干燥的试剂复溶，它必须在几小时内使用，否则将丢弃。此外，实验室设备由于所用的 技术复杂而相对较大，昂贵，并且由于检测方法的复杂性，被设计成由经过训练的人员来使 用。此外，通常也需要大血样。因此，对于精确、方便和廉价地检测和测定凝血时间的分析 系统，存在着需求。
发明概述 本发明提供了用于执行分析以测定血样凝结所需时间的装置和方法。装置包含 涂有一种或多种凝血剂的反应室。将一滴血液或等同物放置在加样端口上，并与反应室中 的凝血剂接触。任选，样品可以被稀释。接触可以通过任何方式，例如通过将盒沿着x、 y 和z轴倾斜。血样可以通过反应室前后移动，直到血液凝结。凝血过程形成的纤维蛋白丛 (fibrin stands)，阻止了血液样品的流动。凝结时间是从样品进入反应室到样品的运动或 流动停止、或毛细管中产生的波幅从最初的无凝血状态发生改变时的总时间。
在参考了下面的详细描述后，本发明的这些以及其它方面将变得了然。此外，在本 文中提出的各种参考文献更详细地描述了某些程序或组合物，因此以其全文引为参考。
附图简述

图1显示了用后即可丢弃条的透视图，其具有一组互连反应室和在一个室中的可
移动元件。 详细描述 所有在本文中引用的出版物、专利和专利申请，不论是在上文还是下文中的，在此 以其全文引为参考。 除非另有指明，在本申请、包括说明书和权利要求书中使用的下列术语，具有下面 给出的定义。必须指出，当用在说明书和随附的权利要求书中时，不带数量的指称物包括了 复数形式，除非上下文明确有另外的表示。 本文中使用的术语"对象"包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但 不限于哺乳动物纲的任何成员人类，非人类灵长动物例如黑猩猩，以及其它猿和猴物种； 农场动物例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物例如兔、狗和猫；实验室动物包括啮齿动物， 例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的例子包括但不限于鸟、鱼等。该术语不指定具体的 年龄或性别。 本文使用的"固体支持物"是指固体表面，例如塑料板、磁珠、乳胶珠、微孔板的孔、 玻璃板、尼龙、琼脂糖、丙烯酰胺等。 本发明涉及测量凝血时间的方法和微流体装置。典型的微流体装置显示在图1 中。装置含有盒100，盒100具有涂有一种或多种凝血剂例如组织因子或其它凝血剂的反 应室110和120。反应室110和120可以通过一个或多个毛细管通道与血液储存槽(blood reservoir) 130、不凝血参比端口 140和加样端口 150流体连通。将一滴血液或等同物放置 在加样端口 150上。任选，可以将稀释剂放置在储存槽150中，由此血样与稀释剂的混合可 以任选提供稀释的血样。然后可以将血样与凝血剂在反应室110和/或120中接触。接触 可以通过任何方式，例如通过机械移动储存槽130的薄膜，使得毛细管复合体中的样品可 以以给定的频率和幅度，与薄膜致动器同步移位，或者通过将盒沿着x、y和z轴倾斜。血样 可以通过反应室110和120前后移动，直到血液凝结。凝血过程形成的纤维蛋白架阻止了血液样品的流动，也改变了由薄膜动作产生的波形的幅度。凝血时间是从样品进入反应室 110和120到波形的幅度改变、和/或样品的运动或流动停止时的总时间。
