一种用于预防或治疗突变型乙型肝炎病毒感染的抗体组合物的制作方法

一种用于预防或治疗突变型乙型肝炎病毒感染的抗体组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种与乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg)结合以中和乙型肝炎病毒的抗体。发现所述抗体的表面抗原结合位点在病毒复制中发挥非常重要的作用，并且当位点中发生突变时，病毒复制被显著抑制，这样至少HBV病毒不能引起位点中的突变。在本发明中，通过利用源自患者的病毒证实了本发明抗体与由传统的病毒复制抑制剂产生的YMDD突变乙型肝炎病毒结合，或与血浆源性HBIG(乙型肝炎免疫球蛋白)不结合的G145R HBsAg突变体结合。此外，利用对乙型肝炎病毒的独特动物模型黑猩猩来检测本发明抗体的体内效果。结果发现，所述抗体甚至对体内模型中的野生型乙型肝炎病毒具有中和效果。因此，可以看出本发明的抗体不仅对野生型乙型肝炎病毒具有结合能力，而且对具有聚合酶YMDD突变体和表面抗原突变G145R的突变型乙型肝炎病毒具有结合能力，并且对源自患者的各种突变病毒具有结合能力。因此，本发明的抗体不仅能够被有效地用于野生型乙型肝炎病毒的预防或治疗，而且能够被有效地用于突变型乙型肝炎病毒的预防或治疗。
【专利说明】一种用于预防或治疗突变型乙型肝炎病毒感染的抗体组合 物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于预防或治疗由突变型乙型肝炎病毒引起的疾病的组合物，该 组合物包含抗突变型人乙型肝炎病毒（HBV)的中和抗体作为活性成分，传统的病毒复制抑 制剂（例如，拉米夫定或阿德福韦酯）或血浆源性HBIG(乙型肝炎免疫球蛋白）对该突变 型人乙型肝炎病毒（HBV)不起作用或不结合它。

【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)是具有DNA基因组的病毒，属于嗜肝DNA病毒科并引起急性 和慢性肝炎。乙型肝炎病毒（HBV)被划分为在基因核苷酸序列中具有约8%或更多差异的 八种基因型，或基于乙型肝炎表面抗原（HBsAg)的两个抗原决定簇（d/y和w/r)被划分为 四种血清型（adw、adr、ayw和ayr)。全球大约有3. 5亿人具有慢性乙型肝炎病毒（HBV) 感染，特别地，在韩国和中国，慢性乙型肝炎病毒感染的人达到约5-8%，并且乙型肝炎病毒 (HBV)感染是肝病和肝癌的主要原因。目前开发的疫苗可一定程度上在乙型肝炎病毒感染 的预防方面起效果，但是仍存在相当数量的慢性乙型肝炎病毒感染患者。慢性乙型肝炎病 毒（HBV)感染引起肝炎、肝硬化和肝癌，并且在慢性乙型肝炎病毒患者中肝癌的发病率比 未受感染的人高大约300倍。根据WHO报告，大约80%的肝癌是由慢性乙型肝炎引起的。
[0003] 目前已知的乙型肝炎治疗剂包括核苷类似物，所述核苷类似物包括拉米夫定和阿 德福韦酯，其通过抑制乙型肝炎病毒聚合酶（HBV聚合酶）的逆转录酶来抑制乙型肝炎病毒 (HBV)的DNA复制。然而，当施用这些药物3年时，在大约75%的患者中产生抗药性病毒， 降低了药物的疗效。由于这个问题，无法单独使用病毒复制抑制剂来治疗乙型肝炎感染。 为此，试图与干扰素剂结合使用这些抑制剂，但由于严重的副作用，目前没有使用这些抑制 剂。
[0004] 为了类似的目的，考虑使用乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG)制剂，该制剂包括从具有 高抗体效价的血液中分离的乙型肝炎病毒（HBV)抗体。然而，因为HBIG制剂的抗体是从血 浆中分离并纯化的，存在以下这些问题：包括获得血浆的难度、病毒感染的可能性、低活性、 高成本等。
