专利名称：阿司匹林在防治骨质疏松症的应用的制作方法
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骨质疏松症是一个世界范围的、越来越引起人们重视的健康问题。目前全世界约2亿人患有骨质疏松，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。估计患病总人数已超过2亿。骨质疏松是老年人最常见的疾病。本发明涉及阿司匹林在防治骨质疏松症的应用。阿司匹林是临床常用的一种具有解热，镇痛及抗炎药物。在治疗风湿病，类风湿病等疾病有明显的疗效，本课题组研究发现阿司匹林对骨质疏松具有较好的预防及治疗作用，对肾上腺糖皮质激素，环磷酰胺等药物造成的骨质疏松也有具有较好的预防及治疗作用。
背景技术：
骨质疏松症是一个世界范围的、越来越引起人们重视的健康问题。目前全世界约2亿人患有骨质疏松，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。估计患病总人数已超过2亿。骨质疏松是老年人最常见的疾病。在美国和西方国家中，在年龄超过55岁绝经后的女性中，有一半的人患程度不同的骨质疏松症，而在65岁以上的老年人中患骨质疏松者高达95％以上。随着科学的发展和人类的进步，人均寿命不断延长，老年人口迅速增加，骨质疏松的发病率也随着出现迅速的增加。预计至2050年全世界65岁以上的老年人将由目前3.23亿增加到15.55亿，届时骨质疏松导致髋骨骨折发生人数也将由目前的166万增加到626万，其中亚洲、拉丁美洲、中东和非洲国家的患者将占70％以上。根据官方统计，美国每年用于骨质疏松方面的直接和间接耗资达100亿美元；英国的健康与社会保险机构每年为骨质疏松提供的资金超过5亿英镑；法国仅支付平均每年3万股骨颈骨折的患者的住院费用约13.5亿法郎。骨质疏松所造成的如此巨大的社会和经济负担，构成了一个严重的全球性问题，已经引起世界各国的极大关注。老龄化社会的到来使骨质疏松的发生率日趋增高，严重威胁人们的生活质量。WHO已将2000-2010年确定为“骨关节病十年”。
我国是世界上人口最多的国家，其中老年人口占亚洲老年人口的1/2和世界人口的1/5。北京、上海和成都3市的骨质疏松流行病学调查结果显示，60-69岁年龄段骨质疏松的发生率女性与男性分别为60％和30％左右。我国人口基数大，骨质疏松患者已达6000万～8000万例，这给家庭和社会带来严重的负担[2]。另据统计2000年全国65岁以上的人有1.3亿，占全国人口的10.7％，已成为典型的老年型国家。而患有骨质疏松症的患者在这些人群中约占90％，而髋骨骨折的病人在1年内将有12％～40％死于各种合并症。在存活者中也有50％的人行动不便。这不但给病人造成了严重的身心摧残，同时也给家庭和社会增加了巨大的人力及财力负担。因此，防治骨质疏松是抗衰老，延长寿命，保证人民的生活质量的一个十分迫切的研究课题。
目前国内外防治骨质疏松症药物非常有限，常用的骨矿化促进剂，如钙剂、维生素D疗效有限；骨吸收抑制剂如雌激素、降钙素、二磷酸盐、异丙氧黄酮等虽有一定的作用，但不良反应也多，影响临床应用，骨形成促进剂如氟化物的疗效一直受争议，美国至今还没有上市[2-5]。在临床治疗方面，从雌激素替代疗法，至二磷酸盐类，降钙素等药物的防治已走过了几个重要的发展阶段，目前正转入对骨形态蛋白及白细胞介素等细胞因子的治疗研究，但是，至目前为止，这些用于防治骨质疏松的药物，均有不少副作用，有些疗效一般，有些价格昂贵，目前尚没有一种公认的理想药物，因此，寻找高效低毒防治骨质疏松的药物仍然是药理学工作者迫切的任务。
阿司匹林是临床常用的药物，问世已有100多年的历史，其解热，镇痛，抗炎作用以得到广泛的证明，在临床上被大量应用。本项目组在寻找抗骨质疏松的研究中，发现阿司匹林有预防和治疗骨质疏松的作用，可用于防治骨质疏松。
发明内容
阿司匹林可用于预防和治疗骨质疏松症。
具体实施例方式为了证明阿司匹林具有预防和治疗骨质疏松的作用，我们用环磷酰胺作为工具药物造成大鼠的骨质疏松和免疫抑制模型，观察中低剂量的阿司匹林的作用效果，并与阳性对照药物碳酸钙维D进行比较，现报道如下1材料与方法1.1药品与试剂1.1.1药品 阿司匹林(药用原料药)由山东新华制药股份有限公司提供，使用时用少量乙醇促溶后用生理盐水调整到实验室所需浓度。中剂量是根据体面积法由正常成人500mg日用量换算而来，稀释5倍为低剂量。环磷酰胺江苏恒瑞医药股份有限公司，批号403501。碳酸钙维D片美国安士制药公司，批号5B16656，每片相当于钙300mg，VitD100单位。
