专利名称：巫山淫羊藿总酚酸在药物及保健食品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及巫山淫羊藿总酚酸及其提取方法，还涉及巫山淫羊藿总酚酸在药物及保健食品中的应用，特别是巫山淫羊藿总酚酸或朝藿定C计总酚酸含量在50％以上的巫山淫羊藿总酚酸在抗氧化、抗菌和增强免疫的药物及保健食品中的应用，属于医药领域。
背景技术：
对体弱的老年人和未成年人及久病的康复者常常需要增强免疫及抗菌抗氧化的药物及保健食品，要求毒副作用小，可长期服用。
淫羊藿是一种传统中药，包括淫羊藿(E.brevicornu Maxim.)、心叶淫羊藿(E.parvifollium s.z.et T.L.zhang)、箭叶淫羊藿(E.pime-diumsagittatum(Sieb.etZucc.)Maxim.)、朝鲜淫羊藿(Epimedium ko-reanum Nakai.)和巫山淫羊藿(E.wushanense T.S.Ying)。
巫山淫羊藿总酚酸的组成主要为双藿苷A(diphylloside A)、淫羊藿属苷A(epimedoside A)、朝藿定C(epimedin C)、淫羊藿苷(icariin)、淫羊藿属苷C(epimedoside C)、意卡瑞苷A(icarisoside A)、去多甲基羟基淫羊藿素(desmethylanhydroicaritin)和齐墩果酸。
发明内容
本发明的目的在于提供巫山淫羊藿总酚酸或含以朝藿定C计总酚酸含量在50％以上的巫山淫羊藿总酚酸的用途，即在制药和保健食品中的应用。以朝藿定C计算的总酚酸含量可使用比色法或紫外分光光度法测定。
本发明涉及巫山淫羊藿总酚酸或含以朝藿定C计总酚酸含量在50％以上的巫山淫羊藿总酚酸作为制备抗氧化药物及保健食品中的应用。
本发明涉及巫山淫羊藿总酚酸或含以朝藿定C计总酚酸含量在50％以上的巫山淫羊藿总酚酸作为制备抗菌药物及保健食品中的应用，例如含以朝藿定C计60％，70％，80％，90％等。
本发明涉及巫山淫羊藿总酚酸或含总酚酸以朝藿定C计含量在50％以上的巫山淫羊藿总酚酸作为制备增强免疫药物及保健食品中的应用。
从巫山淫羊藿中可提取出总酚酸(以含总酚酸以朝藿定C计约50％)，也可再精制成朝藿定C，两者均具有抗氧化、抗菌和增强免疫效果，可用于制备抗氧化、抗菌和增强免疫的药物和保健食品。
巫山淫羊藿总酚酸的制备工艺如下取巫山淫羊藿，用8～20倍量水煎煮3次，每次1小时，合并煎煮液，离心取上清液；水煎煮液上AB-8大孔树脂柱，每克树脂上2mL药液，大孔树脂先用2～5倍的水洗脱，弃去水洗液，大孔树脂再用2～3倍的30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，大孔树脂再用3～8倍的70％乙醇洗脱，回收洗脱液中的乙醇，减压抽干，得残留物，即巫山淫羊藿总酚酸(以朝藿定C计含量50％以上)。
将上述方法制备得到的巫山淫羊藿总酚酸粗品于95％的乙醇中溶解后再上AB-8大孔树脂，70％乙醇洗脱，回收洗脱后的残留物溶于2-5倍的95％乙醇中，过滤，回收乙醇并抽干，再用乙酸乙酯热溶，放置，析出结晶，过滤，得以朝藿定C计含量为80％～97％的巫山淫羊藿总酚酸。
