专利名称：：用于治疗癌症的涉及mda-7的组合物和方法
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：本申请涉及2005年2月8日提交的美国临时专利申请60/650,807，2005年3月14日提交的美国临时专利申请60/661,679，2005年4月29日提交的美国临时专利申请60/676,096，2005年12月12日提交的美国临时专利申请60/749,372，其各自以引用参考方式全文并入本文。政府依据国立卫生研究院的基金号CA16672、CA78778和CA102716可拥有本发明的权益。A.发明领域本发明总地说来涉及分子生物学和肿瘤学领域。更特别地，其涉及包含肿瘤抑制剂例如MDA-7和一种或多种COX-2抑制剂的用于治疗癌症的方法和组合物。该治疗组合比单独的各组分更有效且超过其预计的累加效应。在其他某些实施方案中，本发明涉及用肿瘤抑制剂例如MDA-7和Hsp90抑制剂(例如格尔德霉素及其类似物和衍生物)治疗癌症的方法和组合物。在其他实施方案中，本发明涉及包含MDA-7和维生素E化合物的用于治疗癌症的方法和组合物。本发明也涉及包含肿瘤抑制剂例如MDA-7和肿瘤坏死因子(TNF)的用于治疗癌症的方法和组合物。在其他实施方案中，本发明涉及包含MDA-7和VEGF抑制剂的用于治疗癌症的方法和组合物。本发明也涉及包含MDA-7和IL-10抑制剂的治疗癌症的方法和组合物。B.相关领域的描述1.MDA-7黑素瘤分化相关基因7(mda-7)编码24kDa的蛋白并且是最近描述的肿瘤抑制基因，该基因选择性地诱导癌细胞的细胞死亡和细胞凋亡，但正常细胞幸免(Mhashilkar等人，2001；Mhashilkar等人，2003；Pataer等人，2002)。MDA-7的腺病毒超表达导致多种肿瘤类型的肿瘤选择性生长抑制和细胞凋亡诱导，所述肿瘤类型包括结肠直肠癌(Sarkar等人，2002)、乳腺癌(Mhashilkar等人，2003)、前列腺癌(Mhashilkar等人，2001)和肺癌(Chada等人，2004)。最近显示mda-7(Ad-mda7)和曲妥单抗的腺病毒介导的递送的组合通过减少Akt和β连环蛋白的磷酸化在超表达HER-2/neu(c-erbB2)的乳腺癌细胞中增加抗肿瘤活性。(McKenzie等人，2004)。也证明了腺病毒介导的mda-7的超表达导致人肺癌细胞中PKR的快速诱导，从而导致eIF-2α、其他PKR靶底物的磷酸化和细胞凋亡诱导(Pataer等人，2002)。PKR是干扰素诱导的且为双链RNA激活的蛋白激酶。尽管对其在介导干扰素(IFN)的抗病毒和抗增殖效应中的功能是其最好特征，但PKR也参与转录调控、细胞分化、信号转导和肿瘤抑制(Taylor等人，1999)。很清楚PKR参与细胞凋亡、细胞增殖、信号转导和分化的调控(Williams，2001；Barber，2001；Jagus等人，1999)。也显示PKR受热激蛋白90(Hsp90)分子伴侣复合物的调节(Donze等人，2001)。Hsp90和其共伴侣分子(co-chaperone)p23通过PKR的N末端双链(ds)RNA结合区域以及通过其激酶结构域与PKR结合(Donze等人，2001)。dsRNA和格尔德霉素(此后称为GA)都诱导Hsp90和p23从成熟PKR的快速解离；在体内和体外激活PKR(Donze等人，2001)。Hsp90是暴露于环境应激的细胞中的蛋白重折叠和几个关键调控蛋白的构象成熟所需的伴侣分子(Maloney和Workman，2002)。2.NSAIDS不断增加的实验和流行病学数据表明阿司匹林和一些其他的非甾体抗炎药(NSAID)对结肠直肠癌产生化学预防作用且也可能对胃、食道(Thun等人，1991)甚至膀胱(Earnest等人，1992)癌产生该作用。阿司匹林、布洛芬、吡罗昔康(Reddy等人，1990；Singh等人，1994)、吲哚美辛(Narisawa，1981)和舒林酸(Piazza等人，1997；Rao等人，1995)在经AOM处理的大鼠模型中有效地抑制结肠致癌作用，而氟吡洛芬在APC(Min)+小鼠模型中具有已证明的抗肿瘤效应(Wechter等人，1997)。NSAID也抑制具有被激活的Ki-ras的肿瘤的发展(Singh和Reddy，1995)。NSAID似乎通过在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡来抑制致癌作用(Bedi等人，1995；Lupulescu，1996；Piazza等人，1995；Piazza等人，1997b)。许多研究表明NSAID的化学预防特性，包括细胞凋亡的诱导，是其抑制前列腺素合成的能力的功能(综述于DuBois等人，1996；Lupulescu，1996；Vane和Botting，1997)。有人假设这可通过抑制环氧合酶(COX)活性来实现，这样就抑制促炎前列腺素的合成(Hinz等人，1999)。P4-15流行病学和实验室研究表明结肠致癌作用至少部分通过COX同工酶(COX-1和2)调节前列腺素的产量来介导(Kawamori等人，1998)。然而近年来的研究表明，NSAID可通过前列腺素依赖性和非依赖性机制抑制致癌作用(Alberts等人，1995；Piazza等人，1997a；Thompson等人，1995；Hanif，1996)。舒林酸砜(Sulindacsulfone)(NSAID舒林酸的代谢物)缺乏COX抑制性活性但在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡(Piazza等人，1995；Piazza等人，1997b)且在几种致癌作用的啮齿目动物模型中抑制肿瘤的发展(Thompson等人，1995；Piazza等人，1995，1997a)。有人猜测舒林酸活性的潜在机制可能是酪氨酸激酶的直接或间接抑制(Winde等人，1998)，而不是其他NSAID试剂的COX抑制作用。已就其在人临床试验中的效果检查了几种NSAID。已完成布洛芬的IIa期试验(一个月)，甚至在300mg/天的剂量上也观察到平粘膜(flatmucosa)中前列腺素E2(PGE2)水平的显著减少。300mg剂量的布洛芬是非常低的剂量(治疗剂量范围在1200-3000mg/天或更多)，因此甚至在很长的时期内不可能看到毒性。然而，在动物化学预防模型中，布洛芬不如其他NSAID有效。研究已显示了NSAID、阿司匹林对结肠癌发生率的有益作用，只有在每周总共1000mg或更高的剂量下效果才明显(Giovannucci等人，1994)。然而，三个大群组研究对阿司匹林的有益作用产生了矛盾的报导(Gann等人，1993；Giovannucci等人，1996；Greenberg等人，1993)。一组研究人员最近显示在80和160mg/天的剂量之间可减少PGE2α。相反地，另一组研究人员已显示这些低剂量的阿司匹林对结肠粘膜前列腺素没有这样的作用，尽管证明了上胃肠道粘膜中前列腺素的本质性知识。这些研究的结果表明80mg的阿司匹林的剂量是该试剂对结肠粘膜的效应的阈值。因此，由于关于其功效与严重脑血管和胃肠副作用(和长期使用阿司匹林相关的)的明显的风险偶联(Singh，1998)的问题，通常不推荐阿司匹林用于普通人群的结肠直肠癌的最初化学预防。NSAID吡罗昔康是动物模型中最有效的化学预防剂(Pollard和Luckert，1989；Reddy等人，1987；Ritland和Gendler，1999)，尽管其在最近的IIb试验中显示了副作用。NSAID的副作用的大荟萃分析也表明吡罗昔康比其他NSAID具有更多的副作用(Lanza等人，1995)。此外，至少在一个研究中有人认为虽然上胃肠道的肿瘤对吡罗昔康治疗易感，但十二指肠和结肠的肿瘤对其具有相对的抗性(Ritland和Gendler，1999)。已显示舒林酸在家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者中使腺癌产生退化(Muscat等人，1994)，尽管至少一个关于散发性腺瘤的研究已显示没有这样的效果(Ladenheim等人，1995).得益于新的分子技术学的快速发展和人类基因组计算的完成，新的治疗靶正被开发用于抗癌症信号转导途径。最近根据原理设计的药物是塞来考昔-选择性环氧化酶2(COX-2)抑制剂，其已显示作为抗炎药的活性(Garner等人，2002)和在化学预防背景中的活性(Kismet等人，2004)。环氧化酶2(以前称为前列腺素内过氧化物H合酶)是环氧合酶的两种同工型中的一种。与组成型表达的环氧合酶1不同，COX-2是诱导型酶且在许多肿瘤类型(包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和胃癌)中显示高度增加的表达，表明COX-2在致癌作用中起着原因作用(Koehne和Dubois，2004；Howe等人，2001)。最近，已显示塞来考昔促进生长停止和通过下调促存活信号转导激酶、蛋白激酶B(PKB)/Akt来诱导多种癌症(包括乳腺癌)的细胞凋亡(Basu等人，2004；Kulp等人，2004；El-Rayes等人，2004；Leng等人，2003)。HER-2/neu的超表达是攻击性、侵袭性乳腺癌的标志(Ross等人，2003)。近年来的研究已表明COX-2的超表达可以是攻击性乳腺癌的预后标志且似乎与低存活率相关(Denkert等人，2004)。在HER-2/neu阳性肿瘤中发现高水平的COX-2，已有人提出正反馈回路存在于这些标记之间(Benoit等人，2004)。COX-2的表达增加HER-2/neu基因的转录而COX-2的抑制导致减少的HER-2/neu水平。增加的HER-2/neu的表达导致经磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)至Akt/蛋白激酶B(PKB)的组成型信号转导(Le等人，2005)。这些丝氨酸/苏氨酸激酶的激活导致细胞增殖和存活的信号转导(Craven等人，2003)。之前显示Ad-mda7在乳腺癌细胞中负调节Akt存活途径(McKenzie等人，2004)。3.Hsp90抑制剂格尔德霉素(GA)和17-烯丙基-氨基-格尔德霉素(17AAG)可特异性结合Hsp90的NH2末端部分中的ATP结合位点，从而抑制其功能。Hsp90功能的抑制导致其保护的蛋白(clientprotein)(包括类固醇类受体、HER2和Raf、PDK1、Akt和cdk4激酶)降解(Sausville等人，2003)。相反地，以前的研究已显示GA可诱导Hsp90和p23从成熟的PKR快速分离，在体内和体外都激活PKR(Donze等人，2001)。格尔德霉素(GA)是天然存在的具有显著抗癌特性的安沙霉素抗生素。17-烯丙基氨基，17-脱甲氧基格尔德霉素(17AAG)、格尔德霉素衍生物在临床前模型中显示良好的活性和肿瘤选择性且现已进行至癌症患者的I期、II期临床试验，并具有鼓舞人心的初步结果(Kamal等人，2003)。使用17AAG和急性照射的组合疗法在人前列腺癌中产生了超累加(supra-additive)生长抑制效应(Enmon等人，2003)。发现使用低水平的17AAG的组合治疗增强紫杉醇和阿霉素对超表达HER2的乳腺癌细胞系的效应(Solit等人，2003)。以前的研究表明17AAG在乳腺癌细胞中在破坏PI3K/AKT途径，而AKT的下调与结肠肿瘤细胞对丁氯倍他松诱导的细胞凋亡的增强的易感性相关(Rahmani等人，2003)。4.维生素E化合物已公布了描述维生素E琥珀酸酯(VES)的抗肿瘤活性的研究(Prasad等人，1982)。近年来的研究已表明腹膜内施用的VES在动物异种移植物和同种异体移植物模型中具有抗肿瘤活性(Malafa等人，2000；Malafa等人，2002)。研究显示VES通过阻断DNA合成、诱导细胞分化和诱导细胞凋亡来诱导肿瘤细胞生长的浓度和时间依赖性抑制(Kline等人，1998；Kline等人，2001；Neuzil等人，2001；You等人，2001；You等人，2002；Yu等人，2001)。5.癌症几乎半数所有男性和超过三分之一的所有女性在其一生中都将遭受癌症。每年有超过一百万人被诊断患有癌症。尽管癌症死亡率总体在降低，但每年有许多人继续死于一些类型的癌症。肺癌、结肠/直肠癌、前列腺癌和乳腺癌是造成最多死亡的癌症。在威胁女性健康的各种癌症中，乳腺癌是造成女性中癌症相关性死亡的第二大病因。据报导女性中所有癌症死亡的大约15％是由乳腺癌造成的，其发生率只稍微落后于肺癌(Jel等人，2002)。此外，乳腺癌是世界范围内大多数发达和发展中国家癌死亡率的头号原因之一(Pisani等人，1999)。尽管在整个新药和治疗模型的发展过程中已取得了相当大的进步，但仍存在对提高治疗结果同时减少治疗相关的毒性的急迫需要(Peto等人，2000)。对于其他癌症也是这样。本发明解决了对于癌症的新的和改进的疗法的需求。发明概述本发明总地说来提供了使用MDA-7联合一种或多种另外的治疗剂来治疗癌症的方法和组合物。所述另外的治疗剂包括COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物、TNF、VEGF抑制剂或IL-10抑制剂。在一些实施方案中，本发明提供了使用MDA-7和COX-2抑制剂的组合治疗癌症的方法和组合物。本发明也提供了使用MDA-7和Hsp90抑制剂的组合治疗癌症的方法和组合物。在其他实施方案中，本发明涉及使用MDA-7和维生素E化合物的组合治疗癌症的方法和组合物。在其他实施方案中，本发明涉及使用MDA-7和肿瘤坏死因子(TNF)的组合治疗癌症的方法和组合物。本发明也涉及使用MDA-7和血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂的组合治疗癌症的方法和组合物。在其他实施方案中，本发明涉及使用MDA-7和IL-10抑制剂治疗癌症的方法和组合物。本发明的方法具体地包括用于在患者中治疗癌症的方法，其包括给患者提供MDA-7联合i)COX-2抑制剂、ii)Hsp90抑制剂、iii)维生素E化合物、iv)TNF、v)VEGF抑制剂、vi)IL-10抑制剂或vii)i)、ii)、iii)、iv)、v)和vi)中一个或多个的组合。当这些化合物i)、ii)、iii)、iv)、v)或vi)用于MDA-7的上下文中时，可将其总地称为“MDA-7联合剂(conjunctiveagent)”，而使用MDA-7和i)、ii)、iii)、iv)、v)或vi)的任何联合疗法可称为“MDA-7联合疗法(conjunctivetherapy)”。在某些实施方案中提供的量可视为“有效量”。在某些实施方案中，通过给细胞施用编码MDA-7的表达构建体，然后所述构建体在细胞中表达MDA-7来给细胞提供MDA-7。在特定的实施方案中，所述表达构建体是包含编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体。在一些实施方案中，MDA-7核酸组合物包含一种或多种脂质。例如，所述组合物可包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。在一些实施方案中，在施用MDA-7之前、期间或之后施用抗炎剂。可通过给患者施用包含纯化的MDA-7蛋白的组合物来给患者提供MDA-7。在某些实施方案中，所述方法包括使患者接受放射疗法、化学疗法和/或恶化前期病损或恶性病损的手术切除术。在某些实施方案中，也涉及用于通过给细胞提供MDA-7和MDA-7联合剂来治疗乳腺癌细胞的方法和组合物，所述MDA-7联合剂是针对所述细胞的COX-2抑制剂。一些实施方案涉及用于在患者中辐射敏化癌细胞的方法，该方法包括给所述细胞提供MDA-7和MDA-7联合剂。术语“辐射敏化”是指使细胞对辐射的破坏效果更易感。要理解“有效量”是指以产生治疗益处的量为患者提供1)MDA-7和2)i)COX-2抑制剂、ii)Hsp90抑制剂、iii)维生素E化合物、iv)TNF、v)VEGF抑制剂或vi)IL-10抑制剂或与MDA-7疗法一起使用的其他试剂中的任何试剂。要理解给患者提供一定量的MDA-7和一定量的i)COX-2抑制剂、ii)Hsp90抑制剂、iii)维生素E化合物、iv)TNF、v)VEGF抑制剂或vi)IL-10抑制剂，所述两种量据信都促成治疗有益处。在其中将多于两种不同的物质(例如维生素E化合物的组合或维生素E化合物和COX-2抑制剂的组合)与MDA-7一起提供的实施方案中，要理解术语“有效量”是指给患者提供这样的量，该量作为提供给患者的物质的组合的量的结果提供了治疗有益方面。在某些实施方案中，所述组合物包含MDA-7多肽和另一种抗癌剂，例如COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物或其他MDA-7联合剂例如VEGF抑制剂、TNF或IL-10抑制剂。因此，在本发明的一些方法中，给患者施用包含纯化的MDA-7蛋白的组合物。术语“纯化的”是指先前将MDA-7蛋白与其他蛋白分离开和指在被配制在组合物中之前该蛋白纯度至少为大约95％。在某些实施方案中，纯化的MDA-7蛋白具大约或至少大约95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5％或更高或其中可衍生的任何范围的纯度。此外，预期纯化的MDA-7蛋白是有活性的，即其能够诱导细胞凋亡。也可根据活性验证所述纯化的MDA-7蛋白是合格的，这样其活性至少是等量的未纯化的MDA-7(例如通过重组方法制备的)的活性(通过细胞凋亡活性测量)的大约、至少大约或至多大约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更多(或其中可衍生的任何范围)。在其他实施方案中，其包含可在患者中或患者的细胞中产生MDA-7多肽、COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E、VEGF抑制剂、TNF多肽或IL-10抑制剂的化合物。患者是在接受治疗的患有癌症的任何动物。在本发明的许多实施方案中，患者是哺乳动物，特别是人。所述癌症可以是任何类型的癌症。例如，所述癌症可以是黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。在某些实施方案中，所述癌症包括上皮癌细胞。在特定的实施方案中，所述癌症是乳腺癌、肺癌或前列腺癌。受试者可以是在施用相关的预防剂时已知或怀疑无特定疾病或健康相关性状况的受试者。受试者可以是例如无已知疾病或健康相关性状况的受试者(即，健康受试者)。在一些实施方案中，所述受试者是处于发生特定疾病或健康相关性状况的风险中的受试者。例如，所述受试者可具有已在过去进行治疗的癌症的历史，其处于发生癌症复发的风险中。所述受试者可以是因为遗传易感性或因为过去的化学治疗的原因而处于发生癌症复发风险中的受试者。可选择地，所述受试者可以是具有被成功治疗的癌症的历史，目前无疾病，但处于发生第二原发性肿瘤风险中的受试者。例如，该风险可以是过去用作第一原发性肿瘤的疗法的放射疗法或化学疗法造成的。在一些实施方案中，所述受试者可以是具有第一疾病或健康相关性状况的受试者，所述受试者处于发生第二疾病或健康相关性状况的风险中。“治疗”和“医治”是指为获得疾病或健康相关性状况的治疗性益处对受试者施用或使用药剂、药物或药物治疗剂或对受试者实施治疗方法或方案。“疾病”或“健康相关性状况”可以是由于任何原因例如感染、遗传缺陷和/或环境应激造成的身体部分、器官或系统的任何病理状况。所述原因可以是已知的或可以是未知的。这些状况的实例包括，但不限于，恶化前状态、发育异常、癌症和其他过度增生性疾病。所述癌症可以是例如复发的癌症或已知或怀疑对常规治疗方案和标准疗法具有抗性的癌症。在整个本说明书中所用的术语“治疗性益处”是指在受试者的状况的医学治疗方面提高或增强其健康的任何事件，其包括，但不限于，初癌(pre-cancer)、发育异常、癌症和其他过度增生性疾病的治疗。治疗性益处的非穷举性实例包括延长受试者的寿命任何时间、减少或延迟疾病的瘤形成发展、减少过度增生、减少肿瘤生长、延迟转移灶的转移或减少转移灶的数目、降低癌细胞或肿瘤细胞增殖速度、减少或延迟从恶化前状态至瘤形成发展的进程以及减轻受试者的因受试者的病症产生的疼痛。“预防”和“防止”根据其通过和平常的意思使用，表示“在......之前起作用”或这样的作用。在特定疾病或健康相关性状况的背景中，这些术语是指为了阻止疾病或健康相关性状况的发生给受试者施用或使用药剂、药物或治疗剂或对受试者实施治疗方法或方案。在本发明的某些实施方案中，这些方法包括递送MDA-7蛋白或编码该蛋白的核酸以在受试者中预防疾病或健康相关性状况。适合预防疾病或病症的药物组合物的量是已知或怀疑阻止疾病或健康相关性状况发生的量。本发明考虑到，除了至少一种其他药剂例如COX-2抑制剂或任何其他MDA-7联合剂外，还可给受试者提供MDA-7。在本发明的其他实施方案中，方法包括鉴定需要治疗的患者。可基于例如获得患者病史、进行一个或多个检验以确定患者具有癌症或肿瘤、对患者进行手术或进行活组织检查来鉴定患者。因此，在一些实施方案中，通过给患者施用包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸的组合物来给患者提供MDA-7，其中该MDA-7多肽在患者中表达。涉及编码MDA-7的核酸序列处在能够在患者中提供表达的启动子的控制之下。所述启动子可以是组成型启动子、组织特异性启动子、阻抑启动子或诱导型启动子。在某些实施方案中，所述启动子是CMVIE启动子。在其他实施方案中，其包含增强子。可在本发明的方法中使用包含表达构建体的载体来将MDA-7提供给患者。在某些实施方案中，所述载体是病毒载体。如果使用病毒载体，在一些实施方案中用鱼精蛋白配制所述载体。在某些实施方案中，用一种或多种脂质配制载体。在一些实施方案中，脂质制剂是DOTAP胆固醇(或其衍生物)(DOTAPchol)制剂。考虑到给患者施用的组合物可以存在于药物可接受的制剂中。可使用的病毒载体是腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒和痘苗病毒。在特定的实施方案中，所述载体是腺病毒载体，其可以是复制缺陷型。在该情况下，每施用(患者/施用)或每日(平均日剂量)给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒(cp)或噬斑形成单位(pfu)。这些剂量包括大约、至少大约，或至多大约109、1010、1011、1012或1013个vp或pfu(或其中可衍生的任何范围)，所述剂量可以是每次施用或每日或每个治疗周期提供的量。事实上，本发明的实施方案阐明了MDA-7和COX-2抑制剂的组合在促进癌细胞的细胞凋亡方面提供了协同治疗效应。本发明的实施方案也阐明了MDA-7和TNFα的组合在抑制肿瘤细胞增殖方面提供了协同治疗效应。在本发明的其他实施方案中，方法涉及MDA-7和Hsp90抑制剂的组合，所述组合在促进癌细胞的细胞凋亡方面提供了协同治疗效应。本发明的其他实施方案阐明了MDA-7和一种或多种维生素E化合物的组合在促进癌细胞的抑制方面提供了协同治疗效应。本发明的其他实施方案阐明了MDA-7和VEGF抑制剂的组合在肿瘤生长的抑制方面提供了协同治疗效应。本发明的实施方案阐明了MDA-7和TNF多肽的组合在癌症的治疗方面提供了协同治疗效应。此外，在一些实施方案中，MDA-7和IL-10抑制剂的组合在癌症的治疗方面提供了协同治疗效应。“协同”表示治疗效果比基于用作单一疗法的各试剂的累加效应预期的治疗效果大。在本发明的方法中给患者提供MDA-7和COX-2抑制剂。在其他方法中，给患者提供MDA-7和Hsp90抑制剂。在其他方法中，给患者提供MDA-7和至少一种维生素E化合物。在其他实施方案中，给患者提供MDA-7和VEGF抑制剂。在另一个实施方案中，给患者提供MDA-7和TNF多肽。在其他实施方案中，给患者提供MDA-7和IL-10抑制剂。术语“提供”按照其普通和平常的意思使用，表示“供应或供给以用于使用”(牛津英语词典)。在本发明的方法中将患者的癌细胞或与患者的癌细胞相邻的细胞暴露于MDA-7和COX-2、Hsp90抑制剂、维生素E化合物、VEGF抑制剂和/或TNF。MDA-7产生旁观者效应，结果与癌细胞相邻的细胞可表达MDA-7并将其提供给癌细胞。在本发明的实施方案中，给患者施用组合物以给该患者提供MDA-7和/或COX-2抑制剂。在其他实施方案中，给患者施用组合物以给患者提供MDA-7和/或Hsp90抑制剂。在其他实施方案中，给患者施用组合物以给患者提供MDA-7和/或一种或多种维生素E化合物。特别地可在所述组合物中包含维生素E化合物的酯化形式。此外，在一些实施方案中，给患者施用组合物以给患者提供MDA-7和/或VEGF抑制剂。在其他实施方案中，给患者施用组合物以给患者提供MDA-7和/或TNF多肽。此外，给患者施用组合物以给患者提供MDA-7和/或IL-10抑制剂。可通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来施用化合物和组合物。可使用施用途径的组合。例如，可通过一个途径提供MDA-7而通过另一个途径提供MDA-7联合剂。可选择地，给患者施用一种剂量的a)MDA-7或b)COX-2、Hsp90抑制剂、维生素E化合物、VEGF抑制剂、TNF或IL-10抑制剂(MDA-7联合剂)，同时以不同的方式给患者施用另一种剂量。在某些实施方案中，将化合物或组合物直接注射入或注射至肿瘤。可选择地或另外地，可将化合物或组合物用于或施用至残留的瘤床。此外，在特定的实施方案中，患者通过口服摄入COX-2抑制剂或将其通过静脉内途径给患者施用。在其他实施方案中，通过口服摄入Hsp90抑制剂或通过输注或注射将其提供给患者。在特定的实施方案中，通过口服摄入维生素E化合物或通过静脉内或腹膜内途径施用其。在某些实施方案中，通过输注例如静脉内输注施用VEGF抑制剂或IL-10抑制剂。在特定的实施方案中，将TNF直接施入或施至肿瘤。也可通过瘤内途径提供任何MDA-7联合剂。作为治疗的部分，可按照下列次数或至少下列次数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多次给患者提供MDA-7、COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物、VEGF抑制剂、TNF或IL-10抑制剂。特别地考虑到作为对患者的癌症治疗的部分多次给患者提供MDA-7和COX-2抑制剂。特别地考虑到在其他实施方案中，作为对患者的癌症治疗的部分，多次给患者提供MDA-7和Hsp90抑制剂。在其他实施方案中，作为对患者的癌症治疗的部分，多次给患者提供MDA-7和维生素E化合物。此外，可存在处方疗程，如果需要可重复该疗程。这同样适用于使用任何其他MDA-7联合剂的疗法。可在施用MDA-7联合剂之前、同时或之后给患者施用MDA-7。本领域技术人员熟悉施用多种治疗剂的治疗方案。例如，可在提供MDA-7联合剂前后24小时内给患者提供MDA-7。在一些实施方案中，可在提供MDA-7联合剂前后2小时内给患者提供MDA-7。在其他实施方案中，可在提供MDA-7联合剂之前给患者提供MDA-7。在其他实施方案中，可在提供MDA-7之前给患者提供MDA-7联合剂。本发明可用于在细胞中诱导细胞凋亡。其可用于治疗癌症的方法和组合物。所述癌症可以是下列类型的癌症中的任何一种黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、成神经细胞瘤神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。在某些实施方案中，所述癌症包括上皮癌细胞。在特定的实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在乳腺癌的情况下，患者可以是HER-2/neu阴性或患者可以是HER-2/neu阳性。因此，治疗可不依赖于患者的HER-2/neu的状况。此外，本发明可用于预防癌症或治疗初癌或恶化前期细胞，包括组织转化、发育异常和超常增生。其也可用于抑制不想要的但良性的细胞，例如鳞状化生细胞、发育异常细胞、良性前列腺超常增生细胞、增生性病损等。可通过本领域的方法(包括此处描述的MDA-7联合疗法)中止、中断或延迟至癌症或至更严重的癌症形式的进展。此外，所述癌症可包括不能切除的或可切除的肿瘤。在一些实施方案中，癌症表现出对放射疗法、化学疗法和/或免疫疗法(例如曲妥单抗)或对此处描述的但作为单一疗法的任何试剂(与MDA-7联合疗法相比)的抗性。此外，所述癌症可包括转移癌或第二肿瘤，尽管在一些实施方案中，其只涉及一种或多种原发性肿瘤。还可进行本发明的方法和组合物以抑制肿瘤的转移或预防肿瘤的进一步生长以及减少或消除肿瘤或癌症。在特定的实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，在所述方法中给癌症患者提供MDA-7和COX-2抑制剂。本发明的其他方法涉及治疗患者的乳腺癌，包括给患者施用i)包含编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体，其中所述核酸序列处在能够在患者中表达的启动子的控制之下；和ii)COX-2抑制剂。在本发明的一些实施方案中，通过直接给患者施用COX-2抑制剂来给患者提供COX-2抑制剂。在其他实施方案中，给患者施用COX-2抑制剂的前体药物，当其在患者体内时，其转化成COX-2抑制剂的活性形式。在本发明中，COX-2抑制剂选自塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、lumiracoxib和艾托考昔。此外，可使用多种COX-2抑制剂，例如2、3或4种这些抑制剂(和/或其相关的前体药物)的组合。在更特定的实施方案中，所述MDA-7联合剂是COX-2抑制剂。使用MDA-7和COX-2抑制剂进行的辐射敏化作用通过将肿瘤细胞停滞在细胞周期中对辐射敏感的G2/M期而发生。因此，在进行辐射敏化后可降低或减少癌细胞通常暴露的辐射量。可选择地，辐射期的次数或辐射期的长度可减少。在某些实施方案中，任何单一量、总量、辐射期的次数或辐射期的长度的减少为大约、至少大约或至多大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000％或更多，或其中可衍生的任何范围。本发明也可涉及用于治疗癌症的方法，在所述方法中，给癌症患者提供MDA-7和Hsp90抑制剂。在某些实施方案中，方法包括通过提供i)包含编码MDA-7的核酸的腺病毒载体，其中所述核酸处在能够在患者中表达的启动子控制之下；和ii)Hsp-90抑制剂来治疗癌症。术语“Hsp-90抑制剂”是指特异性地和直接抑制Hsp90功能的物质。在某些实施方案中，Hsp-90抑制剂结合Hsp90多肽。在某些实施方案中，方法包括通过提供i)包含编码MDA-7的核酸的腺病毒载体，其中所述核酸处在能够在患者中表达的启动子控制之下；和ii)Hsp-90抑制剂来治疗癌症。在本发明的一些实施方案中，通过直接给患者施用Hsp90抑制剂来给患者提供Hsp90抑制剂。在其他实施方案中，给患者施用Hsp90抑制剂的前体药物，当其在患者体内时，其转化成Hsp90抑制剂的活性形式。在本发明中所述Hsp90抑制剂在一些实施方案中是格尔德霉素或格尔德霉素的衍生物或类似物。术语“衍生物”是指直接或通过修饰或部分取代从另一种物质产生的物质。术语“类似物”是指结构与另一种分子相似或共有相似或对应的属性的物质(例如，能够特异性结合Hsp90的格尔德霉素)。此外，可使用多种Hsp90抑制剂，例如2、3或4种这些抑制剂(和/或其相应的前体药物)的组合。在某些实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症的方法，在该方法中，给患者提供MDA-7和维生素E的组合。术语“维生素E化合物”是指为生育酚和生育三烯酸亚家族中的脂溶性、抗氧化的化合物的天然和合成的物质，以及这些物质的酯化形式和缀合形式。生育酚和生育三烯酸家族各自具有alpha(α)、beta(β)、gamma(γ)和delta(δ)同效维生素(vitamer)作为成员。酯化形式包括醋酸酯和琥珀酸酯形式。在某些实施方案中，所述维生素E化合物是合成的，而在其他实施方案中其是特定同效维生素的天然存在形式。在特定的实施方案中，维生素E化合物是维生素E琥珀酸酯(VES)，也称为α-生育酚琥珀酸酯。在本发明的某些实施方案中，通过直接给患者施用维生素E来给患者提供维生素E化合物。术语“维生素E”理解为八种脂溶性、抗氧化生育酚和生育三烯酸化合物中的任一种。在其他实施方案中，给患者施用维生素E的前体药物，当其在患者体内时，其转变成维生素E的活性形式。在某些实施方案中，所述前体药物是维生素E的酯化形式，例如醋酸酯或琥珀酸酯形式。本发明涉及，所述维生素E化合物在一些实施方案中是α生育酚或α生育酚的酯化形式，例如α生育酚琥珀酸酯或α生育酚醋酸酯。术语“酯化形式”是指具有酯基的物质形式。在某些其他实施方案中，在本发明的方法和组合物中使用维生素E化合物的类似物而不使用维生素E化合物。术语“类似物”是指与另一种分子结合相似或共有相似或对应的属性的物质(例如，TroloxC)。在其他实施方案中，本发明的方法和组合物使用维生素E缀合物。此外，可使用多种维生素E化合物，例如2、3或4种这些同效维生素和/或酯化形式的组合。本发明也涉及在患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给患者提供MDA-7和TNF。所述TNF可以是任何TNF，例如TNF-α、TNF-β、TNF-γ、TNF-δ或TNF-ε。在本发明的特定实施方案中，TNF是TNF-α。所述TNF可包含全长氨基酸序列或部分长度的序列，只要所述部分长度的序列能够发挥TNF的功能。也包括在TNF的定义中的是TNF的全长和部分长度序列的氨基酸序列变体，只要这些序列变体能够如同TNF发挥功能。此外，本发明涉及用于在患者中治疗癌症的方法，该方法包括给患者提供MDA-7和VEGF抑制剂。在癌症治疗的背景中，抗血管生成因子可依赖于抑制血管内皮生长因子(VEGF)和其受体之间的相互作用。肿瘤VEGF的表达在临床上与许多种恶性肿瘤的疾病进展相关。这些相关性据认为促成了VEGF诱导肿瘤血管发生的能力，其通过刺激内皮细胞的趋化性和致有丝分裂作用以及增加内皮细胞相关性蛋白酶的活性和提高微血管细胞中的整联蛋白的表达以提高细胞外基因的相互作用来诱导肿瘤血管发生。已在人血管内皮上鉴定了与酪氨酸激酶活性相关的VEGF的两个高亲和力受体Flt-1和KDR。VEGF对这些受体的结合据认为引起受体酪氨酸激酶结构域的二聚化和随后的激活。所述VEGF抑制剂可以是本领域技术人员已知的任何VEGF抑制剂。例如，所述抑制剂可以是DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、蛋白、多肽、肽、抗体、寡糖或小分子。在特定的实施方案中，所述VEGF抑制剂是抗体，例如针对VEGF或VEGF受体的抗体。在更特定的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，例如特异性结合VEGF或VEGF受体的单克隆抗体。在更特定的实施方案中，所述VEGF抑制剂是贝伐单抗(Avastin)。在一些实施方案中，所述VEGF抑制剂是小分子。这些小分子的实例包括VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂。