专利名称：一种重楼总皂苷的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于制药领域，特别是公开了一种重楼有效部位-总皂苷的制备方法及其用途。
背景技术：
重楼为百合科植物滇重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.M azz.和七叶一枝花P.polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎。在我国，重楼是多种著名中成药，如云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁胶囊等的主要组成药物。但这些药物基本上仍是将重楼与其它药物配伍之后，采用水或乙醇的提取物直接制剂而成，保留着传统中药的制备方式。重楼总皂苷为重楼多重药理作用的主要有效成分，重楼有效部位就是应用现代科学技术将其中的总皂苷类成分富集到50％以上含量。由重楼总皂苷制成的药物具有服用量少、制剂性能好等多种优点，克服了传统中药用量大，工艺粗的诸多缺点。目前，由重楼总皂苷制成的药物主要用于治疗子宫出血。已有的制备技术中，有两种方法可以达到使重楼提取物中总皂苷的含量超过50％的要求。这两种方法分别是单纯的树脂吸附法和膜过滤结合树脂吸附法。单纯的树脂法是将重楼的提取液浓缩，离心，所得到的上清液通过大孔树脂柱制备重楼总皂苷，这种方法的缺陷在于由于重楼总皂苷水溶性差，大量重楼总皂苷在提取液浓缩时沉淀出来，从而导致浓缩液离心后的上清液中仅保留了部分总皂苷，使得通过该方法制备重楼总皂苷，有效成分的提取回收率只有不到50％。膜过滤结合树脂吸附法改进了单纯树脂法有效成分回收率低的的不足，但是工艺步骤繁琐，生产过程中乙醇用量多，随着能源价格的飞涨，工艺的繁复、乙醇用量过大都使得大工业生产的成本显著提高。此外，该工艺中在脱色时，使用丙酮等有机溶剂，一定程度上也增加了生产的成本和危险性。
发明内容
本发明的目的就是克服现有重楼总皂苷生产工艺中的不足，提供了一种重楼有效部位-总皂苷的制备方法，同时提供重楼总皂苷在制药中的新用途。
本发明是这样实现的将重楼饮片或粗粉，加入6～12倍60％～95％的含水醇(V/W)，回流提取2～3次，每次提取时间为1～3小时，合并提取液，合并后的提取液离心；分出沉淀和上清液，然后将上清液浓缩至0.2～1.0g生药/ml，静置过夜后离心，得上清液A及沉淀A’。向沉淀A’中加入相当于提取所用生药量1～5倍(V/W)的去离子水进行搅拌、洗涤，然后再次离心，倾出上清液，得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，将合并A、B后的上清液通过装有大孔吸附树脂的层析柱，上清液按重楼总皂苷的量计与干树脂的比例为1∶4～1∶10，上柱流速1～4BV/h，树脂径高比为1∶3～1∶9；用水洗涤树脂3～12BV，洗脱流速为1-6BV/h，水洗脱液弃去；用含65～95％含水乙醇(V/V)洗脱2～6BV，流速为1～6BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.1～1.25，与沉淀B’合并，干燥，即得重楼有效部位-总皂苷。
所述的大孔树脂为非极性或弱极性大孔树脂。
用上述方法制得的重楼总皂苷含量为50％～90％，其中重楼皂苷I和重楼皂苷II的量合计为10％～20％，重楼总皂苷的回收率大于85％。
本发明改变了现有技术中膜过滤结合树脂吸附法中沉淀部分的处理方法，通过酒精提取、膜过滤、丙酮脱脂、树脂脱色等步骤实现、缩减为仅通过醇提水沉和去离子水洗涤沉淀完成，使得制备工艺显著简化。同时，生产过程中减少了乙醇用量，显著降低了生产成本，省去了丙酮的使用，进一步减少了成本和生产中的危险性；有效成分提取回收率高，含量高，质量稳定。
本发明的另一发明点是重楼总皂苷作为在制备抗炎、消肿、止痛的外用药物、抗病毒药物、抗肿瘤以及肿瘤辅助治疗药物中的应用。