1.1.2试剂盐酸四环素上海新亚制药厂生产，批号891224-18；甲基丙烯酸甲酯北京化工厂生产，批号940117；Calcein(Sigma chemical Co.USA，lot61F0527)；骨组织染料(Masson-Goldner Trichrome；Poncean Fuchsin Stock；Phosotungstic acid-Oragne；Light green；Sliver Nitrate)等均为Sigma产品。
1.2实验仪器AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司生产)，XSZ-0800生物显微镜(广西梧州市光学仪器厂)，血细胞计数板(上海求精生化仪器有限公司)，低速锯(BuehlerLTD USA)，Leica组织切片机(德国)，LEICA QWN半自动图象分析仪(德国莱卡)。
1.3实验方法1.3.1实验动物与分组3月龄大鼠45只，雌雄各半，体重(207.23±42.2)g，由广东医学院实验动物中心提供，SPF级，动物合格证号2005A023。按体重对等原则随即分成5组，每组9只。A组为正常对照组该组大鼠每天灌胃给予5ml·kg-1·d-1生理盐水。B组为模型组(环磷酰胺组)，该组大鼠每天灌胃给予环磷酰胺4.5mg·kg-1·d-1。C组为阳性药物对照组(碳酸钙维D组)，该组大鼠每天灌胃给予环磷酰胺4.5mg·kg-1·d-1及碳酸钙维D0.4mg·kg-1·d-1。D组为中剂量阿司匹林组该组大鼠每天灌胃给予环磷酰胺4.5mg·kg-1·d-1及阿司匹林45mg·kg-1·d-1。E组为低剂量阿司匹林组该组大鼠每天灌胃给予环磷酰胺4.5mg·kg-1·d-1及阿司匹林9mg·kg-1·d-1。5组动物均自由饮水和进食标准饲料。实验共给药15天，实验结束时，尾静脉取血做白细胞计数。后心脏取血处死，取胸腺和脾脏用AE240电子天平称重，计算器官指数，脾脏指数指脾脏重量与体重的比值，胸腺指数指胸腺重量与体重的比值。取左侧胫骨进行骨组织形态计量学测量。
1.3.2骨组织形态计量学测量[12]大鼠在处死前11、10d和4、3d分别给予四环素(30mg·kg-1)和calcein(8mg·kg-1)标记各2次，以在骨组织形成双荧光标记。大鼠给药15d后测定体重，处死并取左侧胫骨，除尽肌肉与组织，用低速锯将其分为2段，取上段曝露骨髓腔，固定于10％PBS福尔马林液24h，按硬组织切片法用甲基丙烯酸甲酯包埋不脱钙骨，切取两张4μm薄片及一张9μm厚片，薄片分别进行Masson-Coldner染色和AgNO3染色后封片，厚骨片则直接封片，厚、薄片皆在距骺线1mm处至远端3mm范围内进行松质骨的骨形态计量学参数测量。骨组织形态计量学静态参数包括骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小粱分离度(Tb.SP)，动态参数包括荧光标志周长百分数(％L.Pm)，矿化沉积率(MAR)，骨小粱周长形成率(BFR/BS)，骨小粱面积形成率(BFR/BV)，骨小粱体积形成率(BFR/TV)，每毫米破骨细胞数量(Oc.N/mm)。
1.3.4数据处理参数值用(X±S)表示，各组之间的差异性用组间t检验。用变化率表示各实验组大鼠相对参数的变化〔如变化率A＝(待比较组/A组-1)×100％〕2结果2.1阿司匹林对环磷酰胺大鼠体重、器官指数及血白细胞的影响阿司匹林对环磷酰胺大鼠体重、器官指数及血白细胞的影响见表1
表1 阿司匹林对环磷酰胺大鼠体重、器官指数及血白细胞的影响
注n＝9；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表1可见，环磷酰胺对大鼠的体重和胸腺指数没有明显影响，说明本试验剂量的环磷酰胺对大鼠毒性不大。但脾脏指数(p＜0.05)和血白细胞数(p＜0.001)都有明显下降，提示环磷酰胺在本实验用量已可对大鼠产生了明显的免疫抑制作用。而阿司匹林和碳酸钙维D都不能对抗环磷酰胺的免疫抑制。