在特定的实施方案中，所述VEGF抑制剂是核酶，例如特异性靶向VEGFmRNA或VEGF受体mRNA的核酶。在更特定的实施方案中，所述VEGF抑制剂是可溶性VEGF受体。在本发明的一些实施方案中，涉及抑制VEGF信号转导的分子。在某些实施方案中，可通过受体酪氨酸激酶抑制剂抑制VEGF信号转导。可使用的受体酪氨酸激酶抑制剂包括，但不限于ZD4190、ZD6474和AZD2171(Astra-Zeneca，Wilmington，DE)、CEP-7055(Cephalon，Frazer，PA)、PTK787(Novartis，Basel，Switzerland)和SU5416(Sugen，SouthSanFrancisco，CA)。本发明也涉及通过给患者提供MDA-7和IL-10抑制剂来治疗患者的癌症的方法。IL-10抑制剂可以是本领域技术人员已知的任何IL-10抑制剂。例如，所述抑制剂可以是DNA、RNA、核酶、寡核苷酸、蛋白、多肽、肽、抗体或小分子。在特定的实施方案中，所述IL-10抑制剂是抗体，例如抗IL-10的抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。如上所示，可通过给患者施用包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸的组合物来给患者提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在患者中表达。在特定的实施方案中，所述组合物是药物可接受的组合物。可选择地，可通过给患者施用上述纯化的MDA-7蛋白来给患者提供MDA-7。在某些特定的实施方案中，所述组合物是药物可接受的组合物。在本发明的涉及提供MDA-7和TNF的方法中，可通过给患者施用包含具有编码TNF的序列的核酸的组合物来给患者提供TNF，其中TNF多肽在患者中表达。在本发明的涉及提供MDA-7和VEGF抑制剂的方法中，可通过给患者施用包含具有编码VEGF抑制剂的序列的核酸的组合物来给患者提供VEGF抑制剂，其中VEGF抑制剂在患者中表达。在本发明的涉及提供MDA-7和IL-10抑制剂的方法中，可通过给患者施用包含具有编码IL-10抑制剂的序列的核酸的组合物来给患者提供IL-10抑制剂。在一些实施方案中使用单一组合物给患者提供MDA-7和COX-2抑制剂。给患者施用的组合物包括此处公开的本发明的组合物。此外，在一些实施方案中，可为患者提供包含COX-2抑制剂和i)纯化的MDA-7蛋白或ii)具有编码MDA-7的序列的核酸的组合物。可选择地，所述组合物可包含COX-2抑制剂的前体药物而不包含COX-2抑制剂。在本发明的其他方法中，在一些实施方案中通过施用单一组合物来给患者提供MDA-7和Hsp90抑制剂。给患者施用的组合物包括此处公开的本发明的组合物。此外，在一些实施方案中，给患者提供包含Hsp90抑制剂和i)纯化的MDA-7蛋白或ii)具有编码MDA-7的序列的核酸的组合物。可选择地，所述组合物可包含Hsp90抑制剂前体药物而不包含Hsp90抑制剂。在一些实施方案中通过施用单一组合物来给患者提供MDA-7和维生素E化合物。给患者施用的组合物包括此处公开的本发明的组合物。此外，在一些实施方案中，给患者提供包含COX-2抑制剂和i)纯化的MDA-7蛋白或ii)具有编码MDA-7的序列的核酸的组合物。可选择地，所述组合物可包含维生素E的酯化形式、维生素E类似物或维生素E缀合物而不包含维生素E。上述关于单一组合物的实施方案也适用于其他MDA-7联合剂例如VEGF抑制剂、TNF或IL-10抑制剂。在其他实施方案中，将MDA-7和COX-2抑制剂或其他MDA-7联合剂分开地提供给患者。类似地，在某些实施方案中分开地将MDA-7和Hsp90抑制剂提供给患者。此外，在其他实施方案中，分开地将MDA-7和一种或多种维生素E化合物提供给患者。在这些情况下，给患者提供一种药物且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时和/或1、2、3、4、5、6、7天和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周内或其中可衍生的任何范围内提供或施用另一种药物。在某些实施方案中，在提供COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂或维生素E化合物或MDA-7联合剂前后24小时内给患者提供MDA-7。在其他实施方案中，在提供COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物或其他MDA-7联合剂前后2小时内给患者提供MDA-7。在一些实施方案中，在提供COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物或其他MDA-7联合剂之前给患者提供MDA-7，而在其他实施方案中，在提供MDA-7之前提供所述试剂。此外，患者可在整个使用MDA-7的治疗过程中服用或施用MDA-7联合剂。例如，患者可接受为期6周的MDA-7治疗。在该期间内，患者可以在整个六周的时期内以例如至少每天一次或每周一次的基础服用例如COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂或维生素E化合物。因此，可在提供MDA-7前后24小时内(或上面指定的任何时段)给患者服用或提供COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物或其他MDA-7联合剂，且可多次提供MDA-7。因此，可在每次给患者提供(以蛋白或编码该蛋白的核酸的形式)MDA-7前后24小时之内给患者服用或提供COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物、VEGF抑制剂、TNF或IL-10抑制剂。此外，在上面指定的任何时段内，可多次给患者服用或提供COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂或维生素E化合物或其他MDA-7联合剂。例如，患者可在提供MDA-7前后24小时以内服用三剂COX-2抑制剂。因此，在提供MDA-7前后的指定的时段内，可给患者服用或提供1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次或其中可衍生的任何范围内次数的MDA-7联合剂。可选择地，可在使用MDA-7的治疗期间或整个治疗过程中全身性地提供COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物或其他MDA-7联合剂。在一些实施方案中，在提供MDA-7和COX-2抑制剂(或其他MDA-7联合剂)各自至少一次后使患者接受放射疗法。在其他实施方案中，使患者接受亚致死剂量的放射疗法。术语“亚致死剂量”是指在单个辐射期提供给患者的辐射的量，该量低于暴露于辐射的患者细胞的致死量(即，使细胞死亡的量)。亚致死剂量低于目前提供给具有相似特征(指，例如，癌症的分期、肿瘤大小、预后等)、未首先接受辐射敏化治疗的癌症患者的剂量。可在暴露于辐射大约、至少大约或至多大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时和/或1、2、3、4、5、6、7天或更长时间或其中可衍生的任何范围之前进行辐射敏化治疗。在本发明的某些实施方案中，方法也包括使患者接受放射疗法和/或化学疗法。在其他实施方案中，患者接受免疫疗法。在其他特定的实施方案中，方法也包括切除患者的肿瘤的全部或部分。可除去多个肿瘤(整个的或部分的)。在这些情况的各情况下，可在其他癌症疗法之前、期间或之后提供MDA-7和/或COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂、维生素E化合物、VEGF抑制剂、TNF和/或IL-10抑制剂。在某些实施方案中，在肿瘤切除之后至少通过例如向所得的瘤床施用具有一种或多种试剂的组合物来提供MDA-7和/或MDA-7联合剂。在其他实施方案中，使患者接受切除患者肿瘤的全部或部分。可在切除患者肿瘤的全部或部分之前、期间或之后施用MDA-7和MDA-7联合剂。在一些实施方案中，在切除患者肿瘤的全部或部分后提供MDA-7和MDA-7联合剂。在一些实施方案中，至少通过给所得的瘤床施用组合物来给患者提供MDA-7和MDA-7联合剂。可一次或多次施用MDA-7和MDA-7联合剂。在其中MDA-7或MDA-7是腺病毒载体的特定的实施方案中，可一次或多次给患者施用腺病毒载体。本发明的其他实施方案包括提供不同的肿瘤抑制剂以取代本发明的实施方案中的MDA-7。其他肿瘤抑制剂包括，但不限于p53、FUS1、C-CAM、FHIT、DCC、Rb和PTEN。这样，可如上所述使用所述蛋白或编码该肿瘤抑制剂的核酸。本发明也涉及药物组合物。在一些实施方案中，存在包含a)COX-2抑制剂或COX-2抑制剂的前体药物；和b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。在包括编码MDA-7的核酸的实施方案中，所述核酸可以是腺病毒载体。药物组合物可包含塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、lumiracoxib和艾托考昔中的一种或多种药物。在某些实施方案中，其包含塞来考昔。其他药物组合物包含a)Hsp90抑制剂或Hsp90抑制剂的前体药物；和b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或编码MDA-7多肽的序列的核酸。在包含编码MDA-7的核酸的实施方案中，所述核酸可以是腺病毒载体。在特定的实施方案中所述组合物包含GA或17-GAA。在进一步的实施方案中，药物组合物包含格尔德霉素或格尔德霉素衍生物或其类似物或前体药物。本发明也涉及包含a)至少一种维生素E化合物；和b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸的药物组合物。在包括编码MDA-7的核酸的实施方案中，所述核酸可以是腺病毒载体。在特定的实施方案中，所述组合物包含VES。在一些实施方案中，通过给患者施用包含纯化的TNF的组合物来给患者提供TNF。如上所示，该TNF可以是全长TNF氨基酸序列或保持作为TNF的生物学功能的部分长度序列或全长或部分长度的TNF序列变体，只要该序列保持一些生物学活性水平。类似地，在涉及MDA-7和VEGF抑制剂施用的实施方案中，当其为蛋白时，可以以纯化的蛋白施用。类似地，在涉及MDA-7和IL-10抑制剂的施用的实施方案中，当IL-10抑制剂为氨基酸序列时，可以包含该纯化的蛋白的组合物的形式将其提供给患者。在特定的实施方案中，给患者提供包含纯化的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7的序列的核酸和纯化的TNF氨基酸序列的组合物。在其他特定的实施方案中，给患者提供包含TNF和纯化的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7的序列的核酸的组合物。在更特定的实施方案中，所述TNF是TNFα蛋白。在其他实施方案中，给患者提供至少下列物质(a)纯化的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7蛋白的序列的核酸；和(b)特异性结合VEGF的单克隆抗体。在某些特定的实施方案中，所述单克隆抗体是贝伐单抗。在其他实施方案中，给患者提供组合物，所述组合物包含(a)纯化的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7蛋白的序列的核酸；和(b)特异性结合IL-10的抗体或具有编码特异性结合IL-10的抗体的序列的核酸。在某些特定的实施方案中，所述单克隆抗体是贝伐单抗。本发明总地说来也涉及药物组合物，所述药物组合物包含(a)纯化的且有活性的TNF或具有编码TNF的序列的核酸；和(b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。在特定的实施方案中，所述纯化的且有活性的TNF是纯化的且有活性的TNFα。在其他特定的实施方案中，具有编码TNF的序列的核酸是具有编码TNFα多肽的序列的核酸。在某些实施方案中，所述药物组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。在特定的实施方案中，所述编码MDA-7多肽的核酸是腺病毒载体。所述药物组合物可包含具有编码TNF多肽例如TNFα多肽的序列的核酸。编码TNF多肽的核酸可以是腺病毒载体。在特定的实施方案中，所述药物组合物包含(a)具有编码MDA-7的核酸序列的第一腺病毒载体，其中所述核酸有效偶联至第一启动子序列；和(b)具有编码TNF多肽的序列的第二腺病毒载体，其中所述编码TNF多肽的核酸序列有效连接至第二启动子。所述TNF多肽可以是例如TNFα多肽。在一些实施方案中，所述药物组合物包含具有编码MDA-7的第一核酸序列和编码TNF多肽的第二核酸序列的腺病毒载体。在更特定的实施方案中，编码TNF多肽的第二核酸序列是编码TNFα多肽的核酸序列。第一核酸序列和第二核酸序列可有效连接或不连接至一个或多个共同的启动子。本发明也涉及在患者中治疗和预防癌症的方法，所述方法包括给患者施用药物可接受的组合物，该组合物包含编码MDA-7蛋白的多核苷酸和脂质。所述癌症可以是上面所示的癌症中的任何癌症。在某些实施方案中，所述患者是肺癌患者。例如，所述肺癌可以是非小细胞肺癌、小细胞肺癌或转移性肺癌(具有扩散至肺界线外部的癌症)。除了治疗来自肺癌的继发性肿瘤外，还可进行对原发肺癌的治疗。在其他实施方案中，所述方法进一步定义为治疗受试者的转移性肺癌的方法。本发明考虑到适合用于药物施用的任何脂质。在某些实施方案中，所述组合物进一步定义为包含脂质体。考虑本发明的方法包括适合于药物施用的任何脂质体。在某些实施方案中，所述脂质体是DOTAP胆固醇纳米颗粒。在下面在说明书中更详细地描述脂质体和纳米颗粒。施用的方法/途径可以是本领域技术人员已知的任何方法，例如静脉内，皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞的施用。本发明的其他实施方案涉及治疗患者的癌症的方法，其包括给受试者提供MDA-7和泰索帝(多西他奇)。可通过本领域技术人员已知的任何方法给患者提供MDA-7。例如，可通过给患者施用包含具有编码多肽的序列的核酸的组合物来给患者提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在患者中表达。在一些实施方案中，通过给患者施用包含纯化的MDA-7蛋白的组合物来给患者提供MDA-7。所述组合物可包含一种或多种另外的抗癌剂，例如其他化学治疗剂或MDA-7联合剂。示例性化学治疗剂示于下面的说明书中。在其他实施方案中，患者正接受一种或多种其他抗癌疗法的治疗。这些疗法的实例包括放射疗法、另外的化学疗法、免疫疗法、其他形式的基因疗法和手术疗法。在某些实施方案中，给患者提供包含泰索帝和i)纯化的MDA-7蛋白或ii)具有编码MDA-7的序列的核酸的组合物。可在泰索帝施用之前、期间或之后提供MDA-7。在一些实施方案中，例如，在提供泰索帝前后24小时内给患者提供MDA-7。更特别地，可在提供泰索帝前后2小时内给患者提供MDA-7。可在提供泰索帝之前给患者提供MDA-7，或可在提供MDA-7之前给患者提供泰索帝。某些实施方案中，通过给患者施用泰索帝来给患者提供泰索帝。所述癌症可以是上述这些癌症中的任何一种。在某些特定的实施方案中，所述方法还包括使患者接受放射疗法和/或化学疗法。例如，可在提供MDA-7和泰索帝各自至少一次后使患者接受放射疗法。在一些实施方案中，使患者接受亚致死剂量的放射治疗。在一些实施方案中，使患者接受其肿瘤的全部或部分的切除。可在肿瘤切除之前、期间或之后提供泰索帝。在一些实施方案中，至少通过给所得瘤床施用组合物来给患者提供MDA-7和/或泰索帝。可一次或多次施用泰索帝。在其中所述组合物包含核酸的实施方案中，所述核酸可以存在于载体中。例如，所述载体可以是病毒载体。在特定的实施方案中，所述病毒载体是腺病毒载体。在一些实施方案中，用鱼精蛋白配制腺病毒。每次施用可给患者施用一定量的病毒颗粒。在某些实施方案中，每次给药对患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。在本发明的一些其中施用核酸组合物的实施方案中，所述核酸组合物可包含一种或多种脂质。这些脂质-核酸组合物包含上述脂质中的任一种。这些脂质的实例包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。本发明总地说来也涉及在受试者中预测MDA-7癌症疗法的功效的方法，其包括(a)测定来自受试者的包含细胞的生物样品中的IL-10表达水平，和(b)根据IL-10表达水平是否与MDA-7抗性细胞或MDA敏感细胞相关，施用或不施用MDA-7癌症疗法。在一些实施方案中，所述受试者是已接受化学疗法、放射疗法或一些其他形式抗癌疗法治疗的受试者。可使用本领域技术人员已知的任何方法测定生物样品中的IL-10表达水平。例如，在一些实施方案中，使用特异性识别IL-10的抗体测定IL-10的表达水平。在其他实施方案中，使用与IL-10转录物互补或同一的核酸引物或探针测定IL-10的表达水平。包含癌细胞的生物样品可以是任何类型的生物样品，只要其包含一个或多个癌细胞。例如，所述生物样品可以是体液样品，例如血浆样品、血清样品、血液样品、脑脊液样品或尿液样品。在特定的实施方案中，所述生物样品是组织样品，例如来自受试者的肿瘤组织样品。在其他实施方案中，如果所述受试者表达与MDA-7抗性细胞相关的IL-10水平，那么在受试者中预测MDA-7癌症疗法的功效的方法进一步包括给受试者提供IL-10抑制剂。上面所示的方法中的任一方法可用于将IL-10抑制剂给受试者施用。此外，基于上面所示的教导，本领域技术人员能够确定由受试者表达的IL-10水平是否与MDA-7抗性细胞相关。本发明总体上也涉及用于在患者中预防疾病或健康相关性状况的方法，其包括给患者提供MDA-7，其中所述MDA-7足以在受试者中预防癌症。疾病或健康相关性状况可以是例如恶化前病损或癌症。所述癌症可以是上述癌症中的任一种癌症。如上所述，受试者可以是处于发生癌症的风险中的受试者。例如，受试者可具有遗传易感性或可具有成功治疗的癌症的历史。给受试者提供MDA-7以预防疾病或健康相关性状况的方法包括上面所示的方法中的任一种方法。在某些实施方案中，通过给患者施用包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸的组合物来给患者提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在患者中表达。所述组合物可以是药物可接受的组合物。如上所述，本部分包含对此的讨论，所述核酸可以是载体例如病毒载体。可通过本领域技术人员已知的任何方法例如上述方法中的任一种方法进行施用。本发明也涉及在受试者中预防癌症的方法，该方法包括给受试者施用包含编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体，其中所述核酸序列处在能够在患者中表达的启动子的控制之下。上面对腺病毒载体进行了详细的描述，本部分包含了对此的讨论。通过本领域技术人员已知的任何方法(包括上述方法)进行施用。在一些实施方案中，患者具有已用化学疗法、放射疗法、免疫疗法和/或基因疗法成功治疗的癌症的历史。在一些更特定的实施方案中，患者接受放射疗法。例如，可在提供MDA-7和MDA-7联合剂至少一次后，使患者接受放射疗法。放射疗法的剂量可以是本领域技术人员已知的任何剂量。例如，在一些实施方案中，所述剂量是放射疗法的亚致死剂量。本发明总体说来也涉及用于在患者中治疗恶化前病损的方法，该方法包括给患者提供MDA-7。可通过本领域技术人员已知的任何方法例如通过给患者施用包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸的组合物来提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在患者中表达。所述组合物可以是上述药物可接受的组合物。在某些实施方案中，所述核酸是载体。载体如上所述，本部分包含对此的讨论。可配制用于此处描述的施用(包括组合物的口服、静脉内和直接注射施用)的组合物。关于本发明的一个方面所描述的任何实施方案同样可用于本发明的其他方面。例如，在一种MDA-7联合剂的背景中所描述的任何实施方案可用于任何其他MDA-7联合剂。实施例部分中的实施方案理解为可用于本发明的所有方面的本发明的实施方案。尽管本公开内容支持表示唯一选择和“和/或”的定义，但除非明确地指出表示唯一选择或选择是相互排除的，权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”的意思。在本申请全文中，术语“大约”用于表示值包含用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。遵循多年的专利法，除非明确指出，术语“一种”和“一个”，当在权利要求或说明书中与词语“包含”结合使用时，是指一个或多个。通过下列详细描述，本发明的其他目的、特征和有利方面将变得明显。然而，应当理解详细的描述和特定的实施例，当表示本发明的特定实施方案时，仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修饰对于本领域技术人员将变得更加明显。附图概述下面的附图形成了本说明书的部分，其用于进一步说明本发明的某些方面。通过参考与此处提供的特定实施方案详细描述结合的这些附图中的一或多幅，可更好地理解本发明。图1A-B.在塞来考昔、Ad-mda7或Ad-mda7+塞来考昔处理72小时后细胞的生存力。用PBS(磷酸缓冲盐溶液)(作为对照)、Ad-luc(萤光素酶)(作为报告蛋白)、Ad-mda7、塞来考昔以及Ad-mda7和塞来考昔的组合(M+C)处理HER2-(MDA-MB-436)(a)和HER2+(MCF7/Her18)(b)乳腺癌细胞。与对照(PBS)相比，所述组合显示最显著减少的存活分数。通过MTT测定法测量存活力。将吸光度作为相对对照的百分比生存力作图。(*p＜0.05)图2.在72小时处理后通过台盼蓝排斥法(trypanblueexclusion)确定细胞死亡。用Ad-mda7、Ad-luc、塞来考昔或Ad-mda7和塞来考昔(M+C)处理Her2-(MDA-MB-436)和Her2+(MCF7/Her18)乳腺癌细胞3天，然后通过台盼蓝排斥法测定细胞的生存力。与对照(PBS)相比，在联合组(M+C)中两种细胞系都显示了显著增加的死亡细胞群。将数据以细胞死亡百分比相对处理作图。(*p＜0.05)图3A-B.75小时处理后的细胞周期分析。用Ad-mda7、Ad-luc、塞来考昔或Ad-mda7和塞来考昔的组合处理Her2-(MDA-MB-436)(a)和Her2+(MCF7/Her18)(b)乳腺癌细胞3天，然后收集漂悬的和贴壁的细胞进行细胞周期分析。与对照(PBS)相比，组合(M+C)中的MCF7/Her18细胞显示显著增加的细胞周期的G1期。图4A-B.通过膜联蛋白V/FITC和TUNEL测定法进行的流式细胞术。在72小时的处理后收获7MDA-MB-436(a)和MCF7/Her18(b)细胞，然后按照厂商的方案进行染色。根据膜联蛋白V/FITC测定，塞来考昔和mda7处理显示增加的细胞凋亡(p＜0.05)，Ad-mda7和塞来考昔的组合处理(M+C)在所有组中显示最多增加的细胞凋亡百分比(p＜0.05)。根据TUNEL测定，与对照(PBS)相比，联合塞来考昔处理显示显著增加的细胞凋亡(p＜0.05)。(*p＜0.05)图5A-B.格尔德霉素(GA)在人肺癌细胞中增强腺病毒mda-7介导的细胞杀伤作用。(A)用不同剂量的格尔德霉素处理后，A549和H460细胞中的细胞死亡的百分比。在处理后48小时通过流式细胞术分析细胞。对各细胞系进行三份重复实验。(B)在Ad-mda7、Ad-luc、GA、Ad-mda7+GA和Ad-luc+GA处理后对A549和H460细胞中的细胞凋亡进行流式细胞术分析。对各细胞系进行三份重复实验。图6A-B.Ad-mda7和GA抑制肺细胞的运动性。(A)在PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Ad-mda7+GA、Ad-luc+GA和GA处理后，A549和H460细胞中的表面E-钙粘蛋白水平的流式细胞分析。每种细胞系进行三份重复试验。(B)如“材料和方法”中所述确定肺癌细胞运动性。Ad-mda7+GA显著地减少A549和H460肺癌细胞的运动性。显示的数据代表三个独立实验。图7.17AAG在人肺癌细胞中增强腺病毒mda-7介导的细胞杀伤作用。在Ad-mda7、Ad-luc、17AAG、Ad-mda7+17AAG和Ad-luc+17AAG处理后，A549和H460细胞中细胞凋亡的流式细胞分析。对于各细胞系进行三份重复实验。图8A-B.Ad-mda7与维生素E琥珀酸酯联合的处理抑制人卵巢癌细胞的生长但不抑制正常细胞的生长。(A)用Ad-luc(载体对照)、生育酚(维生素E琥珀酸酯，8μg/mL)、Ad-mda7(2000vp/细胞)或其组合处理人卵巢癌细胞(MDAH2774)或(B)人正常成纤维细胞(MRC-9)。图9.对用Ad-luc(载体对照)、生育酚(维生素E琥珀酸酯，8μg/mL)、Ad-mda7(1000vp/细胞)或其组合处理的MDAH2774细胞进行使用抗Fas抗体的Western印迹分析。将各处理条件下存在的Fas蛋白的水平定量标绘在Y轴上，作为与未处理细胞相比Fas蛋白的百分比增加。图10A-C.DOTAPChol-mda-7复合物抑制皮下肿瘤的生长。将具有皮下肿瘤(A549或UV223m)的裸鼠和C3H小鼠分组，如下每天对其进行处理，进行总共6个剂量(50μg/剂)无处理、PBS、DOTAPChol-LacZ复合物或DOTAPChol-CAT复合物和DOTAPChol-mda-7复合物。(A)A549。(B)UV2237m。各时间点表示各组的平均肿瘤体积。条柱表示标准误差。(C)在处理后48小时采集皮下肿瘤并就MDA-7蛋白的表达进行分析。在用DOTAPChol-mda-7复合物处理的肿瘤中，18％的A549肿瘤细胞和13％的UV2237m肿瘤细胞产生MDA-7蛋白，而对照肿瘤细胞不产生MDA-7蛋白。图11.在用DOTAPChol-mda-7复合物处理后，MDA-7诱导细胞凋亡。采集来自不接受处理、接受PBS、DOTAPChol-LacZ或DOTAPChol-CAT复合物或DOTAPChol-mda-7复合物处理的动物的皮下肿瘤(A549，和UV2237m)，然后通过TUNEL染色就凋亡性细胞死亡进行分析。在用DOTAPChol-mda-7复合物处理的肿瘤中经历凋亡性细胞死亡的细胞的百分比(对于A549为13％和对于UV2237m为9％)显著高于其他处理组中的百分比(P＝0.001)。条柱表示标准偏差。图12.DOTAPChol-mda-7复合物抑制肿瘤血管化作用。就CD31对未处理的或用PBS、DOTAPChol-LacZ或DOTAPChol-CAT复合物或DOTAPChol-mda-7复合物处理的皮下肿瘤(A549和UV2237m)进行CD31染色和进行半定量分析。在DOTAPChol-mda7处理的肿瘤中CD31阳性内皮染色显著低于其他处理组的肿瘤中的染色(P＝0.01)。条柱表示标准偏差图13.DOTAPChol-mda-7复合物抑制实验性肺转移。每天用PBS、DOTAPChol-CAT复合物或DOTAPChol-mda-7复合物处理具有肺肿瘤(A549，UV2237m)的nu/nu或C3H小鼠，总共进行6个剂量(50g/剂)。与两个对照组中的肿瘤生长相比，在用DOTAPChol-mda-7复合物处理的裸鼠和C3H小鼠中，转移性肿瘤生长都被显著抑制(P＝＜0.05)。条柱表示标准偏差。图14.卵巢癌细胞的化学敏化作用。与其他处理组相比，用Ad-luc和紫杉醇或Ad-mda7和紫杉醇处理的细胞显示生长抑制。然而，只在用Ad-mda7和紫杉醇处理的细胞中观察到显著的表现出累加至协同的生长抑制(P＝＜0.05)。在三份重复小孔中进行实验，实验结果表示为两个分开实验的平均值。条柱表示标准误差。图15.Ad-mda7选择性抑制乳腺癌细胞的生长但不抑制正常细胞。显示与对照载体(*Ad-luc或空Ad)相比，对于Ad-mda7的细胞系、p53突变状态(m突变的；wt野生型)和IC50(通过氚化胸苷测定法测定的产生50％生长抑制所需的浓度)值的概述。#.以Ad-mda7的IC50除以Ad-对照的IC50的比率估计选择性指数(S.I)。图16A-E.MDA-7诱导PKR且对于肿瘤细胞具有细胞毒性。(A)通过2000vp/细胞的MOI用Ad-mda7(mda-7)或Ad-luc(luc)处理的MCF-7和MDA-MB-453细胞的Western印迹分析。MDA-7蛋白存在于Ad-mda7-处理的细胞中但不存于对照处理的细胞中。用MDA-7诱导PKR蛋白。β-肌动蛋白是显示等量蛋白上样的对照。(B)使用Ad-mda7处理乳腺癌在体外抑制肿瘤细胞生长。在T47D、MDA-MB-361、MCF-7、BT-20中进行氚化胸苷测定；用Ad-mda7或Ad-luc(0-10,000vp/细胞；0-500pfu/细胞)处理细胞4天，然后通过3H-胸苷摄取来监测生长。数据表示为平均值+SD。(C)MDA-7诱导G2/M细胞停止(箭头)。使用PI和流式细胞术就细胞周期分析用Ad-mda7、Ad-luc或载体对照处理的肿瘤细胞。(D)Ad-mda7以剂量和时间依赖性的方式诱导肿瘤细胞死亡。用Ad-mda7或Ad-luc转导MDA-MB-453细胞且在转导后24-72小时用台盼蓝染色进行分析。结果表示为细胞死亡百分比对载体剂量和时间。将数据表示为平均值+SD并作图。(E)Ad-mda7在HMEC细胞中不诱导细胞死亡。用Ad-mda7和Ad-luc转导细胞并在4天后通过台盼蓝染色进行分析。结果表示为细胞死亡的百分比对剂量(0-10,000vp/细胞)。将数据表示为平均值+SD作图。图17A-C.Ad-mda7诱导乳腺癌细胞的细胞凋亡。(A)用Ad-mda7或Ad-luc处理乳肿瘤系3天，然后使用膜联蛋白V分析细胞凋亡。*p＜0.01。将数据表示为平均值+SD作图。(B)MDA-7在T47D细胞中诱导BAX。用2000vp/细胞的Ad-luc或Ad-mda7处理T47D细胞，然后就MDA-7和BAX的表达评估裂解物。使用ZVAD的处理减少细胞凋亡但MDA-7或BAX不减少细胞凋亡。(C)MDA-7在乳腺癌细胞中诱导细胞凋亡相关的蛋白。用Ad-mda7、Ad-luc或无处理(UT)处理MDA-MB-468细胞。用抗胱天蛋白酶3、PARP和MDA-7的抗体探测细胞裂解物。β-肌动蛋白用作内对照以显示等量蛋白上样。图18A-D.Ad-mda7抑制乳腺肿瘤异种移植物的生长。使用乳腺癌细胞MCF-7(A)、MDA-MB-468(B)和MDA-MB-361(C)在裸鼠中诱导肿瘤形成。然后用Ad-mda7、Ad-luc或PBS注射所述肿瘤，然后让其生长。结果表示为肿瘤体积(以mm3表示)对时间(以天表示)。对于MCF-7和MB-361，*p＜0.002；对于MB-468，p＜0.004。(D)Ad-mda7在8个MDA-MB-46乳腺癌异种移植物中诱导细胞凋亡。在裸鼠中产生肿瘤，然后用PBS、Ad-Lu或Ad-mda7注射肿瘤，24小时后采集肿瘤，将其固定在福尔马林中。使用抗MDA-7蛋白或PKR蛋白的抗体对石蜡包埋的切片进行免疫组织化学分析。在Ad-mda7处理的肿瘤中，观察到MDA-7和PKR表达(蓝色染色的细胞)显著增加。Ad-mda7处理的肿瘤也显示高水平的TUNEL信号(箭头)。对照肿瘤未显示MDA-7表达、PKR的诱导或细胞凋亡。图19.Ad-mda7在多种模型中显著抑制乳腺癌生长。显示肿瘤模型和p53状态。图20A-B.当与他莫昔芬组合时，Ad-mda7表现协同效应。(A)用Ad-mda7和他莫昔芬或空Ad和他莫昔芬处理的T47D细胞的生长抑制。用Ad载体(0-1000vp/细胞)和不断增加的他莫昔芬(0-2ng/mL)处理细胞3天，就细胞增殖对其进行分析。(B)用Ad-mda7或Ad-luc作为单一疗法或与1μg/ml他莫昔芬的组合处理MCF-7和T47D。数据表示为平均值+SD。图21A-B.使用他莫昔芬和Ad-mda7的组合处理抑制乳腺癌细胞生长。如所显示的，用Ad-mda7或Ad-luc(0-2000vp/细胞)和他莫昔芬(0-2ng/mL)处理乳腺癌细胞系(A)T47D和(B)MCF-7。3天后，使用3H胸苷吸收测定增殖。数据表示为平均值+SD。图22A-D.Ad-mda7和阿霉素或赫赛汀的组合处理抑制肿瘤细胞生长。如所显示的，用Ad-mda7或Ad-luc与阿霉素(0-1ng/mL)处理(A)T47D和(B)MCF-7乳腺癌细胞系。3天后，使用3H胸苷吸收测定增殖。数据表示为平均值+SD。(C)MDA-MB-453细胞的裂解物的Western分析，所述细胞用作为单一疗法(对照)的Ad-mda7(M)或Ad-luc(L)进行处理，或用Ad-mda7(M)或Ad-luc(L)与他莫昔芬、阿霉素或赫赛汀的组合进行处理。使用抗p53和BCL-2家族成员的抗体探测印迹。使用微管蛋白染色验证等量上样。(D)Ad-mda7与赫赛汀在Her2+细胞中协同作用。如所显示的，通过台盼蓝染色在用对照(UT)、1μg/ml赫赛汀(H)、2000vp/细胞的Ad-luc(L)、Ad-mda7(M)或组合处理3天后的MDA-MB-453(Her2+)和MCF-7(Her2-)乳腺肿瘤细胞中测量细胞死亡。数据表示为平均值+SD.图23.当与化学疗法组合时，Ad-mda7调节不同细胞凋亡调节剂。用Ad-mda7、Ad-luc(2000vp/细胞)或载体和指定的治疗剂一起处理MDA-MB-453细胞。使用抗p53、BCL-2、BCL-XL、BAX的抗体免疫印迹细胞裂解物并使用微管蛋白进行标准化。将Ad-mda7裂解物中的信号与对应的Ad-luc处理进行比较。↓与Ad-luc对照相比减少的表达；↑与Ad-luc对照相比增加的表达；-Ad-mda7或Ad-luc之间无变化；n.s.无信号。图24A-B.使用Ad-mda7与放射疗法的组合研究。(A)Ad-mda7+放射(RT)的组合在克隆形成细胞中减少细胞的存活。以2000vp/细胞用RT、空Ad或Ad-mda7处理MDA-MB-468乳腺癌细胞；在感染48小时后，刺激细胞(0、2或4Gy)，然后通过克隆形成测定进行评估。与对照处理相比，Ad-mda7+放射疗法的组合协同抑制乳腺癌细胞中的集落形成。(B)放射疗法(RT)和Ad-mda7的组合在体内显著减少了乳腺癌生长。当MDA-MB-468乳腺癌肿瘤达到大约100mm3时，将动物分成6个处理组(各组中的动物为n＝5)；PBS、Ad-luc、Ad-luc+RT、RT、Ad-mda7和Ad-mda7+RT。每隔一天以2×1010vp/ml的剂量通过瘤内注射递送重组腺病毒，进行总共3次注射。在第3次注射24小时后，将5Gy的单剂量递送至后肢。通过两维测量估量肿瘤的生长并记录肿瘤体积。处理组之间在肿瘤的大小上存在显著的差异。Ad-mda7单一疗法比单独的RT或Ad-luc/RT产生更大的肿瘤生长抑制。