有效成分巫山淫羊藿总酚酸制备抗氧化、抗菌和增强免疫的药物和保健食品以常规制剂的形式来使用；所述的常规制剂含作为活性成分在制剂中与药学和保健食品上可接受的载体如适宜于胃肠内和胃肠外给予的有机或无机的固体或液体赋形剂混合，该制剂可以是固体形式如片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂，也可以是液体形式如注射剂、乳剂等。
上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂，如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二酸、抗坏血酸、甘露醇等。
上述的制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。
在药物和保健食品安全性方面，巫山淫羊藿的急毒LD50＞23g/Kg(小鼠)。所以巫山淫羊藿基本属于无毒物质，是一种比较安全物质。
为更好的理解本发明的实质，下面将用巫山淫羊藿总酚酸的药理实验及结果来说明其在制药和保健食品中的用途。
一、受试提取物巫山淫羊藿总酚酸提取物。
1.1提供单位陕西省生物医药重点实验室1.2性状黄色至深黄色的固体粉末，味微苦。
1.3规格含总酚酸以朝藿定C计≥50％1.5溶剂二次重蒸水或甲醇1.5储存条件4℃，密闭保存1.6配制方法水配制成二、菌种选择铜绿甲单孢细菌(PAO)，革兰氏阳性菌，为医院中广泛存在的致病菌。对于烧伤病人，手术后恢复期病人和免疫力低下的未成年人和老年人常常构成致命的危害，并且此菌极易对普通抗生素产生抗药性，是目前较难解决的问题，选此菌种实验，具有代表性。
三、实验材料铜绿甲单孢细菌黄烷基苯肼自由基(DPPH)昆明种健康小鼠四、实验方法与结果4.1巫山淫羊藿总酚酸抗菌作用4.1.1固体培养基实验采用滤纸片法，淫羊藿总酚酸用甲醇配制成不同浓度(2-20μg/mL)的溶液，点于滤纸片上，覆盖于带PAO菌的固体培养基上，同时以不含样品的甲醇液点于滤纸片上作为空白对照，于培养箱中培养24小时，取出，于LAS-3000荧光/化学发光成像分析仪中测定，发现带样滤纸片周边与不含样品的滤纸片有明显扩大的暗圈。
4.1.2液体培养基实验取巫山淫羊藿总酚酸，用水配制成不同浓度(1-50μg/mL)的溶液，分别加入液体培养基和PAO菌悬液，同时以水加入PAO菌悬液，作为对照，搅拌均匀，倾于96孔板，置于VICTOR3TM1420 MULTLABEL COUNTER多孔技术仪中培养24小时，培养过程中每半小时测定一次发光值(CPS)和PAO菌的细胞数(OD)，以发光值对测定次数作图，得到巫山淫羊藿总酚酸对PAO菌毒性基因(rhLA)表达的抑制作用图，以PAO菌生长过程中的细胞数(OD)对测定次数作图，得到巫山淫羊藿总酚酸对PAO菌生长的抑制作用图，结果如图1、图2所示。
液体菌悬液的发光值高，代表毒性基因的表达量高，从图1可以看出，加样菌悬液的发光曲线一直低于对照菌悬液，表明巫山淫羊藿总酚酸对PAO菌的表达有明显的抑制作用，而加样液体菌悬液的细胞生长曲线与对照液体菌悬液的生长曲线完全重合，表明巫山淫羊藿总酚酸对PAO菌的生长无抑制作用。这种抗菌机理表明巫山淫羊藿总酚酸抗菌作用是通过抑制毒性基因的表达而非毒性基因的生长。因为普通抗生素是通过抑制细菌的生长而抗菌的，这种机理细菌极易产生抗药性，尤其是医院中广泛存在的铜绿甲单孢细菌，抑制细菌的表达则不易产生抗药性，因此，巫山淫羊藿总酚酸抗菌作用优于普通抗生素，具有应用前景。
4.2巫山淫羊藿总酚酸抗氧化作用本实验以体外抗氧化体系为模型，巫山淫羊藿总酚酸成分对DPPH自由基的抗氧化活性，揭示了淫羊藿的保健功能。