2.2阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态学的影响正常对照组大鼠胫骨骨组织形态学观察可见该组的动物骨小梁呈现结构紧密、粗细均匀、连续性好；环磷酰胺模型组大鼠胫骨骨组织形态学观察可见该组动物骨小梁结构明显稀疏，细小，个别呈结节或钮扣状，出现大片无骨小梁骨髓区；碳酸钙维D组大鼠胫骨骨组织形态学观察可见该组动物的小梁骨较环磷酰胺模型组明显增粗，增多，连续性有所恢复；中剂量阿司匹林组大鼠胫骨骨组织形态学观察可见该组动物的骨小梁粗细均匀，分布均匀，连续性好，较环磷酰胺模型组在小梁骨的数量、宽度、长度、以及分布上都有了大幅改善；低剂量阿司匹林组大鼠胫骨骨组织形态学观察可见该组动物的小梁骨多且粗、排列有序，连续性较好，较环磷酰胺模型组明显改善。
2.3阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响见表2表2 阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响
注n＝9；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表2可见环磷酰胺可使大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数和骨小梁厚度显著下降(P＜0.01)，骨小梁数量下降37.8％(P＜0.05)，骨小粱分离度增加了67.8％(P＜0.01)；提示环磷酰胺可使大鼠的小梁骨明显变稀，变薄，甚至断裂，骨髓空腔增大。阿司匹林和碳酸钙维D防治组的骨小梁数量、厚度以及面积百分数都显著增加(P＜0.01)，而骨小梁分离度降低(P＜0.05)，这一结果提示中、低量的阿司匹林以及碳酸钙维D都可有效对抗环磷酰胺所诱导的骨质疏松样改变，增加骨量，使骨小梁紧密，连续性强。
2.4阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响见表3
表3 阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响
注n＝9；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表3可见，环磷酰胺使大鼠五个骨形成的指标都明显下降(P＜0.05)，其中骨小粱体积形成率下降了72.2％(P＜0.001)，而每毫米破骨细胞数量虽上升了10.6％，但差别无显著意义(P＞0.05)；提示环磷酰胺在不影响骨吸收的情况下，明显抑制骨形成，使成骨细胞的数量、活性降低，骨基质矿化减少，骨再建处于负平衡中。阿司匹林和碳酸钙维D都明显增加环磷酰胺大鼠的骨形成参数值，其中三个骨形成率都呈大幅增长(P＜0.01)，骨矿化沉积率较正常大鼠也有明显上升(P＜0.01)；提示中、低剂量的阿司匹林以及碳酸钙维D可有效对抗环磷酰胺的骨形成抑制作用，促进成骨细胞的自身增值和分化，增加胶原矿化和新骨形成。
3.讨论3.1环磷酰胺可致实验大鼠产生免疫抑制，阿司匹林对此无预防作用环磷酰胺作为临床广泛使用的化疗药物，有明显的免疫抑制作用，本实验采用的环磷酰胺给药量对大鼠的体重没有影响，对大鼠的胸腺指数也没有明显影响，提示了该实验大鼠还没有产生明显的药物毒性作用，但该实验用量的环磷酰胺已可使大鼠的外周血白细胞数和脾脏指数显著地降低，产生了明显的免疫抑制作用。而阿司匹林并无法对抗这一免疫抑制作用，与阿司匹林能促进免疫分子、干扰素和白细胞介素-1的生成而提高机体免疫力的报道结果不一致，可能与使用剂量和作用机制有关，有待进一步研究。
3.2环磷酰胺可致实验大鼠骨量明显丢失，本实验剂量的阿司匹林能有效地预防骨丢失从骨组织形态计量学研究的静态参数结果可见环磷酰胺能使大鼠骨量减少，骨小梁结构疏松退化，提示环磷酰胺可使大鼠产生明显的骨丢失，导致典型的骨质疏松的形态学改变；而阿司匹林可使骨小梁增多，变粗，增加环磷酰胺大鼠的骨量，改善骨微观结构，且中剂量的效果稍优于低剂量，提示了阿司匹林具有预防环磷酰胺致大鼠骨质疏松的作用，该作用可能与阿司匹林改善血流循环以及抑制脂质过度氧化等作用有关。
3.3环磷酰胺致实验大鼠骨质疏松与其抑制骨形成有关，阿司匹林的预防机制是促进骨形成骨骼在整个生命过程都处于骨吸收和骨形成的动态平衡之中，这一平衡与破骨细胞和成骨细胞的功能密切相关。任何因素引起的成骨细胞生成减少、活性抑制或破骨细胞生成增加、过度活化，都将使骨形成弱于骨吸收，而引起骨丢失导致骨质疏松。