盒100可以是长方形、圆形、椭圆形或任何形状，并可以由适合的材料制成，所 述材料根据其性质进行选择，例如良好的导热性、适于光透射的透明性、易于焊接的机械 性质、允许均匀涂层和试剂稳定性的表面性质、以及对液体介质中性以防止对分析的干 扰。为此，适合的塑料包括具有高的自由表面能和低的水吸附性的塑料，包括PETG、聚酯 (Mylar )、聚碳酸酯(Lexan⑧)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、SAN、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯 (ABS)，特别是由Borg Warner在商标名Cycolac下提供的ABS，等等。可选地或等价地，可 商购的模制盒可用于实施本发明。 盒100可以具有涂有一种或多种凝血剂例如组织因子的反应室110和120。每个 反应室可以优选暴露于大气。在本发明的一个方面，反应室110和120可以具有遍布的障 碍物128。障碍物128可以是任何形状，例如圆筒或柱形，在它们之间具有空隙，允许血样前 后流动，直到凝结。在本发明的另一方面，反应室110和120不具有障碍物128。
血样可以通过传统方式从患者获得，例如静脉穿剌或扎手指。样品可以通过加样 端口 150施加到盒100上。在本发明的一个方面，从患者获得的血样在本发明的方法和装 置中无需附加的操作即可使用。或者，从患者获得的血样可以被处理，以完全或部分地除去 血红细胞。血红细胞可以通过任何已知的方法移除，例如离心、将样品与血红细胞凝集剂反 应、或通过使用血红细胞过滤器。在实施方法中使用血浆，可以通过例如允许成像系统更好 地监测血液中发生的物理变化，例如纤维蛋白原物理聚合成纤维蛋白，来提供更好的准确 度和精确性。 在凝结前，血液或血浆可以任选用稀释剂进行稀释。稀释剂可以简单地是水性溶 液，或者它可以是非水性溶液，并任选可以包含各种添加剂，例如盐、蛋白、糖、糖类、金属离 子例如钙、镁、镧系元素等。某些稀释剂的配方可以包括含有明胶的组合物和乳液。稀释剂 典型是缓冲溶液，例如柠檬酸缓冲液。稀释剂可以放置在储存槽130、加样端口 150或不凝 血孔140中。 然后可以将未稀释的样品或稀释过的样品移动到反应室110和120中，以便进行 凝血分析。在本发明的一个方面，样品可以使用压力来移动。例如，储存槽130可以是与薄 膜组合的弯曲元件，或柔性的、可压縮的、可紧縮的、可膨胀的或可压力移动的层或元件。薄 膜的位置要使得薄膜的一个表面暴露于环境，而薄膜的第二个表面限定出储存槽130的内 腔部分，薄膜的移动引起内腔中压力的改变。压力的改变引起血样进出反应室110和120、 以及进出不凝血参比端口 140和加样端口 150的运动。优选，储存槽130的薄膜可以机械 运动，使得毛细管复合体中的血样以给定的频率和幅度位移。 本发明的凝血分析包括凝血酶原时间(PT)、部分促凝血酶原激酶时间(PTT)、活 化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶凝血时间(TCT)、纤维蛋白原、肝素管理测试 (HMT)、鱼精蛋白响应时间(PRT)、肝素响应时间(HRT)、低分子量肝素(L丽H)、低范围肝素 管理测试(LHMT)和蛇静脉酶(ecarin)凝血时间(ECT)，这些测试每种的试剂都如本领域中 所述。可以将用于一种或多种分析的试剂放置在一个或两个反应室110和120中。试剂可 以施加在反应室的所有表面上，或仅仅施加在障碍物128上。将用于分析的试剂放置在反 应室110和120之一中， 一个反应室用作活性对照，反应室140用作不凝血对照，因为该室中将不发生凝血。或者，每个反应室110和120可以具有不同的凝血分析试剂。例如，反应 室110可以具有用于PT分析的试剂，而反应室120可以具有用于HRT分析的试剂。