巫山淫羊藿总酚酸以甲醇溶解，分别配制为浓度约为0.5-5mg/mL的溶液，作为样品溶液。
分别吸取不同浓度的样品溶液于5mL容量瓶中，各加入4mL的0.025mg/mL DPPH溶液，以甲醇定容至5mL，同法制备空白对照溶液，另取抗坏血酸(VC)配制为0.5-5mg/mL的溶液，同法操作制备阳性对照，室温下避光静置1小时后于516nm处测定吸光值。
DPPH·的清除率通过下式计算
清除率(％)＝[(DPPH·)t＝0-(DPPH·)t]/(DPPH·)t＝0×100％式中(DPPH·)t＝0为体系中DPPH自由基的初始浓度；(DPPH·)t为t时刻溶液中DPPH自由基的浓度。以样品(mg)/DPPH·(mg)对DPPH自由基清除率作图，就可以得到清除50％DPPH自由基时所需样品的量，即EC50值。
实验结果表明(从图3可见)，巫山淫羊藿总酚酸的EC50值为0.723，抗坏血酸(VC)的EC50值为0.182，具抗氧化能力显著高于同类植物，与抗氧化的代表物质抗坏血酸相差不远。
4.3巫山淫羊藿总酚酸增强免疫功能作用4.3.1巫山淫羊藿总酚酸用生理盐水分别配成13g/L，26g/L和52g/L 3个浓度，4℃冰箱保存备用。N-羟基脲(N-hydroxy-urea)由中国科学院上海生物化学研究所提供。昆明种健康小鼠雌雄各半，体重(20±2)g，在实验条件下适应1周后，随机分为5组，进行试验，以羟基脲320mg/(kg·d)ig小鼠，正常组每日ig生理盐水0.5mL，治疗组参照成人每千克体重用量(乘10～20倍)，分别以巫山淫羊藿总酚酸300，600和1200mg/(kg·g)ig小鼠，连续10d，实验第11天称体重和脾脏湿重、检测各组小鼠IL-2和NK细胞活性。
4.3.2脾细胞悬液制备无菌取出小鼠脾脏后，用100目钢网研磨脾脏制备细胞悬液，吸入离心管后静置10min，弃去沉淀的团块，Hanks液洗2遍，用完全RPMI-1640培养基调至所需浓度作为小鼠NK活性的效应细胞及小鼠IL-2的产生细胞。
IL-2活性测定方法取前述方法制备的实验小鼠脾细胞，加ComA刺激48h，再用指示细胞(小鼠胸腺细胞)共同培育，同时作指示细胞加IL-2对照，培养60h，加3H-TdR12h后收集测cpm值，根据标准曲线求得标木IL-2活性(U/mL)。
NK细胞活性测定方法制备小鼠NK活性的效应细胞，每孔100μL标记靶细胞1×105(YAC-1)与标记同位素37kBq混匀，37℃培养20～24h，弃上清，加入DNA酶和胰酶各100μL(分别含10μgDNA和0.6mg胰酶)，充分混匀，放置1h后收获每管上清0.5mL置另外的试管中。对照管以FCS-1640代替效应细胞。用γ计数仪分别测每管上清和细胞部分的cpm值。NK细胞活性(％)＝实验管3H-TdR释放率-对照管3H-TdR自然释放率。
统计学处理采用t检验。
4.3.3结果实验小鼠一般状态模型对照组第6天起表现活动迟缓、弓背蜷缩、毛枯不荣，肢尾冷等体征并伴有体重减轻，显著低于对照组(P＜0.05)，巫山淫羊藿总酚酸治疗组上述体征出现较迟(6～8d)，程度较轻，且无体重下降(略有增加)，与对照组相比，无显著性差异(P＜0.05)。见表1。
TFE对抗羟基脲鼠IL-2、NK细胞活性和脾脏指数的影响巫山淫羊藿总酚酸治疗组与模型对照组相比IL-2、NK细胞活性、脾脏指数明显升高，有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，而与正常组相比则差异无显著性，表明巫山淫羊藿总酚酸可拮抗羟基脲对小鼠的免疫抑制作用，见表1。