在接受XRT和Ad-mda7的组合的动物中观察到最显著的生长抑制。*p＜0.002图25.Ad-mda7载体感染的乳腺癌细胞表达IL-24蛋白，从而导致细胞的杀伤。如所显示的用不同量的Ad-mda7或Ad-luc处理MDA-MB231和MDA-MB453，进行72小时。将通过台盼蓝排斥测定法细胞计数的结果表示为使用三份重复样品的两个独立实验的平均值+SD并作图。**p＜0.01，与Ad-luc相比。图26.Ad-mda7诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。(A)如所显示的，用Ad-mda7或Ad-luc转导MDA-MB453细胞。在72小时的温育后用FACS测定法分析细胞。图中显示PI染色的细胞的分布。箭头标示显著高于对照或Ad-luc处理的细胞的G2/M细胞群体(p＜0.05)。将结果表示为两个独立实验的平均值+SD并作图。(B)向MDA-MB231和MDA-MB453细胞中加入5000vp/细胞的Ad-mda7或Ad-luc进行3天，然后通过膜联蛋白V分析定量凋亡细胞的百分比。*表示显著高于对照(p＜0.05)的凋亡细胞群体。将结果表示为三个独立实验的平均值+SD并作图。图27.IL-24蛋白激活磷酸STAT3且在乳腺癌细胞中诱导细胞杀伤。用3000vp/细胞Ad-mda7+指定浓度的正常小鼠IgG或抗IL24单克隆抗体处理MDA-MB231和MDA-MB453乳腺癌细胞以及MeWo黑素瘤细胞(阳性对照)。3天的温育后，将细胞死亡对处理作图。将数据表示为使用三份重复样品的两个独立实验的平均值+SD并作图。与Ad-mda7介导的杀伤相比，*p＜0.01。图28A-B.IL-24介导的乳腺癌细胞的杀伤通过IL-20R1发生。(A)单独地使用30ng/mlIL-24或与500ng/ml指定的抗体(抗-MDA7、抗IL-20R1、抗IL-22R1或正常小鼠IgG)一起处理MDA-MB231和MDA-MB453细胞，进行96小时。与IL-24介导的杀伤相比，*p＜0.01。数据表示为三份重复样品的平均值+SD。(B)IL-24蛋白诱导MDA-MB453细胞的细胞凋亡。向MDA-MB453细胞培养基中加入各种稀释度的人IL-24蛋白。IL-24的Western印迹示于上图中。在96小时的处理后，收集细胞，然后使用TUNEL染色确定凋亡细胞群体。图29.IL-10阻断IL-24的杀伤活性。(A)使用30ng/mlIL-10、IL-19、IL-20、IL-22或IL-24处理MDA-MB231和MDA-MB453细胞96小时。将通过台盼蓝排斥测定法获得的细胞计数的结果表示为使用三份重复样品的两个独立实验的平均值+SD并作图。与IL-10相比，*p＜0.01。用30ng/mlIL-24、或IL-24与浓度不断增加的IL-10(0-300ng/ml)或与煮沸变性的IL-10一起处理(B)MDA-MB231和MDA-MB453细胞。*p＜0.05表示与单独的IL-24相比，显著的细胞死亡抑制。数据表示为使用三份重复样品的两个独立实验的平均值+SD。图30A-B.MDA-7/IL-24抑制肺肿瘤细胞中的VEGF。用PBS、Ad-Luc或Ad-mda7处理肺肿瘤细胞。在处理后72小时收集细胞和培养上清液，然后通过印迹法分析外源MDA-7蛋白的表达和来自细胞裂解物的VEGF以及通过ELISA分析上清液中的VEGF。(A)MDA-7和VEGF在PBS-Ad-luc-和Ad-mda7-处理的细胞中的表达。β-肌动蛋白用作内部上样对照。(B)通过ELISA测定VEGF表达并表示为相对于PBS的百分比抑制。图31A-B.MDA-7-介导的VEGF抑制不依赖于肿瘤细胞杀伤。用PBS、Ad-Luc或Ad-mda7(1000vp/细胞)处理肿瘤细胞。(A)在处理后不同的时间点上收集细胞并确定细胞的生存力。在24至72小时期间，在这三种处理组中未观察到显著的肿瘤细胞抑制。(B)在处理后48小时和第72小时，培养上清液的分析显示，与Ad-luc处理相比，Ad-mda7处理的上清液中的VEGF水平减少。如在细胞生存力测定中观察到的，观察到Ad-mda7对VEGF的抑制不依赖于细胞的杀伤。图32.MDA-7介导的VEGF抑制通过抑制Src发生。如实施例8中所述，用PBS、Ad-Luc或Ad-mda7处理肿瘤细胞，收集该细胞并就Src激酶活性的表达对其进行分析。与PBS和Ad-luc处理的细胞中的Src活性相比，Ad-mda7对Src激酶的抑制显著增加。图33.肿瘤细胞中MDA-7介导的VEGF抑制影响内皮细胞增殖和细胞信号转导。(A)在处理后48小时收集来自用BS、Ad-luc或Ad-mda7处理的H1299细胞的条件培养基，然后在过量的抗MDA7中和抗体(10μg/ml)或重组VEGF165蛋白(50ng/ml)存在或不存在的情况下加入HUVEC中。如实施例8中所述，通过台盼蓝测定法就细胞增殖分析细胞，通过western印迹法就VEGFR2信号转导分析细胞。与来自PBS和Ad-luc处理的细胞的条件培养基相比，来自Ad-mda7处理的H1299细胞的条件培养基显著抑制HUVEC增殖。(B)VEGFR2和pAKT(HUVEC中的VEGF受体信号转导的下游靶)在第5、10和60分钟的分析显示VEGFR2和AKT在用来自PBS和Ad-luc处理的肿瘤细胞的条件培养基处理的HUVEC中被激活。然而在用培养基处理的HUVEC中未观察到VEGFR2和AKT的激活，所述培养基来自在抗MDA7中和抗体存在或不存在的情况下用Ad-mda7处理的肿瘤细胞。当向来自Ad-mda7处理的肿瘤细胞的条件培养基中加入rhVEGF蛋白时，HUVEC中的VEGFR2和AKT的激活恢复。图34.贝伐单抗而非MDA-7抑制内皮细胞增殖。用PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Avastin、Ad-luc+Avastin或Ad-mda7+Avastin处理肿瘤(H1299)细胞和内皮(HUVEC)细胞。检测与Ad-luc或Ad-mda7组合的三种不同浓度的Avastin。在处理后48小时和72小时收集细胞并通过台盼蓝排斥测定法测量细胞生存力。在肿瘤细胞中，在任何处理组中未观察到显著的抑制。然而，在内皮细胞中，在使用Avastin、Ad-luc+Avastin和Ad-mda7+Avastin处理的细胞中观察到显著的抑制。然而，当以剂量依赖性的方式用Ad-mda7和Avastin处理内皮细胞时，观察到最显著的抑制。图35.肿瘤细胞中MDA-7和Avastin的组合对VEGF的抑制影响内皮细胞的增殖。在处理后48小时收集来自用PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Avastin、Ad-luc+Avastin或Ad-mda7+Avastin进行处理的H1299细胞的条件培养基并将其加入至HUVEC。通过“材料和方法”中的台盼蓝测定法就细胞增殖分析细胞。与来自PBS和Ad-luc处理的细胞的条件培养基相比，来自Ad-mda7-、Avastin-、Ad-luc+Avastin-和Ad-mda7+Avastin处理的H1299细胞的条件培养基显著抑制HUVEC增殖。然而，当用来自Ad-mda7+Avastin处理的肿瘤细胞的条件培养基处理HUVEC时，抑制效果最显著。图36.Ad-mda7+Avastin在体内显著地减少VEGF。图37.MDA-7+Avastin在体内抑制肿瘤生长。通过注射H1299肿瘤细胞(5×106)在裸鼠中产生皮下H1299肿瘤细胞。将动物分组(n＝8只/组)并如下进行处理PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Avastin、Ad-luc+Avastin和Ad-mda7+Avastin。瘤内注射Ad-mda7或Ad-luc(1×1010vp/注射)和腹膜内注射Avastin(5mg/Kg)。每周进行二次处理，进行四周，每周测量肿瘤大小三次。在实验结束时，对动物实施安乐死，然后分离肿瘤并将其接受免疫组织化学分析和western印迹分析。与其他处理组相比，用Ad-mda7+Avastin处理的小鼠中观察到显著的肿瘤生长抑制。与来自用PBS或Ad-luc处理的小鼠中的肿瘤相比，在Ad-mda7、Avastin和Ad-luc+Avastin处理的小鼠中也观察到肿瘤生长的显著抑制。在任何处理组中未观察到显著的体重减轻(测量至第28天)。图37.Ad-mda7+TNFα处理抑制肿瘤细胞增殖。用PBS(P)、TNFα(T)、Ad-Luc(L)、Ad-mda7(M)、Ad-luc+TNF(L+T)或Ad-mda7+TNF(M+T)处理前列腺肿瘤(LNCaP)肿瘤细胞。以1500vp/细胞进行病毒处理和以5ng/ml进行TNF处理。在处理后48小时和72小时将细胞接受XTT测定以确定细胞生存力。与其他处理组相比，用Ad-mda7+TNF处理的细胞显示显著的生长抑制。图38.TNFα增加转导效率。在TNFα(10ng/ml)存在或不存在的情况下用100、300、600和1200vp/细胞的Ad-GFP处理肿瘤(LNCaP)细胞。未接受处理的细胞用作对照。在TNFα处理后24小时，收集细胞，用PBS洗涤3次，重悬浮于500ulPBS并接受FACS分析。用单独的Ad-GFP处理的细胞显示了转导效率(所述转导效率对于100vp/细胞的Ad-GFP始于73.5％)的剂量依赖性增加。然而，在TNFα存在的情况下，转导效率增加且对于100vp/细胞的Ad-GFP观察到转导效率为92.8％。在TNFα存在的情况下转导的增加从300vp/细胞的Ad-GFP开始似乎达到了饱和。图39.Ad-mda7+TNFα处理导致增加的SubG0/G1期的细胞数目。用PBS(P)、TNFα(T；10ng/ml)、Ad-Luc(L；1500vp/细胞)、Ad-mda7(M；1500vp/细胞)、Ad-luc+TNF(L+T)、Ad-mda7+TNF(M+T)、Ad-luc+抗TNF抗体(L+A；lug/ml)或Ad-mda7+抗TNF抗体(M+A)处理肿瘤(LNCaP)细胞。在处理后48小时收集细胞，用PBS洗涤3次，重悬浮于500ul包含碘化丙啶(0.5ug/ml)的PBS中。将细胞接受FACS分析。与范围在0.45％至26.3％之间的其他处理组相比，观察到用Ad-mda7和TNF处理的大量细胞处于标志凋亡细胞的SubG0/G1期(70％)。举例说明性实施方案的描述A.MDA-7组合物本发明的组合物和方法使用MDA-7多肽和编码该多肽的核酸。MDA-7是已显示抑制癌细胞生长的肿瘤抑制剂，所述癌细胞为p53野生型、p53-无效型和p53突变型。此外，观察到的p53无效细胞中的细胞凋亡相关性B基因的上调表明MDA-7能够使用非p53依赖性机制诱导癌细胞的破坏。B.MDA-7已在人PBMC中鉴定了Mda-7mRNA(Ekmekcioglu等人，2001)，但未报导过人MDA-7蛋白的细胞因子功能。基于基因和蛋白序列的特征(NCBI数据库检索号XM_001405)将MDA-7称为IL-24。鼠类MDA-7蛋白同源物FISP(IL-4诱导的分泌蛋白)被报导为Th2特异性细胞因子(Schaefer等人，2001)。如由基因敲除研究所证明的，FISP的转录是通过TCR和IL-4受体结合，然后激活PKC和STAT6诱导的。已表征了FISP的表达但对于该假定的细胞因子仍未赋予功能(Denkert等人，2004)。大鼠MDA-7同源物C49a(Mob-5)具有与mda-7基因78％的同源性且与伤口愈合相关(Soo等人1999；Zhang等人，2000)。也显示Mob-5为分泌蛋白，且在大鼠转化细胞上鉴定了假定的细胞表面受体(Zhang等人，2000)。因此，MDA-7基因和分泌的MDA-7蛋白的同源物在不同物种中表达和分泌。然而，没有数据显示MDA-7具有细胞因子活性。这些活性具有通过增强抗原的免疫原性治疗多种疾病和感染的另外的功能。人mda-7cDNA(SEQIDNO1)编码进化上保守的、206个氨基酸(SEQIDNO2)的蛋白，预测大小为23.8kDa。推导的氨基酸序列包含从大约氨基酸26至45的疏水片段，该片段具有信号序列的特征。结构数据、对已知细胞因子的同源性、染色体定位、预测的N末端分泌信号肽和其调控细胞因子分泌的证据的综合都支持MDA-7/IL-24作主IL-10家族细胞因子的分类(参见Chada等人，2004综述)。49个氨基酸的前导序列鉴定其为分泌蛋白；最近的研究确认了这点并且还报导Ad-mda7转导的细胞释放高水平的40kDa的MDA-7蛋白形式，该蛋白可结合异源二聚体受体IL-20R1/IL-20R2和IL-22R2/IL-20R1。在其释放入细胞外区室之前，所述蛋白的细胞内形式(23-30kDa)被切割和被广泛修饰(主要通过糖基化修饰)(参见Chada等人，2004综述，其以参考引用方式并入本文)。如由正常的黑色素细胞中增加的mRNA水平(与原发性和转移性黑素瘤相比)和早期垂直生长期黑素瘤细胞(所述细胞选择为在裸鼠中增强肿瘤形成)中减少的MDA-7表达所证明的，MDA-7的表达与黑素瘤的进展呈反相关。报导指出MDA-7是具有肿瘤细胞凋亡活性的IL-10家族细胞因子且其诱导的细胞毒性效果对于肿瘤细胞是特异性的(参见Chada等人，2004综述)。几个研究小组已研究了介导mda-7的细胞凋亡活性的信号转导途径。这些途径表现为多条途径，细胞类型特异性，且包括由蛋白的细胞内形式和分泌形式(旁观者效应)诱导的效应(参见USN10/791,692，其以参考引用方式并入本文)。关于MDA-7的其他信息和数据可见于美国专利申请系列号09/615,154、10/017,472、10/378,590和10/791,692，其全部以引用参考方式全文并入本文。其他研究已显示MDA-7的提高的表达在体外抑制癌细胞生长且诱导人乳腺癌细胞中的细胞凋亡以及在裸鼠中抑制肿瘤生长(Jiang等人，1996和Su等人，1998)。Jiang等人(1996)报导了发现，即MDA-7在各种来源(包括乳腺、中枢神经系统、子宫颈、结肠、前列腺和结缔组织)的癌细胞中是有效的生长抑制基因。使用集落抑制测定法证明提高的MDA-7的表达在人宫颈癌(HeLa)、人乳腺癌(MCF-7和T47D)、结肠癌(LS174T和SW480)、鼻咽癌(HONE-1)、前列腺癌(DU-145)、黑素瘤(HO-1和C8161)、恶性成胶质细胞瘤(GBM-18和T98G)和骨肉瘤(Saos-2)中增强生长抑制性。MDA-7在正常细胞(HMEC、HBL-100和CREF-Trans6)中的过度表达显示有限的生长抑制作用，表明mda-7转基因效应在正常细胞中是不明显的。总之，所述数据表明在体外由提高的MDA-7表达引起的生长抑制作用在癌细胞中比在正常细胞中更有效。Su等人(1998)报导了对MDA-7抑制癌细胞生长的机制的研究。该研究报导MDA-7在乳腺癌细胞系MCF-7和T47D中的异位表达诱导了细胞凋亡(如可通过细胞周期分析和TUNEL测定检测到的)但对正常HBL-100细胞无影响。来自用腺病毒mda-7(“Ad-mda7”)感染的细胞的细胞裂解物的Western印迹分析显示细胞凋亡刺激蛋白BAX的上调。Ad-mda7感染只在MCF-7和T47D细胞而不在正常HBL-100或HMEC细胞中提高BAX蛋白的水平。这些数据导致研究人员评估离体Ad-mda7转导对MCF-7肿瘤细胞的异种移植物肿瘤形成的影响。离体转导在肿瘤异种移植物模型中导致对瘤形成和进展的抑制。使用基因疗法治疗癌症的主要方法是诱导细胞凋亡。这可通过使癌细胞对其他试剂产生敏感或通过刺激细胞内途径直接诱导细胞凋亡来实现。其他癌症疗法利用肿瘤对诱导血管发生从而为不断生长的肿瘤提供必需营养物的需要。内皮他丁和血管他丁是两种这样的疗法的实例(WO00/05356和WO00/26368)。尽管不依附关于这些构建体的可操作性的特定理论，但在位于C末端的参与受体结合的D螺旋区域存在跨物种的mda-7与IL-10的显著的氨基酸序列同源性。因此，优选地包含该30-35个氨基酸的区域的分子是特别优选的。因此，在本发明的一个实施方案中，血管发生相关性疾病的治疗包括施用治疗性肽或多肽。在另一个实施方案中，治疗包括给靶(包括疾病细胞或内皮细胞)施用编码mda-7的核酸表达构建体。所述靶细胞摄取构建体，然后表达由核酸编码的治疗性多肽，从而抑制靶细胞的分化。表达MDA-7的细胞反过来可分泌可与相邻的未被转导的或未被表达构建体感染的细胞相互作用的蛋白。这样，建立新脉管系统所需的复合物相互作用被抑制了，从而实现了对肿瘤的治疗。在本发明的另一个实施方案中，可用MDA-7或表达该蛋白的构建体治疗血管发生相关性疾病。适合本发明中的治疗法的一些血管发生相关性疾病是牛皮癣、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、骨关节炎(OA)和肺中的瘤前病损。在另一个实施方案中，对许多种癌症状态的治疗在本发明的范围之内。例如，黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤，星形细胞瘤、神经胶母细胞瘤，白血病、神经母细胞瘤，头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。在更优选的实施方案中，所述血管发生相关性疾病是类风湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、瘤前病损、原位癌，口毛状白斑或牛皮癣可以是治疗的对象。在特定的实施方案中，所述癌症包括可以或不可以切除的肿瘤。此外，所述癌症可包括转移性肿瘤或可能能够转移的肿瘤。可通过本发明的方法和组合物治疗的癌细胞也包括来自膀胱、血、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠，牙龈，头部、肾、肝、肺脏、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的细胞。此外，所述癌症可具体地是下列组织学类型，尽管其不限于这些类型赘生物、恶性肿瘤、癌瘤、未分化的癌瘤、巨细胞癌和梭形细胞癌、小细胞癌、乳头状癌、鳞状细胞癌、淋巴上皮癌、基底细胞癌、毛基质癌、移行细胞癌、乳头状移行细胞癌、腺癌、恶性胃泌素瘤，、胆管癌、肝细胞癌、混合肝细胞癌和胆管癌、小梁性腺癌、腺样囊性癌、腺瘤性息肉内腺癌、腺癌、家族性结肠息肉病、实体癌、恶性类癌瘤、支气管肺泡乳头状腺癌、乳头状腺癌、嫌色细胞癌、嗜酸细胞癌、嗜酸性腺癌、嗜碱细胞癌、透明细胞腺癌、颗粒细胞腺癌、滤泡腺癌、乳头状和滤泡状腺癌、非包囊硬化性癌、肾上腺皮质细胞癌、子宫内膜样癌、皮肤附属器癌、大汗腺腺癌、皮脂腺癌、皮脂腺癌、粘液表皮样癌、囊腺癌、乳头状囊腺癌、乳头状浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌、浸润性导管癌、髓样癌、小叶癌、炎性癌；柏哲德氏症、乳腺癌、腺泡细胞癌、腺鳞癌、腺癌w/鳞状组织转化、恶性胸腺瘤，、恶性卵巢间质肿瘤、恶性泡膜细胞瘤、恶性粒层细胞瘤、恶性男性细胞瘤、支持细胞癌；恶性睾丸间质细胞瘤、恶性脂质细胞瘤、恶性神经节细胞瘤、恶性乳房外的神经节细胞瘤、嗜铬细胞瘤、血管球肉瘤、恶性黑素瘤、无黑色素性恶性黑素瘤、浅表扩展性黑素瘤、巨色素痣中的恶性黑素瘤、上皮样细胞黑素瘤、恶性蓝痣、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、小泡型横纹肌肉瘤、间质肉瘤、恶性混合瘤、牟勒氏管混合瘤、肾胚细胞瘤、肝毒细胞瘤、癌肉瘤、恶性间叶瘤、恶性布伦纳瘤、恶性叶状肿瘤、滑膜肉瘤、恶性间皮瘤、无性细胞瘤；胚胎性癌、恶性畸胎瘤、恶性卵巢甲状腺肿样瘤、绒毛膜癌、恶性中肾瘤、血管肉瘤、恶性血管内皮瘤、卡波西肉瘤、恶性血管外皮细胞瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、皮质旁骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性成软骨细胞瘤、间质软骨肉瘤、骨巨细胞瘤、尤因氏肉瘤、恶性牙源性肿瘤、成釉细胞牙肉瘤、恶性成釉细胞瘤、成釉细胞纤维肉瘤、恶性松果体瘤、脊索瘤、恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、星形细胞瘤、原浆性星形细胞瘤、纤维性星形细胞瘤、星形母细胞瘤、神经胶母细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层肿瘤、小脑肉瘤、神经节母细胞瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、嗅神经源性肿瘤、恶性脑膜瘤、神经纤维肉瘤、恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤、恶性淋巴瘤、何杰金氏病、何杰金氏副肉芽肿、小淋巴细胞恶性淋巴瘤、大细胞恶性淋巴瘤、弥漫性恶性淋巴瘤、滤泡恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病、其他特定的非何杰金氏淋巴瘤、恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤、肥大细胞肉瘤、免疫增生性小肠疾病；白血病、淋巴系白血病、浆细胞性白血病、红白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、髓细胞性白血病、嗜碱细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、单核细胞性白血病、巨核母细胞白血病、巨核母细胞白血病、髓样肉瘤和毛细胞性白血病。在本发明的某些实施方案中，以表达MDA-7多肽的核酸形式提供mda-7。在特定的实施方案中，所述核酸是病毒载体，其中所述病毒载体剂量是或至少是103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015或更高的pfu或病毒颗粒。在某些实施方案中，所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、弹状病毒载体或疱疹病毒载体。最优选地，所述病毒载体是腺病毒载体。在其他特定的实施方案中，所述核酸是非病毒载体。在某些实施方案中，表达该多肽的核酸有效连接至启动子。适合于本发明的启动子的非限定性实施例包括CMVIE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22或MHCII类启动子，然而，用于驱动mda-7基因或本发明的免疫基因表达的任何其他启动子，例如此处提供的启动子，据认为可用于本发明的实施。优选地，通过注射施用本发明的核酸。其他实施方案包括通过多次注射施用核酸。在某些实施方案中，在疾病或肿瘤的位置上、区域中或远侧进行注射。在一些实施方案中，通过连续输注、瘤内注射、腹膜内或静脉内注射施用核酸。在其他实施方案中，在肿瘤切除前或之后或切除前和切除后者施用核酸。可选择地，在化学疗法、生物疗法、免疫疗法、手术或放射疗法之前、期间或之后施用核酸。优选地所述患者是人。在其他实施方案中，所述患者是癌症患者。C.核酸、载体和调控信号本发明涉及与mda-7基因和其基因产物MDA-7相关的多核苷酸或核酸分子。此外，本发明涉及与免疫原分子相关的多核苷酸或核酸分子。可从哺乳动物细胞分离和纯化这些多核苷酸或核酸分子。分离的和纯化的MDA-7核酸分子(其为与mda-7基因产物相关的核酸分子)，分泌形式或全长形式，可采取RNA或DNA的形式。如此处所用的，术语“RNA转录物”是指为从DNA核酸分子转录的产物的RNA分子。这样的转录物可编码一种或多种多肽。如本申请中所用的，术语“多核苷酸”是指已从总基因组核酸分离出来的核酸分子，RNA或DNA。因此“编码MDA-7的多核苷酸”是指包含MDA-7编码序列的，而且从总基因组DNA和蛋白中分离或纯化从而不含总基因组DNA和蛋白的核酸片段。当本申请涉及编码MDA-7的多核苷酸或核酸的功能或活性时，其是指多核苷酸编码具有诱导癌细胞细胞凋亡的能力的分子。术语“cDNA”是指使用RNA为模板制备的DNA。与基因组DNA或RNA转录物相反，使用cDNA的有利方面是使用重组DNA技术(参见Sambrook，2001；Ausubel，1996)操作序列的稳定性和能力。也可有使用全长或部分基因序列的时候。可选择地，cDNA可以是有利的因为其代表多肽的编码区且消除了内含子和其他调控区。来自给定的细胞的给定的MDA-7编码核酸或mda-7基因可由天然变体或株系代表，所述变体或株系具有稍许不同但仍编码MDA-7多肽的核酸序列。在特定的情况下，人MDA-7多肽是个特定的实施方案。因此，本发明也包含具有最少氨基酸改变但具有相同活性的MDA-7的衍生物。术语“基因”简单用于指编码功能性蛋白、多肽或及肽的核酸单位。如本领域技术人员所理解的，该功能性术语包括基因组序列、cDNA序列和更小的经基因工程改造的基因片段，所述序列和片段表达或经改造从而可表达蛋白、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体。编码MDA-7的核酸分子可包含下列长度或至少下列长度的连续核酸序列5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000或更多核苷酸、核苷或碱基对。这些序列可以与SEQIDNO1(MDA-7编码序列)是同一的或互补的。“实质上从其他编码序列分离的”是指目的基因形成核酸片段的编码区的部分，和指所述片段不包含天然发生的核酸的大的部分例如大的染色质片段或其他功能性基因或cDNA编码区。当然，这是指原始分离的核酸片段，且不排除通过人工操作后来加至所述片段的基因或编码区。在特定的实施方案中，本发明涉及分离的DNA片段和包含了DNA序列的重组载体，所述DNA片段和序列编码在其氨基酸序列中包含与SEQIDNO2所示的序列一致或基本上一致的连续氨基酸序列的MDA-7蛋白、多肽或肽(对应于称为“人MDA-7”或“MDA-7多肽”的MDA-7)。术语“基本上如SEQIDNO2中所示的序列”是指序列基本上对应于SEQIDNO2的一部分但具有相对少量的与SEQIDNO2的氨基酸不同的氨基酸或生物学功能与其等同的氨基酸。术语“生物学功能等同”在本领域中是容易理解的且在此处被进一步详细地定义。因此，具有大约70％、大约71％、大约72％、大约73％、大约74％、大约75％、大约76％、大约77％、大约78％、大约79％、大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％或大约99％和其中可衍生的任何范围内例如大约70％至大约80％，和更优选地大约81％至大约90％，更优选地大约91％至99％的与SEQIDNO2的氨基酸相同或功能等同的氨基酸的序列是作为“基本上如SEQIDNO2所示的序列”的序列，只要所述蛋白保留诱导细胞凋亡的生物学活性。在特定的实施方案中，MDA-7蛋白、多肽或肽或生物学功能等同物的生物学活性包括增强免疫反应。在某些其他实施方案中，本发明涉及在其序列中包含基本上如SEQIDNO1所示的核酸序列的分离的DNA片段和重组载体。术语“基本上如SEQIDNO1所示的”以上述相同的意思使用且是指所述核酸序列基本上对应于SEQIDNO1的部分但具有相对少数与SEQIDNO2的密码子不同或功能上等同于其的密码子。同样，编码展示MDA-7活性的蛋白、多肽或肽的DNA片段可用于本发明的实施方案。在特定的实施方案中，本发明涉及包含编码MDA-7多肽或肽的分离的核酸片段和重组载体，所述多肽或肽在其氨基酸序列中包含与MDA-7多肽一致或基本上对应于其的连续氨基酸序列。本发明的载体主要设计用于用在真核启动子(即，组成型、诱导型、阻抑型、组织特异性启动子)控制之下的治疗性mda-7基因或编码MDA-7的核酸序列转化细胞。另外，所述载体可包含有助于其体外操作(如果不是因为其他原因)的选择标记。然而，选择标记可在产生重组细胞中起着重要作用。下面的表1和2列出了用于本发明的应用的多种调控信号。表1-诱导型元件表2-其他启动子/增强子元件真核细胞中控制编码蛋白的基因转录的启动子和增强子由多个基因元件组成。细胞装置能够收集和整合由各元件输送的调控信息，从而使得不同基因演化出不同的、通常复杂的转录调控模式。术语“启动子”此处用于表示成簇围绕RNA聚合酶II的起始位点的转录控制模块组。许多关于启动子组织的机制的构想源于几个病毒启动子(包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的启动子)的分析。获得最近工作充实的这些研究已显示启动子由分开的功能性模块组成，各模块由大约7-20bp的DNA组成，且包含一个或多个转录激活因子蛋白的识别位点。各启动子中至少一个模块用作RNA合成的起始位置。该位置最为熟知的实例是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中，与其自身起始位置交叠的分开的元件帮助固定起始位置。另外的启动子元件调控转录起始的频率。一般地，这些元件位于起始位点上游30至110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也在起始位点下游包含功能性元件。元件之间的间隔是可变的，这样当元件相对另一个元件倒转或移动时启动子功能仍得到保存。在tk启动子中，元件之间的间隔可在活性开始下降之前增加至50bp的距离。依赖于启动子，单个元件似乎可共同协作或独立地激活转录。增强子最初作为增加位于相同DNA分子的较远的位置上的从启动子的转录的基因元件被发现的。在较长距离上发挥作用的该能力在原核转录调控的经典研究中鲜有先例。随后的工作显示具有增强子活性的DNA区域的组织与启动子非常相似。即，其由许多单个的元件组成，各个元件与一个或多个转录蛋白。增强子和启动子之间的基本区别是可操作性。启动子区域作为整体必须能以一定距离刺激转录；启动子区域或其组成元件则不一定需要这样。在另一方面，启动子必须具有一个或多个在特定的位点和以特定的方向指导RNA合成起始的元件，而增强子缺少这些特异性。除了该可操作的区别外，增强子和启动子是非常相似的实体。启动子和增强子在细胞中具有激活转录的相同的一般功能。其通常交叠和邻接，通常似乎具有非常相似的模块组织。总之，这些原因暗示着增强子和启动子是同源实体且结合至这些序列的转录激活因子蛋白可以以基本相同的方式与细胞转录机器相互作用。在一些实施方案中，用于本发明的启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子。该启动子可以以存在于载体pcDNAIII中的形式从Invitrogen商购获得，其可用于本发明。dectin-1和dectin-2启动子也用于本发明。下面是可与本发明一起使用的其他病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的目录。此外任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动编码寡核酸加工酶、蛋白折叠辅助蛋白、选择标记蛋白或目的异源蛋白的结构基因表达。可证明有用的另一个信号是多腺苷酸化信号。这些信号可从人生长激素(hGH)基因、牛生长激素(BGH)基因或SV40获得。内部核糖体结合位点(IRES)元件可用于产生多个基因或多顺反子信使RNA。IRES元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核酸体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已描述了来自小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌)的IRES(Pelletier和Sonenberg，1988)和来自哺乳动物信使RNA的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。可将IRES元件连接至异源可读框。可一起转录多个可读框，各可读框被IRES分隔，产生了多顺反子信使RNA。依靠IRES元件，核糖体可接近各可读框进行有效翻译。可使用单个启动子/增强子转录单个信使RNA来有效地表达多个基因。无论如何，要理解启动子是当功能性地置于基因的上游时导致该基因表达的DNA元件。本发明的大多数转基因构建体功能性地置于启动子元件的下游。提供本发明的组合物和用于给患者施用本发明的组合物的方法D.载体MDA-7多肽可由载体中包含的核酸分子编码。这样，可通过施用该载体给患者提供MDA-7多肽，只要所述多肽在患者中表达。术语“载体”是指可将核酸序列插入其中以转导入细胞的载体核酸分子，所述载体分子可在所述细胞中复制。核酸序列可以是“外源的”，这表示所述核酸对于向其中导入载体的细胞是外源的或该序列与细胞中的序列是同源的但位于通常未在其中发现该序列的宿主细胞核酸内的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员会有良好的装备通过标准重组技术构建载体，所述重组技术描述于Sambrook等人，(2001)和Ausubel等人，1996，两者以参考引用方式并入本文。除了编码修饰的多肽例如修饰的白树毒素外，载体可编码非修饰性多肽序列例如标签或靶向分子。有用的编码这些整合蛋白的载体包括pIN载体(Inouye等人，1985)、编码组蛋白片段的载体和用于产生谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶性整合蛋白以进行后期纯化和分离或切割的pGEX载体。靶向分子是引导修饰的多肽至对象身体中的特定器官、组织、细胞或其他位置的分子。术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的基因产物的至少部分核酸序列的载体。在一些情况下，然后将RNA分子翻译成蛋白、多肽或肽。表达载体可包含多种“控制序列”，所述控制序列是指有效连接的编码序列在特定宿主生物中转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可包含发挥其他功能的序列和在下文中描述的核酸序列。1.病毒载体a.腺病毒感染递送重组DNA的一个方法包括使用腺病毒表达载体。尽管已知腺病毒载体具有很低的整合入基因组DNA的能力，但该特征被由这些载体提供的基因转移的高效率所抵销。“腺病毒表达载体”是指包含含有足以(a)支持构建体包装和(b)支持最终表达已克隆至其中的重组基因构建体的腺病毒序列的构建体。所述腺病毒载体可以是复制缺陷型的，或至少条件缺陷型，腺病毒载体的性质据认为对于本发明的实施不是至关重要的。所述腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚型A-F的任一种。亚组C中的腺病毒5型是为获得用于本发明的条件复制缺陷型载体的起始材料。这是因为腺病毒5型是关于其的大量生物化学和遗传学信息都已知的人腺病毒，且其其历史上一直用于大多数使用腺病毒作为载体的构建体。如上所述，本发明的常用载体是复制缺陷型载体且不具有腺病毒E1区域。因此，将转化构建体导入在E1编码序列已被除去的位置上是最方便的。然而，构建体在腺病毒序列内插入的位置对于本发明不是至关重要的。编码目的基因的多核苷酸也可插入如由Karlsson等人(1986)描述的E3置换型载体的缺失的E3区域位置，或其中辅助细胞系或辅助病毒能互补E4缺陷的E4区域中。腺病毒的生长和操作对于本领域技术人员来说是已知的，且其在体外和体内展示广谱宿主性。