[0005] 近年来，有报道称存在能够使这些抗体无效的突变病毒，例如，在乙型肝炎病毒 (HBV)的表面蛋白的145位具有甘氨酸替换为精氨酸的突变体。此外，已经出现能够使抗体 无效的各种突变体。因为这个原因，传统的乙型肝炎病毒治疗剂很难表现出满意的治疗效 果。
[0006] 因此，迫切需要开发与乙型肝炎病毒（HBV)抗原表位特异性结合的抗体，用于治 疗乙型肝炎病毒（HBV)，在抗原表位中不会产生突变，从而该抗体的疗效不会因突变体而降 低。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于提供一种用于预防或治疗由感染突变病毒引起的疾病的组合 物，所述突变病毒对已被用于预防或治疗乙型肝炎病毒（在下文中简称为"HBV"）的传统治 疗剂具有抗性。
[0008] 为了实现上述目的，本发明提供一种用于预防或治疗具有HBV表面抗原（HBsAg) 的G145R突变或HBVDNA聚合酶的YMDD(酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）突变 的HBV感染的抗体组合物，所述组合物中含有的抗体包括：
[0009] 具有选自SEQIDNO: 1至SEQIDNO:5的任何一个氨基酸序列的重链可变区；和 具有选自SEQIDN0:6至SEQIDNO: 10的任何一个氨基酸序列的轻链可变区。
[0010] 根据下面的详细描述和所附的权利要求，本发明的其他特征和实施方式将变得显 而易见。

【专利附图】

【附图说明】
[0011] 图1是示出了本发明抗体在黑猩猩中的HBV中和活性的图表。
[0012] 图2绘示了照片（参见图2a和2c)和图表（参见图2b)，这些照片和图表示出了 用来检测本发明的抗体是否与乙型肝炎患者血液的HBV结合所进行的免疫沉淀测试的结 果。
[0013] 在图2(a)中，I:0.Iyg的本发明抗体，2 :0.5yg的本发明抗体，3 :1yg的本发明 抗体，4 :5yg的本发明抗体，和5 :PBS缓冲液。
[0014] 在图2(c)中，I:PBS，2 :用Iyg的抗破伤风类毒素人抗体（TT-F9)处理，3 :用 IUg的Hepabig处理，4 :用Iyg的抗乙型肝炎病毒表面抗原人源化抗体（HuS10)处理， 和5 :用Iyg的本发明抗体处理。
[0015] 图3是一组照片，示出了用来检测抗体是否与感染HBV的人肝组织结合所进行的 免疫组织化学染色测试的结果。具体地，图3(a)是示出本发明抗体与感染HBV的人肝组织 强结合的照片，图3(b)是示出同型阴性对照抗体不与同一组织结合的照片。
[0016] 图4是乙型肝炎病毒（HBV)的基因图谱。通过以下方式来构建质粒pHBVl. 3-MBRI: 在pcDNA3.I(Invitrogen，USA)的Pmel限制酶位点中插入1. 3倍序列的HBV(adr亚型）基 因（Genbank登录号DQ683578)(从HBV基因组增强子I上游至聚腺苷酸化区域下游的HBV 基因）。
[0017] 图5示出使用水动力小鼠模型来检测抗体对G145R突变病毒的中和活性的实验结 果，表明野生型HBV和G145R突变型HBV的表面抗原和病毒颗粒均被从小鼠血液中除去。
[0018] 实施本发明的最佳实施方式
[0019] 下文中，将进一步详细描述本发明。
[0020] 本发明涉及一种用于预防或治疗具有HBV表面抗原（HBsAg)的G145R突变体或 HBVDNA聚合酶的YMDD(酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）突变体的HBV感染的 抗体组合物，所述组合物含有的抗体包括：
[0021] 具有选自SEQIDNO: 1至SEQIDNO:5的任何一个氨基酸序列的重链可变区；和 具有选自SEQIDN0:6至SEQIDNO: 10的任何一个氨基酸序列的轻链可变区。