表1各实验组体重、IL-2，NK细胞活性
与模型组相比*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001模型对照组小鼠IL-2和NK细胞活性明显降低，与正常组相比有显著性差异，显示用羟基脲建立免疫功能低下小鼠模型是成功的。而且模型对照组小鼠还出现了明显的类似中医“阳虚”的体征，淫羊藿为临床常用的补阳药物，用其主要有效成分巫山淫羊藿总酚酸进行治疗，符合“因证论治”、“虚则补之”的中医理论，本实验中巫山淫羊藿总酚酸治疗组小鼠“阳虚”体征均明显减轻，正常组和治疗组体重略有增加，而模型对照组小鼠体重反而减少，表明巫山淫羊藿总酚酸对改善羟基脲所致小鼠整体机能状态有明显的作用。
IL-2主要由CD+4和CD+8T细胞产生，此外NK细胞、LAK细胞亦可产生，IL-2分布于T细胞、B细胞、NK细胞及MΦ表面。IL-2通过与上述细胞膜表面的IL-2R结合，而引起广泛的生物学效应，是参与免疫应答的重要细胞因子。IL-2活性在很大程度上决定T细胞依赖性免疫应答的强度。NK细胞通过直接接触和ADCC效应对多种肿瘤细胞和病毒感染细胞有较强的杀伤作用。此外还有重要的免疫调节和对造血系统的调节作用。而静止的NK细胞必须经活化后才能发挥其杀伤作用。NK细胞膜表面表达中等亲和力的IL-2R，IL-2可正反馈上调NK细胞活性。巫山淫羊藿总酚酸对模型小鼠IL-2和NK细胞活性及升高脾脏指数的增强作用，显示巫山淫羊藿总酚酸对免疫功能低下小鼠具有良好的免疫促进作用。
在巫山淫羊藿总酚酸300和600mg/(kg·d)实验组间IL-2活性呈一定程度的剂量依赖关系(见表1)，而巫山淫羊藿总酚酸1200mg/(kg·d)剂量组未明显随剂量增加的IL-2和NK细胞活性增加，提示在此基础上再加大TFE给药量，可能对治疗组小鼠IL-2和NK细胞活性没有进一步促进作用，反而有可能出现巫山淫羊藿总酚酸的毒副作用。
羟基脲的作用环节主要在于抑制核苷酸还原酶的活性，从而抑制DNA合成。淋巴细胞是分裂增殖旺盛的细胞，对羟基脲抑制DNA合成的影响，会远较一般细胞敏感，故细胞活性也易受到抑制。巫山淫羊藿总酚酸很可能是通过拮抗羟基脲对核苷酸还原酶的抑制，从而促进核酸合成而达到增强免疫功能的作用。
可以看出巫山淫羊藿总酚酸有拮抗羟基脲抑制模型小鼠IL-2和NK细胞活性的作用，尤以600mg/(kg·d)剂量组效果最为显著。
五、制剂形式可以巫山淫羊藿总酚酸为原料，制成各种常用制剂类型如胶囊剂、片剂等。
图1液体菌悬液发光(毒性基因表达)曲线图2液体菌悬液细胞生长(毒性基因生长)曲线图3巫山淫羊藿总酚酸自由基清除率试验
具体实施例方式
实施例1取200g巫山淫羊藿，用3000ml水煎煮3次，每次1小时，合并煎煮液，离心取上清液；水煎煮液上AB-8大孔树脂柱，每克树脂上2mL药液，大孔树脂先用3倍的水洗脱，弃去水洗液，大孔树脂再用2倍的30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，大孔树脂再用5倍的70％乙醇洗脱，回收洗脱液中的乙醇，减压抽干，得残留物，即巫山淫羊藿总酚酸(以朝藿定C计含量53％)。
