专利名称：：重楼皂苷i的制备方法及其抑制血管生长的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从重楼中提取分离得到的重楼皂苷I，即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-(Ha-L-呋喃阿拉伯糖(1—4)Ha-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷(CAS号为76296-72-5)的制备方法，及其在抑制血管生长方面的用途。
背景技术：
：重楼(RhizomaParidis)，又称七叶一支花，是百合科重楼属植物的泛称,以蚤休之名首载于《神农本草经》。重楼属植物全世界共有24种,我国种类最多，拥有19种，其中西南各省区种类和资源极为丰富。常见的品种有华重楼、滇重楼和七叶一支花。药用的有华重楼、云南重楼、七叶一支花、狭叶重楼、长药隔重楼、海南重楼、凌云重楼、南重楼。《中国药典》2005年版中记载，重楼白勺来、源应为云南重t娄ParispolyphyllaSmithvar.yunnanensis(Franch.)Hand.一Mazz.和七叶一枝花P.DphyllaSmithvar.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎。味苦，性微寒，有小毒，归肝经,具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效,用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症。(国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005年版)一部，化学工业出版社，183.)至今尚未见关于抑制血管方面的报道。(张树潘.重楼属植物的化学成分及其药理活性研究进展.海峡药学，2007，19(6):4-7;康利平,马百平,张洁,等.重楼中甾体皂苷的分离与结构鉴定.中国药物化学杂志,2G05,15(l):26-30;王羽，张彦军，高文远，等.滇重楼的抗肿瘤活性成分研究.中国中药杂志，2007，32(14):1425-1428;HUANGYun，WANGQiang,CUILi~jian.PrimaryCommentsonChemotaxonomyofspp，BasedonSaponinsAnalysis.JournalofChinesePhar-maceuticaliences2005,14(3):176—180.)肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一。居各类疾病死亡率的第二位。大量临床治疗证明，化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有极大的破坏效应。这些疗法使得人体的造血系统和免疫功能遭受严重的损害，极易导致病人死亡。对血管的依赖性是一切肿瘤细胞所共有的，血管生成是肿瘤生长和转移中的一个重要步骤，无论原发性肿瘤和继发性肿瘤，一旦生长直径超过2mm，都会有血管生成，随之将是肿瘤迅速生长，转移发生。(F。lkmaiU.whatistheevidencethattumorsareangiogenesisdepartmentJNatlCancerInst.1990，82:4-6.)目前对肿瘤的治疗主要有三大类药物，分别为细胞毒药物，放、化疗辅助类药物，血管生长抑制剂。目前血管生长抑制剂是一类非常有前途的抗肿瘤药物。在以鸡胚绒毛尿囊膜为模型，筛选对血管生长有抑制作用的化合物的实验中，从重楼中获得的重楼皂苷I一即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-0-(a-L-呋喃阿拉伯糖(1—4)Ha-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷表现出了较好的血管生长抑制作用。
发明内容本发明的目的之一是提供重楼皂苷I的制备方法，及其在抑制血管生长方面的用途。本发明涉及从重楼中提取分离得到的重楼皂苷I即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-(Ma-L-呋喃阿拉伯糖(1—4)Hct-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-Op-D-吡喃葡萄糖苷(化学结构如式l)的制备方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式1重楼皂苷I的化学结构式其制备方法如下(l)取重楼，依次用6-15倍量的石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、水进行超声提取，提取3-5次，每次20min-100min，过滤后，上清液减压浓縮后得到各部位。