可以高滴度例如每ml109-1011个噬斑形成单位获得该组病毒，且其具有高感染性。腺病毒的生活周期不需要整合入宿主细胞基因组。通过腺病毒载体递送的外源基因是附加体，因此具有较低的对宿主细胞的遗传毒性。b.逆转录病毒感染逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于其通过逆转录过程在感染的细胞中将其RNA转变成双链DNA的能力(Coffin，1990)。然后将所得的DNA作为前病毒稳定地整合入细胞染色体并指导病毒蛋白的合成。所述整合导致病毒基因序列保留在受体细胞和其后代中。为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入病毒的基因组以取代某些病毒的序列，从而产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，可构建包含gag、pol和env基因但不包含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人，1983)。当将包含cDNA的重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列一起导入(例如通过磷酸钙沉淀法)该细胞系时，所述包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装入病毒颗粒，然后所述病毒颗粒被分泌入培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。然后收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地对其进行浓缩，然后用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染许多细胞类型。然而，整合和稳定的表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等人，1975)。c.AAV载体腺伴随病毒(AAV)是吸引人的用于本发明的载体系统，因为其具有高整合频率且其可感染非分裂细胞，从而使其能够在组织培养中用于将基因递送入哺乳动物细胞(Muzyczka，1992)。AAV在传染性方面具有广谱宿主性(Tratschin等人，1984；Laughlin等人，1986；Lebkowski等人，1988；McLaughlin等人，1988)，这意味着其可用于本发明。关于rAAV载体的产生和用途的详细内容描述于美国专利5,139,941和美国专利4,797,368，各自以参考引用方式并入本文。显示AAV在基因递送中的应用的研究包括LaFace等人(1988)；Zhou等人(1993)；Flotte等人(1993)；和Walsh等人(1994)。重组AAV载体已成功地用于标记基因(Kaplitt等人，1994；Lebkowski等人，1988；Samulski等人，1989；Shelling和Smith，1994；Yoder等人，1994；Zhou等人，1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等人，1985；McLaughlin等人，1988)和参与人疾病的基因(Flotte等人，1992；Ohi等人，1990；Walsh等人，1994；Wei等人，1994)的体外和体内转导。最近，已批准AAV载体用于进行囊性纤维化的治疗的I期人试验。一般地，通过共转染包含侧翼连接两个AAV末端重复的目的基因的质粒(McLaughlin等人，1988；Samulski等人，1989；各自以参考引用方式并入本文)和包含无末端重复的野生型AAV编码序列的质粒例如pIM45(McCarty等人，1991；以参考引用方式并入本文)来产生重组AAV(rAAV)病毒。也用携带AAV辅助功能所需的腺病毒基因的腺病毒或质粒感染或转染细胞。用腺病毒污染以该方式产生的rAAV病毒贮液，所述腺病毒在物理上必须与所述rAAV颗粒分开(例如，通过氯化铯密度离心)。可选择地，可使用包含AAV编码区的腺病毒载体或包含AAV编码区和腺病毒辅助者基因中的一些或所有基因的的细胞系(Yang等人，1994；Clark等人，1995)。也可使用具有作为整合的前病毒的rAAVDNA的细胞系(Flotte等人，1995).d.鱼精蛋白鱼精蛋白也可用于与表达构建体形成复合物。然后可用上述脂质组合物配制这些复合物以给细胞施用。鱼精蛋白是与DNA结合的小的高碱性的核蛋白。其在核酸递送中的应用描述于美国专利5,187,260，其以参考引用方式并入本文。涉及用于通过将病毒载体与鱼精蛋白分子复合来增加病毒载体的转导效率的方法和组合物的美国专利申请10/391,068(2003年3月24日提交)具体地以参考引用方式并入本文。2.非病毒递送除了编码MDA-7蛋白的核酸的病毒递送外，下面是将重组基因递送入给定的宿主细胞的其他方法，因此这方法也被认为在本发明内。a.脂质介导的转化在本发明的其他实施方案中，表达载体可被捕获在脂质体或脂质制剂中。脂质体是特征在于磷脂双层膜和内部水性介质的囊状结构。多层脂质体具有多个由水性介质分开的脂层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时其自发地形成。在封闭的结构形成之前脂质组分进行自我重排并将水和溶解的溶质包含在脂双层之间(Ghosh和Bachhawat，1991)。也涉及与Lipofectamine(GibcoBRL)复合的基因构建体。脂质体制剂的最新进展已提高了体内基因转移的功效(WO98/07408)。由等摩尔比例的1，2-双(油酰氧)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)和胆固醇组成的新脂质体制剂显著增强了体内全身性基因递送，大约150倍。据认为DOTAP胆固醇脂质制剂形成了称为“三明治脂质体”的独特结构。据报导该制剂将DNA“夹”在内陷的双层或‘花瓶’结构之间。这些脂质体的有益特征包括通过胆固醇产生的胶体稳定性、二维DNA包装和增加的血清稳定性。在09/575,473中提供了用于治疗癌症的这些制剂的生产和用途，所述参考资料以参考引用方式并入本文。在其他实施方案中，脂质体进一步定义为纳米颗粒。此处定义的“纳米”颗粒是指亚微米颗粒。所述亚微米颗粒可以是任何大小。例如，所述纳米颗粒可具有大约0.1、1、10、100、300、500、700、1000纳米或更大的直径。给患者施用的纳米颗粒可以是不止一种大小。本领域技术人员已知的任何方法可用于产生纳米颗粒。在一些实施方案中，在生产过程中挤出纳米颗粒。关于纳米颗粒的生产的示例性信息可见于美国专利申请公开号20050143336、美国专利申请公开号20030223938、美国专利申请公开号20030147966和U.S.S.N.60/661,680，其各自具体地在该部分引用作为参考。在某些实施方案中，在施用脂质核酸复合物后，将抗炎剂与脂质一起施用以预防或减少炎症。例如，抗炎剂可以是非甾体抗炎剂、水杨酸、抗风湿剂、类固醇或免疫抑制剂。关于将抗炎剂与脂质-核酸复合物一起施用的信息可见于美国专利申请公开号20050143336，其具体地以参考引用方式并入本文。可通过本领域技术人员已知的任何方法合成DOTAP胆固醇纳米颗粒。例如，所述方法可与Chada等人，2003或Templeton等人，1997中所示的方法相同，其两者具体地以参考引用方式并入本文。在小鼠中进行注射之前2至3小时新鲜配制DOTAPChol-DNA复合物。本领域技术人员熟悉使用脂质体或脂质制剂捕获核酸序列的应用。脂质体是特征在于磷脂双层膜和内部水性介质的泡状结构。多层脂质体具有多个由水性介质分开的脂层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时其自发地形成。在封闭的结构形成之前脂质组分进行自我重排并将水和溶解的溶质包含在脂双层之间(Ghosh和Bachhawat，1991)。也涉及与Lipofectamine(GibcoBRL)复合的基因构建体。脂质介导的核酸递送和外源DNA在体外的表达已经非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。Wong等人(1980)证明了在培养的鸡胚、HeLa和肝细胞瘤细胞中进行脂质介导的递送和外源DNA的表达的可行性。基于脂质的非病毒制剂提供了腺病毒基因疗法的另一种选择。尽管许多细胞培养研究已证明基于脂质的非病毒基因转移，但通过基于脂质的制剂进行的全身性基因递送受到限制。基于非病毒脂质的基因递送的主要限制是包含所述非病毒递送载体的阳离子脂质的毒性。脂质体的体内毒性部分地解释了体外和体内基因转移结果之间的差异。促成该矛盾的数据的另一个因素是在血清蛋白存在和不存在的情况下脂质体稳定性的差别。脂质体和血清蛋白之间的相互作用对脂质体的稳定性质具有很大的影响(Yang和Huang，1997)。阳离子脂质体吸引和结合带负电荷的血清蛋白。被血清蛋白包被的脂质体溶解或被巨噬细胞吸收，从而导致其从循环中清除。目前的体内脂质体递送方法使用皮下、皮内、瘤内或颅内注射以避免与循环中的阳离子脂质相关的毒性和稳定性问题。脂质体和血浆蛋白的相互作用解释了体外基因转移(Felgner等人，1987)和体内基因转移(Zhu等人，1993；Solodin等人，1995；Liu等人，1995；Thierry等人，1995；Tsukamoto等人，1995；Aksentijevich等人，1996)的功效之间的差异。脂质体制剂的最新进展已提高了体内基因转移的功效(WO98/07408)。由等摩尔比例的1，2-二(油酰氧)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)和胆固醇组成的新脂质体制剂显著增强了体内全身性基因递送，大约150倍。据认为DOTAP胆固醇脂质制剂形成了称为“三明治脂质体”的独特结构。据报导该制剂将DNA“夹”在内陷的双层或‘花瓶’结构之间。这些脂质体的有益特征包括通过胆固醇产生的胶体稳定性、二维DNA包装和增加的血清稳定性。通常在(I)反相蒸发法(II)脱水-再水化(III)去污剂透析和(IV)薄膜水合作用后通过对脂质体混合物的超声处理或系列挤出(serialextrusion)进行脂质体制剂的制备。在制备后，脂质结构可用于封装当在循环中时有毒的(化疗剂)或不稳定的(核酸)化合物。脂质体封装已导致这些化合物的更低的毒性和更长的血清半衰期(Gabizon等人，1990)。许多疾病疗法正使用基于脂质的基因转移策略来增强常规疗法或建立新疗法，特别是用于治疗过度增生性疾病的疗法。可将脂质体与血凝病毒(HVJ)复合。已显示这有利于与细胞膜的融合，从而促进脂质体封装的DNA进入细胞(Kaneda等人，1989)。在另一个实施方案中，可将脂质体与细胞核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或与其一起使用(Kato等人，1991)。在其他实施方案中，可将脂质体与HVJ和HMG-1两者复合或与其联合使用。可通过聚丙烯酰胺凝胶、氯化铯梯度离心、柱层析或通过本领域技术人员已知的任何其他方法(参见例如，Sambrook等人，2001，以参考引用方式并入本文)纯化用于非病毒递送的核酸。在某些方面，本发明涉及作为分离的核酸的核酸。如此处所用，术语“分离的核酸”是指已分离的不含大量细胞组分或体外反应组分，和/或一个或多个细胞的大量总基因组核酸和转录的核酸的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)。用于分离核酸的方法(例如平衡密度离心沉淀法、电泳分离、柱层析)对于本领域技术人员来说是熟知的。E.蛋白、肽和多肽本发明涉及MDA-7多肽的方法和组合物。在某些实施方案中，MDA多肽用于癌症的治疗。在某些实施方案中，直接提供MDA-7多肽。术语“蛋白”和“多肽”在此处可互换使用。本发明的其他实施方案包括包含MDA-7蛋白和缺少其内源信号序列的MDA-7的截短形式或具有异源信号序列的MDA-7多肽的纯化蛋白组合物的应用。截短的MDA-7分子包括，例如，大致始于MDA-7氨基酸残基46-49和更靠近N末端截短的分子。具体地包括始于残基46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和182且终止于残基206的分子。在其他实施方案中，包括残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48与SEQIDNO2中所示的MDA-7的其他连续残基。本发明也涉及MDA-7或编码MDA-7的核酸和一种或多种下列物质(a)TNF、(b)VEGF抑制剂或(c)IL-10抑制剂组合的方法和组合物。在本发明的某些实施方案中，所述TNF、VEGF抑制剂或IL-10抑制剂是蛋白、多肽或肽。如本领域技术人员所理解的，可在MDA-7多肽或肽、TNF多肽或肽、VEGF抑制剂多肽或肽或IL-10抑制剂的结构中进行修饰和改变但仍能产生具有相似或想要的特征的分子。例如，某些氨基酸可被其他氨基酸置换或在蛋白质序列中包含缺失、添加或截短而不显著丧失与结构相互作用的结合能力。因为其是确定该蛋白的生物学功能活性的蛋白的相互作用能力和性质，因此可在蛋白序列(当然，或其基础的DNA编码序列)中产生某些氨基酸序列置换，但获得具有相似的肿瘤抑制、诱导细胞凋亡、抗原性或细胞因子特性的蛋白。因此本发明者认识到可在MDA-7多肽或肽(或其基础的DNA)的序列中产生许多改变而不显著丧失其生物学用途或活性。TNFα的全长氨基酸序列和核酸序列在此处分别示于SEQIDNO3和SEQIDNO4。TNFβ的全长氨基酸序列和核酸序列在此处分别示于SEQIDNO5和SEQIDNO6。VEGF-A以通过选择剪接从单个基因产生的几种同种型存在。VEGF-A的同种型121的全长氨基酸序列和核酸序列此处分别示于SEQIDNO7和SEQIDNO8。VEGF-A的同种型165的全长氨基酸序列和核酸序列此处分别示于SEQIDNO9和SEQIDNO10。VEGF-A的同种型189的全长氨基酸序列和核酸序列此处分别示于SEQIDNO11和SEQIDNO12。VEGF-A的同种型206的全长氨基酸序列和核酸序列此处分别示于SEQIDNO13和SEQIDNO14。VEGF-B的全长氨基酸序列和核酸序列此处分别示于SEQIDNO15和SEQIDNO16。VEGF-C的全长氨基酸序列和核酸序列此处分别示于SEQIDNO17和SEQIDNO18。VEGF-D的全长氨基酸序列和核酸序列此处分别示于SEQIDNO19和SEQIDNO20。胎盘生长因子(VEGF家族的成员)的全长氨基酸序列和核酸序列此处分别示于SEQIDNO21和SEQIDNO22。在功能等同物方面，本领域技术人员也理解，生物学功能等同蛋白或肽的定义的内涵是对可在分子的确定部分内产生的改变的数目的限制的概念，所述改变仍导致具有可接受水平的等同生物学活性的分子。因此生物学功能等同肽此处定义为其中某些但非大部分或所有氨基酸可被置换的肽。特别地，涉及小肽时，较少的氨基酸可被改变。当然，可根据本发明容易地制备和使用许多具有不同置换的蛋白/肽。也很好地理解，当某些残基(例如酶的活性位点中的残基或RNA聚合酶II结合区域中的残基)显示对于蛋白或肽的生物学或结构特性特别重要时，这些残基通常不可以改变。氨基酸置换通常基于氨基酸侧取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析显示精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸都具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有总体相似的形状。因此，基于这些考虑，下列亚组在此处定义为生物学功能等同物精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。为产生更为定量的改变，可考虑氨基酸的亲水性指数。基于其疏水性和电荷特征给每个氨基酸赋予亲水性指数，这些指数是异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/甘氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白相互作用生物学功能中的重要性在本领域内是广为理解的(Kyte&Doolittle，1982，以参考引用方式并入本文)。已知某些氨基酸可被具有相似亲水性指数或评分的其他氨基酸置换但仍保持相似的生物学活性。在基于亲水性指数产生改变的过程中，其亲水性指数在±2内的氨基酸的置换是优选的，其亲水性指数在±1内的氨基酸的置换是特别优选的，其亲水性指数在±0.5内的氨基酸的置换是更优选的。在本领域也理解可基于亲水性有效地进行相似氨基酸的置换，特别是当由此产生的生物学功能等蛋白或肽用于免疫实施方案时，如在本发明的情况下，特别有效。美国专利4,554,101，此处引用作为参考，指出蛋白的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性控制的)与其免疫原性和抗原性(即与该蛋白的生物学特性)相关。如美国专利4,554,101中所述，已将下列亲水性值分配至氨基酸残基精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，其亲水性在±2内的氨基酸的置换是优选的，其亲水性在±1内的氨基酸的置换是特别优选的，其亲水性在±0.5内的氨基酸的置换是更特别优选的。尽管描述已集中在由氨基酸改变产生的功能等同多肽上，但要认识到这些改变可通过改变编码DNA来实现，也要考虑遗传密码子具有简并性以及两个或更多密码子可编码相同的氨基酸。1.体外蛋白产生除了实施例中提供的纯化方法外，描述了用于体外产生蛋白的一般方法。在用本发明的一些实施方案中的病毒载体转导后，可用多种方法制备原代哺乳动物细胞培养物。为了使细胞在体外和与表达构建体接触时保持活力，必需确保细胞保持与恰当比例的氧和二氧化碳以及营养物接触，同时保护其免受微生物污染。此处参考资料详尽地描述和公开了细胞培养技术(Freshney，1992)。上述的一个实施方案包括使用基因转移使细胞永生化从而用于产生和/或提供蛋白。可如上所述将目的蛋白的基因转移入合适的宿主细胞中，然后在合适的条件下培养细胞。事实上可以该方式使用任何多肽的基因。上面描述了重组表达载体和其中包含的元件的产生。可选择地，要产生的蛋白可以是通常由所述细胞合成的内源蛋白。本发明的另一个实施方案使用用表达免疫基因产物(更具体地具有免疫原活性的蛋白)的病毒载体转染的自体B淋巴细胞系。哺乳动物宿主细胞系的其他实例包括Vero细胞和HeLa细胞、其他B细胞和T细胞系例如CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji等以及中国仓鼠卵巢的细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞。此外，可选择调节插入序列的表达或以想要的方式修饰和加工基因产物的宿主细胞系。蛋白产物的这些修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白的功能可以是非常重要的。不同的宿主细胞具有对于蛋白的翻译后加工和修饰是特征性和特异性的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。可使用多种选择系统，包括，但不限于分别存在于tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。同样，抗代谢物抗性可用作选择的基础对于dhfr，其提供对二氢叶酸的抗性；gpt，其提供对霉酚酸的抗性；neo，其提供对氨基葡糖苷G418的抗性；和hygro，其提供对潮霉素的抗性。可以两种模式在体外繁殖动物细胞作为在整个培养物中悬浮生长的非贴壁依赖性细胞或作为需要附着至固体基质以进行其增殖的贴壁依赖性细胞(即，单层类型的细胞生长)。来自连续的已建立的细胞系的非贴壁依赖性或悬浮培养是大规模生产细胞和细胞产物的最为广泛使用的方法。然而，悬浮培养的细胞具有局限性，例如致瘤潜能和比贴壁细胞低的蛋白产量。2.ER靶向序列本发明的多肽包括一种或多种内质网靶向序列。细胞内蛋白的最终定位依赖于蛋白序列内的编码的靶向序列。在最简单的情况下，信号的缺乏指导蛋白进入缺省途径，即细胞质。注定保留在ER中的蛋白必须具有特定的信号肽以使蛋白保留在ER中。本发明的多肽可以在或可以不在N末端或C末端包含额外的氨基酸残基。ER是从细胞核膜延伸至整个细胞质的膜包围的管和囊(潴泡)。蛋白的分泌途径如下粗面型ER→高尔基体→分泌小泡→细胞外部。对于待分泌的蛋白，所述蛋白通常必须从ER运输至高尔基体。然而，某些蛋白必需要保留在ER内，例如BiP、信号肽酶、蛋白质二硫键异构酶。特定的定位信号将蛋白靶向ER。某些蛋白因为在其羧基末端存在ER靶向序列Lys-Asp-Glu-Leu(KDEL，以单字母密码子表示)而保留在ER腔中。如果该序列不是蛋白的部分，则蛋白被转运至高尔基体中并被分泌出细胞。在羧基末端上存在KDEL序列或KKXX序列(KKXX序列)导致蛋白保留在ER中。这些序列的存在导致所述蛋白对这些区室的膜中的特定循环受体的结合，从而被选择性地转运回ER。蛋白从ER输出不仅通过宏观流动发生，而且通过受调控的途径发生，所述途径特异性地识别介导蛋白转运至高尔基体的靶向信号。16至30个残基的ER信号序列的存在指导核糖体至ER膜并起始蛋白穿过ER膜的转运。ER信号序列通常位于蛋白的N末端。这些靶向序列通常包含一个或多个带正荷的氨基酸，之后是6-12个疏水性残基的连续片段。信号序列通常在蛋白仍然在核糖体中生长时从蛋白切除。来自在信号序列的几个疏水氨基酸的特定缺失或其中一个突变成带电荷的氨基酸都可导致蛋白不能穿过ER膜进入腔内。随机N末端氨基酸序列的添加将使胞质蛋白被转移至ER腔，表明疏水残基形成了对于ER靶向是至关重要的结合位点。内质网靶向序列可包含任何数目的氨基酸残基，只要这些氨基酸残基将多肽的目的地靶向内质网。本发明的多肽可包含单个ER靶向序列或多个ER靶向序列。关于ER靶向信号的其他信息可见于国际互联网invitrogen.com/content/sfs/manuals/pshooter_pef_man.pdf上的Invitrogen目录号V890-20、V891-20、V892-20和V893-20，“pShooterVectorManualI(pEF/mycvectors)，”，其以引用参考方式全文并入本文。信号序列识别和靶向ER的蛋白的综述也可见于Walter和Johnson，1994；Koch等人，2003；和Kabat等人，1987，其也具体地以参考引用方式并入本文。3.MDA-7纯化的方法本发明在本发明的一些实施方案中使用纯化的MDA-7。可使用下列方法和本领域技术人员已知的相似的方法实施此处公开的MDA-7的纯化方法。这些方法公开于10/791,692，其以参考引用方式并入本文。下面提供该公开内容的部分(无图)。F.抗体的产生1.结合MDA-7的抗体在大肠杆菌(E.coli)中产生重组的组氨酸标记的MDA-7蛋白并在镍螯合NTA琼脂糖柱上进行纯化。将材料以分批的模式结合至镍螯合树脂进行45分钟，然后倒入柱中并使洗脱液流过柱床。用含有0.5％chap的10mMTrispH8.0洗涤材料，最后用10mMTrispH8.0+400mM咪唑将其洗脱出柱子。对10mMTrispH8.0透析洗脱的MDA-7。终产物显示为具有大约23kDa的分子量的单一条带。氨基末端蛋白序列显示为正确的蛋白且纯度估计为大于90％。使用下列方案将该材料注射入兔子皮下注射400mgMDA-7蛋白和IFA以及100mgMDP，3周后，注射200μgMDA-7蛋白和IFA，之后再静脉内注射100mgMDA-7蛋白。基于ELISA测定，抗血清的滴度显示为大于1/100,000。需要时对动物进行加强免疫。通过巯基键将MDA-7蛋白偶联至固体支持树脂。充分洗涤树脂和结合的蛋白。使用该清洗的材料制备用于抗体纯化的MDA-7柱。用20mMTris缓冲液pH8.0以1∶1的稀释度稀释兔多克隆血清，然后在泵入MDA-7柱之前通过0.2微米过滤器进行过滤。然后用相同的20mMTris缓冲液pH8.0洗涤柱子直至吸光度返回至基线。用0.1M醋酸将抗体洗脱出柱子。立即将包含抗体洗脱剂调节回pH8.0。然后对10mMTrispH8.0透析亲和纯化的抗体并进行浓缩。2.结合IL-10和VEGF的抗体本发明的一些实施方案涉及包含MDA-7和IL-10抑制剂的方法和组合物，其中所述抑制剂是抗体。本发明也涉及包含MDA-7和VEGF抑制剂的方法和组合物，其中VEGF抑制剂是结合VEGF的抗体。涉及结合免疫调节剂例如IL-10的抗体的信息可见于美国专利6,168,791，其具体地以参考引用方式并入本文。美国专利6,168,791教导抗体和用于产生结合免疫调节剂例如IL-10或IL-10的激动剂的抗体和用于产生抗体的方法。关于IL-10抗体的产生的其他信息可见于美国专利6,407,218和美国专利申请20050101770，其各自具体地以参考引用方式并入本文。此外，在下面在VEGF或IL-10特异性抗体的上下文中描述关于用于MDA-7纯化的抗体。IL-10抗体序列的实例包括结合IL-10的抗体分子或其结合片段，包括至少一个抗体轻链可变区或其结合片段，其包含具有至少一个选自CDR1(SEQIDNO23)、CDR2的SEQIDNO24和CDR3的SEQIDNO25的氨基酸序列的多肽；和构架区，其中构架区的氨基酸序列是全部或基本上全部人免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一个抗体重链可变区或其结合片段，其包含具有至少一个选自互补性决定区1(CDR1)的SEQIDNO26、CDR2的SEQIDNO27和CDR3的SEQIDNO28的氨基酸序列的多肽；和构架区，其中构架区的氨基酸序列是全部或基本上全部人免疫球蛋白氨基酸序列。所述抗体还可包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包括γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。所述抗体还可包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包括λ或κ人轻链恒定区。关于抗人IL-10抗体的其他信息可见于国际互联网sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/i5020dat.pdf，其以参考引用方式并入本文。如此处所用的，术语“抗体”是指展示想要的生物学活性的任何形式的抗体或其片段。因此，其在广义上进行使用且具体地包括单克隆抗(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其展示想要的生物学活性。包含在结合IL-10的抗体的定义内的是IL-10抗体结合片段。如此处使用的，术语“IL-10结合片段”或“其结合片段”包括仍然基本上保持其抑制IL-10活性的生物学活性的抗体片段或衍生物。因此，术语“抗体片段”或IL-10结合片段是指全长抗体的部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双特异性抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；和从抗体片段形成的多特异性抗体。一般地，结合片段或衍生物保持其IL-10抑制活性的至少50％。优选地，结合片段或衍生物保持其IL-10抑制剂活性的至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。IL-10结合片段也可包含基本上不改变其生物学活性的保守性氨基酸置换。术语“单克隆抗体”，如此处所用的，是指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即构成所述群体的各个抗体除了可能可少量存在的天然发生的突变外是完全相同的。单克隆抗体是高度特异性的，是抗单一抗原表位的。相反地，常规(多克隆)抗体制剂通常包括多个抗(或对于......是特异性的)不同表位的抗体。修饰词“单克隆”表示从基本上均一的抗体群体获得的抗体的特征，但不能解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人，Nature256495(1975)等人描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利4,816,567)制备。也可使用例如Clackson等人，Nature352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。如此处所用的，术语“人源化抗体”是指包含来自非人(例如，鼠类)抗体和人抗体的序列的抗体形式。这些抗体是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。一般地，人源化抗体将包含至少一个，通常两个基本上完整的可变结构域，其中所有或基本上所有的对应于非人免疫球蛋白的高变环的高变环和所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的高变环和FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，通常为人免疫球蛋白的部分。可使用产生单克隆抗体的任何合适的方法。例如，可用IL-10或其片段免疫受体。可使用任何合适的免疫方法。这些方法可包括使用其他免疫刺激剂、重复的加强免疫和一种或多种免疫途径的使用。可将IL-10或VEGF的任何合适来源用作产生此处公开的组合物和方法的非人抗体的免疫原。这些形式包括，但不限于通过本领域内已知的重组、合成、化学或酶降解方法产生完整的蛋白、肽和表位。可使用足以产生具有生物学活性的抗体的抗原的任何形式产生抗体。因此，引发抗原可以是单一表位、多个表位或单独的整个蛋白或与本领域内已知的一种或多种免疫原性增强剂组合的蛋白。引发抗原可以是分离的全长蛋白、细胞表面蛋白(例如，使用所述抗原的至少部分转染的细胞进行免疫)或可溶性蛋白(例如，只使用蛋白的细胞外结构域部分进行免疫)。可在经遗传修饰的细胞中产生抗原。编码抗原的DNA可以是基因组或非基因组DNA(例如cDNA)且编码细胞外结构域的至少部分。如此处所用的，术语“部分”是指组成目的抗原的免疫原性表位的最小数目的氨基酸或核酸(根据适宜的情况)。可使用适合转化目的细胞的任何基因载体，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非病毒载体例如阳离子脂质。G.使用多克隆抗体纯化和表征分泌的MDA-71.亲和柱产生首先纯化来自兔血清的不同抗人MDA-7多克隆抗体。将冷冻的兔血清样品解冻，然后用无菌1XPBS缓冲液1∶1的稀释度稀释。将稀释的样品各自在4℃下暴露于水浴中过夜，然后轻微摇动加入至2mlProteinA-Sepharose(SIGMA)。产生4个不同的柱。用10倍体积的20mM磷酸氢二钠(61ml)洗涤树脂以产生pH7.0。用3倍柱体积的0.15MNaCl(pH3.0)以三等份洗脱柱子，然后用0.5MHEPES中和。使用Bradford蛋白测定法(BioRad)定量洗脱的抗体。然后通过在10,000MWCO透析盒中透析过夜将抗体交换入包含0.5MNaCl的0.1MNaHCO3(pH8.3)中。为了活化干的CNBr-Sepharose，用10-15倍柱体积的1mM冷HCl洗涤1克无水溴化氰葡聚糖。使用5ml的系列体积以确保除去蔗糖。然后通过1倍体积的系列洗涤用10倍体积洗涤活化的CNBr-Sepharose，从而将其交换入0.1MNaHCO3，pH8.3中。在各情况下，在纯化和缓冲液交换后回收大约80-90毫克的抗体。然后在温和的旋转条件下，将5ml溶胀活化的CNBr-Sepharose与80-90毫克在0.1MNaHCO3，pH8.3中配制的纯化的抗体一起在室温下温育4小时。通过Bradford蛋白测定法确定抗体结合效率，在各情况下大于95％的抗体结合至活化的CNBr-Sepharose。在偶联后，通过在0.1MTris，pH8.0中用25-30倍柱体积洗涤来封闭未反应的基团。然后通过0.1MTris，pH8.0，0.5MNaCl的系列洗涤，用5X柱体积的系列洗涤洗涤柱5次，交替用0.1M醋酸缓冲液，pH4.0，0.5MNaCl进行洗涤。对洗涤液进行蛋白估量，未检测到蛋白。2.亲和层析纯化获得分泌可溶性、糖基化的MDA-7的稳定转染的293T细胞并将其在RPMI中保持高度汇合，所述RPMI含有5％胎牛血清和1∶100L谷氨酰胺、1∶100青霉素/链霉素和1∶100HEPES。每2至3天对细胞进行分盘，交替地每7天保持在1∶1000稀释的潮霉素(20mg/ml母液)中。然后每2至3天收集400ml上清液，然后使用AMICON超滤杯(AMICONstirredcell)通过10,000分子量截断值的膜进行浓缩。在水浴方法中，在轻微摇动的条件下将50ml浓缩的上清液在4℃下暴露于5ml床体积的抗体-CNBr-sepharose(亲和树脂)中进行2天。然后将亲和树脂置于PharmaciaXK26柱中，将上清液通过3次以确保抗原对抗体的最大结合。通过重力作用流动用5×20ml0.1MTrispH8.0洗涤亲和树脂。用3×5ml1MNaCl，0.1M甘氨酸，pH3.0洗脱MDA-7，然后立即用0.5mlHEPES缓冲液中和。在洗脱和中和后立即加入2mg人血白蛋白以保护蛋白免受损失。然后通过10,000分子量截断值的旋转柱(spincolumn)(AMICON)浓缩所述洗脱的蛋白，然后将其交换入无菌1XPBS中。然后在室温下在旋转的条件下将1至1.5ml1XPBS交换的亲和纯化的蛋白暴露于200微升3x洗涤的Protein-ASepharose(SIGMA)中，进行2小时，或在旋转的条件下在4℃下过夜。A蛋白的暴露吸收渗漏入洗脱级分的抗体。在亲和纯化中检测4种不同的多克隆抗体(此处描述了所述抗体的产生)。在亲和纯化之前使用大小分辨纯化(参见大小排阻)除去大量污染蛋白，所述染染蛋白中最丰富的是牛血清白蛋白(BSA)。然而，以该方式分离的MDA-7的暴露未能允许柱上的抗体保留MDA-7。这可能是因为BSA封闭了在BSA不存在时可保留MDA-7的非特异性结合位点。MDA-7是高度糖基化的蛋白，因此认为其能够很容易地粘附至塑料或其他表面。从包含MDA-7的上清液中除去BSA抑制了通过亲和层析对MDA-7的纯化。大部分蛋白存在于流出液中。直至洗脱时无MDA-7蛋白保留在亲和柱上。包含显著量BSA(2-3mg/ml，通过银染)的亲和纯化物保持生物学功能的时间比其中BSA污染显著较少的纯化物更长。在BSA存在的情况下的亲和纯化产物允许MDA-7保留在亲和柱上直至用高摩尔NaCl和低pH洗脱。通过多克隆亲和树脂进行的亲和纯化导致具有相对相似量的MDA-7的多批纯化物。考马斯分析显示相对少量的污染蛋白。观察到超过大约20％均一度的MDA-7纯化。亲和纯化是可重复的且富集MDA-7至相对纯度(通过对12％的聚丙烯酰胺凝胶的考马斯染色分析测得)。根据Western印迹上检测到的条带的强度，抗原暴露于亲和树脂的时间越长，保留的MDA-7越多。当比较透析盒和离心柱时，交换入1XPBS的方法之间没有显著差异。3.