本发明以重楼总皂苷为原料，可将其作为活性成分与制药学上可接受的载体或药用辅料开发成相宜的抗炎、消肿、止痛、抗病毒、抗肿瘤以及肿瘤辅助的制剂，如胶囊剂(软胶囊、硬胶囊)、凝胶剂、软膏剂、滴丸剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液等。
重楼总皂苷的药效学试验药物重楼软膏，含药量分别为5％、10％、15％；凝胶剂含药量分别为5％、10％、15％；重楼总皂苷含量60％动物新西兰大白兔、Wister种大鼠、昆明种小鼠菌株及病毒株、细胞株人食道癌细胞Eca-109、胃癌细胞SGC-7901、白血病细胞HL-60、柯萨奇病毒株(CVB2)、甲1型(A1)和甲3型(A3)流感病毒、Hela细胞株(一)外用消炎、止痛的药效学数据1.抗炎试验1.1小鼠耳廓肿胀法取18-22g昆明种雌性小鼠50只，随机分为5组，分别为重楼软膏组(高、中、低剂量组)、皮炎平霜和赋形剂对照组。将药物涂于小鼠右耳两面100mg/只，给药30min后，再于小鼠右耳两面涂二甲苯0.1ml/只，致肿，左耳不涂为正常耳。1h后脱颈椎处死小鼠，用直径6mm打孔器冲下双耳同一相应部分的圆片，称重，以左、右耳重量之差为肿胀度，比较药物的抗炎作用。结果见表1。
表1 重楼软膏对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响
与赋形剂对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01
1.2重楼软膏对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的试验取大鼠50只，按体重，性别随机分为5组。将大鼠右后肢用于固定，在其踝关节处用圆珠笔作一标志，动物的右后肢浸入足容积测量装置内，浸入深度以标志处为界。读取动物右后肢的正常体积(ml)，给各组动物分别涂药物于右后肢，均给药300mg，30min后在每只鼠右后肢足掌心向踝关节方向进行皮下注射1％角叉菜胶液0.1ml/只。其后每30min测定鼠后肢的容积，连续3次，结果见表2表2 重楼软膏对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的影响
与赋形剂对照组比较*P＜0.05，**P＜0.011.3对大鼠棉球肉芽肿试验取大鼠50只，随机分5组。腹腔注射巴比妥钠30mg.kg-1麻醉，在每只鼠的左右蹊部用碘酊消毒，75％酒精棉球脱碘后，各1cm长的小口，用眼科镊子将20mg的高压灭菌棉球(青霉素和链霉素混合液0.2ml)浸泡，烘干，从切口处植入皮下，随机缝合皮肤。从手术当日分别涂以重楼凝胶、赋形剂及皮炎平霜，剂量均为300mg/只，涂药于肉芽肿处，连续给药8d，第9天打开原切口将棉球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，放烘箱中70℃恒温烘干，称重。将称的重量减去棉球原重量即得肉芽肿重量。比较各组的差异，结果见表3。
表3 重楼凝胶对大鼠棉球肉芽的影响
与赋形剂对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.止痛作用药效学试验对小鼠的镇痛试验(热板法)将热板预热10min，调节恒温水浴装置，使水温控制在(75±0.5)℃。取18-22g小鼠50只，随机分为5组，每次1只放在热板上，小鼠自放在热板上至出现舔后足所需时间(s)作为该鼠的痛阀值。舔后足时间小于5s或大于30s或跳跃者弃之不用。将合格的小鼠随机分为5组，测其常痛阀值(即用药前痛阀值)。重楼凝胶和赋形剂组动物脊部脱毛涂药100mg，哌替啶组小鼠腹腔注射0.01g·kg-1，给药后30、60s，分别测定小鼠痛阀值。如60s仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛阀值以60s计算，结果见表4。
表4重楼凝胶对小鼠热板出现痛反应时间的影响
与赋形剂对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05