(2)将步骤(1)得到的取乙酸乙酯部位用适量乙醇分散后，1-3倍量的硅胶拌样，10-50倍量硅胶装柱，上样，依次用石油醚、石油醚乙酸乙酉旨、乙酸乙酯、乙酸乙酯乙醇、乙醇洗脱得到重楼皂苷I即(2511)-/\5(6)-烯-螺甾-3-0-KL-呋喃阿拉伯糖(1—4)}-[a-L-吡喃鼠李糖基G—2)]-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷粗品。(3)将步骤(2)得到的重楼皂苷I粗品用硅胶、反相硅胶法进行进一步纯化。得到式(1)所示的重楼皂苷I即(25R)-△5(6)-烯-螺甾-3-0-{a-L-呋喃阿拉伯糖(1—4"-[a-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-0+D-口比喃葡萄糖苷纯品。其实施例如下实施例1重楼皂苷I即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-(Ha-L-呋喃阿拉伯糖(1—4)Ha-L-吡喃鼠李糖基(1—2)]-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷的制备取2kg重楼，依次用10倍量的石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、水分3次超声提取，每次30min,过滤后，上清液减压浓缩后得到各部位。收集乙酸乙酯提取物，在硅胶(200300目)柱上，先用石油醚洗脱，然后用体积比为l:l的石油醚、乙酸乙酯、乙醇的混合液洗脱。收集用体积比为l:l的石油醚、乙酸乙酯、乙醇的混合液洗脱后得到的洗脱液，减压浓縮，得到粗品，用硅胶、反相硅胶法进行进一步纯化结晶，得到10克单体化合物，经结构解析，确定结构为重楼皂苷I。重褛皂苷I物理性质及波谱数据如下无色透明针晶或白色粉末，易溶于氯仿、甲醇。ESI-MS分子量:854.466分子式C"H7016ESI-MS(m/z):855(M+)，722(M-Arb)，576(M-Arb-Rha)，415(M-Arb-Rha-Glu)，397(M-Arb-Rha-Glu-H20)，379(M-Arb-Rha-Glu-2H20)，283，271，253，251，213，199，173，159，147，139，129，107，93，85，69，55(100%)。'HNMR(DMS0-d6)Sppm:5.391(1H，d，J二5.0Hz)，5,245(1H，d，J二5,4Hz),2.43,2.15(H-l)，1.8(H—2)，3.48(H-3)，1.8(H-4)，5.336(1H，br，H-6)，1.53(H-8)，0.9(H-9)，4.88(H-IO)，1.5(H-ll)，1.16(H-12)，1.8(H-13)，1.14(H-14)，1.93,1.90(H-15，17)，4.27(H-16)，3.4(H-17)，0.739(s，H-18)，0.964(H—19)，3.8(H-20)，1.82(H-20)，0.915(d，J=6.7Hz'H—21)，1.53-1.60(H-24)，3.42,3.21(H-26)，0.739(d，H-27)。4.43(d，J=7.8Hz，H-l')，3.35(H-2')，3.23(H-3')，3.26(H-4')，3.47(H-5')，3.60(H-6')，5.037(s，H-l")，3.64(H-2")，3.41(H-3")，3.19(H—4")，3.99(H-5")，1.089(d，J=6.0Hz,H-6〃)，4.88(H-r,)，3.68(H-3〃0，3.86(H-4辨)，3.67(H-5"。"CNMR(DMS0-d6)5卯m:38.1(C-1)，29.5(C-2)，76.5(C-3)，37.3(C-4)，140.7(C-5)，121.7(C-6)，32.0(C-7)，30.3(C-8)，50.0(C-9)，36.9(C-10)，20.8(C—11)，39.9(C-12)，40.5(C—13)，56.2(C—14)，32.0(C-15)，80.7(C-16)，62.2(C-17)，16.5(C-18)，19.4(C-19)，41.6(C-20)，15.1(C-21),108.9(C-22)，31.4(C-23)，28.9(C-24)，31.4(C-25)，66.4(C-26)，17.6(C-27)，98.4(C-l')，81.8(C-2')，76.4(C-3')，75.4(C-4')，76.1(C-5')，61.8(C-6')，100.5(C-l〃)，70.9(C-2")，71.0(C-3")，72.3(C-4")，68.4(C-5〃)，18.2(C-6〃)，108.2(C-1〃')，82.4(C-2"，76.8(C-3〃0，84.9(C-4'"，60.4(C-5"0。