[0022] 根据本发明的抗体可以是针对从细胞系HBAb-49(KCLRF-BP-00054)产生的具有 G145R突变的HBV表面抗原（HBsAg)或DNA聚合酶YMDD基序突变的抗体。G145R突变是HBV 表面抗原的145位处甘氨酸替换为精氨酸，血浆源性HBIG不与该G145R突变结合，而YMDD基序位于乙型肝炎病毒的DNA聚合酶基因的C端区域并在氨基酸序列的552位处甲硫氨酸 (M)替换为缬氨酸（V)或异亮氨酸（I)。
[0023] 所述抗体组合物用于对HBV治疗剂拉米夫定或阿德福韦酯具有抗性的突变病毒 感染的预防或治疗。
[0024] 此外，所述抗体组合物可进一步包括抗病毒剂。所述抗病毒剂优选为选自干扰素、 抗-HBV单克隆抗体、抗-HBV多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂和siRNA制剂中 的一种或更多种，但并不限于此。
[0025] 所述抗体组合物优选地含有浓度为0.l_50mg/ml的抗体。本发明还提供一种包含 所述抗体组合物作为活性成分的药物制剂。所述药物制剂优选地以〇. 〇〇l-l〇mg/kg(体重） 的剂量施用于哺乳动物，包括人。
[0026] 可按照任何常规方法将所述抗体组合物制成药物制剂。在制剂的制备中，所述抗 体优选与介载体混合或用介载体稀释，或包封在介载体内。当将介载体用作稀释剂时，其可 为固体、半固体或液体物质，对活性成分起运载体、赋形剂或介质作用。因此，制剂可为片 剂、丸剂、散剂、药囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气溶胶、软和硬明胶胶囊、无菌注射 溶液、无菌包装粉剂等剂型。
[0027] 适合的介载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖 醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯 吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂可额外地包括充填剂、抗 凝结剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。可按照本领域已知的任何方法来配制 本发明的组合物，以便在将其施用于哺乳动物后提供活性成分的速释、缓释或迟释。
[0028] 在利用黑猩猩来验证本发明抗体的HBV中和活性的实验中，显示在施用HBV和抗 体的混合物之后一年，黑猩猩没有感染HBV。在对照组的黑猩猩中，显示产生了HBV病毒颗 粒和表面抗原并且在恢复期产生了抗HBV表面抗原的抗体（参见图1)。
[0029] 此外，免疫沉淀测试显示本发明的抗体对患者血液的HBV具有优异的结合能力 (参见图2)。此外，免疫组织化学染色测试显示本发明的抗体强结合于感染HBV的人肝组 织（参见图3)。
[0030] 根据本发明的抗体可具有结合于并中和对抗体有抗性和可避免抗体的HBV的 HBsAg的能力，所述HBsAg不能被传统的病毒复制抑制剂（拉米夫定或阿德福韦醋）或血衆 源性HBIG所抑制。在本发明的一个实施例中，利用含YMDD突变病毒的患者血液通过酶联 免疫吸附测试（ELISA)来检测抗体的结合能力，所述YMDD突变病毒在乙型肝炎病毒聚合酶 的逆转录酶上具有YMDD突变并对病毒复制抑制剂具有抗性。结果表明，抗体强结合于所有 YMDD突变病毒（参见表5和表6)。
[0031] 本发明抗体的最大特点在于，其对不能被血浆源性HBIG中和的、在HBV表面蛋白 的145位具有甘氨酸替换为精氨酸的突变体的结合和中和能力。为了验证这一能力，利用 水动力小鼠模型产生突变病毒，并检测抗体是否具有中和所产生的突变病毒的能力。结果 表明，小鼠模型血液中的HBsAg和HBV均被除去（参见图5)。
[0032] 研宄表明，本发明的抗体与患者肝移植后复发的乙型肝炎病毒（HBV)结合，并且 HBV病毒均为在HBV表面蛋白的145位具有甘氨酸替换为精氨酸的突变体（参见表8)。