例如，如果凝血分析是PT，可以使用任何来源的促凝血酶原激酶。例如，促凝血酶 原激酶可以从商业来源购买，或者它可以从人类胎盘、兔脑、牛脑、公牛脑和人脑中提取。也 可以使用通过重组DNA技术生产的促凝血酶原激酶。典型的来源是兔脑。兔脑粉是可商购 的，它可以按照标准技术如下进行分离从例如新西兰白兔中取出剥离了相连的血管的全 脑，将兔全脑在Waring混合器中、在过量丙酮中匀浆以产生浆液，并将浆液在真空下干燥，
以产生在真空下、在-2(rc储存时稳定的兔脑粉末。粉末状牛脑、粉末状公牛脑、粉末状人
脑、通过重组DNA技术生产的粉末状促凝血酶原激酶、以及粉末状人胎盘，可以以类似的方 式或通过众所周知的技术方法来制备。 然后可以将粉末状促凝血酶原激酶源，例如兔脑粉末或人胎盘粉末，在水性溶液 中进行提取，以制备促凝血酶原激酶提取物。水性溶液可以是温暖的盐水溶液，任选含有金 属离子螯合剂。金属离子螯合剂可以是柠檬酸、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双 氨乙基醚四乙酸(EGTA)，及其盐。粉末状脑物质使用水性溶液提取，促凝血酶原激酶分离在 上清液中。可以将上清液离心以分离促凝血酶原激酶，然后可以将分离的促凝血酶原激酶 冷冻干燥。 然后可以通过将通过上述过程制备的促凝血酶原激酶提取物与f丐离子进行混合， 来制备促凝血酶原激酶试剂。通过该过程制备的促凝血酶原激酶可以、但不是必须在最终 试剂中包含金属离子螯合剂。可以使用任何来源的钙离子，例如氯化钙、酒石酸钙、葡萄糖 酸钙、柠檬酸钙或乳酸钙等。这样制备的或从商业来源获得的促凝血酶原激酶试剂可以放 置在反应室110和120中。 在另一个实施例中，凝血分析可以是蛋白C激活剂分析，说明了使用了蛋白C激活 剂分析的本发明方法和装置。该分析使用的试剂含有内源凝血途径或因子X的引发剂，蛋 白C激活剂(例如凝血调节蛋白、ProtacTM、其它催化性或化学计量激活剂)，钙离子，一种 或多种在凝血级联中与钙结合位点相互作用的金属化合物、优选为一种或多种镧系金属化 合物，以及任选的增量剂和/或稳定剂。 蛋白C的浓度可以与凝血时间、凝块形成的速度、最终凝块的完整性(即凝块强 度)或其任何组合相关联。分析可以针对标准对照血浆进行校正，以建立测量信号与蛋白 C浓度之间的关系。如果需要，标准对照曲线可以在样品测量之前立即产生，或者可以是纸 质的或电子储存的标准对照曲线。 上面描述的全血或血桨样品可以原样使用，或可以在蛋白C缺乏的血桨中稀释， 优选1份样品对5份该缺乏血浆，以降低干扰物质的浓度并补充任何可能由于遗传或临床 病症而缺乏的凝血因子。此外，如果需要，可以向稀释样品中加入聚凝胺或另一种肝素拮抗 剂。 在本发明的蛋白C分析中，将样品定位于含有蛋白C分析试剂的反应室110和 120。该蛋白C分析试剂含有蛋白C激活剂、内源凝血途径或因子X的引发剂、钙离子、以及 任选的一种或多种镧系金属化合物。 在蛋白C分析中，反应以初始延迟时间开始，在此期间，据认为，凝血调节蛋白捕 获凝血酶并活化蛋白C，样品的凝结在大约至少200秒后、优选大约至少250秒后、更优选大约至少300秒后开始。初始延迟时间可以在几秒到大约5-7分钟之间变化。 在本发明的蛋白C分析中，内源凝血途径或因子X的引发剂可以是任何能够触
发凝血级联的物质，例如ThromboScreen Kontact ,可以从Pacific Hemostasis of
Huntersville， N. C.商购。也可以使用因子X、凝血酶原时间(PT)和活化的部分促凝血酶
原激酶时间(APTT)的其它凝结引发剂，包括从纯化的组分复溶的试剂。蛋白C激活剂优选