阴离子交换纯化合并两到三批亲和纯化的MDA-7并将其在室温下交换入10,000MWCO透析盒中的50mMMES，pH5.0中2至12小时。然后将蛋白以1ml/分钟的流速加入5ml床体积的阴离子交换柱上。收集10ml的流出液并用不连续梯度的50mMMES，pH5.0中配制的1MNaCl洗脱结合的蛋白。洗脱程序始于以2ml/分钟的流速进行的10ml50mMMES，pH5.0的洗涤。第一步洗脱为在5分钟内从0M至0.25MNaCl和在50mMMES，0.25MNaCl，pH5.0下洗涤5分钟。第二梯度步骤为在5分钟内从0.25MNaCl至0.5MNaCl，然后进行5分钟洗涤。终洗脱从0.5MNaCl至1MNaCl。将MDA-7保留在柱上直至用0.9-1.0MNaCl洗脱；MDA-7被纯化至大约90％-95％的均一性。18KDa未糖基化的蛋白在pH5.0下不结合阴离子交换柱。对来自MDA-7的亲和阴离子交换后的级分的银染分析显示MDA-7的未糖基化形式不与共纯化的糖基化蛋白结合。天然的MDA-7复合物似乎包含至少三种分子量为21、28和27/26的蛋白。以前，尝试使用一步骤阴离子交换纯化法以纯化MDA-7，其中将包含MDA-7的上清液交换入50mMMES，pH6.0中。一步阴离子交换纯化证明来自阴离子交换柱的各个峰包含通过多克隆抗MDA-7在western印迹上检测到的MDA-7。通过该方法进行的纯化不能在任何范围的离子强度上显著地富集MDA-7，因为MDA-7在所有使用的NaCl摩尔浓度上从柱上渗出。4.大小排阻层析使用注入XK261米柱(Pharmacia)中的S200Sephadex(Pharmacia)产生200ml床体积大小的排阻层析柱。通过重力使柱子稳定平衡，然后用BioRadBioLogicWorkstation以3.5ml/分钟的速率填充柱子。为确定由293t细胞分泌的MDA-7的表观摩尔重量，组合蛋白分子量标准(小鼠IgG5mg、碱性磷酸酯酶3mg、BSA10mg和人β2微管蛋白3mg)确定相对保留时间。将纯化的蛋白的洗脱时间对分子量作图，然后推导出0.97的R2值。将包含MDA-7的200ml293t上清液通过AMICON超滤装置中的10,000MWCO过滤器浓缩至10ml，然后在1XPBS中以2ml/分钟装入大小分辨柱中。每5ml收集级分。通过连续样品的Western印迹分析，然后与从已知的标准产生的线比较来确定相对保留时间。将80-100kDa的表观分子量赋予结合的MDA-7。发现低于0.1％的总的存在的MDA-7以31kDa单体的形式存在。图15显示保留时间对分子量的比较。MDA-7复合物在大约85-95kDa的分子量之间洗脱。5.大小、阴离子和凝集素纯化尝试使用通过伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱的凝激素纯化来纯化MDA-7。然而，未获得相对纯度的净增加。使用组合纯化(其中将大小排阻、阴离子和凝集素纯化法全部组合使用)富集MDA-7。然而，这些方法的组合没有一个提供比通过亲和层析，然后进行阴离子层析获得的MDA-7的纯度更高。这些结果显示通过亲和层析和阴离子交换层析可将MDA-7纯化至至少90-95％的均一性。H.使用单克隆抗体纯化和表征分泌的MDA-71.抗体的产生指定为7G11F.2(单克隆抗体)的杂交瘤克隆经确定产生抗体，该抗体在通过对稳定转染的293t细胞(所述细胞已用布雷菲德菌素A处理)的细胞内FACS分析检测IL-24/mda-7阳性细胞中是最有效的。基于这些初步数据，将该克隆用于产生5升上清液。简而言之，以1×106个细胞/ml将细胞(7G11F.2)接种在50ml含有10％胎牛血清和1∶100L谷氨酰胺、1∶100青霉素/链霉素和1∶100HEPES的DMEM中。接种细胞并培养10天，然后收集上清液。2.抗体的纯化通过以2000rpm离心10分钟沉淀细胞以使上清液澄清，然后轻轻倒出上清液。然后将澄清的上清液通过0.22醋酸纤维素薄膜过滤器进行无菌过滤，之后通过YMCO30kDa膜在氮气氛下用Amicon超滤装置浓缩至50ml。将浓缩的上清液在4℃下暴露于交联至sepharose的重组G蛋白，(Sigma)。用3倍柱体积的1MNaClpH3.0以3等分洗脱抗体，然后用0.5MHEPES中和。为除去污染的牛IgG，将所得的洗脱物通过透析盒(Pierce/Endogen，YMCO30kDa)交换入包含0.4MNaCl(总的)的1XPBS中。将蛋白在4℃下暴露于交联至sepharose的重组A蛋白(Sigma)。收集从柱流过的流出物，因为A蛋白以比小鼠IgGla更高的亲和力结合牛IgG。通过SDSPAGE上的分析确定相对纯度，相对纯度达到90％的纯度，对于(7G11F.2)，污染蛋白主要由牛IgG组成。使用Bradford蛋白测定法(BioRad)定量洗脱的抗体。然后通过在10,000MWCO透析盒中透析过夜来将抗体交换入含有0.5MNaCl的0.1MNaHCO3，pH8.3中。3.亲和柱的产生为激活干的CNBr-Sepharose，用10-15柱体积的1mM冷HCl洗涤1克CNBr-Sepharose。使用系列5ml的体积以确保除去蔗糖。然后通过系列1倍柱体积的洗涤用10倍柱体积洗涤活化的CNBr-Sepharose从而交换入0.1MNaHCO3，pH8.3中。在纯化和缓冲液交换后回收25mg抗体(7G11F.2)。在轻微旋转的条件下，将2ml溶胀活化的CNBr-Sepharose在室温下与纯化的抗体在0.1MNaHCO3，pH8.3中温育4小时。通过Bradford蛋白测定法确定抗体结合效率；大于95％的抗体结合至活化的CNBr-Sepharose。在偶联后，用25-30倍柱体积的0.1MTrispH8.0洗涤封闭未反应基团。最后用5X柱体积的0.1MTrispH8.0，0.5MNaCl的系列洗涤洗涤柱5次，其间交替用0.1M醋酸缓冲液，pH4.0，0.5MNaCl进行洗涤。对洗液进行蛋白质评估，未检测到蛋白质。4.亲和纯化分泌可溶性、糖基化IL-24的稳定转染的293t细胞获自Introgen，Inc，且将所述细胞以高汇合度保持在包含10％胎牛血清和1∶100L谷氨酰胺、1∶100青霉素/链霉素和1∶100HEPES的RPMI中。每2-3天分离细胞，其间交替地每7天将细胞保持在1∶1000稀释的潮霉素(20mg/ml母液)中。每2-3天收集400ml的上清液并使用Amicon超滤装置将其通过10,000分子量截断值的膜进行浓缩。在分批法(batchmethod)中，在轻微摇动的条件下，将50ml浓缩的上清液在4℃下暴露于5ml床体积的抗体-CNBr-Sepharose(亲和树脂)。将所述亲和树脂置于PharmaciaXK26柱中，使上清液通过3次以确保抗原对抗体的最大结合。用5×20ml0.1MTrispH8.0通过重力作用流出洗脱IL-24，然后立即用0.5mlHEPES缓冲液中和。在洗脱和中和后立即加入2mg人血清白蛋白以保护蛋白免受蛋白损失。然后通过10,000分子量截断值的离心柱(Amicon)浓缩洗脱的蛋白，然后将其交换入无菌1XPBS中。在旋转的条件下，将1-1.5ml1XPBS交换亲和纯化的蛋白在室温下暴露于200微升3x洗涤的重组A蛋白-Sepharose(Sigma)中进行2小时，或在4℃下在旋转的条件下过夜。A蛋白暴露吸附渗入洗脱液中的抗体且其去除对于保持IL-24功能是至关重要的。IL-24/mda-7在7G11F.2单克隆抗体柱上保留量与先前部分的多克隆抗体柱的保留量相似。下面的一般技术也是熟知的且可用于实施纯化方法。a.凝胶电泳凝胶电泳是可用于纯化方法的熟知技术。可将使用标准方法(Sambrook等人，2001)进行的琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝胶电泳用于纯化方法。b.层析技术可选择地，可使用层析技术进行MDA-7的分离和纯化。存在许多种可用于本发明的层析法吸附、亲和、分配、离子交换和分子筛，和许多使用其的专门技术，包括柱层析、纸层析、薄层层析和气相层析术(Freifelder，1982)。c.免疫试剂本发明的某些方面包括使用免疫试剂。在本发明的某些实施方案中，将免疫试剂用于MDA-7制剂的纯化。可将抗体与纯化方法一起使用。这些抗体可容易地产生和/或容易地获得。如此处所用的，术语“抗体”广义地是指任何免疫结合剂例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般地，IgG和/或IgM是优选的，因为其在生理状况下是最常见的抗体且因为其在实验室条件下最容易制备。术语“抗体”用于表示具有抗原结合区的任何抗体样分子，且其包括抗体片段例如Fab′、Fab、F(ab′)2、单结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)等。用于制备和使用基于各种抗体的结构和片段的技术在本领域内是熟知的。用于制备和表征抗体的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988；以参考引用方式并入本文)。认识到单克隆抗体(MAb)具有某些有利方面，例如，重现性和大规模生产性，因而其用途通常是优选的。因此本发明提供了人、鼠类、猴子、大鼠、仓鼠、兔子和甚至鸡来源的单克隆抗体。由于试剂的容易制备和容易获得的原因，鼠类单克隆抗体通常是优选的。然而，也考虑“人源化”抗体，以及来自小鼠、大鼠或其他物种、具有人恒定和/或可变区结构域的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和基因工程产生的抗体和其片段。用于产生针对患者的牙疾病而“客户定制的”抗体的方法也是已知的且也考虑这些客户定制的抗体。用于产生单克隆抗(MAb)的方法对于本领域技术人员来说也是熟知的。I.NSAID和COX-2抑制剂NSAID是非甾体抗炎药。除了抗炎作用外，其具有止痛、退热和血小板抑制作用。其主要用于治疗慢性关节炎症状和某些与疼痛和炎症相关的软组织病症。其可通过抑制环氧合酶从而阻断前列腺素的合成来起作用，所述环氧合酶将花生四烯酸转化成环式内氧化物，即前列腺素的前体。本发明考虑使用这些选择性抑制酶COX-2的NSAIDS。NSAID在结肠肿瘤细胞系和动物组织中诱导细胞凋亡，且表现在肿瘤中抑制Ki-ras的激活；然而，仍未查明Ki-ras的激活为NSAID介导的细胞毒性的机制。该细胞毒性是否依赖于NSAID的抗炎特性也还不清楚。也抑制Ki-ras激活的NSAID舒林酸被代谢成两种不同的分子，所述分子的差异在于其抑制COX的能力不同，但两者都能够通过诱导细胞凋亡产生化学预防性效应。然而，舒林酸砜缺少COX抑制活性，且其最可能以不依赖于前列腺素合成的方式促进诱导细胞凋亡。此外，本发明涉及COX-2选择性抑制剂，所述抑制剂是指特异性地和直接抑制环氧合酶的化合物或试剂。COX-2选择性抑制剂包括塞来考昔(CELEBREXTM)、罗非考昔(VIOXXTM)、伐地考昔(BEXTRATM)、lumiracoxib(PREXIGETM)或艾托考昔(ARCOXIATM)。因为其对心血管系统的作用和认识的增加的心血管疾病风险，塞来考昔和罗非考昔的商业形式最近已退出市场。PREXIGE和ARCOXIA仍未获得FDA批准在美国使用，尽管其在其他国家获得批准。1.塞来考昔在某些实施方案中，本发明涉及COX-2抑制剂塞来考昔。由Searle以商品名CELEBREXTM销售的塞来考昔的化学名称4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺。经验式为C17H14F3N3O2S，分子量为381.38。CELEBREXTM以100或200mg的口服胶囊进行销售。塞来考昔在动物模型中展现抗炎、止痛和解热活性。作用机制据认为是抑制前列腺素合成的结果。酶环氧合酶-2(或“COX-2”)是该途径中重要的酶。COX-2的选择性抑制(相关酶COX-1不被抑制)是塞来考昔的特征，且据认为该选择性抑制减少了潜在的与COX-1的抑制相关的胃肠细胞毒性。a.药物动力学在口服给药后大约3小时达到塞来考昔的血浆峰值水平。当与高脂肪餐一起服用时，血浆水平延迟大约1至2小时，总吸收量增加10-20％。包含铝或镁的抗酸剂导致血浆浓度的减少。塞来考昔在临床剂量范围内高度结合蛋白，体外研究表明白蛋白和α1-酸性糖蛋白是主要的结合蛋白。细胞色素P4502C9是塞来考昔的主要代谢酶。三种主要的代谢产物是醇、对应的羧酸和其葡萄糖醛酸苷缀合物；这些代谢物不具有COX-1和COX-2抑制剂的活性。在服用单剂后，57％的剂量随粪便排泄，27％随尿液排出。在禁食的条件下有效半衰期是大约11小时。b.患者群体老年患者具有最高的血清浓度，且老年男性比老年女性具有更高的浓度。对于体重小于50kg的老年患者，开始时应当使用更低的剂量。黑人显示具有比高加索人更高的血清浓度。肝功能不全增加血清浓度，而肾功能不全减少浓度。c.药物相互作用关于抑制细胞色素P4502C9的药物的应用应当询问患者。特定的潜在药物相互作用包括氟康唑和锂以及可能地呋塞米和ACE抑制剂的相互作用。d.副作用和禁忌症NSAID的副作用通常包括胃十二指肠刺激和胃肠刺激。然而，塞来考昔比其他NSAID显示低得多的这些效应。其他可能的副作用包括类过敏性反应，尽管还未报道过塞来考昔的该副作用。也应当避免给患有晚期肾脏病的患者和孕妇施用所述药物。e.NSAID的组合也可将多种COX-2抑制剂的组合用于本发明。例如，通过使用更低剂量的多种COX-2抑制剂和MDA-7，可能减少与更高剂量的单种化合物相关的副作用或毒性。特别地对于本发明概述的目的，可以该方式将塞来考昔和其他COX-2抑制剂一起使用。2.VIOXXTM在某些实施方案中，本发明涉及COX-2抑制剂罗非考昔。由Merck以商品名VIOXXTM销售的罗非考昔的化学名称为4-[4-(甲磺酰)苯基]-3-苯基-2-(5H)呋喃酮。经验式为C17H14O4S，分子量为314.36。VIOXXTM以12.5、25或50mg口服胶囊的形式或作为浓度为12.5或5mg/5ml的口服悬浮剂销售。塞来考昔在动物模型中展示抗炎、止痛和解热活性。作用机制据认为是通过选择性抑制COX-2(而非COX-1)来抑制前列腺素的合成的结果。a.药物动力学在口服给药后2-3小时罗非考昔达到血浆峰值水平。食物不影响血浆水平，除了在脂肪餐后峰值水平延迟1-2小时。其主要通过胞质酶还原代谢。b.药物相互作用特定的潜在药物相互作用包括利福平、茶碱和华法林。c.副作用和禁忌症在患者中观察到判定(adjudicated)为严重心血管血栓症的高发病率。3.伐地考昔在某些实施方案中，本发明涉及COX-2的抑制剂伐地考昔。由Pfizer以商品名BEXTRA销售的伐地考昔的化学名称为4-(5-甲基-3-苯基-4-异噁唑基)苯磺酰胺。经验式为C16H14N2O3S，分子量为314.36。BEXTRA以10或20mg的口服胶囊销售。塞来考昔具有抗炎、止痛和解热活性。据认为其以血浆中发现的量选择性地抑制COX-2，但不抑制COX-1。a.药物动力学在大约3小时后可获得伐地考昔的血浆峰值水平。食物不会造成显著的影响，但当食用高脂肪餐时，血浆水平延迟大约1-2小时。伐地考昔由P450同功酶3A4和2C9以及非-P450酶通过葡萄苷酸化代谢。抑制3A4和/或2C9的药物，例如氟康唑和酮康唑可增加血浆浓度。b.患者群体差异未鉴定或未研究。c.药物相互作用关于抑制细胞色素P4502C9和3A4的药物的应用应当询问患者。特定的潜在药物相互作用包括氟康唑和酮康唑。此外，人血浆中存在伐地考昔的活性代谢产物，其浓度为伐地考昔浓度的大约10％。d.副作用和禁忌症已证明严重的皮肤反应。也已观察到胃肠毒性。J.Hsp90抑制剂本发明涉及Hsp90抑制剂，其是指直接结合Hsp90且具有抗肿瘤活性的化合物。Hsp90是对于多种突变的和超表达的信号蛋白(所述蛋白促进肿瘤细胞的生长和/或存活)的折叠、装配和活性至关重要的分子伴侣。Hsp90保护之蛋白(Hsp90clientprotein)包括突变的p53、Raf-1、Akt、ErbB2和缺氧诱导型因子1α(HIF-1)(Neckers，2002)。在某些实施方案中，所述化合物是天然和合成的小分子，例如苯醌安沙霉素类和其类似物。在特定的实施方案中，Hsp90抑制剂是格尔德霉素和其类似物和衍生物。格尔德霉素(GA)是由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)产生的苯醌安沙霉素抗生素。已显示其具有抗肿瘤特性，该特性据认为是由其特异性结合热激蛋白Hsp90从而导致其保护之蛋白的脱稳定化和降解的能力产生的(Whitesell等人，1994；Neckers等人，1999)。临床试验中的GA类似物是17-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17AAG)，其是毒性较低且更稳定的格尔德霉素的类似物(GA)(Schulte等人，1998)。尽管17AAG对Hsp90的结合比GA弱，但17AAG与GA相比展示相似的抗肿瘤效应且具有更好的毒性特征。来自I期临床试验的信息证明17AAG具有在低于最大耐受剂量的浓度上获得的抗肿瘤活性(Agnew等人，2001)。本发明包括GA的靶向形式。例如，赫赛汀，第一个批准用于实体瘤治疗的mAb，靶向Her2且被选择用于将GA靶向超表达Her2的肿瘤。NCI已报道与单独的赫赛汀相比，这些缀合物递送了更有效的选择性细胞毒性影响。为制备这些缀合物，修饰GA以引入潜在的伯胺(Mandler等人，2002)。在去保护后，该伯胺提供了引入使得能够连接至蛋白的马来酰亚胺基的位点(Mandler等人，2004)。称为InvivoGen的公司已产生了格尔德霉素的衍生物17-(3-(4-马来酰亚胺基butyrcarboxamido)丙基-氨基)格尔德霉素(GMB-APA-GA)，可容易地将其与赫赛汀或其他mAb缀合。如在本申请中其它实施方案背景中所描述的，可将其他抗体用于本发明。格尔德霉素类似物和衍生物包括，但不限于，17AAG、NSC255110、NSC682300、NSC683661、NSC683663、17DMAG、15-羟基格尔德霉素、三环格尔德霉素类似物(KOSN-1633)、甲基-geldanamycinate、17-甲酰基-17-去甲氧基-18-O，-21-O-二羟基格尔德霉素和17-羟甲基-17-去甲氧基格尔德霉素。参见Patel等人(2004)；Smith等人(2004)；Tian等人(2004)；Hu等人(2004)；LeBrazadec等人(2004)，其以参考引用方式并入本文。在某些实施方案中，以作为使用硼替佐米的治疗方案的部分的形式提供GA或GA的衍生物或类似物，所述硼替佐米是26S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性的可逆抑制剂。剂量可以是大约，至少大约，或至多大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7.3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0mg/m2(对于肿瘤大小)或mg/天、或其间可衍生的任何范围。在特定的实施方案中，经静脉内途径提供硼替佐米。在某些实施方案中，患者将在28天的周期的第1、8和15天以300mg/m2的剂量通过静脉内输注接受GA或类似物或衍生物。如果需要，可进行多个治疗周期。K.维生素E化合物术语“维生素E”是指8个相关的、脂溶性的、抗氧化的化合物(alpha(α)-生育酚、beta(β)-生育酚、gamma(γ)-生育酚、delta(δ)-生育酚、α-生育三烯酸、β-生育三烯酸、γ-生育三烯酸和δ-生育三烯酸)的家族。生育酚和生育三烯酸亚家族各自由具有独立的生物学效应的α、β、γ和δ同效维生素组成。生育酚与生育三烯酸的差异在于其具有饱和的植基侧链而不是不饱和异戊烯侧链。α-生育酚是唯一的在人体中保持活性的维生素E形式，从而是血液和组织中发现的最丰富的维生素E形式(Traber，1999)。α-生育酚在人中的主要功能似乎是其用作抗氧化剂的能力(参见国际互联网lpi.oregonstate.edu/infocenter/vitamins/vitaminE)。可获得维生素E的合成形式(由12.5％真正的(authentic)RRR-α-生育酚和87.5％立体异构体组成的化学混合物；即，在生产过程中产生的7种分子，所述分子具有相同数目和类型的在RRR-α-生育酚中发现的以相同次序连接但其空间排列不同的原子)(参见“DietaryReferenceIntakesforVitaminC，VitaminE，Selenium，andCarotenoids，”2000，和Kline等人，2003)。因此，天然的真正的维生素E(称为RRR-α-生育酚或d-α-生育酚)和合成的维生素E(称为all-rac[emic]-α-生育酚或d1-α-生育酚)不是化学等同物。可以醋酸酯或琥珀酸酯衍生物的形式购买真正的RRR-α-生育酚和合成的维生素E。进行对RRR-α-生育酚的色满头的这些修饰以保护C-6位置上的羟基部分在暴露于空气时免受氧化，且为恢复抗氧化潜能必须除去所述修饰(Kline等人，2003)。已鉴定了称为α-TEA的RRR-α-生育酚的非水解醚类似物(Lawson等人，2003)。特别地，α-TEA可作为维生素E类似物用于本发明的方法和组合物。Birringer等人的论文描述了维生素E的类似物，且此处引用作为参考(Birringer等人，2003)。通常可以α-生育酚醋酸酯或α生育酚琥珀酸酯的形式产生和制备获得维生素E化合物。这些形式通过在肠中除去醋酸或琥珀酸部分在体内转变成α-生育酚之前都不具有任何抗氧化剂的活性。酯化形式比未酯化形式的抗氧化性更强且在存储时间和温度范围内比未酯化形式更加稳定得多。琥珀酸酯形式的激活比醋酸酯形式慢，但琥珀酸酯形式表现出对于其他形式来说不可获得的组织的可接近性和有益方面。维生素E在体内具有多种机制。其破坏自由基(抗氧化剂功能)、稳定膜、抑制前列腺素的合成和阻止血小板凝集、在一些癌细胞中诱导细胞分化且抑制一些肿瘤细胞的生长(鼠类神经母细胞瘤、大鼠神经胶质瘤和人前列腺)。其抗癌能力可能与其抑制前列腺合成的能力相关，因为过量的前列腺素可抑制免疫系统(参见国际互联网网站springboard4health.com/notebook/v-e.html)。几项研究已描述了RRR-α-生育酚琥珀酸酯(维生素E琥珀酸酯；VES)、RRR-α-生育酚的可水解酯衍生物的有效的抗肿瘤活性。Prasad和Edwards-Prasad第一个描述了维生素E琥珀酸酯(而不是维生素E的其他形式)诱导小鼠黑素瘤B-16细胞的形态学改变和生长抑制的能力并提出维生素E琥珀酸酯可以是有用的肿瘤治疗剂(Prasad等人，1982)。其他研究已证明维生素E琥珀酸酯在体外是多种上皮癌细胞类型包括乳腺、前列腺、肺和结肠癌细胞以及造血淋巴细胞性白细胞和淋巴瘤细胞的有效生长抑制剂(Fariss等人，1994；Kline等人，1998；Kline等人，2001；Neuzil等人，2000；Prasad等人，1992；Schwartz等人，1992)。近年来的研究已证明当其腹膜内(i.p.)施用时，维生素E琥珀酸酯在动物异种移植物和同种异体移植物模型中具有抗肿瘤活性(Malafa等人，2000；Malafa等人，2002；Neuzil等人，2001；Weber等人，2002)，表明可能的治疗潜能。已显示腹膜内或口服(p.o.)给药的维生素E琥珀酸酯具有对致癌物[苯并(a)芘]在小鼠中诱导的贲门窦致癌作用的抑制作用，从而表明作为抗癌剂的潜能(Wu等人，2001)。研究已证明维生素E琥珀酸酯通过DNA合成阻断、诱导细胞分化和诱导细胞凋亡来诱导浓度和时间依赖性肿瘤细胞生长的抑制(Kline等人，1998；Kline等人，2001；Neuzil等人，2001；You等人，2001；You等人，2002；Yu等人，2001)。维生素E琥珀酸酯值得关注不仅是因为其诱导对肿瘤细胞的生长抑制效应而且还因为其不具有对正常细胞和组织的毒性(Fariss等人，1994；Kline等人，1998；Kline等人，2001；Neuzil等人，2000；Prasad等人，1992；Schwartz等人，1992；Weber等人，2002)。不可水解的维生素E琥珀酸酯衍生物的应用已显示其是完整的化合物而不是其分解产物的任一产物(即，RRR-α-生育酚或琥珀酸)，所述不可水解的维生素E琥珀酸酯衍生物负责抗增殖效应(Fariss等人，1994)。因此，该维生素E衍生物的抗增殖作用被认为是归因于非抗氧化剂性质。RRR-α-生育酚琥珀酸酯(VES)是已通过酯键进行结构修饰从而在色满头部的6位置包含替代羟基部分的琥珀酰部分的RRR-α-生育酚的衍生物。该酯连接的RRR-α-生育酚的琥珀酸部分是影响引发细胞凋亡和抑制DNA合成的最有效的维生素E形式。该维生素E形式诱导肿瘤细胞进行细胞凋亡，同时对正常细胞无凋亡诱导作用。维生素E的琥珀酸化形式以完整的试剂形式作为抗癌剂是有效的；然而，可断裂琥珀酸部分从而将RRR-α-生育酚的琥珀酸酯形式转变成游离RRR-α-生育酚的细胞和组织酯酶使得该化合物失去抗癌功效。RRR-α-生育酚在上皮或免疫来源的细胞中既不表现抗增殖活性也不表现促凋亡生物学活性。维生素E通常发现于植物中且在种子中更丰富，来自其中的生育酚，以其天然状态，在人和动物(野生和驯养的)中更容易被吸收和利用。参见美国专利5,179,122，其以参考引用方式并入本文。通过工业化方式对食物和饲料进行加工以便长期贮存促进了维生素E组分的加速降解。为弥补天然或合成的维生素E的损失，通过注射或口服施用天然或合成的维生素E的营养补品。众所周知，生育酚是不稳定的分子。为提高生育酚的稳定性，制造方法通常将醋酸或琥珀酸基团附着至生育酚，产生维生素E醋酸酯或琥珀酸酯(d-或d1-α-生育酚醋酸酯或琥珀酸酯)。众所周知，可通过正常和衰弱的肠对亲水性维生素E的增加的吸收来表现水性维生素E水溶液和分散体的亲水性质对肠吸收维生素E的影响。天然或合成的维生素E的来源也影响其生物利用度在本领域是已知的。在衰弱的消化道中，在患有脂质吸收障碍综合征例如肝脏胆汁郁积和囊性纤维化的患者中对维生素E的吸收进行了研究。这些患者不能够吸收维生素E或其他饮食脂质。当给这些患者口服施用维生素E的水溶液性形式(d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯或“TPGS”)时，在一周内检测到血液生育酚的提高。当用植物油中的生育酚给相同的患者剂量给药时，血液中没有显著的生育酚的增加(Traber等人，1988)。因此，天然的或合成的生育酚的类型以及TPGS的亲水性质在确定人和动物中维生素E的吸收和生物利用度中可以是非常重要的。Bateman等人(1984)在人临床研究中显示了以水可分散性制剂的形式施用维生素E的有利方面，在所述研究中，将维生素A、E和B2配制入液体媒介物(AquaBiosorb)中，然后封装入口服施用的软胶胶囊中。在该制剂中，以＜＝100nm的颗粒直径的悬浮剂的形式将B2以整合入制剂中。所述软弹性胶胶囊包含按重量百分比计算20％的聚山梨醇酯80、1％去水山梨糖醇单油酸酯和79％作为水分散基质的蒸馏甘油一酯。Bateman证明在他的剂型中除了脂溶性维生素A和E外，水溶性维生素B2的亲水性质显示了增强的吸收。维生素E的这些形式中的任何形式预期可用作本发明的部分。维生素E缀合物包括，但不限于，维生素E吡咯烷羧酸(焦谷氨酸)缀合物，包括维生素E琥珀酸(VESA)焦谷氨酸缀合物、维生素E琥珀酸(VESA)聚乙二醇胺焦谷氨酸缀合物；维生素E吡咯烷酮缀合物包括维生素E琥珀酸(VESA)吡咯烷酮缀合物；维生素E龙胆酸缀合物类，包括维生素E龙胆酸缀合物。美国专利6,858,227，其以参考引用方式并入本文。L.血管内皮生长因子抑制剂血管内皮生长因子(VEGF)是对于血管内皮细胞高度特异性的促有丝分裂剂。作为来自单个VEGF基因的选择剪接的结果产生5种VEGF亚型。这些亚型的差异在于其分子量和生物学特性例如其结合细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖的能力。响应缺氧，激活的癌基因和多种细胞因子增强VEGF的表达。VEGF诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移和抑制细胞凋亡。体内VEGF诱导血管发生和血管的透化作用，且在血管发生的调控中起着中心作用。下调的VEGF表达通过促进肿瘤血管发生来促进实体瘤的进展和促成了几种其他疾病的病因学，所述其他疾病的特征在于异常血管发生。因此，VEGF信号转导的抑制消除了许多肿瘤的发展。VEGF抑制剂是任何分子，例如DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白、多核苷酸、肽或小分子，与所述分子不存在的情况下的VEGF的活性相比，所述分子阻断或减少VEGF活性。可使用本领域技术人员已知的任何测定法评估VEGF的活性和确定在分子存在或不存在的情况下VEGF的活性。在本说明书的其他部分详细描述VEGF抑制剂的实例。VEGF抑制剂的剂量可以是本领域技术人员已知的任何剂量。例如，如果VEGF抑制剂是贝伐单抗，那么通过静脉内输注的剂量可以在大约0.1至大约10mg/kg或更多。可根据副作用和临床指标例如对治疗的反应来确定特定的剂量。在发生胃肠产孔、需要医疗干预的伤口裂开、严重出血、肾病综合征或高血压危象的患者中应当永久性停用贝伐单抗。M.IL-10抑制剂干扰素10(IL-10)是近年来描述的在鼠类和人生物体中鉴定的天然内源免疫抑制细胞因子。鼠类干扰素10(mIL-10)最初被描述为从T辅助T细胞克隆释放的细胞因子合成抑制因子，但其也具有对多种淋巴细胞亚型的增殖效应，包括对CD4-，8+鼠类脾T细胞的克隆效率的促进作用。最近已对人干扰素10(hIL-10)进行了测序并显示该干扰素在DNA序列水平以及氨基酸水平上具有与mIL10的高度同源性。此外，最近已对猪干扰素10进行了测序并显示其在DNA序列水平以及氨基酸水平上具有与hIL-10的高度同源性。同样，hIL-10具有与Epstein-Barr病毒基因组中的可读框BCRF1的高度同源性，且病毒IL-10确实显示一些与hIL-10相似的活性。人IL-10由活化T细胞克隆和永生化B细胞产生，除了其细胞因子合成抑制因子(CSIF)活性、抑制几种促炎细胞因子和集落刺激因子的产生外，其也诱导单核细胞产生天然白介素1受体拮抗剂蛋白/肽(IRAP)，从而间接抑制IL-1活性。IL-10也下调其自身由单核细胞的产生并抑制II类MHC表达。IL-10抑制剂是任何分子，例如DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白、多核苷酸、肽或小分子，与所述分子不存在的情况下的IL-10的活性相比，所述分子阻断或减小IL-10的活性。在本说明书的其他部分已提供了关于特定的IL-10抑制剂的信息。可使用本领域技术人员已知的任何测定法评估IL-10的活性和确定分子存在和不存在的情况下IL-10的活性。IL-10抑制剂的剂量可以是本领域技术人员已知的任何剂量。例如，通过静脉内输注的剂量可以是大约0.1至大约10mg/kg或更多。可根据副作用和临床指标例如对治疗的反应来特别地制定剂量。N.TNFTNF是所有刺激急性期反应的其他细胞因子组群的成员。在该家族中存在不同的成员例如TNF-α和TNF-β。TNF-α是从噬菌体表面上的212个氨基酸长的前肽切割而来的185个氨基酸的糖蛋白肽激素。一些细胞分泌更短或更长的亚型。TNFα由损伤过程例如由感染造成的损伤过程中的白细胞、内皮组织和几种其他组织释放。其释放受几种其他介质例如白介素1和细菌内毒素刺激。其通常与白介素1和6一起具有许多对各种器官系统的作用。TNF的剂量可以是本领域技术人员已知的任何剂量。例如，通过静脉内输注的剂量可以是大约0.1至大约10mg/kg或更高。可根据副作用和临床指标例如对治疗的反应来特别地制定剂量。O.泰索帝多西他奇(由Aventis制造的泰索帝)是抗瘤化疗剂。经显示泰索帝用于在之前的化疗失败后治疗具有局部晚期或转移性乳腺癌的患者。泰素帝的剂量可以是本领域技术人员已知的任何剂量。例如，所述剂量可以是从大约1mg/m2至大约1,500mg/m2或更多。P.药物制剂和递送在本发明的某些实施方案中，涉及包括递送编码MDA-7蛋白的表达构建体的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及编码免疫原的表达构建体的递送。可选择地，所述表达构建体包含编码MDA-7多肽和免疫原的序列。涉及免疫反应的疾病和状况的实例包括使用疫苗进行预防或治疗的疾病。包括肺癌、头与颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺中的瘤前病灶、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌和可通过施用MDA-7多蛋白以增强诱导的免疫反应来治疗的与免疫反应相关的任何其他疾病或状况。1.有效量药物组合物的“有效量”通常定义为足以可检测地和重复地获得所述的想要的结果，例如改善、减轻、减小或限制疾病或其症状的程度的量。可使用更严格的定义，包括疾病的消除、根除或治愈。2.施用在某些特定的实施方案中，使用本发明的方法和组合物杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、减少肿瘤或组织大小以及逆转或减小肿瘤细胞的恶性表型、诱导免疫反应或抑制血管发生是想要的。施用的途径将自然地随病灶的位置和性质或被靶向的位置变化而变化，其包括例如真皮内、皮下、局域、胃肠外、静脉内、肌内、鼻内、全身性或口服施用和配制。直接注射、瘤内注射或注射入肿瘤血管特别适用于分散的、实体的、可接近的肿瘤或其他可接近的靶区域。局部、局域或全身性施用也可以合适的。对于＞4cm的肿瘤，施用的体积为大约4-10ml(优选地10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，使用大约1-3ml的体积(优选地3ml)。以单剂量递送的多次注射包含大约0.1至大约0.5ml的体积。通过以大约1cm间距间隔对肿瘤或被向的位点施用多次注射有利于接触病毒颗粒。在手术干预的情况下，可在手术前使用本发明以使不能做手术的肿瘤能够接受切除。可选择地，可在手术时和/或之前使用本发明以治疗残留或转移性疾病。例如，可用包含MDA-7或编码MDA-7-的构建体的组合物与免疫原性分子一起或在免疫原分子不存在的情况下注射或输注切除产生的瘤床。可在切除后通过例如在手术的位置植入导管继续进行输注。也设计周期性的术后疗法。也涉及表达构建体或病毒构建体的连续输注。可通过想要的吸收量来确定连续输注中递送的构建体和肽的量。也可在合适时应用连续施用，例如，肿瘤或其他不想要的受影响的区域被切除，对瘤床或被靶向的位置进行治疗以消除残留、微小的疾病。有时通过注射或使用导管进行递送。这些连续输注可在治疗开始后进行从大约1-2小时至大约2-6小时、至大约6-12小时、至大约12-24小时、至大约1-2天、至大约1-2周或更长时期。一般地，通过连续输注的治疗组合物的剂量等于通过单次或多次注射提供的量，所述剂量在进行输注的时段内可进行调整。治疗方案也可变化，且通常依赖于肿瘤类型、肿瘤部位、免疫状况、靶位置、疾病进展和患者的健康状况和年龄。很明显，某些类型的肿瘤需要更激进的治疗，而同时某些患者不能忍受更繁重的方案。临床医生最适合于基于治疗制剂的已知功效和毒性(如果有)作出这些判断。在某些实施方案中，接受治疗的肿瘤或影响的区域可以是(至少开始时可以是)不能切除的。