从骨组织形态计量学研究的动态参数结果显示环磷酰胺组可反映成骨细胞数量和活性的％L.Pm/％，MAR分别下降了50.8％，21.6％，代表骨形成和骨转换活跃程度的主要指标BFR/BV也下降了50％，而骨吸收参数Oc.N/mm却无明显改变。提示环磷酰胺诱导大鼠产生骨质疏松是在不影响骨吸收的情况下，降低成骨细胞的数量和活性，使骨形成弱于骨吸收，而致使大鼠骨丢失。阿司匹林组的％L.Pm/％，MAR，BFR/BV三个指标都有大幅增长，低剂量组分别增加了148.8％，95.3％，243.9％；中剂量组则分别增加了330％，94.8％，363.1％，且较正常大鼠也有明显增加(P＜0.05)；而两个剂量组的Oc.N/mm改变都不具有显著性，提示了阿司匹林预防环磷酰胺致大鼠的骨质疏松是由于上调成骨细胞功能，促进骨形成，使骨形成强于骨吸收。
3.4阿司匹林预防环磷酰胺致骨质疏松的机制探讨环磷酰胺对骨形成的抑制作用，可能是因为(1)骨形成与成骨细胞功能密切相关，成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，主要功能是分泌骨胶原，以及参与类骨质矿化，促进新骨形成[14]。环磷酰胺可破坏细胞DNA和抑制核酸合成，可能通过抑制了骨髓基质的间质细胞向成骨细胞分化，降低成骨细胞活性，使胶原的合成与矿化受阻，从而抑制骨形成，导致骨丢失。(2)骨细胞和免疫细胞通过各自新释放的细胞因子和体液因子，共同发挥着骨髓与骨之间的彼此关联的机能，保障骨钙平衡，支持骨形成和骨重建，一旦平衡破坏，骨形成则会被抑制[14]。环磷酰胺作为免疫抑制剂，可明显减少骨髓有核细胞数量，破坏骨髓微环境，极可能通过破坏骨与免疫的平衡，而抑制骨形成。(3)环磷酰胺损伤胃肠道，使机体对钙质的吸收和利用减弱，可沉积的骨钙减少，而影响骨的矿化。
阿司匹林预防环磷酰胺致骨质疏松的机制探讨(1)阿司匹林具有骨形成的促进作用，使％L.Pm/％，MAR，BFR等重要的骨形成指标都明显增长，其中中剂量组的骨形成较正常大鼠活跃。(2)文献报道阿司匹林具有清除超氧化物酶、羟基和其他自由基的作用，具有保护细胞DNA的抗氧化活性，可能对抗环磷酰胺对成骨细胞合成和分化的影响，促进骨形成作用。(3)阿司匹林具有抑制血小板的聚集，减轻凝血反应，改善微循环的作用，该作用可改善与骨重建相密切交流的骨髓微循环环境，对骨的营养和提高成骨细胞功能具有重要的意义；(4)阿司匹林具有促进高密度脂蛋白形成的作用，该作用可抑制脂质的过度氧化，预防动脉粥样硬化，同时可改善骨内血循环，抑制骨髓细胞成脂化，从而维持骨代谢正常。
3.5阿司匹林预防环磷酰胺致骨质疏松的意义
(1)联合应用于肿瘤治疗环磷酰胺已被广泛运用于肿瘤的治疗，而阿司匹林也开始被用于预防癌症的发生发展。而二者是从不同角度对肿瘤细胞产生作用，其中环磷酰胺是通过直接破坏肿瘤细胞的DNA而抑制其生长繁殖；阿司匹林则是通过抑制COX-2的表达等作用[7]，促进肿瘤细胞调亡，预防癌症发生和转移。本研究观察到阿司匹林可有效地对抗环磷酰胺所导致的骨丢失，如果能将两者联合应用于肿瘤治疗，那么既可以增强环磷酰胺的抗肿瘤作用，又可预防骨质疏松的发生。
(2)联合应用于风湿性疾病治疗在临床上，环磷酰胺和阿司匹林都已经被广泛应用于风湿病的防治中。环磷酰胺作为免疫抑制剂，能够减少炎症并抑制免疫系统，主要通过改变DNA的合成，干扰细胞繁殖而起作用；阿司匹林通过抑制环氧化酶，减少炎症物质的产生，控制炎症引起的一系列症状。如果能以适当的剂量将两者联合运用于风湿病的治疗，既有效地控制风湿病的症状，又预防了环磷酰胺导致的骨丢失。
权利要求
1.阿司匹林在防治骨质疏松症的应用。
全文摘要
本发明公开了阿司匹林在防治骨质疏松症的应用，动物实验研究发现阿司匹林对骨质疏松症具有较好的预防及治疗作用，对肾上腺糖皮质激素，环磷酰胺等药物造成的骨质疏松也有具有较好的预防及治疗作用。阿司匹林可制成临床可接受的丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、皮肤外用制剂中的任何一种，供临床预防和治疗骨质疏松症应用。
文档编号A61P19/10GK1947719SQ20061014302
公开日2007年4月18日 申请日期2006年10月29日 优先权日2006年10月29日
发明者吴铁, 崔燎, 于琼, 林坚涛 申请人:广东医学院