(二)重楼总皂苷体外抗病毒试验1.重楼总皂苷对感染了CVB3病毒的细胞发生病变的抑制作用在96孔培养板的Hela单层细胞内，每孔感染CVB3100TCID50，2h后倾去病毒液，分别加入高、中、低浓度的重楼总皂苷，培养96h后观察细胞病变。在另一组试验中，每孔先加入CVB3100TCID50，培养96h后观察病变(“-”表示无细胞病变；“+”表示有25％细胞病变；“++”表示有50％细胞发生病变，“+++”表示75％细胞发生病变；“++++”表示有100％细胞发生病变)。结果见表5。
表5重楼总皂苷对感染了CVB3病毒的细胞发生病变的抑制作用
2.重楼总皂苷对流感病毒的抑制作用将重楼总皂苷配成高、中、低(20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL)三个浓度，取人“O”型血配成0.75％浓度，将细胞培养(病毒液)25μL，加入微量V型血凝板上进行2倍稀释，最终稀释度1∶256，加入0.75％的红细胞悬液50μL，37℃1h，观察红细胞凝集，以++为终点，以血凝滴度表示。结果显示重楼总皂苷在以上三个浓度下，对A1型流感病毒的血凝滴度分别为1∶4、1∶8、1∶16，对A3型流感病毒的血凝滴度为1∶4、1∶4、1∶8，表明重楼总皂苷对A1和A3型流感病毒具有很好的抑制作用。
(三)重楼总皂苷抗肿瘤细胞试验将重楼总皂苷(60％含量)配成高、中、低三个浓度，以人食道癌细胞Eca-109、胃癌细胞SGC-7901、白血病细胞HL-60为对象，进行体外细胞生长抑制试验(MTT法)，结果见表6-8。
表6抑制食道癌细胞Eca-109生长试验结果
表7抑制胃癌细胞SGC-7901生长试验结果
表8抑制白血病细胞HL-60生长试验结果
具体实施方式
实施例1它重楼饮片1kg，加入6倍量60％的乙醇，回流提取2次，每次提取时间为1小时，合并乙醇提取液，合并后的乙醇提取液离心(转速4000转/分钟，时间30分钟)，分出沉淀和上清液，将上清液浓缩至0.25g生药/ml，静置过夜后离心，得上清液A及沉淀A’。向沉淀A’中加入相当于提取所用生药量1倍(V/W)的去离子水进行搅拌、洗涤，然后再次离心(转速4000转/分钟，时间30分钟)，倾出上清液，得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，将合并A、B后的上清液通过装有D101型大孔吸附树脂(非极性)的层析柱，上清液按重楼总皂苷的量计与干树脂的比例为1∶4，上柱流速1BV/h，树脂径高比为1∶3；用水洗涤树脂3BV，洗脱流速为1BV/h，水洗脱液弃去；用含65％的乙醇洗脱2BV，流速为1BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.1，与沉淀B’合并，真空干燥(75℃，6h)，即得。所制得的重楼样品中总皂苷的含量为50％，重楼皂苷I和重楼皂苷II的量合计为10％。
实施例2取重楼饮粗粉1kg，加入12倍量95％的乙醇，回流提取3次，每次提取时间为3小时，合并乙醇提取液，合并后的乙醇提取液离心(转速10000转/分钟，时间90分钟)；分出沉淀和上清液，将上清液浓缩至1.0g生药/ml，静置过夜后离心，得上清液A及沉淀A’，向沉淀A’中加入相当于提取所用生药量5倍(V/W)的去离子水进行搅拌、洗涤，然后再次离心(转速10000转/分钟，时间90分钟)，倾出上清液。得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，将合并A、B后的上清液通过装有AB-8型大孔吸附树脂(弱极性)的层析柱，上清液按重楼总皂苷的量计与干树脂的比例为1∶10，上柱流速4BV/h，树脂径高比为1∶9；用水洗涤树脂12BV，洗脱流速为6BV/h，水洗脱液弃去；用含95％的乙醇洗脱6BV，流速为6BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.25，与沉淀B’合并，真空干燥(75℃，6h)，即得。所制得样品中总皂苷的含量为90％，重楼皂苷I和重楼皂苷II的量合计为20％。