使用治疗性病毒构建体的治疗可增加肿瘤的可切除性，这归因于边缘处的皱缩或某些特定侵袭性部分的消除。在进行治疗后，可能可以进行切除术。术后的其他治疗法将用于消除肿瘤或被靶向的位置上的微小残留疾病。对于原发性肿瘤或术后瘤床，一般的疗程包括多剂给药。一般的原发性肿瘤治疗包括在两周的时间内施用6剂药物。可重复该两周方案1、2、3、4、5、6或更多次。在疗程中，可重新评估对完成计划的剂量给药的需要。所述治疗可包括多种“单位剂量”。单位剂量定义为包含预先确定的量的治疗性组合物。被施用的量和特定途径以及制剂在临床领域内的技术人员的能力范围之内。单位剂量不一定以单次注射施用，相反其可包括在一段时间内的连续输注。本发明的单位剂量可以根据病毒构建体的噬斑形成单位(pfu)方便地进行描述。单位剂量范围为103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu或病毒颗粒(vp)和更高的范围。或者，指定的量可为作为平均每日、平均每周或平均每月剂量施用的量。可以大约或至少大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0.9.0、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或更多ng/ml，或其间可衍生的任何范围内的剂量对患者施用蛋白。可选择地，此处指定的任何量可以是以平均每日、平均每周或平均每月剂量施用的量。可以大约或至少大约0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000mg或更多，或其间可衍生的任何范围内的剂量对患者施用COX-2抑制剂。可选择地，指定的量可以是以平均每日、平均每周或平均每月剂量施用的量，或其可以以mg/kg表示，其中kg是指患者的体重，上面已对mg进行了说明。在其他实施方案中，指定的量是上述任何数量，但表示为mg/m2(对于肿瘤的大小或患者表面)。GA或其类似物和衍生物的浓度可为大约，至少大约或至多大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多mg或mg/m2(对于肿瘤大小或患者表面积)或其间可衍生的任何范围的剂量。可选择地，指定的量可以是以平均每日、平均每周或平均每月剂量施用的量，或其以mg/kg表示，其中kg是指患者的体重，而上面已对mg进行了说明。维生素E化合物或其类似物的浓度可以为大约，至少大约或至多大约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多mg、μg/ml、mg/kg(对于患者体重)或mg/m2(对于肿瘤大小或患者表面积)或其间可衍生的任何范围内的剂量。可选择地，维生素E化合物或类似物的量可用I.U.(国际单位)来表示。在某些实施方案中，维生素E化合物的量是大约，至少大约，或至多大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000或更多I.U或其间可衍生的任何范围。3.可注射的组合物和制剂在一些实施方案中，用于递送免疫原性分子、编码MDA-7蛋白的表达构建体、MDA-7蛋白和/或免疫原的方法是通过全身性施用递送。然而，此处公开的药物组合物可选择地可通过如美国专利5,543,158、美国专利5,641,515和美国专利5,399,363(各自明确地以其全文以参考引用方式并入本文)中描述的胃肠外、皮下、直接、气管内、静脉内、皮内、肌内或甚至腹膜内途径施用。可通过注射器或用于注射溶液的任何其他方法注射递送核酸，只要表达构建体能够通过注射所需的特定针头规格。最近描述了新的无针注射系统(美国专利5,846,233)，该系统具有界定了用于装载溶液的安瓿小室的喷嘴和用于将溶液推挤出安瓿小室至递送位置的能量装置。也描述了用于基因疗法的注射系统，该注射系统允许以任何深度精确地多次注射预先确定的量的溶液(美国专利5,846,225)。可在水中适当地与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合来制备作为游离碱的活性物质或药物可接受盐的溶液。也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物以及油中制备分散体。在普通的贮藏和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适合用于注射用途的药物剂型包括无菌水溶液或分散体和用于无菌注射溶液或分散体的临时配制的无菌粉剂(美国专利5,466,468，此处明确地以其全文以参考引用方式并入本文)。在所有情况下，剂型必须是无菌的且必须是达到容易注射的程度的流体。其在生产和贮藏条件下必须是稳定的且必须进行防腐处理以抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、聚乙醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可通过例如使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物的作用。在许多情况下，其优选地包含等渗剂，例如，糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生可注射组合物的延迟吸收。在某些制剂中，使用基于水的制剂，而在其他情况下，其可以是基于脂质的制剂。在本发明的特定实施方案中，包含MDA-7(或编码核酸)和/或MDA-7联合剂的组合物存在于基于水的制剂中。在其他实施方案中，所述制剂是基于脂质的。优选地，维生素E化合物可存在于基于水或基于脂质的制剂中。例如，对于以水溶液形式的胃肠外施用，如果需要，所述溶液应当被合适地缓冲且首先用足够的盐或糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在该情况下，在本公开内容的教导下，可使用的无菌水性介质对于本领域技术人员来说是已知的。例如，可将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，然后将其加至1000ml的皮下输液或注射入提及的输注位置，(参见例如，“Remington′sPharmaceuticalSciences”第15版，pages1035-1038和1570-1580)。依赖于被治疗的受试者的情况必需对剂量进行一些改变。负责施用的人无论如何将确定个体受试者的合适剂量。此外，对于人的施用，制剂应当满足FDA生物制品标准办公室(FDAOfficeofBiologicsstandard)要求的无菌、无热原性、一般安全性和纯度标准。通过在合适的溶剂中将活性物质以需要的量与与各种其他上面列举的组分(当需要时)引入，然后通过过滤灭菌来制备无菌注射液。一般地，通过将各种无菌活性组分整合入媒介物中来制备分散体，所述媒介物包含基本分散介质和需要的来自上面例举的组分的其他组分。在用于无菌注射液的制备的无菌粉剂的情况下，一些制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性组分+来自其先前无菌过滤液的任何其他想要组分的粉剂。可以中性或盐的形式配制此处公开的组合物。药物可接受的盐，包括酸加成盐(用蛋白的游离氨基形成的)和用无机酸例如盐酸或磷酸或用例如有机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。也可从无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铝、氢氧化钙或氢氧化铁和这样的有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等衍生用游离羧基形成的盐。在配制后，以与剂型相容的方式和以这样的量例如治疗有效量施用溶液。以多种剂型例如注射溶液、药物释放胶囊等容易地施用所述制剂。如此处所用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。这些介质和试剂用于药物活性物质的应用在本领域内是熟知的。除非任何常规介质和试剂不与活性组分相容，否则可将其用于治疗性组合物。也可将补充性活性成分整合入组合物。术语“药物可接受的”是指当给人施用时不产生过敏或相似的不良反应的分子实体和组合物。包含作为活性组分的蛋白的水性组合物的配制在本领域内是熟知的。一般地，将这些组合物配制为可注射的液体溶液或悬浮液；也可配制适合在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。可通过注射例如皮下或肌内注射经胃肠外途径常规地施用化合物和试剂。适合用于其他施用模式的其他制剂包括栓剂和在一些情况下为口服制剂。对于栓剂，常规的粘合剂和载体可包括，例如，聚烷基二醇或甘油三酯例如可从包含大约0.5％至大约10％，优选地大约1％至大约2％的活性组分的混合物形成栓剂。口服制剂包括这些常用的赋形剂如药物级的甘露糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂的形式且包含大约10％至大约95％的活性组分，优选地大约25％至大约70％的活性组分。可将MDA-7蛋白(或其片段)或编码MDA-7的全部或部分的核酸配制为中性形式或盐形式。药物可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成的)和与无机酸例如盐酸或磷酸或与有机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。也可从无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铝、氢氧化钙或氢氧化铁和这样的有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙基羟乙胺、组氨酸、普鲁卡因等生成与游离羧基形成的盐。在某些制剂中，将MDA-7联合剂配制为无水粉剂。使用以取代纯糖形式的乳制品副产品形式存在的易接近的廉价原料进行加工是本发明的进一步的目的。已发现可通过制备包含蛋白胶体和双糖的维生素E无水粉剂的方法实现这些目的，其中将维生素E酯分散在残液中，该残液碱土金属离子含量较低但富含乳糖(来自乳糖产生)，存在按重量计算占残液固体含量2至30％的酪蛋白酸盐；并如美国专利4,262,017中所示的将所述分散体喷雾干燥，所述专利以参考引用方式并入本文。所述方法产生了具有可人的香味且可用作食品和动物饲料的添加剂的自由流动的维生素E无水粉剂。所述无水粉剂还具有良好的制锭特征。合适的维生素E酯是d-和d，1-α-生育酚的常规酯。特定的实例是维生素E醋酸酯、维生素E琥珀酸酯、维生素E棕榈酸酯和维生素E烟酸酯。其中，醋酸酯是优选的。以与剂型相容的方式和以这样的量例如治疗有效的量施用所述蛋白、核酸或COX-2抑制剂、Hsp90抑制剂或维生素E化合物。施用的量依赖于被治疗的受试者，包括癌症的侵袭性、任何肿瘤的大小、以前的或其他疗程。需要施用的活性组分的精确量依赖于医生的判断。用于初始施用和后续施用的合适方案也是可变的，但通常是初始施用后，接着进行其他施用。这些施用可以是以单剂形式在连续经历10，20，30，40，50，60分钟和/或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或更多小时和/或1，2，3，4，5，6，7天或更多天的全身性施用。此外，施用可通过定时释放或持续释放机制(通过制剂和/或施用模式)。施用的方式可多种多样。可使用用于施用的常规方法中的任一种方法。据认为这些方法包括对固体形式的生理可接受的基质的口服施用或通过注射等以胃肠外途径施用生理可接受的分散体。剂量可依赖于施用的途径且可根据宿主的大小变化而变化。在许多情况下，想要对两种治疗剂(MDA-7和COX-2抑制、Hsp90抑制剂或维生素E化合物)中的各治疗剂进行多次施用。Q.联合治疗在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括MDA-7多肽或编码其的表达构建体以及COX-2抑制剂或Hsp90抑制剂和其他药剂(包括MDA-7联合剂或组合物)以增强MDA-7的功效或增加使用MDA-7的任何治疗、诊断或预防功效。可以有效地获得想要的效果例如杀死癌细胞和/或抑制血管发生的组合量提供这些组合物。该方法可包括将细胞与表达构建体和药剂或多种因子同时接触。这可通过将细胞与单一组合物或包含两种或所有药剂的药物制剂接触，或通过将细胞与两种或多种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物提供1)MDA-7(作为蛋白或核酸)；和/或2)COX-2抑制剂或Hsp90抑制剂(或其他MDA-7联合剂)；和/或3)第三药剂。在本发明的实施方案中，除了第二或其他抗肿瘤剂或疗法外，将mda-7基因(或eDNA)或蛋白疗法与COX-2抑制剂一起使用(称为“MDA-7/COX-2抑制剂疗法”)。在其他实施方案中，除了第二或其他抗肿瘤剂或疗法外，将mda-7基因(或cDNA)或蛋白疗法与Hsp90抑制剂一起使用(称为“MDA-7/Hsp90抑制剂疗法”)。可选择地，可以数分钟至数周的间隔在其他抗癌治疗之前或之后进行MDA-7/COX-2抑制剂疗法或MDA-7/Hsp90抑制剂疗法。在其中将MDA基因或蛋白疗法与COX-2抑制剂或Hsp90抑制剂分开地提供给患者的实施方案中，一般确保有效时段不超过每次递送的时间之间的间隔，这样所述两种物质仍然能够对患者产生有利的组合效应。可选择地，在其中将MDA-7/COX-2抑制剂疗法或MDA-7/Hsp90抑制剂疗法与第二抗癌疗法分开地提供给患者的实施方案中，一般确保有效时段不超过每次治疗时间之间的间隔，这样所述两种疗法仍然能够对患者产生有利的组合效应。在该情况下，可在相互之间大约12-24小时内和更优选地大约相互之间6-12小时内为患者提供1)MDA-7/COX-2抑制剂疗法或2)MDA-7/Hsp90抑制剂疗法和第二抗癌疗法。在一些情况下，显著延长治疗的时段是想要的，然而，其中各个施用之间要经过几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。可在使用另一种MDA-7联合剂而不用COX-3抑制剂或Hsp-90抑制剂的情况下进行本发明。在某些实施方案中，疗程可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90天或更长时间。可在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、和/或90天和其任何组合提供一种药剂，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和/或90天或其任何组合提供另一种药剂。在一天内(24小时期间)，可一次或多次地给患者施用药剂。此外，在疗程后，存在不施用抗癌疗法的时间段。依赖于患者的状况，例如其预后、抵抗力、健康状况等，该时间段可持续1、2、3、4、5、6、7天和/或1、2、3、4、5周和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更长时间。可使用各种组合，MDA基因或蛋白疗法为“A”，而MDA-7联合剂为“B”A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A可选择地，“A”可以是MDA-7/联合剂疗法的施用，而“B”是第二抗癌疗法的施用。在其他实施方案中，MDA-7基因或蛋白疗法是“A”，而MDA-7联合剂是“B”；或，“A”可以是MDA-7/MDA-7联合剂疗法的施用，而“B”是第二抗癌疗法的施用。对患者施用本发明的任何物质或疗法将依照用于这些物质的一般方案，如果有的话，要考虑载体或任何蛋白或其他药剂的毒性。在此在一些实施方案中，存在监测归因于MDA-7和/或MDA-7联合剂造成的毒性的步骤。必要时可重复治疗周期。各种标准的治疗法以及手术干预也可与所述的疗法一起使用。在特定的实施方案中，可将第二抗癌疗法例如化学疗法、放射疗法、免疫力疗法或其他基因疗法与例如此处描述的MDA-7/COX-2抑制剂疗法或MDA-7/Hsp90抑制剂疗法或任何其他MDA-7联合疗法一起使用。1.化学治疗癌症疗法包括多种与基于化学和放射疗法组合的联合疗法。组合化学治疗剂包括，例如，顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、双氯乙基甲胺、环磷酰胺、喜树碱、异磷酰胺、美法兰、氯氨布西、重硫酸盐、亚硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、反铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱或前述物质的其任何类似物或衍生变体。2.放射疗法导致DNA损伤且已广泛使用的其他因子包括通常称为γ射线、X射线和/或放射性同位素至肿瘤细胞的直接递送。其他形式的DNA损伤因子也包括例如微波、质子束辐射(美国专利5,760,395和美国专利4,870,287)以及UV辐射。所有这些因素最可能对DNA的前体、DNA复制和修复以及染色体的组装和维持造成广泛的DNA损伤。X射线的剂量范围对于长时段(3至4周)在50至200伦琴的日剂量范围内变动，对于单一剂量为2000至6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很广，且依赖于同位素的变衰期、发射的辐射的强度和种类以及被赘生性细胞的吸收。术语“接触”和“暴露”，当用于细胞时，在此处用于描述将治疗性构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或直接与靶细胞放置在一起的方法。例如，为实现细胞杀伤作用，可将两种药剂以有效地杀死细胞或阻止其分裂的组合量递送至细胞。3.免疫疗法在癌症治疗的背景中，免疫疗法通常依赖于免疫效应细胞和分子靶向和破坏癌细胞的应用。曲妥单抗(赫赛汀TM)就是这样的实例。免疫效应器可以是例如对于肿瘤细胞表面上的一些标记是特异性的抗体。所述抗体可单独地用作疗法的效应器或其可招募其他细胞以进行实际的细胞杀伤作用。也可将所述抗体缀合至药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)且只用作靶向试剂。可选择地，所述效应器可以是具有直接或间接地与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。治疗方法的组合，即，直接的细胞毒性活性与ErbB2的抑制或减少可在治疗ErbB2超表达的癌症中提供治疗益处。另一种免疫疗法也可用作使用MDA-7/COX-2抑制剂疗法或MDA-7/Hsp90抑制剂疗法的联合疗法的部分。下面描述用于联合疗法的一般方法。在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须具有易于靶向(即不存在于大部分其他细胞上的)一些标记。存在许多肿瘤标记且这些标记中的任一个可适合用于本发明的上下文中的靶向。常见的肿瘤标记包括癌胚抗原、前列腺特异抗原、泌尿系统肿瘤相关性抗原、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、SialylLewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbB和p155。可选择的免疫疗法的方面是组合抗癌效应和免疫刺激效应。也存在免疫刺激因子，包括细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趋化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子例如FLT3配体。已显示将免疫刺激分子例如蛋白或使用基因递送与肿瘤抑制剂例如MDA-7组合可增强抗肿瘤效应(Ju等人，2000)。此外，可使用抗这些化合物中的任一种的抗体靶向此处描述的抗癌剂。如先前所述，目前在研究中的或使用中的免疫治疗剂的实例是免疫佐剂例如，牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、镰状疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳香化合物(美国专利5,801,005、美国专利5,739,169、Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)、细胞因子治疗剂例如干扰素α、β和γ；IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)、基因治疗剂例如TNF、IL-1、IL-2、p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和美国专利5,846,945)和单克隆抗体例如，抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗p185；Pietras等人，1998；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。赫赛汀(曲妥单抗)是阻断HER2-neu受体的嵌合(小鼠-人)单克隆抗体。其具有抗肿瘤活性和已被批准用于恶性肿瘤的治疗(Dillman，1999)。也将一种或多种抗癌疗法与此处描述的MDA-7疗法一起使用。存在许多用于癌症的被动免疫疗法的不同方法。其可被广泛地分为下列类型单独的抗体注射；偶联至毒素或化学治疗剂的抗体的注射；偶联至抗放射性同位素的抗体的注射；抗独特型抗体的注射；和最后，骨髓中肿瘤细胞的净化(purging)。4.基因疗法在另一个实施方案中，联合疗法包括其中在施用MDA-7多肽或编码该多肽的核酸之前、之后或同时施用治疗性多核苷酸。将MDA-7多肽或编码核酸与编码另一种基因产物的载体一起递送可具有对靶组织的组合治疗效应。5.手术大约60％的癌症患者经历了一些类型的手术，该手术包括预防性、诊断性或分期、治疗性和姑息性手术。治疗性手术是可与其他疗法例如本发明的疗法、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或可选择的疗法一起使用的癌症疗法。根治手术包括其中组织的全部或部分被物理除去、切离和/或破坏的切除。肿瘤切除是指肿瘤的至少部分的物理除去。除了肿瘤切除外，通过手术的疗法包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(Mohs氏手术)。本发明还可与浅表癌、初癌或附带量的正常组织的去除一起使用。在癌细胞、组织或肿瘤的部分或全部切除后，可在体内形成腔。可通过用其他抗癌疗法对该区域进行输注、直接注射或局部施用来进行治疗。例如可每1、2、3、4、5、6或7天、或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这些治疗。这些治疗也可具有不同的剂量。6.激素疗法也可将激素疗法与本发明或与先前描述的任何其他癌症疗法一起使用。激素的应用可用于某些癌症例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌的治疗以降低某些激素例如睾酮或雌激素的水平或阻断其效应。该治疗通常与至少一种作为治疗选择或减少转移风险的其他癌症疗法一起使用。R.实施例包括下列实施例用于展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到后面的实施例中公开的技术代表了由本发明者发现在本发明的实施中良好地发挥功能的技术，因此可被认为组成了其实践的优选模式。然而，在本公开内容的教导下，本领域技术人员应当认识到可在公开的特定实施方案中产生许多改变但仍能获得相似或类似的结果而不背离本发明的精神或范围。实施例1塞来考昔和AD-MDA7的协同杀肿瘤效应A.材料和方法1.细胞系经基因工程改造而表达提高的HER-2/neu水平的雌激素受体阳性MCF7细胞(MCF7/Her18细胞)是来自Dr.Mien-ChieHung的赠品。雌激素受体阴性和非超表达HER-2/neu的MDA-MB-436人乳腺癌细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，Virginia)。将细胞在潮湿的37℃、5％CO2的气氛下培养在补充有10％胎牛血清和10mML谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GIBCOInvitrogenCorporation，Grandisland，NY)的高蔗糖DMEM/F-12培养基中。2.腺病毒转导和塞来考昔处理具有mda-7基因(Ad-mda7)和萤光素酶报道基因(Ad-luc)的重组腺病毒载体获自IntrogenTherapeutics(IntrogenTherapeutics，Houston，TX)。对于MCF7/Her18和MDA-MB-436细胞系，分别以每细胞2000或1000个病毒颗粒(vp)(100或50噬斑形成单位/细胞)的MOI使用Ad-mda7或Ad-luc转导培养皿中的1×106个细胞。将塞来考昔溶解在DMSO中，然后以低于0.1％(为了不影响细胞存活)的终浓度加入至细胞培养基-然后对于以20或50μM的剂量(分别对于MCF7/Her18和MDA-MB-436细胞)导入培养物中。为了比较Ad-mda7和塞来考昔的组合效应，选择载体和塞来考昔的剂量以确保低于50％的毒性。3.细胞增殖测定通过在台盼蓝(InvitrogenCo.，Carlsbad，CA)排斥法和MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑盐)(Sigma，St.Louis，MO)测定法后进行细胞计数来确定塞来考昔和Ad-mda7对人乳腺癌细胞生长的影响。简而言之，以每60mm培养皿6×105个细胞的密度接种细胞。24小时后，除去培养基，然后按计划加入具有或不具有塞来考昔的培养基，然后如所描述的进行病毒转导。15在72小时的温育后，收集悬浮细胞和贴壁细胞，然后使用血细胞计数器计算混合的细胞群体。通过台盼蓝排斥法染色确定细胞生存力。关于MTT测定，以三份重复将1,000个细胞接种在96孔板中并在72小时后进行测定。温育后，用DMSO固定细胞，然后用MTT溶液(5mg/ml)染色。用自动分光光度测量微量板读数仪(EL808Ultramicroplatereader，Bio-TekInstruments，Inc.，Winooski，VT)在570nm读取吸光率。将值进行标准化，并将其表示为与对照细胞相比的百分比变化并作图(平均值±S.E.M.)。4.细胞周期和细胞凋亡的测定收获时所有培养物都是未汇合的。用经冰预冷的80％的乙醇固定收获的细胞，用碘化丙啶(PI)(Sigma，St.Louis，MO)染色，然后如先前所述使用流式细胞仪(FCM)(EPICSXL-MCL，Coulter，Miami，FL)进行分析。收集和沉淀悬浮在培养基中的细胞和经胰蛋白酶处理的贴壁细胞。洗涤所述收获的细胞，然后通过使用膜联蛋白V/FITC细胞凋亡检测试剂盒(BDBiosciences，FranklinLake，NJ)用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)/PI进行染色。按照厂商的方案进行BrdU(5-溴-2-脱氧尿苷)/末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)-介导的2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(dUTP)-生物素缺口末端标记(TUNEL)测定法(APO-Direct，BDBiosciences，FranklinLake，NJ)。简而言之，洗涤多聚甲醛固定的细胞，然后将其与染色液(10μlTdT反应缓冲液、0.75μlTdT酶和8μlFITC-dUTP)一起温育过夜。第二天，漂洗细胞并将其重悬浮于1mlPI/RNA酶溶液中。在黑暗处在室温下温育30分钟后，进行流式细胞术以获得凋亡细胞的百分比。使用与FCM组合的程序(Multicycle，PhoenixFlowSystem，SanDiego，CA)分析细胞周期。5.前列腺素E2(PGE2)的测量为了确定PGE2，的浓度，以1×106个细胞/100mm的培养皿的密度接种细胞，然后用塞来考昔、Ad-mda7或两种药剂的组合处理细胞。在72小时的温育后，将3μl花生四烯酸(1mM)加入培养基中以提高PGE2的产量，进行30分钟。收集上清液，然后在-80℃下贮存直至按照厂商的指导手册使用酶联免疫测定试剂盒(CaymanChemical，AnnArbor，MI)测量PGE2的浓度。来自三份重复的值的最终结果表示为pg/ml。6.Western印迹法裂解细胞，然后使用BioRadAssay(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)确定蛋白浓度。通过western印迹分析法使用10％SDS凝胶分析裂解物。用50ug蛋白给泳道上样，在90V下电泳2小时。将凝胶转移至用5％脱脂奶粉封闭的硝酸纤维素膜上，然后用一抗(COX-2(CaymanChemicalCo.，AnnArbor，MI)、β连环蛋白(SantaCruzBiotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)、Akt(CellSignaling，Beverly，MA)和p-Akt(CellSignaling，Beverly，MA))在4℃下温育过夜。洗涤膜，然后用二抗在室温下温育1小时。然后将膜显影，使用增强化学发光(ECL)western印迹检测剂(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)检测蛋白信号。用抗β连环蛋白的抗体(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)温育膜以评估等量的蛋白上样。将结果接受密度测定法。7.统计学分析在对照和处理组之间和不同实验组之间进行统计学分析。使用Student’st检验进行平均值的比较。也用Student’st检验就显著性分析western印迹的密度测定法。具有p＜0.05的值的差异在统计学上被认为是显著的。B.结果1.Ad-mda7和塞来考昔的共处理抑制乳腺癌细胞的生长在用Ad-mda7和/或塞来考昔处理后，使用台盼蓝排斥法和MTT测定法评估细胞的生存力。如使用MTT测定法的图1所示，所述组合治疗组在48小时和72小时的温育后，与对照相比，无论HER-2/neu的表达状况如何，都显示了显著降低的细胞生存力。HER-2/neu(+)细胞显示了在24小时的处理后Ad-mda7和组合处理之间可存活细胞的数目的差异(p＝0.04)，在48小时的处理后，与对照相比，组合组中的生存力显著降低(p＝0.045)，且所有处理组都显示，与对照相比，存活显著降低(对塞来考昔p＝0.002，对于Ad-mda7p＝0.02，和对于组合p＝0.009)。24小时后，HER-2/neu(-)细胞在组间未显示差异，但与对照相比，组合开始显示差异(p＝0.049)。组合处理和Ad-mda7处理与塞来考昔相比似乎在杀死HER2/neu(-)细胞方面更有效(分别为p＝0.03和p＝0.02)，且在第2天所述组合在对肿瘤细胞的杀伤上优于Ad-mda7(p＝0.02)。在72小时的处理后，Ad-mda7比对照更有效(p＝0.02)，且所述组合在细胞毒性上要优于塞来考昔(p＝0.01)。如使用台盼蓝排斥法的图2所示，在HER-2/neu(+)细胞中，塞来考昔和组合处理与对照相比在肿瘤细胞杀伤数目中显示更大功效(分别为p＝0.04和p＝0.01)。在MCF7/Her18细胞中的三个处理组之间，塞来考昔和Ad-mda7与组合相比都未显示增加的细胞毒性(p＝0.01)。在MDA-MB-436细胞中，与对照、Ad-mda7或塞来考昔(分别为p＝0.01、0.01和0.01)相比，组合处理是最有效的治疗组。也在这些细胞中确定组合处理对PGE2产生的影响(表4)。可重现地，与对照(对于HER-2/neu(+)p＝0.01和对HER-2/neu(-)细胞p＝0.049)相比，组合显示更大的对PGE2产生的抑制。与MCF7/Her18细胞中发现的显著减少(p＝0.04)相比，在MDA-MB-436细胞中使用单一疗法Ad-mda7的处理没有显示产生的PGE2的量的显著减小(p＝0.06)。塞来考昔在两种细胞系中都诱导PGE2产生(对于MCF7/Her18，p＝0.03和对于MDA-MB-436，p＝0.049)。表4.在用单一疗法或联合疗法处理72小时后乳腺癌细胞中的前列腺素E2的产量(pg/ml)。*2000vp/细胞(对于MDA7/Her18细胞)和1000vp/细胞(对于MDA-MB-436细胞)的感染复数(MOI)20uM(对于MCF7/Her18)，50uM(对于MDA-MB-436)Ad-mda7(编码黑素瘤分化相关基因-7的重组腺病毒)，2000vp/细胞(对于MCF7/Her18)和1000vp/细胞(对于MDA-MB-436)的MOI§p＜0.05，与对照相比2.与单独处理相比，Ad-mda7和塞来考昔的组合增加细胞凋亡以前使用肿瘤细胞系的研究已证明Ad-mda7诱导G2/M细胞周期停滞，而塞来考昔诱导G1阻断。Ad-mda7和塞来考昔的组合在细胞周期的G1期阻断MCF7/Her18细胞(p＝0.03)且显著地比单独的塞来考昔介导的G1阻断更明显。在HER2/neu(-)细胞中，组合治疗导致，与塞来考昔或Ad-mda7相比，S期的细胞增加(图3)。在MCF7/Her18和MDA-MB-436细胞中，塞来考昔在G1检查点比Ad-mda7阻止更多的细胞(p＝0.02)，而Ad-mda7单一疗法导致G2/M阻断(图3)。使用膜联蛋白V-FITC和TUNEL测定法评估早期和晚期细胞凋亡事件(图4)；两种测定法都证明与单一疗法或对照相比，联合疗法诱导的细胞凋亡显著增加。此外，无论HER-2/neu表达状态如何都观察到增加的细胞凋亡(p＜0.05)。膜联蛋白V-FITC测定表明塞来考昔和Ad-mda7在两种细胞中都促进细胞凋亡(p＜0.05)。在HER-2/neu(+)细胞中，与TUNEL相比，增加的膜联蛋白V染色可反映与MDA-MB-436相比，MCF7/Her18细胞中更快的细胞凋亡的动力学。3.Ad-mda7和塞来考昔的组合减少COX-2、Akt和p-Akt的表达已知Ad-mda7处理负调控Akt和p-Akt的表达(Mhashilkar等人，2003)。在Ad-mda7转导后就β连环蛋白的表达观察到相似的效果。为了阐明在Ad-mda7和塞来考昔的组合处理后Ad-mda7和塞来考昔对代表性促存活标记的表达的作用，进行western印迹以分析COX-2、Akt、p-Akt和β连环蛋白的稳定状态水平。通过Western印迹分析和密度测定法确定Akt和p-Akt的水平。与对照(PBS)相比，HER2-(MDA-MB-436)和HER2+(MCF7/Her18)细胞在组合处理后显示显著减少的Akt和p-Akt的表达。HER2+细胞中Akt的相对密度数值是塞来考昔(1.01)、Ad-mda7(0.99)和两者(0.53*)(*p＜0.05)。