[0033] 上述结果表明，本发明的抗体和包括该抗体的组合物能够被有效地用于对传统治 疗剂具有抗性的突变HBV病毒感染的预防或治疗。特别地，可以看出所述抗体和所述组合 物能够被非常有效地用于G145R突变HBV或YMDD基序突变HBV感染的预防或治疗。 实施例
[0034] 以下，将参照实施例更详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员将显而易 见的是，这些实施例仅是解释性的目的，而不被理解为限制本发明的范围。
[0035] 实施例1 :在黑猩猩中进行HBV中和能力实验
[0036] 为了检测本发明的抗体在体内是否具有中和HBV的能力，进行了以下实验。
[0037] 将从肝炎研宄基金会（USA)获得的HBVIOOCID5ci (50 %黑猩猩感染剂量）放置在 三个试管中。向三个试管中的两个分别以0.Img和IOmg的量加入本发明的抗体，所述抗体 包括具有氨基酸序列SEQIDNO:2的重链可变区和具有氨基酸序列SEQIDNO:7的轻链可 变区，而剩余的一个试管中不加入抗体。用PBS(磷酸盐缓冲液）缓冲液将每个试管中混合 物的容积调整为3ml，之后使混合物在37°C反应1小时，然后在4°C过夜，随后用液氮冷冻， 由此制备测试物质。
[0038] 对于动物实验，将测试物质分别静脉施用于从未感染HBV的三只黑猩猩（参见表 1)〇
[0039] 表 1
[0040][表1]施用于每只黑猩猩的抗体剂量
[0041]

【权利要求】
1. 一种用于预防或治疗具有HBV表面抗原（HBsAg)的G145R突变或HBV DNA聚合酶 的YMDD (酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸）突变的HBV感染的抗体组合物，所述 组合物包括抗体作为活性成分，所述抗体包括： 具有选自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:5的任何一个氨基酸序列的重链可变区（VH);和 具有选自3￡〇10勵:6至3￡〇10勵：10的任何一个氨基酸序列的轻链可变区（￥1)。
2. 如权利要求1所述的抗体组合物，进一步包括抗病毒剂。
3. 如权利要求2所述的抗体组合物，其中所述抗病毒剂包括选自干扰素、抗-HBV单克 隆抗体、抗-HBV多克隆抗体、核苷类似物、DNA聚合酶抑制剂和siRNA制剂中的一种或多种。
4. 如权利要求1所述的抗体组合物，其中所述YMDD突变为M552V突变或M552I突变。
5. 如权利要求1所述的抗体组合物，其中所述病毒是对拉米夫定、阿德福韦酯或 HBIG(乙型肝炎免疫球蛋白）具有抗性的突变乙型肝炎病毒（HBV)。
6. 如权利要求1所述的抗体组合物，其中所包含的所述抗体的浓度为0. l_50mg/ml。
7. -种药物制剂，包含权利要求1至6中任一项所述的抗体组合物作为活性成分。
8. 如权利要求7所述的药物制剂，进一步包括选自介载体、赋形剂和稀释剂中的一种 或多种。
9. 如权利要求7所述的药物制剂，其中所述制剂为选自片剂、丸剂、散剂、药囊、酏剂、 混悬剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气溶胶、软和硬明胶胶囊、无菌注射溶液和无菌包装粉剂的剂 型。
10. 如权利要求7所述的药物制剂，其中所述药物制剂优选以0. 00l-10mg/kg的剂量施 用于哺乳动物。
【文档编号】A61K38/21GK104487090SQ201380036814
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年7月8日 优先权日:2012年7月10日
【发明者】金世镐, 洪广元, 辛庸源, 张基奂 申请人:株式会社绿十字