实施例3取重楼饮片1kg，加入8倍量70％的含水醇，回流提取2次，每次提取时间为2小时，合并乙醇提取液，过滤；将过滤后的乙醇提取液浓缩至0.5g生药/ml，静置过夜，过滤，得上清液A及沉淀A’，向沉淀A’中加入相当于提取所用生药量2倍量(V/W)的去离子水进行搅拌、洗涤，离心，倾出上清液，得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，将合并A、B后的上清液通过装有D101型大孔吸附树脂(非极性)层析柱，上清液按重楼总皂苷的量计与干树脂的比例为1∶7，上柱流速2BV/h，树脂径高比为1∶5；用水洗涤树脂5BV，洗脱流速为3BV/h，水洗脱液弃去；用含70％的乙醇洗脱4BV，流速为3BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.15，与沉淀B’合并，真空干燥(75℃，6h)，即得。所制得样品中总皂苷的含量为65％，重楼皂苷I和重楼皂苷II的量合计为17％。
实施例4重楼总皂苷50g，加入卡波姆940 10g、三乙醇胺6g、甘油50g、乙醇50g、氮酮50g、对羟基苯甲酸乙酯1g，蒸馏水加至1000ml，高速搅拌均匀后制成凝胶剂。
实施例5重楼总皂苷50g，加入羟丙基甲基纤维素50g、氮酮20g、丙二醇50g、苯酚1g、甘油50g、蒸馏水加至100ml，由乳均机混匀后制成凝胶剂。
实施例6重楼总皂苷50g，加入羊毛脂50g、对羟基苯甲酸乙酯0.3g、凡士林加至1000g，制成软膏剂。
实施例7重楼总皂苷50g，加入硬脂酸300g、三乙醇胺40g、甘油80g、羊毛脂40g、液状石蜡250ml、蒸馏水1000ml，制成软膏剂。
权利要求
1.一种重楼总皂苷的制备方法，其特征在于该方法是重楼饮片或粗粉，加入体积重量比为6～12倍的60％～95％的含水醇，回流提取2～3次，每次提取时间为1～3小时，合并提取液，合并后的提取液离心；分出沉淀和上清液，然后将上清液浓缩至0.2～1.0g生药/ml，静置过夜后离心，得上清液A及沉淀A’；向沉淀A’中加入相当于提取所用生药量体积重量比为1～5倍的去离子水进行搅拌、洗涤，然后再次离心，倾出上清液，得上清液B和沉淀B’；合并上清液A和B，将合并A、B后的上清液通过装有大孔吸附树脂的层析柱，上清液按重楼总皂苷的量计与干树脂的比例为1∶4～1∶10，上柱流速1～4BV/h，树脂径高比为1∶3～1∶9；用水洗涤树脂3～12BV，洗脱流速为1-6BV/h，水洗脱液弃去；用含体积比为65～95％含水乙醇洗脱2～6BV，流速为1～6BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.1～1.25，与沉淀B’合并，干燥，即得重楼总皂苷。
2.按照权利要求1所述的方法制得的重楼总皂苷在制备抗炎、消肿、止痛的外用药物、抗病毒药物、抗肿瘤以及肿瘤辅助治疗的药物中应用。
3.如权利要求1所述的一种重楼总皂苷的制备方法，其特征在于所述的大孔树脂为非极性和弱极性大孔树脂中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种重楼有效部位－总皂苷的制备方法及其用途。本发明改变了现有技术中膜过滤结合树脂吸附法中沉淀部分的处理方法，通过酒精提取、膜过滤、丙酮脱脂、树脂脱色等步骤实现、缩减为仅通过醇提水沉和去离子水洗涤沉淀完成，使得制备工艺显著简化。同时，生产过程中减少了乙醇用量，显著降低了生产成本，省去了丙酮的使用，进一步减少了成本和生产中的危险性；有效成分提取回收率高，含量高，质量稳定。本发明还提供了重楼总皂苷作为在制备抗炎、消肿、止痛的外用药物、抗病毒药物、抗肿瘤以及肿瘤辅助治疗药物中的应用。
文档编号A61P31/12GK1899491SQ20061005222
公开日2007年1月24日 申请日期2006年6月30日 优先权日2006年6月30日
发明者张琳, 孙治国, 田景奎, 梁波, 李凌军 申请人:浙江大学