本发明还涉及结构式如下式所示的重楼皂苷I抑制血管生长的用途。实验例重楼皂苷I即(25R)-A5(6)-烯-螺甾-3-0-{a-L-呋喃阿拉伯糖(1—化-a-L-吡喃鼠李糖基(1—2)-3-0-P-D-吡喃葡萄糖苷的抑制血管生长的实验研究1模型名称鸡胚绒毛尿囊膜模型2试验方法精密称取重楼皂苷I，用乙醇溶解，配制成浓度约为0.4mg/ml的溶液，备用。选择体质量相近(50.4-5)g，表皮无污染、无破损的新鲜种蛋，置于温度37.8±0.5°C、相对湿度65%-70%的中孵育7日，每日早中晚各翻转一次。将明胶海绵用打孔器制成直径约为6mm的圆形小块，无菌环境下用微量进样器向小块内加药。阳性药和样品均加5^d。待明胶海绵将药物完全吸收干燥后，置于紫外灯下消毒风干。种蛋消毒后放入37'C孵化箱，气室向上，至孵蛋第7天，将种蛋随机分为6组，每组15枚。在超净台上将蛋胚用酒精消毒后用牙科钻在蛋胚顶端钻一小孔，然后小心地去掉周围的蛋壳和壳膜，使开口约为1.2cmxl.2cm大小；确定加样部位后小心地用注射针头从气室与卵黄分隔处挑破气室膜，注入12滴无菌水，使气室膜与CAM膜分开，然后用镊子轻轻去除上层的气室膜，暴露下层的CAM膜。将加药并消毒后的明胶海绵小块置于近胚头lcm处两条前卵黄静脉之间的相对无血管区。用透明胶纸封闭卵壳口，37.8士0.5"C孵育2d。给药后的鸡胚在37.8i0.5'C的恒温孵化箱中孵育2日后，取出，撕去透明胶纸，用甲醇-丙酮(1:1)将加药的鸡胚尿囊膜血管固化10min，小心剥下CAM膜，用眼科剪将鸡胚尿囊膜以明胶海绵为圆心剪成直径约为2cm的圆，置于载玻片上，在显微镜下观察、照相。数据以均数i标准差(IiS〉表示，应用非参数检验，应用SAS统计软件进行单因素方差分析比较各组间差异。3试验结果将血管按照直径进行统计，将数据分为大、中、小三个等级。数据以均数士标准误(i士S)表示。实验数据统计结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与空白组比较**P<0.01由于大血管和中血管在给药之前就己经形成，因此，我们在分析数据时，主要对小血管进行分析。试验结果表明给药组与空白组比较差异有显著性意义(P〈0.01)。4试验结论药效学实验表明，本发明化合物重楼皂苷I有良好的抑制血管生长的活性，具备制备成具有抑制血管生长作用的抗肿瘤药物应有的活性，具有广阔的应用前景。权利要求1重楼皂苷I即(25R)-Δ5(6)-烯-螺甾-3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖(1→4)}-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化学结构如下所示)，其特征在于其制备方法如下(1)取重楼，依次用6-15倍量的石油醚、乙酸乙酯、95％乙醇、80％乙醇、60％乙醇、水进行超声提取，提取3-5次，每次20min-100min，过滤后，上清液减压浓缩后得到各部位。(2)将步骤(1)得到的取乙酸乙酯部位用适量乙醇分散后，1-3倍量的硅胶拌样，10-50倍量硅胶装柱，上样，依次用石油醚、石油醚乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸乙酯乙醇、乙醇洗脱得到重楼皂苷I即(25R)-Δ5(6)-烯-螺甾-3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖(1→4)}-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷粗品。(3)将步骤(2)得到的重楼皂苷I粗品用硅胶、反相硅胶法进行进一步纯化。得到式(1)所示的重楼皂苷I即(25R)-Δ5(6)-烯-螺甾-3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖(1→4)}-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷纯品。2.权利要求1所述的重楼皂苷I，抑制血管生长的用途。全文摘要本发明涉及重楼皂苷I即(25R)-Δ5(6)-烯-螺甾-3-O-{α-L-呋喃阿拉伯糖(1→4)}-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法及其抑制血管生成的用途，通过有剂溶剂提取重楼后，以硅胶及反相硅胶色谱法制备重楼皂苷I，可作为抗肿瘤药物应用。文档编号C07J71/00GK101597317SQ20081017241公开日2009年12月9日申请日期2008年11月10日优先权日2008年6月5日发明者强李,葳毕,雷海民申请人:雷海民