HER2+细胞中pAkt的相对密度数值是塞来考昔(0.61*)、Ad-mda7(1.85)和两者(0.36*)(*p＜0.05)。HER2-细胞中Akt的相对密度数值是塞来考昔(0.72)、Ad-mda7(1.00)和两者(0.44*)(*p＜0.05)。HER2-细胞中pAkt的相对密度数值是塞来考昔(0.67)、Ad-mda7(1.61)和两者(0.37*)(*p＜0.05)。通过Western印迹分析和密度测定法确定COX-2的相对水平。与对照(PBS)相比，HER2-(MDA-MB-436)和HER2+(MCF7/Her18)细胞在组合处理后显示显著减少的COX-2的表达。HER2+细胞中COX-2的相对密度数值是塞来考昔(0.53)、Ad-mda7(0.78)和两者(0.53*)(*p＜0.05)。HER2-细胞中COX-2的相对密度数值是塞来考昔(0.74)、Ad-mda7(0.78)和两者(0.45*)(*p＜0.05)。通过Western印迹分析和密度测定法确定β连环蛋白的相对水平。HER2-(MDA-MB-436)和HER2+(MCF7/Her18)细胞未显示β连环蛋白表达的显著差异。HER2+细胞中β连环蛋白的相对密度数值是塞来考昔(0.78)、Ad-mda7(0.64)和两者(0.85)(*p＜0.05)。HER2-细胞中β连环蛋白的相对密度数值是塞来考昔(0.82)、Ad-mda7(0.97)和两者(0.61)。在处理后，无论HER-2/neu表达如何，显著减少的Akt、p-Akt和COX-2的水平非常明显(p＜0.05)。除了组合处理外，塞来考昔在MCF7/Her18细胞中显示比对照更强的抑制Akt的磷酸化的能力(p＝0.04)。在MDA-MB-436细胞中，与对照相比塞来考昔在一定程度上抑制Akt的表达(p＝0.054)。Ad-mda7在两种细胞系中都增加p-Akt，然而对于Ad-luc也观察到该增加，表明该效应不是MDA-7蛋白依赖性的。与对照相比Ad-mda7和塞来考昔的组合减少p-Akt超过70％，与塞来考昔单一疗法相比，减少大约50％。Ad-mda7和塞来考昔都减少COX-2的表达，此外在MDA-MB-436中看到COX-2被联合疗法抑制。Ad-mda7和塞来考昔在MCF7/Her18细胞中都减少连环蛋白，但在MDA-MB-436细胞中只少量地减少连环蛋白水平。所述组合在两种细胞系中减少连环蛋白，然而该下调在统计学上不显著。C.讨论Ad-mda7的独特特性是抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡而不影响正常细胞(Mhashilkar等人，2003；Pataer等人，2002；Jiang等人，1996；Saeki等人，2000)。一个在肿瘤细胞中起作用的机制(该机制可负责肿瘤细胞杀伤作用)是促存活调节因子Akt和磷酸化的Akt的下调(Mhashilkar等人，2003；McKenzie等人，2004)。环氧合酶2(COX-2)是代谢花生四烯酸从而产生各种类型的前列腺素所需的一个酶。级联反应中的其他酶，环氧合酶1在细胞中组成型表达，但COX-2的不同在于其通常在肿瘤细胞中被诱导或上调。最近，已认识到COX-2在多种人癌症中表达增强，从而导致许多研究人员考查选择性或非特异性COX-2抑制剂预防或治疗癌症的作用。阿斯匹林和其他非甾体抗炎药物已证明在其在许多癌症特别是结肠癌中的化学预防用途是有效的(Steinbach等人，2000；Thun等人，1991)。更近以来，存在不断增多的检查选择性COX-2抑制剂(包括塞来考昔)在预防和治疗多种癌症包括乳腺癌中的潜在用途的报道(Basu等人，2004；Liu等人，2003；Howe等人，2002)。在复杂的信号转导中，PI3K/Akt因其在调节细胞凋亡和存活途径中的作用已受到明显的关注(Mhashilkar等人，2003)。最早作为逆转录病毒致癌基因被分离的PI3K在几种人癌症中驱动促存活途径(Fry，2001)。受细胞内磷脂水平调节的PKB/Akt(丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)似乎在肿瘤发生中起着至关重要的作用(Knuefermann等人，2003)。由于PKB/Akt(一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)是PI3K的下游靶，因此其在多种人癌症中通过在Thr308和Ser473上磷酸化扩增或激活(Marte和Downward，1997)。已显示PI3K/Akt存活途径调节NF-κB(NF-κB)信号转导途径和抑制肿瘤坏死因子(TNF)诱导的细胞凋亡的诱导作用(Burow等人，2000)。HER-2/neu促进PI3K/Akt途径的激活，然后该激活又激活NF-κB，从而导致细胞凋亡的抑制。此外，PI3K/Akt信号途径可促进转化生长因子β(TGF-β)介导的癌细胞迁移(Bakin等人，2000)。因此，在各种癌症的治疗中，近年来的研究已集中在对Akt的活性的调控或抑制上。最近报道塞来考昔，一种有效的且具有选择性的COX-2抑制剂，在体外通过抑制Akt的激活来诱导癌细胞的细胞凋亡(Hsu等人，2000)。腺病毒载体已成功地广泛用于体外和体内转移治疗性基因。可能预测Ad-mda7和塞来考昔的组合将减少Akt的磷酸化，且由于PGE2和HER-2/neu受体表达之间的正反馈环的原因，在超表达HER-2/neu的细胞中增强的杀肿瘤效应更令人注目(Benoit等人，2004)。事实上，这些实验成功地证明了塞来考昔和Ad-mda7组合在HER-2/neu阳性和HER-2/neu阴性乳腺癌细胞中产生增强的抗肿瘤活性。这些抗肿瘤活性通过抑制COX-2表达和通过下调PI3K/Akt促存活途径而发生。Ad-mda7和塞来考昔的联合应用可提供几个有利方面，包括以低于两种药剂作为单一疗法产生有效作用所需的剂量的剂量增加细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长。实施例2MDA7和塞来考昔产生的辐射敏化作用A.材料和方法在辐射前，在用或不用单独的Ad-mda7、单独的塞来考昔或两种物质的组合预处理3天的情况下，将MDA-MB-436和MDA-MB-468人乳腺癌细胞(参见实施例1)暴露于不同剂量的辐射。就克隆形成存活检测所述细胞以比较三种不同处理方法的辐射敏化效应。进行流式细胞术和细胞周期分析以评估细胞周期的改变和细胞凋亡的诱导。通过Student’s检验进行统计学评估。B.结果克隆形成存活检测显示Ad-mda7和塞来考昔的组合在两种乳腺癌细胞系中都显著增强了肿瘤细胞的辐射敏化作用。在亚致死剂量(即在低于塞来考昔(对于MB436，50μM和对于MB468，30μM)和Ad-mda7(对于MB436为1,000和对于MB468为2,000的感染复数(MOI))的50％杀肿瘤效应的剂量)，所述组合显示两种细胞系的显著增强的辐射敏化作用(p＜0.05)。与对照相比，在联合疗法组中存在增加的凋亡细胞的百分比，但这在统计学上不显著。细胞周期分析证明与对照相比，组合组中G2/M细胞周期增加。实施例3使用格尔德霉素和其类似物增强AD-MDA7的细胞杀伤作用A.材料和方法1.细胞系和试剂A549和H460人肺癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心。将所有细胞在5％CO2气氛、37℃下保持在补充有10％胎牛血清、10mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(LifeTechnologies，Inc.，GrandIsland，NY)的RPMI1640。格尔德霉素(GA)获自Calbiochem(SanDiego，CA)。17-烯丙基-氨基格尔德霉素(17AAG)由Dr.NguyenDao(NationalCancerInstitute，Bethesda，MD)馈赠。将17AAG作为10mM母液配制在DMSO(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)中，然后在-20℃下贮存。最终的工作液在培养基中进行稀释，从而包含少于0.01％的DMSO。在弱光条件下进行使用该化合物的所有实验。2.腺病毒的产生以前报道过Ad-mda7、Ad-LacZ和Ad-Luc载体的构建(Pataer等人，2002)。通过用Ad-LacZ感染细胞，然后确定转导至少70％的细胞所需的滴度来确定A549和H460癌细胞系中腺病毒载体的转导效率。3.流式细胞术分析通过碘化丙啶染色和FACS分析测量细胞的细胞凋亡。收集细胞，通过离心沉淀细胞，然后重悬浮于包含50μg/ml碘化丙啶、0.1％TritonX-100和0.1％柠檬酸钠的磷酸缓冲盐溶液中，在FACS分析之前进行涡旋(Becton-DickensonFACScan，MountainView，CA；FL-3channel)。4.Western印迹分析在48小时的感染之后，制备细胞的提取物，然后如先前所述进行免疫印迹测定(Pataer等人，2002)。使用下列抗体PKR(K-17)、HSP90、β连环蛋白、E-钙粘蛋白、Raf-1和β肌动蛋白抗体购自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。磷酸-PKR[pT451]和磷酸-eIF-2α[pS51]抗体购自BioSourceInternational(BioSourceInternational，Camarillo，CA)。Akt和磷酸-Akt(Ser473)购自CellSignaling(CellSignaling；Beverly，MA)。抗MDA-7的多克隆抗体或单克隆抗体购自IntrogenTherapeuticsInc(Houston，TX)。5.免疫荧光分析使A549细胞(5×104个细胞/孔)生长在chamber载玻片上直至70％的汇合，然后用Ad-luc、Ad-mda7、GA、Ad-mda7+GA或Ad-luc+GA进行处理。48小时后，用PBS洗涤细胞，然后用新配制的4％多聚甲醛/PBS固定15分钟。然后在4℃下用0.2％TritonX-100透化细胞20分钟，然后用1％正常山羊血清封闭1小时。将兔抗β连环蛋白多克隆抗体在4℃下温育过夜，然后在37℃下用罗丹明二抗显影30分钟。然后在荧光显微镜(OlympusBX50荧光显微镜)下观察细胞(Vorburger等人，2002)。6.免疫沉淀分析用PBS、Ad-mda7、Ad-mda7+GA或单独的GA处理细胞48小时，然后在RIPA缓冲液(1×PBS，1％NonidetP-40，0.5％去氧胆酸钠，0.1％SDS)中裂解细胞。将500μl(500μg)细胞裂解物与一抗在4℃下一起温育过夜。将蛋白A/G琼脂糖加入混合物中并温育4小时。通过在4℃下以2500rpm离心5分钟沉淀小珠。用1mlRIPA缓冲液洗涤沉淀4次。在最后一次洗涤后，向小珠中加入50μl1XSDS-PAGE样品缓冲液，然后涡旋该小珠，并煮沸5分钟。然后在将上清液加载在凝胶上之前，以2500rpm将其离心1分钟。7.运动性测定向24孔板(Costar)的各个孔中加入培养基(0.7ml)。将细胞培养用插件(Fisher；8μm孔径大小，Falcon3097)置于各孔中。将A549和H460细胞调整至5×105个细胞/ml的浓度，然后将500μl的细胞放入各插件中。用PBS、Ad-luc、Ad-mda7、GA、Ad-mda7+GA和Ad-luc+GA温育细胞36小时。36小时后，计数附着在小孔底部的细胞数目。运动性表示为36小时后无药小孔中附着至小孔的细胞数目的百分比。8.统计学分析报道的数据代表三个或更多个独立实验的平均值，且条柱显示标准偏差(SD)。使用ANOVA和双尾Student’st检验分别进行多组和成对比较的统计学分析，P＜0.05被认为是显著的。B.结果1.格尔德霉素(GA)在人肺癌细胞中增强腺病毒mda-7介导的细胞杀伤作用。许多研究人员已显示格尔德霉素可诱导对乳腺部和结肠癌细胞的细胞死亡。对GA是否在人肺癌A549细胞和H460细胞中诱导细胞凋亡进行了研究。在暴露于不同剂量的GA后48小时，对A549和H460细胞系进行流式细胞术分析。图5A显示使用GA处理肺癌细胞导致两种细胞系中高百分比的细胞死亡。在这些癌细胞系中由GA诱导的细胞死亡是剂量依赖性的。在A549和H460细胞系中都检查了在Ad-mda7与50nm和150nm剂量的GA一起处理48小时的效应。流式细胞术分析显示单独的Ad-mda-7在A549和H460细胞中分别导致百分之15和12的细胞凋亡。在第48小时，150nm的单独的GA在A549和H460细胞中分别导致百分之6.3和5.7的细胞凋亡。GA和Ad-mda7组合在A549(25.3和44％)和H460(21.7和37.5％)细胞中导致凋亡细胞的显著增加(图5B)。对于GA和Ad-luc的组合，在这些癌细胞中不显示该凋亡效应的增加(图5B)。此外，该组合效应大于各药剂的累加效应。2.Ad-mda7和GA的联合处理不增加PKR的表达本发明者以前曾报道Ad-mda7诱导和激活ds-RNA依赖性蛋白激酶(PKR)，这导致eIF-2α的磷酸化和肺癌细胞中细胞凋亡的诱导。因此检测Ad-mda7和GA联合处理是否增加PKR的表达水平和磷酸化状态。用Ad-mda7处理的A549和H460细胞展示PKR和磷酸化PKR的量的增加。相比之下，PBS、GA或Ad-luc处理不导致PKR或PKR磷酸化的增加。Ad-mda7和GA的组合在A549和H460细胞中都不增加PKR水平或其磷酸化状态。相比之下，使用GA处理这些癌细胞导致需要Hsp90来产生构象成熟的AKT、P-AKT、Raf靶的降解。有趣的是，Ad-mda7降解AKT，但同时在A549和H460细胞中增加AKT的磷酸化状态。Ad-mda7和GA的共处理显著地在这些癌细胞中降解磷酸化的AKT。这些结果表明对Ad-mda7介导的AKT激活的抑制可部分地归因于Ad-mda7和GA的协同效应。3.Ad-mda7和GA的组合在肺癌细胞中上调表面E-钙粘蛋白和增加β连环蛋白/E钙粘蛋白缔合以前的报道已显示Ad-mda7可上调人肺癌细胞中的E钙粘蛋白(Mhashilkar等人，2003)。本发明者研究了Ad-mda7和GA的组合是否可在人肺癌细胞中增强E钙粘蛋白的上调。如图6A中所示，如通过使用抗E钙粘蛋白单克隆抗体染色和流式细胞术所确定的，单独的Ad-mda7和单独的GA各自可在A549和H460细胞中增加E钙粘蛋白的水平。与PBS、Ad-luc、Ad-mda7、单独的GA或Ad-luc+GA处理相比，Ad-mda7和GA(50nm)的组合处理在这些细胞中进一步增加了E钙粘蛋白的水平。免疫荧光染色显示单独的Ad-mda7和单独的GA各自可在A549细胞中增加β连环蛋白的水平。所述染色实验也显示Ad-mda7和GA的组合在这些细胞中显著地增加β连环蛋白的水平。以前的研究也证明格尔德霉素可刺激β连环蛋白的酪氨酸去磷酸化和增加β连环蛋白/E钙粘蛋白缔合，从而导致显著减少的细胞运动(Bonvini等人，2001)。因此，研究Ad-mda7和GA的组合是否可增加β连环蛋白/E钙粘蛋白缔合。首先用抗E钙粘蛋白抗体免疫沉淀PBS、Ad-mda7、GA或组合处理的细胞，然后用β连环蛋白特异性抗体对其进行免疫印迹。该方法显示，与用PBS、单独的Ad-mda7或GA处理的A549和H460细胞中观察到的水平相比，在用MDA-7和GA的组合处理的细胞中与E钙粘蛋白免疫共沉淀的β连环蛋白的量显著增加。在两种细胞系中，当用抗E钙粘蛋白抗体免疫印迹免疫沉淀时也检测到相同的E钙粘蛋白水平。因为膜结合的β连环蛋白-E钙粘蛋白复合物的丰度与细胞运动呈反相关，因此在体外调查Ad-mda7和GA的组合是否可诱导A549和H460细胞的运动。当在36小时的体外运动检测中加入时，如通过台盼蓝染色所评估的(图6B)，单独的Ad-mda7或GA(50nM)在两种细胞系中都减小运动而不影响细胞生存力。Ad-mda7和GA共处理在A549和H460细胞都导致显著减少的细胞运动性(图6B)。当用Ad-luc和GA共处理时，两个细胞系中都不表现该结果(图6B)。然后调查17AAG-GA类似物一对用MDA-7处理的人肺癌细胞是否具有与GA相同的效应。在用两种不同剂量的17AAG暴露后48小时，对A549和H460细胞系进行流式细胞术分析。图7显示单独使用17AAG或Ad-mda7处理肺癌细胞导致两种细胞系的细胞死亡。与Ad-luc和17AAG的组合相比，17AAG和Ad-mda7的组合导致A549和H460细胞的细胞凋亡显著增加(图7)。实施例4与维生素E琥珀酸酯(VES)组合增强AD-MDA7的生长抑制效应A.材料和方法1.细胞系和试剂从MDAndersonCancerCenter的Dr.JudithWolf获得人卵巢癌细胞MDAH2774。正常的成纤维细胞系MRC-9获自ATCC。Ad萤光素酶和Ad-MDA7载体获自IntrogenTherapeutics(参见例如，Mhashilkar等人，2001，其以参考引用方式并入本文)。维生素E琥珀酸酯获自SigmaChemicals，St.Louis，MO。2.生长抑制的测定法用Ad-luc(载体对照)、生育酚(维生素E琥珀酸酯，8μg/mL)、Ad-mda7(2000vp/细胞)或其组合处理人卵巢癌细胞(MDAH2774)或正常人成纤维细胞(MRC-9)72小时(3天)。在无血清培养基中用Ad-luc或Ad-mda7感染细胞3小时。在3小时的温育后，给细胞补充完全培养基。此时将溶解在DMSO中的生育酚加入细胞以产生8μg/ml的终浓度。在72小时的温育后，收集细胞，然后通过台盼蓝排斥法确定百分比生长抑制。3.Western印迹分析对于Western印迹分析，通过加入细胞裂解缓冲液(20mMHEPES，pH7.5；10mMKCl，1mMMgCl2，1mMEDTA，1mMDTT，250mM蔗糖和1X蛋白酶抑制剂)从用Ad-luc(载体对照)、生育酚(维生素E琥珀酸酯，8μg/mL)、Ad-mda7(2000vp/细胞)或其组合处理的MDAH2774细胞分离总蛋白。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将其固定在尼龙膜上。用抗胱天蛋白酶-9(CellSignaling，Boston，MA)和抗胱天蛋白酶-3、抗Poly(ADP-核糖)聚合酶PARP、抗Bid和抗胱天蛋白酶-8(BD-Pharmingen，SanDiego，CA)、抗Fas和抗MDA-7(IntrogenTherapeutics)、抗细胞色素C(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)和抗β肌动蛋白的一抗探测膜。通过使用合适的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗确定蛋白的表达，然后通过使用Amersham的增强化学发光western印迹检测系统在增强化学发光胶片(Hyperfilm，Amersham)上显示蛋白的表达。4.细胞分级分离如先前所述(Gewies等人，CancerRes.，602163-2168，2000)将细胞分级分离成胞质和线粒体级分以检测细胞色素C的释放。简而言之，用，PBS、Ad-luc、Ad-mda7、生育酚或其组合处理肿瘤细胞72小时。在处理后72小时，用PBS洗涤细胞，通过刮取将细胞收集入管中，然后用聚四氟乙烯树脂研杵将其在小玻璃匀浆器中在100μl冰冷缓冲液M(20mMHEPES(pH7.5)，10mMKCl，1.5mMMgCl2，1mMEGTA，1mMEDTA，1mMDTT，250mM蔗糖，0.1mMPMSF，2μg/ml胃蛋白酶抑制剂，2μg/ml亮抑酶肽(leupeptin)和2μg/ml胰蛋白酶抑制)中进行匀浆(在冰上冲击50次)。以6,000xg在4℃下离心匀浆物20分钟，然后通过western印迹分析，将上清液(线粒体级分)和细胞沉淀(胞质级分)用于检测细胞色素C。R.结果1.使用Ad-mda7联合维生素E(生育酚)的处理增强了对卵巢癌细胞的生长抑制为确定Ad-mda7的生长抑制效应是否可被维生素E增强，用Ad-luc(载体对照)、生育酚(维生素E琥珀酸酯)、Ad-mda7或其组合处理细胞。如图8A所示，与单独使用Ad-mda7或维生素E琥珀酸酯的处理相比，Ad-mda7与维生素E琥珀酸酯的组合提高了生长抑制。图8B显示使用Ad-mda7和维生素E处理正常成纤维细胞不增加生长抑制效应超过在单独用Ad-mda7处理后观察到的生长抑制效应。2.细胞凋亡在用Ad-mda7维生素E(生育酚)处理的卵巢癌细胞中增加的指标为确定Ad-mda7与维生素E琥珀酸酯的组合的提高的生长抑制效应是否归因于细胞凋亡，对用Ad-luc、Ad-mda7、维生素E琥珀酸酯或其组合处理的人卵巢癌细胞进行Western印迹分析。该分析显示在维生素E琥珀酸酯存在的情况下，MDA-7蛋白的产量极大地增加。与增加的MDA-7蛋白产量一致，Western印迹分析也显示观察到用Ad-mda7联合维生素E琥珀酸酯处理的癌细胞中细胞凋亡的标志增加。特别地，与用各药剂单独处理的细胞相比，观察到在用Ad-mda7和维生素E琥珀酸酯处理的癌细胞中胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、PARP和Bid的裂解具有更大程度的增加。此外，来自线粒体的细胞色素C的增加的释放(如由减少的细胞色素C蛋白的表达所表明的)也表明用Ad-mda7和维生素E琥珀酸酯处理的细胞的细胞凋亡增加。最后，与单独使用各药剂的情况相比，在用Ad-mda7和维生素E琥珀酸酯处理的癌细胞中更容易检测到细胞凋亡相关的Fas蛋白(图9)。实施例5在脂质体介导的mda-7/IL-24基因递送后对肺肿瘤生长的局部和全身性抑制作用A.材料和方法1.材料所有脂质(DOTAP、胆固醇)都购自AvantiPolarLipids(Albaster，AL)。Ham’s/F12培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO-BRL-LifeTechnologies(NewYork，NY)。多克隆兔抗人MDA-7抗体获自IntrogenTherapeutics，Inc.(Houston，TX)，抗鼠CD31购自SantaCruzBiotechnology，Inc.(PaloAlto，CA)。2.细胞系和动物人非小细胞肺癌细胞系A549获自美国典型培养物保藏中心，并将其保持在补充有10％FBS、1％谷氨酸和抗生素的Ham’s-F12培养基中。鼠类UV2237M细胞获自Dr.IsaiahJ.Fidler(M.D.AndersonCancerCenter)且如其他文献(Ramesh等人，2001)中所描述的进行保持。定期传代细胞并就支原体的存在检测细胞。按照已建立的动物培养和使用的规章指导方针将用于本研究的4至6周龄的雌性BALB/c裸(nu/nu)小鼠(Harlan-SpragueDawleyInc.，Indianapolis，IN)和C3H/Ncr小鼠(国立癌症研究所，Fredericksburg，MD)保持在无病原体环境中和进行操作。3.质粒的纯化如在其他文献(Templeton等人，1997；Gaensler等人，1999)中所描述的将用于本研究的质粒克隆入pVax质粒载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)和进行纯化。简而言之，将携带在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的细菌β半乳糖苷酶(Lac-Z)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)或人mda-7cDNA的质粒在卡那霉素选择的条件下培养在大肠杆菌宿主株系DH5α中。通过使用显色鲎阿米巴样细胞裂解物动力学测定试剂盒(chromogeniclimulusamebocytelysatekineticassaykit)(Kinetic-QCL；Biowhittaker，Walkersville，MD)确定纯化的质粒的内毒素水平。通过OD260/280比率确定纯化的质粒DNA的浓度和纯度。4.DOTAP胆固醇脂质体的合成和DOTAPCHOL-DNA混合物的制备如在其他文献Chada等人，2003；Templeton等人，1997)中所描述的，通过减小的大小(1.0、0.45、0.2和0.1μm)的Whatman过滤器(Kent，UK)合成和挤出DOTAP胆固醇脂质体。在小鼠中进行注射之前2至3小时新配制DOTAPCHOL-DNA复合物。5.颗粒大小分析通过使用N4颗粒大小分析仪(Coulter，Miami，FL)就平均颗粒大小分析新配制的DOTAPCHOL-DNA复合物。脂质体-DNA复合物的平均颗粒大小在300nm至325nm的范围内。6.DOTAPCHOL-mda7复合物对皮下肿瘤异种移植物的影响在所有实验中，将悬浮于100μl无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的5×106个肿瘤细胞注射入右背胁侧。当肿瘤达到4-5mM2的大小时，将动物随机分组并开始进行处理。将具有肿瘤的动物分成4组，每组6只动物。组1不接受处理，组2接受PBS，组3接受DOTAPCHOL-LacZ复合物(50μg/剂量)，组4接受DOTAPCHOL-mda-7复合物(50μg/剂量)；通过肿瘤内途径施用所有处理且每天提供一次处理，总共提供6个剂量。按照规章指导方针通过瘤内注射甲氧氟烷(Schering-Plough，Kenilworth，NJ)来麻醉动物。由不知道处理组的观察人员每隔一天记录肿瘤测量值，使用公式V(mm3)＝a×b2/2计算肿瘤体积，其中“a”是最大面积(dimension)，“b”是垂直直径(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2001)。抗肿瘤功效数据表示为各组中所有动物累积肿瘤体积以考虑肿瘤的大小和数目两者。在所有实验中，在第21天和第24天通过ANOVA确定肿瘤大小的改变的统计学显著性.为检测mda-7对小鼠肿瘤细胞的效应，我们使用同系基因型肿瘤模型。为此，用鼠类UV2237m纤维肉瘤细胞(1×106)皮下注射C3H小鼠并将其分成三组(n＝8/组)。当肿瘤大小达到4-5mM2-时，如下使动物接受瘤内处理无处理(对照)、DOTAPCHOL-CAT复合物或DOTAPCHOL-mda-7复合物。处理方案和治疗效应的分析与已对于A549肿瘤模型所描述的一样。重复实验两次以在第21天和23天通过ANOVA进行统计学分析和显著性计算。7.MDA-7、细胞凋亡和CD31的测量收获分别在nu/nu或C3H小鼠中建立的皮下A549或UV2237m肿瘤，将其固定在4％缓冲的福尔马林中，包埋在石蜡中，然后切成4μm的切片。如在其他文献(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2003)中所描述的就MDA-7转基因的表达对组织切片进行免疫染色。在明视野显微镜下分析对于MDA-7呈染色阳性的肿瘤细胞并由不知道处理组的观察人员进行定量。每个样品分析至少5个视野。为确定处理后肿瘤细胞的命运，如先前所述(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2001)，就凋亡细胞死亡用末端脱氧核苷酸转移酶(Tdt)试剂盒(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)对肿瘤切片进行染色，然后用亚甲蓝或甲基绿进行负染。在所有染色方法中，包括合适的阴性对照。对于CD-31染色，如先前所述(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2003)用抗CD31抗体对组织进行染色，然后以盲方式在显微镜下进行观察。通过在高倍放大率(highpowermagnification)(X400)下在每个样品5个随机选择的视野中计数CD31阳性染色血管的数目来半定量确定微血管密度(MVD)。检查和定量代表每处理组3个肿瘤组织的总共15个视野，结果表示为每视野血管的平均数目。8.处理后肿瘤的特征为确定mda-7基因的治疗效果，在最后一次处理后从小鼠收集肿瘤并将其接受组织病理学检查。由不知道处理组的病理学家进行分析。9.DOTAPCHOL-mda7复合物对实验性肺转移的功效为检测DOTAPCHOL-mda-7复合物对肺转移的功效，用悬浮在100μl无菌PBS中的106个A549肿瘤细胞经尾静脉注射入雌性裸鼠。6天后，将小鼠分成3组并如下进行处理无处理(组1)、DOTAPCHOL-CAT复合物(组2)和DOTAPCHOL-mda-7复合物(组3)。各组有8只小鼠。所有处理包含50μg脂质体-DNA复合物，且每天使用27号针经尾静脉施用一次，总共进行6个剂量。在最后一次剂量给药后3周，通过CO2吸入对动物实施安乐死。用印度墨汁气管内注射各小鼠的肺并将其固定在Feketes溶液中(Ramesh等人，2001)。通过不知道处理组的观察人员在解剖镜下对各肺中的转移性肿瘤的数目进行计数来确定全身性mda-7基因处理的治疗效果。通过Mann-Whitney秩和检验对数据进行分析，如果P值＜0.05那么组间的差异解释为统计学上显著的。作为同系基因型肺肿瘤模型，用鼠类UV2237m纤维肉瘤细胞(1×106)注射C3H小鼠并将其分成3组(n＝7/组)。注射后6天，如下处理动物无处理、DOTAPCHOL-CAT复合物或DOTAPCHOL-mda-7复合物。处理方案和治疗效果的分析与已对于A549模型所描述的一样。进行2次实验以进行统计学显著性分析。B.结果1.使用DOTAPCHOL-mda-7复合物进行的肿瘤细胞的体外转染评估DOTAP胆固醇脂质体通过使用编码人MDA-7/IL-24蛋白的表达质粒将质粒DNA递送入人(A549)和小鼠(UV2237m)肿瘤细胞的能力。使用与mda-7质粒DNA复合的DOTAP胆固醇脂质体进行转染导致外源MDA-7蛋白在第24和48小时在A549和UV2237m肿瘤细胞中表达。对来自DOTAPCHOL-mda-7转染的A549和UV2237m细胞的组织培养物上清液的分析在第48小时但非第24小时显示分泌的MDA-7蛋白。在第48小时，分泌MDA-7蛋白的检测与Ad-mda7处理的细胞中观察的不同，在所述细胞中，在第24小时可检测到分泌的MDA-7蛋白(Mhashilkar等人，2001)。这表明使用DOTAP胆固醇脂质体获得的转基因MDA-7表达低于使用Ad-mda7获得的表达。在PBS处理的细胞中未观察到分泌的MDA-7蛋白。因此，DOTAP胆固醇脂质体可有效地将mda-7DNA递送至肿瘤细胞，从而产生细胞内和分泌的转基因MDA-7产物，尽管低于Ad-mda7。2.MDA-7抑制皮下肿瘤生长评估DOTAPCHOL-mda-7复合物在nu/nu小鼠中抑制A549人肺皮下肿瘤的生长的能力。与未处理的、用PBS处理的或用DOTAPCHOL-LacZ复合物处理的动物中的肿瘤生长相比，通过瘤内途径用DOTAPCHOL-mda-7复合物处理荷瘤小鼠显著抑制了肿瘤生长(P＝0.001)(图10A)。对肿瘤的组织病理学分析显示在各处理组之间肿瘤浸润细胞无显著改变。然后评估mda-7基因对C3H小鼠中的皮下肿瘤的治疗效应。将具有UV223M肿瘤的小鼠分成3组，一组不接受处理，第二组接受使用DOTAPCHOL-CAT复合物的处理，第三组接受使用DOTAPCHOL-mda-7复合物的处理。当与两个对照组中的肿瘤生长相比时，在用瘤内施用DOTAPCHOL-mda-7复合物处理的小鼠中从第19天开始UV2237m肿瘤的生长受到抑制(图10B)。然而在第23天观察到显著的肿瘤抑制作用(P＝0.01)。与未处理的对照小鼠相比，也在用DOTAPCHOL-CAT复合物处理的小鼠中观察到肿瘤抑制(P＝0.24)。然而，在DOTAPCHOL-CAT复合物处理的小鼠中观察到的抑制效应归于非特异性效应且与我们先前的研究一致(Ramesh等人，2001).为了证明观察到的肿瘤抑制效应是由于mda-7基因表达引起的，就MDA-7蛋白的表达将注射后48小时获得的皮下A549和UV2237m肿瘤接受免疫组织化学分析。在用DOTAPCHOL-mda-7复合物处理的A549肿瘤(8％)和UV223m肿瘤(13％)中观察到MDA-7蛋白的表达(P＝0.001；图10C)，表达MDA-7蛋白的肿瘤数目显著高于未处理的、用PBS处理的、DOTAP胆固醇LacZ处理的或用DOTAPCHOL-CAT复合物处理的动物中的数目。在用DOTAPCHOL-CAT复合物处理的A549肿瘤中观察到几种非特异性染色水平。对MDA-7表达模式的分析显示除了呈现为细胞外的更弥散的染色模式外还存在强烈的细胞内染色。在人肿瘤异种移植物和鼠类同系基因型肿瘤中都观察到该染色模式。3.用DOTAPCHOL-mda7复合物处理的肺肿瘤中的凋亡性细胞死亡为确定用DOTAPCHOL-mda-7复合物处理后的肿瘤细胞的命运，如先前所述(Saeki等人，2002)就凋亡性细胞死亡分析来自nu/nu小鼠和C3H小鼠的皮下肿瘤(A549，UV2237m)。与来自未处理的、用PBS处理的、用DOTAPCHOL-CAT处理的或用DOTAPCHOL-LacZ处理的对照动物的肿瘤相比，在用DOTAPCHOL-mda-7处理的肿瘤中观察到显著水平的(P＝0.001)标志凋亡性细胞死亡的TUNEL阳性细胞(13％A549和9％UV2237m)(图11)。4.用DOTAPCHOL-mda-7复合物处理的肺肿瘤中的减少的CD31阳性染色为确定mda-7处理对肿瘤血管化作用的影响，如先前所述(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2003)将肿瘤组织接受CD31染色。与从未处理、PBS处理、DOTAPCHOL-LacZ复合物处理和DOTAPCHOL-CAT-处理的小鼠获得的肿瘤组织相比，在DOTAPCHOL-mda7处理的A549(10％)和UV2237m(5.8％)肿瘤组织中CD31阳性染色的水平显著(P＝0.01)减少(图12)。减少的CD31染色表示减少的血管化作用。5.MDA-7抑制实验性肺转移然后使用人A549肺癌细胞或小鼠UV227m细胞在实验性肺转移模型中检查DOTAPCHOL-mda-7复合物的活性。肿瘤细胞的静脉内递送导致快速的肺部肿瘤接种，在30天后，动物死于极大的肺肿瘤负荷。使用DOTAPCHOL-mda-7复合物全身性治疗荷A549和UV2237m肺肿瘤裸鼠或C3H小鼠导致比使用PBS或DOTAPCHOL-CAT复合物的处理显著(P＜0.05)更低的肺转移数目(图13)。在UV2237m小鼠中，当与用PBS处理的小鼠相比时，使用DOTAPCHOL-CAT复合物的处理导致肿瘤结节数目的显著减少，从而表明存在一些非特异性抗肿瘤活性(图13)。此外，如由缺乏发病率和死亡率所证明的，所述处理能被充分耐受而无观察到的处理相关性毒性。实施例6Ad-mda7诱导卵巢癌细胞的化学敏化作用用紫杉醇(0.5nM)、Ad-luc(500vp/细胞)、Ad-luc和紫杉醇或Ad-mda7和紫杉醇处理接种在6孔培养板(5×105/孔)中的MDAH2774卵巢癌细胞。在处理后72小时收获细胞，然后通过台盼蓝排斥测定法就细胞生存力分析所述细胞。未处理的细胞用作对照。与其他处理组相比，用Ad-luc和紫杉醇或用Ad-mda7和紫杉醇处理的细胞显示生长抑制。然而，只在用Ad-mda7和紫杉醇处理的细胞中观察到累加至协同的显著生长抑制(P＝＜0.05)(图14)。