为按照上面的描述制备或从商业来源获得的凝血调节蛋白。 另一方面，本发明的装置和方法可用于细菌内毒素的凝结和/或发色测试。细菌 内毒素主要是源自于革兰氏阴性细菌的细胞膜的脂多糖组分。这些测试大部分利用了来自 美国鲎(Limulus Polyphemus)的鲎变形细胞裂解物(LAL) 。 LAL暴露于细菌内毒素或葡聚 糖，触发了原始的凝血系统，导致将液体LAL转化成固化的凝胶凝块，类似于哺乳动物血浆 凝结分析。该测试、以及利用可选的生物系统(即东方鲎(Tachypleus)变形细胞裂解物)、 这些系统的纯化成分、重组蛋白单独或与其它凝血系统成分、结构蛋白、蛋白酶抑制剂或激 活剂相组合作出的任何修改，也很适合用于本发明的装置和方法。该测试系统的用途包括 但不限于定量肠胃外药物、灌洗流体、透析溶液、WFI、和医学装置以及IVD产品和加工材料 中的内毒素水平。使用本发明的装置和方法对细菌内毒素进行的凝结和/或发色测试，在 监测内毒素血症和败血症患者中也发现了用途。 在本发明的一个方面，样品在反应室110和120中以及在不凝血参比端口 140中 位移的频率和/或幅度，可以作为时间的函数进行测量。参比端口 140中的样品将不凝结， 因为凝血药剂只放置在反应室110和/或120中。样品在反应室110和120中位移的频率 和/或幅度，可以与样品在不凝血参比端口 140中的频率和/或幅度进行比较。与不凝血 参比端口 140相比，样品在反应室110和120中位移的频率和/或幅度的变化，指示了样品 在凝结时间点从液体向纤维状凝胶的转变。典型地，不凝血参比端口 140可以保持向大气 开放，以缓冲冲着凝血反应孔的力，由此允许在凝块一形成时就检测到它。没有不凝血通道 吸收附加的力，捕获得较弱的凝块可能从柱上裂开，或导致其检测的延迟。
凝结时间可以通过检测液体样品在与凝血试剂接触后物理变化的改变程度来检 测。物理变化可以是任何变化，例如浊度(包括吸光度)、粘度、介电常数等。优选，物理变 化通过光学测量检测运动和或波的性质、或通过浊度(或吸光值)来检测。
储存槽130上的膜或薄膜通常可以以给定的频率振动活动。薄膜的运动将血液 样品全部通过光学路径(沿着毛细管的长度)移动，可以光学观察到正弦波。当凝胶形成 (在凝结点)时，凝块中的纤维蛋白网缠绕在柱周围，具体反应孔中的运动停止。然而参比 垛口 140中的运动继续，光学元件将参比端口 140中波的运动针对反应室110和120中的 进行匹配。在另一方面，反应室110可以用作具有固定凝血时间的对照，而反应室120可以 用于可变的患者样品的测试区。 反应孔可以相对于毛细管系统的其余部分制造得更深，以增加波形的尺寸。
除了光学元件之外，可以使用其它方法来检测凝结的血液样品。例如，液体样品 的浊度(或吸光度)可以容易地通过光学监测，可以使用可商购的装置例如STAT MUN0 SYSTEM Quick Turbo II(由A &T Corp.制造)、自动化分析仪Multiple Chemistry Unit 502X(由A & TCorp.制造)、自动化分析仪Automatic Analyzer 7070 (由Hitachi Ltd. 制造)等，容易地检测浊度变化的程度。
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例如，浊度测量可以使用自动化分析仪Multiple Chemistry Unit502X来进行，其 中可以选择340到795nm之间的两种波长作为测量波长。通过在数秒内进行的间歇测量， 可以同时测量选定的两种波长。 尽管已经参考优选实施方案和各种可替代实施方案对本发明进行了具体的显示 和描述，但相关技术领域的专业人员将会理解，可以对其进行各种形式和细节上的改变而 不背离本发明的精神和范围。所有在本申请中引用的已出版的专利和出版物，在此以其全 文引为参考。