实施例2将实施例1制备得到的巫山淫羊藿总酚酸于95％的乙醇中溶解后上AB-8大孔树脂，70％乙醇洗脱，回收洗脱后的残留物与2倍的95％乙醇中，过滤，回收乙醇并抽干，再用乙酸乙酯热溶，放置，析出结晶，过滤，得纯化后的巫山淫羊藿总酚酸(以朝藿定C计含量70％)。
实施例3取巫山淫羊藿总酚酸50克(以朝藿定C计总酚酸含量为55％)，粉碎过100目筛，加入淀粉3克混合均匀，再加入10％淀粉浆适量制成软材，20目筛网制粒，60-70℃干燥，过30目筛整粒，加入羟丙基纤维素3克和硬脂酸镁1克充分混匀，压片，薄膜包衣，即得片剂1000片。每片含巫山淫羊藿总酚酸50mg。
实施例4取巫山淫羊藿总酚酸50克(以朝藿定C计总酚酸含量为70％)，粉碎过100目筛，加入淀粉3克，微晶纤维适量，用稀乙醇制粒，20目筛网制粒，60-70℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁适量，充分混匀，填入胶囊即得。
每日服用100-300mg巫山淫羊藿总酚酸。
实施例5取巫山淫羊藿总酚酸(以朝藿定C计总酚酸含量为58％)30克，粉碎过100目筛，加入淀粉300克，加入10％淀粉浆适量制成颗粒，60-70℃干燥，分装200袋。
权利要求
1.巫山淫羊藿总酚酸，其特征在于主要活性成分为朝藿定C，以朝藿定C计总酚酸含量在50％以上；巫山淫羊藿总酚酸的制备方法如下巫山淫羊藿用8～20倍量水煎煮，煎煮液上AB-8大孔树脂柱，先用2～5倍的水洗脱，再用2～3倍的30％乙醇水溶液洗脱，最后用3～8倍的70％乙醇洗脱，回收70％乙醇洗脱液，减压抽干，得残留物即巫山淫羊藿总酚酸。
2.权利要求1所述的巫山淫羊藿总酚酸的制备方法，其特征在于，巫山淫羊藿用8～20倍量水煎煮，煎煮液上AB-8大孔树脂柱，先用2～5倍的水洗脱，再用2～3倍的30％乙醇水溶液洗脱，最后用3～8倍的70％乙醇洗脱，回收70％乙醇洗脱液，减压抽干，得巫山淫羊藿总酚酸。
3.根据权利要求2所述的巫山淫羊藿总酚酸的制备方法，其特征在于，制备得到的巫山淫羊藿总酚酸粗品于95％的乙醇中溶解后再上AB-8大孔树脂，70％乙醇洗脱，回收洗脱后的残留物溶于2-5倍的95％乙醇中，过滤，回收乙醇并抽干，再用乙酸乙酯热溶，放置，析出结晶，得以朝藿定C计含量为80％～97％的巫山淫羊藿总酚酸。
4.权利要求1所述的巫山淫羊藿总酚酸在制备抗氧化药物和保健食品中的应用。
5.权利要求1所述的巫山淫羊藿总酚酸在制备抗菌药物和保健食品中的应用。
6.权利要求1所述的巫山淫羊藿总酚酸在制备增强免疫药物和保健食品中的应用。
全文摘要
本发明公开了巫山淫羊藿总酚酸的提取方法，还公开了巫山淫羊藿总酚酸在制备抗氧化、抗菌和增强免疫的药物及保健食品中的应用。巫山淫羊藿总酚酸的制备工艺如下取巫山淫羊藿，用8～20倍量水煎煮3次，每次1小时，合并煎煮液，离心取上清液；水煎煮液上AB－8大孔树脂柱，每克树脂上2ml药液，大孔树脂先用2～5倍的水洗脱，弃去水洗液，大孔树脂再用2～3倍的30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，大孔树脂再用3～8倍的70％乙醇洗脱，回收洗脱液中的乙醇，减压抽干，得残留物，即巫山淫羊藿总酚酸(以朝藿定C计含量50％以上)。
文档编号A61K31/7048GK1973848SQ20061010485
公开日2007年6月6日 申请日期2006年11月6日 优先权日2006年11月6日
发明者孙文基, 谢娟平 申请人:西北大学