权利要求
一种盒，其含有两个反应室、血液储存槽、参比端口和加样端口，其中两个反应室通过毛细管通道与血液储存槽流体连通，血液储存槽通过毛细管通道与参比端口流体连通，参比端口通过毛细管通道与加样端口流体连通，并且其中储存槽包括用于移动毛细管通道内样品的薄膜。
2. 权利要求l的盒，其中基材选自塑料、玻璃、尼龙、金属及其组合。
3. 权利要求2的盒，其中基材是塑料。
4. 权利要求l的盒，其中反应室含有凝血剂。
5. 权利要求4的盒，其中凝血剂用于选自下面的分析凝血酶原时间(PT)、部分促凝血 酶原激酶时间(PTT)、活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶凝血时间(TCT)、纤 维蛋白原、肝素管理测试(HMT)、鱼精蛋白响应时间(PRT)、肝素响应时间(HRT)、低分子量 肝素(L丽H)、低范围肝素管理测试(LHMT)、蛇静脉酶凝血时间(ECT)及其组合。
6. 权利要求5的盒，其中分析是PT。
7. 权利要求5的盒，其中分析是APTT。
8. —种用于测定凝血时间的方法，所述方法包括提供包含两个反应室、血液储存槽、参比端口和加样端口的盒，其中两个反应室通过毛 细管通道与血液储存槽流体连通，血液储存槽通过毛细管通道与参比端口流体连通，参比 端口通过毛细管通道与加样端口流体连通；将样品放置在加样端口中；将用于分析的凝血剂放置在至少一个反应室中；将稀释剂经样品端口移动到混合孔中，并将样品与稀释剂混合以提供稀释的样品；将样品移动到反应室中；以及测定样品凝结的时间。
9. 权利要求8的方法，其中基材选自塑料、玻璃、尼龙、金属及其组合。
10. 权利要求9的方法，其中基材是塑料。
11. 权利要求9的方法，其中样品是血液或血浆。
12. 权利要求8的方法，其中反应室含有凝血剂。
13. 权利要求12的方法，其中凝血剂用于选自下面的分析凝血酶原时间(PT)、部 分促凝血酶原激酶时间(PTT)、活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶凝血时间 (TCT)、纤维蛋白原、肝素管理测试(HMT)、鱼精蛋白响应时间(PRT)、肝素响应时间(HRT)、 低分子量肝素(L丽H)、低范围肝素管理测试(LHMT)、蛇静脉酶凝血时间(ECT)及其组合。
14. 权利要求13的方法，其中分析是PT。
15. 权利要求13的方法，其中分析是APTT。
16. 权利要求8的方法，其中样品凝结的时间通过光学方法测定。
17. 权利要求8的方法，其中样品凝结的时间通过浊度测量来测定。
18. 权利要求8的方法，其中储存槽包括用于移动毛细管通道内样品的薄膜。
19. 权利要求8的方法，还包括将稀释剂放置在储存槽中。
全文摘要
本发明提供了执行分析以测定血液样品凝结所需时间的装置和方法。装置包含涂有一种或多种凝血剂的反应室。将一滴血液或等同物放置在加样端口上，稀释，并与反应室中的凝血剂接触。稀释后的血样可以通过反应室前后移动，直到血液凝结。凝血过程形成的纤维蛋白架阻止了血样流入反应室。凝血时间是从样品进入反应室到反应室中的波形发生变化、或样品的运动或流动停止时的总时间，可以通过浊度来测量。
文档编号G01R27/08GK101720432SQ200880020722
公开日2010年6月2日 申请日期2008年6月20日 优先权日2007年6月20日
发明者伊曼纽尔·C·埃姆帕克, 威尔玛·曼甘 申请人:Mec戴内米克公司