在三份重复小孔中进行实验，所得结果表示为2个分开的实验的平均值。实施例7mda-7基因转移使乳腺癌细胞对化学疗法、生物学疗法和放射疗法敏化与blc-2家族成员表达的相关性A.材料和方法1.细胞和试剂所有的细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。被评估的乳腺癌细胞系是T47D、MCF-7、MDA-MB-453、SKBr3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-361、HBL-100和BT-20。原代人乳腺上皮细胞(HMEC)、人血管内皮细胞(HUVEC)和MJ-90人成纤维细胞获自Clonetics(SanDiego，CA)。将细胞培养在DMEM培养基(GIBCO，GrandIsland，NY)和胎牛血清(5-10％，依照各细胞系)中，并就支原体的存在对其进行常规检测。赫赛汀(Genentech，SanFrancisco，CA)、泰索帝(Aventis-RPR，Collegeville，PA)、他莫昔芬(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)和阿霉素(AdriaLabs，ColumbusOH)获自MDAndersonCancerCenterpharmacy。2.重组腺病毒以前曾报道包含mda-7基因(Ad-mda7)、萤光素酶报道基因(Ad-luc)或空载体(Ad-CMVp(A))的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)的产生(Mhashilkar，2001)。Ad-mda7的构建包括将mda-7cDNA连接至CMV-IE启动子，然后连接至SV40多腺苷酸化[p(A)]序列；将该表达盒置于Ad5的E1区域中。进行PCRTM，然后用限制性内切酶降解，然后使用DNA测序分析以确定病毒种。Western印迹法分析，将细胞裂解物接受10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后使用辣根过氧化物酶的Super-Signal底物(Pierce，Inc.)通过Western印迹法对其进行分析。由IntrogenTherapeutics产生抗MDA-7多克隆和单克隆抗体。用于本研究的其他单克隆抗体识别PKR、p53、BCL-2、BCL-XL、BAX、微管蛋白和肌动蛋白(SantaCruzBiotechnology)。二抗购自Santa-CruzBiotechnology(SantaCruz，CA)和AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)。3.转导和药物处理在指定的药物(他莫昔芬1-10μg/mL；泰索帝1-10ng/mL；阿霉素1-10ng/mL和赫赛汀1μg/mL)存在或不存在的情况下用Ad-mda7、Ad-空载体或Ad-luc以增加的感染复数(MOI)转导细胞。以500-2000个细胞/孔将细胞涂板在96孔板形式中以进行3H胸苷掺入测定法，或以105-106个细胞/孔将细胞涂板在6孔板形式中以进行蛋白表达检测、台盼蓝生存力测定或细胞凋亡测定。在药物组合研究中，只在加入载体之前加入药物一次，且同时将细胞持续暴露于药剂中。4.细胞增殖分析通过3H胸苷向活跃复制的细胞的DNA中的掺入来测量细胞的生长抑制。向所述细胞加入3H胸苷(1Ci/mL)，然后在15小时后通过从受体细胞除去上清液来终止反应。使用胰蛋白酶/EDTA(GIBCO)收获细胞，使用PackardFiltermate细胞收集器在过滤器上收集细胞，然后按照厂商方案将其在去离子水和甲醇中进行洗涤。干燥过滤器并使用Matrix9600(Packard)分析。5.细胞凋亡和细胞生存力测定通过TUNEL和膜联蛋白V测定法测量细胞凋亡。对于TUNEL测定法，按照厂商方案(Saeki等人，2000)使用生色TUNEL-POD(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)测定法就细胞凋亡分析肿瘤切片，且通过其暗褐色染色鉴定TUNEL阳性细胞。使用ApoAlertAnnexinV-FITC试剂盒(CLONTECH，PaloAlto，CA)(Saeki等人，2000)进行膜联蛋白V测定法。通过台盼蓝排斥测定法确定细胞生存力。使用碘化丙啶(PI)染色的细胞周期分析。通过细胞DNA的PI染色确定细胞周期的进程。将细胞制备为1-2×106个细胞/mLPBS的单细胞悬浮液，用冷70％乙醇固定2小时，然后离心。倒出固定剂，然后在PBS中洗涤细胞，用碘化丙啶(PI，50g/mL)和RNA酶(20g/mL配制于PBS中)进行染色。通过FACS分析评估处理的细胞克隆形成存活测定。使用Ad-mda7和Ad-CMVp(A)(MOI2000个病毒颗粒/细胞)与XRT(0、2或4Gy)一起进行克隆形成存活测定法。以1×105个细胞将MDA-MB-468乳腺癌细胞与空腺病毒载体(Ad-CMVp(A))或Ad-mda7一起培养2天，然后用放射疗法(XRT)进行处理。以2.5×105个细胞的密度重新接种细胞。3周后评估克隆形成存活；固定集落，用吉姆萨染料进行染色，然后计数(Nishikawa等人，2004)。6.动物研究和免疫组织化学分析BalbCnu/nu小鼠获自CharlesRiver实验室(Wilmington，MA)。将乳腺癌细胞注射入6周龄的雌性小鼠的右后肢并观察肿瘤的生长。在所有实验中，将悬浮在100μl无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的肿瘤细胞(MDA-MB-361；MCF-7或MDA-MB-468)注射入右背胁侧，然后使其生长至大约100mm3。然后将动物随机分组(n＝5-10只动物/组)，并如下开始处理组1接受PBS，组2接受Ad-luc以及组3接受Ad-mda7。对于不同的模型剂量给药方案不同在MB-361异种移植物模型中，当肿瘤达到130mM3时，以1×1010vp的剂量用PBS、Ad-luc或Ad-mda7隔日注射每组10只动物，进行总共3个剂量。在MDA-MB-468模型中，以2×1010vp的剂量用PBS、Ad-luc或Ad-mda7隔日注射各自具有130mM3的肿瘤的5只动物，总共进行3次注射。在MCF-7异种移植物模型中，当肿瘤达到85mM3时以1×1010、3×1010或1×1011vp的剂量用PBS、Ad-luc或Ad-mda7隔日注射每组10只动物，进行6次注射。为评估放射疗法组合，将小鼠分成6个处理组(n＝5/组)磷酸缓冲盐溶液(PBS)、Ad-luc、Ad-luc+XRT、单独的XRT、Ad-mda7、Ad-mda7+XRT。在第1、3和5天以2×1010vp/ml的剂量用PBS或腺病毒载体直接注射处理肿瘤，对后肢施用单次辐射(5Gy)来治疗动物。隔日进行肿瘤测量并计算体积。在杀死动物后立即从选择的小鼠收获肿瘤并将其包埋在石蜡中。使用BCIP/NBT底物试剂盒(VectorLaboratories，Burlingame，CA)通过免疫组织化学就MDA和PKR的表达分析肿瘤样品。按照规章指导方针在使用甲氧氟烷(ScheringPlough，Kenilworth，NJ)进行麻醉的情况下进行瘤内注射。在不知道处理组的情况下隔日记录肿瘤测量值，使用公式V(mm3)＝a×b2/2计算体积，其中“a”是最大的面积，“b”是垂直直径(15，23)。当肿瘤大小达到1.5cm时对小鼠实施安乐死。7.统计学分析对肿瘤测量使用Student’st检验来计算实验结果的统计学显著性。ANOVA和双尾Student’st检验分别用于多组和成对组比较的统计分析，p＜0.05被认为是显著的。B.结果1.在用Ad-mda7处理后，MDA-7在乳腺癌细胞中超表达使用一组9种乳腺癌细胞系；亲本肿瘤类型和p53突变状态概述于图15中。两个代表性乳腺癌系MDA-MB-453(突变型p53)和MCF-7(野生型p53)的Western印迹分析显示在Ad-mda7转导后，无论p53状态如何，MDA-7蛋白都显著地超表达(图16A)；在Ad-luc或PBS处理的细胞的裂解物中MDA-7蛋白不明显。肌动蛋白用作内对照以确保等量的蛋白上样。所述结果显示MDA-7的异位表达诱导高水平的双链RNA激活的丝氨酸/苏氨酸激酶PKR，而用Ad-luc转导的细胞则不具该作用。来自其他乳腺癌细胞(T47D、MB-231、MB-361、MB-468、SKBr3、BT-20、HBL-100)的裂解物的Western印迹分析也在Ad-mda7处理的细胞中显示高MDA-7表达。2.Ad-mda7在体外诱导乳腺癌细胞的细胞死亡用增加的剂量的Ad-mda7或对照载体-Ad-萤光素酶(Ad-luc)或Ad-CMVp(A)(空Ad)处理乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、SKBr3、HBL-100、BT-20、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453和MDA-MB-361和3个正常细胞类型HMEC(乳房上皮细胞)、MJ90(成纤维细胞)和HUVEC(内皮细胞)并就生长抑制评估所述细胞。计算各细胞系生长抑制达50％(IC50)所需的载体浓度并将其列于图15中。将Ad-mda7产生的生长抑制的IC50值除以获得的对照载体的IC50值，从而得出选择性系数(S.I.)。该SI表示与对照Ad载体相比，Ad-mda7产生细胞生长抑制的相对能力。正常细胞的SI值都等于1；但乳腺肿瘤细胞的SI值显示Ad-mda7的细胞毒性大于对照＞2至＞30倍(平均＞8)(图15)。尽管S.I.值的变化范围较大，但其证明mda-7活性对于转化的细胞是选择性的，且MDA-7蛋白的表达不在正常细胞中诱导毒性。Ad-mda7的肿瘤细胞选择性效应的另一个实例来自3H胸苷掺入测定法(图16A)；我们的结果显示在用Ad-mda7转导的T47D、BT-20、MDA-MB-361和MCF-7乳腺癌细胞中存在显著的剂量依赖性生长抑制(p＜0.001)。MDA-7的表达抑制细胞增殖高至96％，而Ad-luc转导的细胞的生长改变最小。这些结果表明Ad-mda7可能诱导细胞周期停滞，从而我们进行对未处理的、Ad-luc和Ad-mda7转导的MDA-MB-453和MCF-7细胞的细胞周期分析(PI染色)。如图16C中所示，用Ad-mda7转导的细胞经历细胞周期阻断，与未处理或Ad-luc处理的细胞相比，G2/M细胞的比例增加2-3倍。评估细胞死亡的动力学和剂量反应，显示MDA-MB-453细胞的代表性数据(图16D)在低Ad-mda7剂量(1000vp/细胞50pfu/细胞)在处理后第2天观察到显著的细胞死亡(p＜0.001)；在更高的剂量在第1天观察到显著的杀伤作用，且随时间的推移杀伤作用增强。总之，MDA-7的表达以时间和剂量依赖性方式杀伤乳腺肿瘤细胞，而Ad-luc只显示很小的作用(图16D)。相比之下，对应的正常细胞-人乳房上皮细胞(HMEC)没有显示(即使在更长的时间点上也未显示)来自Ad-luc和Ad-mda7的显著的毒性(图16E)。使用正常成纤维细胞和原代上皮细胞的其他研究确证缺乏抗正常细胞的细胞毒性(图15)。3.Ad-mda7对细胞凋亡的诱导肿瘤细胞中MDA-7的表达除了影响与细胞生长抑制相关的信号外，还影响其他信号，据报道MDA-7的表达在多种癌细胞类型中激活细胞凋亡途径(Mhashilkar等人，2001；Su等人，1998；Saeki等人，2000；Chada等人，2004)。与这些发现相一致，观察到使用Ad-mda7的转导在T47D、MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-468细胞系(分别为41、52、43和32％)中引发细胞凋亡(图17A)。相比之下，当用对照Ad-luc或空Ad转导这些细胞系时，进行细胞凋亡的细胞数目与在用媒介物处理的细胞中观察到的相当。对这些细胞系的进一步测定验证了d-mda7在T47D乳腺癌细胞中剂量依赖性地诱导细胞凋亡和上调BAX(图17B)。使用泛胱天蛋白酶抑制剂ZVAD的处理减少细胞凋亡40％然而BAX的MDA-7诱导并未减少。使用Ad-luc的处理不激活BAX或细胞凋亡(图17B)。然后评估细胞凋亡诱导的机制。Ad-mda7诱导胱天蛋白酶3和PARP的裂解，与线粒体介导的细胞凋亡诱导一致(图17C)。4.mda-7的表达在体内减少肿瘤生长为确定由Ad-mda7诱导的乳腺癌细胞的体外生长抑制是否在体内可转变为对肿瘤生长的相似效应，我们在裸鼠模型中评估了使用MDA-MB-361、MDA-MB-468和MCF-7细胞产生的异种移植物肿瘤。当肿瘤达到大约100mM3时，将动物分成处理组(n＝5-10只动物/组)，并用PBS、Ad-luc或Ad-mda7进行处理。如图18A-D中所示，使用Ad-mda7直接注射肿瘤在所有3个异种移植物模型中诱导肿瘤体积的显著减小(p＝0.002-0.004)，这在第10天非常明显。在第20天理，用Ad-luc或PBS处理的对照肿瘤已经历了4至8倍的体积增加，达到最大超过800mM3。相比之下，Ad-mda7处理的肿瘤显示较小的肿瘤生长(MDA-MB-361和MDA-MB-468)或长至大约其初始体积的3倍(MCF-7)。Ad-luc诱导的对肿瘤生长的效应是可变的，在MB-361模型中具有最大效应；然而Ad-mda7在所有3种模型中恒定地诱导更强和更稳定的生长抑制，从而导致长期的肿瘤生长控制作用。在对于p53是突变型和野生型的两种肿瘤细胞中显著的生长抑制非常明显(参见图19)。在p53野生型MCF-7肿瘤中进行剂量递增试验研究，其中发现低剂量在阻止肿瘤生长上无效，而3倍更高的剂量产生一定的肿瘤生长抑制(p＝0.08)，而对数更高剂量对该攻击性肿瘤产生强烈的肿瘤生长抑制(p＝0.002)(图19和图18A-D)。Ad-mda7处理显著地减少肿瘤生长速率(参见图18C)，如这些肿瘤大小倍增所需时间上所反映的(图19)。这些结果显示MDA-7的表达在体外和体内，在p53野生型和p53突变型乳腺癌细胞中都具有抗增殖活性。也就MDA-7的表达和细胞凋亡的诱导分析MDA-MB-468异种移植物。在Ad-mda7处理的但非PBS或Ad-luc处理的肿瘤中观察到强MDA-7免疫染色(图18D)。TUNEL分析显示MDA-7蛋白表达与细胞凋亡相关。表达MDA-7的肿瘤显示PKR蛋白的高表达(图18D)，类似于体外观察到的情况(图16A)。5.Ad-mda7转导与他莫昔芬、泰索帝或阿霉素处理的组合对乳腺肿瘤细胞死亡具有累加效应如上所示，使用Ad-mda7的单一药剂疗法展示很有前景的抗乳腺癌细胞的抗肿瘤活性。然而，目前的乳腺癌治疗法使用组合细胞毒性化疗法、放射疗法、激素疗法和新的生物学疗法例如赫赛汀的多方式疗法(Winer等人，2000；Fisher等人，1997；Amat等人，2003；Bonnadona，1989；Tantivejkul等人，2003；Pegram等人，2004)。为调查Ad-mda7与化学治疗剂的组合是否可增强细胞毒性，用Ad-mda7+系列化学治疗剂处理乳腺癌细胞系，然后使用细胞增殖和细胞生存力测定法进行分析。首先用雌激素拮抗剂他莫昔芬(其为通过在靶组织中与雌激素竞争对其受体的结合来起作用的非甾体药剂)处理这些细胞(Winer等人，2000；Fisher等人，1997)。为有助于评估组合药物的相互作用，使用各药剂的亚治疗剂量。首先建立Ad-mda7和他莫昔芬(图20A)之间的剂量反应。在T47D细胞中低剂量的空Ad(0-1000vp/细胞)或他莫昔芬(多至2μg/ml)减少细胞增殖少于20％。加入非常低剂量(100vp/细胞)的Ad-mda7不影响细胞生长，而当Ad-mda7与他莫昔芬(分别为60％和80％的抑制)组合时，500vp/细胞和1000vp/细胞的Ad-mda7导致剂量依赖性生长抑制。如图20B(上图框)中所示，MCF-7细胞对单独的他莫昔芬(1g/mL)和Ad-mda7(以1000vp/细胞)显示较小的反应(＜15％)，但使用两种药剂的组合的处理具有协同效应且减少细胞增殖超过60％(p＜0.001)。进行进一步的研究以评估p53突变型T47D细胞在该情况下使用Ad-mda7作为单一药剂的处理显著减少生长。然而，与使用p53wtMCF-7细胞的情况一样，两种组合治疗剂的效应是协同的，且减少胸苷计数80％(p＜0.01)。用Ad-luc或空Ad转导肿瘤细胞减少生长不超过15％。也在MDA-MB-361细胞中观察到类似的协同相互作用。为调查Ad-mda7是否可增强属于紫杉烷家族的药剂的效应，用泰索帝(多西他奇，0.5-2ng/mL)处理乳腺癌细胞。泰索帝是破坏微管网络从而阻止细胞完成有丝分裂和分裂间期的抗肿瘤药(Winer等人，2000；Fisher等人，1997；Amat等人，2003)。使用导致大约40％的胸苷掺入抑制的泰索帝剂量对T47D和MCF-7进行细胞生长测定(图21A-B)。所述细胞对Ad-mda7敏感但对Ad-luc不敏感；当Ad-mda7与泰索帝组合时，在两种细胞系中都观察到增强的敏化作用。在MDA-MB-361细胞中获得相同的结果。然后检测阿霉素(多柔比星)(其为细胞毒性蒽环类抗生素)，据认为其效应是由其核苷酸碱基相互作用和细胞膜脂质结合活性介导的(Winer等人，2000；Tantivejkul等人，2003)。据认为该药剂与修复酶拓扑异构酶II形成可断裂DNA的复合物的直接相互作用在该药物细胞毒性中起着重要作用。使用用作单一药剂的Ad-mda7(200-2500vp/细胞)或阿霉素(1ng/mL)处理T47D或MCF-细胞减少了细胞增殖；而使用Ad-mda7和阿霉素的组合的处理显示了超累加(协同)效应(图22A-B)。协同活性在低药物浓度上非常明显。在T47D细胞中，200vp/细胞的Ad-mda7或1ng/ml的阿霉素导致细胞生长的少量(17-23％)减少，但两种药剂的组合导致显著更大的(＞60％)的生长抑制(p＜0.01)。然后评估使用Ad-mda7与泰索帝、阿霉素、他莫昔芬和赫赛汀一起处理的乳腺癌细胞中的细胞凋亡信号转导(p53；BCL-XL；BCL-2和BAX)(图15C和图16)。与在T47D细胞中观察到的效应相似，乳腺肿瘤细胞的单一药剂Ad-mda7的处理不显著地改变p53或BCL-XL的稳定状态水平，尽管其可减少BCL-2的表达和上调BAX(图22C)。在用泰索帝、阿霉素或赫赛汀处理的细胞中，在Ad-mda7处理后没有观察到p53和BCL-XL的显著改变(图23)。在用两种化学疗法一起处理的细胞中BCL-2和BCL-XL的稳定状态水平减少。Ad-mda7在用泰索帝或阿霉素处理的细胞中诱导BAX的上调，而当与赫赛汀组合时，MDA-7的表达导致BCL-2的减少(图22C)。p53和BCL-2家族成员的分子改变概述于图23中。这些细胞凋亡介导因子显示基于所用的药物和载体的差异调控作用。当作为单一疗法或与化学治疗剂一起递送时，Ad-mda7在乳腺癌细胞中组成型地上调BAX。赫赛汀是作为人表皮生长因子受体2(HER-2)的拮抗剂开发的人源化抗体(Pegram等人，2004)。在本研究中，进行研究以评估通过Ad-mda7的表达增强的赫赛汀对MDA-MB-453(超表达HER2)和MCF-7(HER2阴性)的细胞毒性(图22D)。事实上，当用Ad-mda7和赫赛汀一起处理细胞时，观察到与未处理的对照相比MDA-MB-453细胞的细胞死亡增加超过5倍的协同作用(p＜0.001)。相比之下，MCF-7细胞对赫赛汀具有抗性，正如通过其缺乏Her-2受体表达所预测的。Ad-mda7诱导MCF-7细胞的死亡；然而Ad-mda7/赫赛汀的组合不显示增强的活性。在上述相似的条件下，使用作为单一药剂的Ad-luc或与赫赛汀一起的Ad-luc的处理不显著地增加观察到的细胞死亡的百分比。这些结果表明，与单一疗法相比，Ad-mda7和化学治疗剂、激素或生物药剂的组合使用可降低肿瘤细胞死亡所需的治疗浓度，从而潜地在减少了相关毒性。6.Ad-mda7和放射疗法的组合对乳腺癌细胞克隆形成存活和肿瘤生长具有协同效应。然后进行研究以调查Ad-mda7和XRT联合疗法对MDA-MB-468乳腺癌细胞的影响。用空腺病毒载体(Ad-p(A))或Ad-mda7(两者都用2000vp/细胞的MOI)处理MDA-MB-468细胞，然后进行辐射。使用集落形成测定法评估抗肿瘤活性。如图24A中所示，观察到与XRT或Ad-p(A)相比，Ad-mda7+XRT处理的细胞的存活率显著减少。在2和4GyXRT处观察到MDA-7介导的肿瘤细胞杀伤能力的增强(图24A)。这些结果表明Ad-mda7+放射疗法的组合在体外以超累加的方式抑制MDA-MB-468细胞的集落形成。为调查Ad-mda7和XRT联合疗法在体内的效果，我们单独地或与XRT(5Gy)组合使用Ad-mda7、Ad-luc或PBS处理大的(＞130mM3)MDA-MB-468乳腺癌异种移植物肿瘤。将动物分成6个处理组(各组中n＝5)，并用PBS、Ad-luc、Ad-luc+XRT、XRT、Ad-mda7或Ad-mda7+XRT进行处理。处理组之间肿瘤的显著差异在处理停止后一周内变得明显。单独使用XRT、Ad-mda7的处理以及使用Ad-luc和XRT的组合的处理都导致肿瘤生长的显著减少(p＜0.05)。然而，在接受XRT和Ad-mda7的组合的动物中观察到最显著的改变。如在图24B中所示，观察到Ad-mda7处理的动物中的肿瘤进程的显著抑制。然而当Ad-mda7和XRT一起使用时，观察到肿瘤生长的衰退(p＝0.0017)。来自Ad-mda7/XRT处理的动物中的肿瘤最初大小增加大约50％，但随后减少多至80％。Ad-mda7/XRT组中的所有动物都经历衰退，肿瘤测量达到小于42mM3的最低点。对照肿瘤大小增加超过500％，而XRT处理的肿瘤增加超过350％。Ad-mda7/XRT组中的肿瘤展示长期的稳定作用，而XRT、Ad-luc或Ad-luc/XRT肿瘤生长增大。当就肿瘤大小倍增的时间进行评估时，PBS和Ad-luc处理的动物分别到第10和11天达到该大小；XRT和Ad-luc/XRT组中的动物都用了15天，而Ad-mda7处理的肿瘤用了25天。来自Ad-mda7/XRT处理的动物的肿瘤在超过30天后大小仍未加倍，且平均比其初始大小小25％。只在Ad-mda7处理的肿瘤中而未在PBS或Ad-luc处理的肿瘤中观察到转基因MDA-7蛋白的升高表达(图18D)。实施例8人白介素24(IL-24)蛋白通过IL-20受体杀死乳腺癌细胞并被IL-10拮抗A.材料和方法1.细胞培养和试剂MDA-MB231和MDA-MB453乳腺癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)且将其保持在补充有10％胎牛血清(LifeTechnologies，Inc.)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mML谷氨酰胺和HEPES缓冲液(LifeTechnologies，Inc.，GrandIsland，NY)的DMEM(Hyclone，Inc.，Logan，Utah)中。常规地筛选细胞以确证不存在支原体污染并在生长对数期进行使用。如先前所描述的(Caudell等人，2002)制备单克隆抗IL-24抗体。兔磷酸Stat3(Tyr705)抗体购自CellSignalingTechnologyInc.(Beverly，MA)，β肌动蛋白单克隆抗体和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP生物素缺口末端标记(TUNEL)试剂盒购自OncogeneResearchProducts(SanDiego，CA)，所有其他一抗和二抗购自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。通过台盼蓝排斥测定法分析细胞生存力。用胰蛋白酶处理细胞并将等分以1∶1的体积悬浮于0.4％台盼蓝中。使用血细胞计数器通过光学显微镜评估总细胞数目和进行细胞生存力计数(Chada等人，2005)。2.纯化和使用人IL-24的处理将全长mda-7cDNA克隆入包含CMV启动子的pCEP4FLAG载体(Invitrogen，SanDiego，CA)。将该质粒转染入HEK293细胞，然后使用潮霉素(0.4μg/ml)分离稳定的亚克隆。如所描述的(Caudell等人，2002)使用亲和层析浓缩和纯化来自293-IL24细胞的上清液。以0-30ng/ml的浓度用纯化的IL-24蛋白处理细胞，或使用transwell系统将细胞与293-IL24产生性细胞共培养(Chada等人，2005；Chada等人，2004)。3.基因转移以前已描述了具有mda-7基因的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)(Mhashilkar等人，2001)。将mda-7基因连接至内CMV-IE启动子，然后连接至SV40多腺苷酸化序列。将包含用于萤光素酶的表达的序列的相同腺病毒载体(Ad-luc)用作对照病毒。在感染前1天将细胞涂板。以每细胞625-10,000个病毒颗粒(33-500pfu/细胞)用腺病毒载体(Ad-mda7或Ad-luc)感染靶细胞。最优化实验条件以在大于70％的细胞中获得IL-24蛋白的表达(基于免疫组织化学染色的结果)。4.免疫印迹法如先前所述(Chada等人，2005)进行使用各种抗体和标准方法的免疫印迹法。受试一抗是p-STAT3，胱天蛋白酶-3、p-cdc2(tyr-15)、p-cdc25(ser-216)(CellSignalingTechnologies，Beverly，MA)、抗p27兔多克隆抗体、抗β连环蛋白单克隆、抗p-Akt、抗Akt、抗肌动蛋白(SantaCruzBiotechnology，SantaCruzCA)或抗IL-24抗体(IntrogenTherapeutics，Houston，TX)。使用增强化学发光剂(AmershamBiosciences)显现蛋白。使用磷酸-STAT3特异性抗体通过免疫荧光测定法确定STAT-3的激活(Chada等人，2005)。在染色后1至2小时使用荧光显微镜拍摄照片。5.FACS分析通过流式细胞术检查细胞表面受体亚基IL-20R1和IL-22R1。简而言之，通过加入0.2％EDTA/PBS使单层细胞分离，然后用冰冷PBS洗涤一次，将所述细胞沉淀和重悬浮至0.1ml1％在PBS中配制的FBS中并用抗IL-20R1、抗IL-22R1抗体或正常IgG对照抗体在室温下温育至少60分钟。洗涤细胞并在冰上将其在FITC缀合的二抗(于1％的于PBS中配制的FBS中)中温育30分钟。用0.1％的PBS中的Tween20洗涤细胞3次，沉淀细胞并将其重悬浮于500μl1％的多聚甲醛中，获取和分析数据。使用按照厂商方案进行的膜联蛋白V测定法通过FACS分析确定细胞凋亡。通过在FACScalibur流式细胞仪(BDBiosciences，SanJoseCA)上进行流式细胞术分析来分析细胞。使用10,000个细胞的样品群体进行分析。6.免疫荧光测定法以不同浓度(0-20ng/ml)的人IL-24蛋白处理培养在chamber载玻片中的细胞30分钟。用乙醇∶醋酸(9.5∶0.5)固定细胞，然后用磷酸Stat3一抗和FITC标记的二抗进行染色。使用Nikon荧光显微镜分析载玻片。7.统计学分析使用Student’st检验评价实验结果的统计学显著性。显著性设置在p＜0.05。B.结果1.Ad-mda7载体在乳腺癌细胞中诱导高水平的IL-24表达和细胞杀伤作用在本研究中，评估两个良好建立的乳腺癌细胞系模型MDA-MB231和MDA-MB453。用不同剂量(每细胞0至10,000个病毒颗粒；0-500pfu/细胞)的Ad-mda7转导这些乳腺癌细胞，在72小时后，收集上清液和细胞裂解物，并通过western印迹法就IL-24蛋白的表达探测所述裂解物。两个细胞系都显示IL-24的高水平表达和分泌，所述IL-24的增加与Ad-mda7的剂量相关。在印迹上观察到多个条带，反映了IL-24变成其成熟的糖基化形式的加工。IL-24表达是基因递送的直接结果，因为未处理的细胞或用具有萤光素酶基因(Ad-luc)的对照载体处理的细胞没有显示IL-24的表达。3天后也通过台盼蓝排斥分析就生存力监测细胞培养物。与未处理的细胞相比，使用萤光素酶对照载体的转导只产生少量的杀伤作用，而Ad-mda7以剂量依赖性的方式诱导显著更高(P＜0.001)的杀伤(图25)。细胞杀伤作用与Ad-mda7介导的分泌IL-24的表达强相关，对于MDA-MB231和MDA-MB453细胞相关系数分别为0.98和0.93(表5)。这些数据强烈地表明观察到的细胞杀伤效应是增加的IL-24蛋白表达水平的结果。2.Ad-mda7在乳腺癌细胞中阻止细胞周期进程和诱导细胞凋亡为理解乳腺癌细胞中Ad-mda7诱导的细胞死亡的机制，进行使用PI染色和流式细胞术的细胞周期分析。用Ad-mda7转导的细胞中的细胞周期的分析显示，与未处理的对照或用Ad-luc转导的细胞相比，G2/M群体显著增加(p＜0.05)，表明细胞周期停止在该期(图26A)。通过分析细胞周期蛋白获得对Ad-mda7阻止细胞周期进程的进一步支持。使用Ad-mda7的处理导致CDC-25的磷酸化增加以及总p27水平的增加。CDC-25是参与从G2至M期的细胞周期进程的磷酸酶，通过在Ser216上磷酸化使用该酶失活。CDC-25的失活阻止其使其下游靶去磷酸化，所述下游靶的去磷酸化将使细胞周期继续进行。p27是其水平在静止期细胞中增加的另一个至关重要的细胞周期调控蛋白。增加的细胞周期阻断与减少的CDC-2的磷酸化相关。未处理的细胞和用Ad-Luc对照载体转导的细胞未显示p27或p-CDC-25或p-cdc2水平的变化。为了评价Ad-mda7在细胞凋亡途径的激活中的作用，进行膜联蛋白V测定以分析早期细胞凋亡事件。与Ad-luc处理的对照相比，使用Ad-mda7处理MDA-MB231和MDA-MB453细胞都导致膜联蛋白V阳性细胞的显著增加(p＜0.01)，从而表明更高的细胞凋亡比例(图26B)。Western分析显示在Ad-mda7处理后胱天蛋白酶-3在乳腺癌细胞中表现出剂量依赖性裂解和激活。PI3K存活途径参与乳腺肿瘤发生和化学抗性；因此检查MDA-MB453细胞中的PI3K和Wnt存活信号转导途径中的蛋白表达的调控(Nicholson和Anderson，2002；Campbell等人，2004；Simstein等人，2003)。Western印迹分析显示增加的MDA-7/IL-24表达水平与对涉及细胞存活途径的蛋白的抑制相关。随着细胞内IL-24水平增加，观察到Akt、p-Akt和β连环蛋白的伴随性减少。3.外源IL-24蛋白激活STAT3并杀死乳腺癌细胞因为IL-24蛋白存在于Ad-mda7转导的细胞的上清液和细胞内区室中，因此检查细胞内IL-24对细胞外IL-24在乳腺癌细胞的生长抑制中的功能。MeWo黑素瘤细胞用作阳性对照细胞系，因为已报道IL-24通过配体-受体结合有效地杀死黑素瘤细胞(Chada等人，2004)。将浓度增加的抗MDA7中和抗体加入Ad-mda7转导的细胞的培养物中。在乳腺和黑素瘤细胞系中，与非特异性IgG抗体的加入相比，IL-24的中和显著地减少细胞的杀伤作用(p＜0.01)(图27)，表明该效应是IL-24特异性的。要注意抗IL-24不能完全消除细胞杀伤作用，表明Ad-mda7通过细胞内和细胞外机制杀死乳腺癌细胞。已显示所有IL-10细胞因子家族成员(包括MDA-7/IL-24)在受体阳性细胞系中诱导STAT3的激活(Pestka等人，2004)。因此，通过在乳腺癌细胞中检测STAT3磷酸化和至细胞核的转运来评估IL-24受体结合。IL-24的受体是称为1型IL-20R(IL-20R1/IL-20R2)和2型IL-20R(IL-22R1/IL-20R2)的异源二聚细胞因子受体。使用抗磷酸-STAT3抗体的免疫荧光显微镜技术显示IL-24和IL-10都能够在两种乳腺癌细胞系中激活STAT3。4.IL-24需要结合其IL-20受体以诱导细胞凋亡因为IL-24和IL-10都结合相关的受体和激活STAT3，但只有IL-24具有杀死细胞的能力，进行鉴定通过IL-24介导细胞死亡的受体的研究。用抗IL-24、IL-20R1或IL-22R1的中和抗体处理MDA-MB453和MDA-MB231细胞，然后将其暴露于IL-24并使用台盼蓝染色监测细胞的死亡。抗IL-24能够显著抑制(p＜0.01)IL-24介导的细胞杀伤不低于80％。抗IL-22R1显示中等减少(对于MB231，16％以及对于MB453，22％)，而抗IL-20R1在两种细胞系中显著减少杀伤(p＜0.01)不低于60％(图28A)。组合两种受体中和抗体进一步显著地减少杀伤至与对照相当的水平。使用抗这些受体的特异性抗体和FACS分析进行检查IL-20R1和IL-22R1的细胞表面表达的研究。结果显示IL-20R1染色几乎比IL-22R1染色高4倍，表明IL-20R1在细胞表面更丰富或抗IL-22R1抗体比抗IL-20R1具有更低的结合亲和力(表6)。阳性对照MeWo黑素瘤细胞系表达高水平的两种细胞表面IL-20R1和IL-22R1受体亚基，而这些受体的水平在A549(肺癌细胞)细胞上非常低。5.IL-24，但非其他IL-10家族成员，在乳腺癌细胞中诱导剂量依赖性细胞凋亡为了评估由IL-24蛋白介导的细胞死亡的机制，使用膜联蛋白V测定法评估暴露于IL-24蛋白后乳腺肿瘤细胞中的细胞凋亡。通过Western印迹法就稳定状态的IL-24蛋白水平分析平行培养上清液。使用IL-24蛋白处理乳腺肿瘤系导致显著的细胞死亡诱导，细胞凋亡的不断增加的水平直接与IL-24的剂量相关(图28B)。对于其他IL-10家族细胞因子未观察到该结果。就抗乳腺肿瘤细胞的细胞毒性评估IL-10、IL-19、IL-20和IL-22，但这些因子中没有一个诱导高于背景水平的细胞死亡(图29A)。在乳腺癌细胞中，尽管IL-10和所有其他家族成员都可激活STAT3，但IL-24是唯一的具有直接细胞毒性特征的家族成员。6.IL-10拮抗由IL-24介导的细胞杀伤作用因为以前的研究证明IL-10在PBMC中阻止由IL-24诱导的IL-6、干扰素、TNF和其他细胞因子的表达(Caudell等人，2002；Wang等人，2002)，所以进行研究以评估IL-10和IL-24在信号转导和细胞增殖中是否相互拮抗。为确定IL-10是否可调节IL-24诱导的生长抑制，用相同量的IL-24蛋白和增加量的重组IL-10处理MDA-MB231和MDA-MB453细胞。结果显示IL-10剂量依赖性的方式显著抑制IL-24蛋白诱导的杀伤作用(图29B)。单独的IL-10不刺激细胞增殖或杀死乳腺癌细胞系(图29A)。作为特异性的另外的对照，将IL-10煮沸以阻断其活性。IL-10的煮沸消除了其抑制通过IL-24介导的杀伤作用的能力(图29B)。实施例9贝伐单抗增强Ad-mda7介导的抗肺癌细胞的抗肿瘤活性A.材料和方法1.重组腺病毒载体如以前所报道的(Mhashilkar等人，2001；Saeki等人，2000)构建和纯化Ad-mda7和Ad-萤光素酶(luc)载体。使用携带GFP的腺病毒载体(Ad-GFP)确定对于细胞系的转导效率。当用3000vp/细胞进行感染时，各细胞系的转导效率大于80。用合适的病毒颗粒处理细胞。2.细胞培养和试剂。如以前所描述的(Saeki等人，2000)培养非小细胞肺癌细胞系H1299和A549。HUVEC购自clonetics(Walkersville，MD)并保持在由厂商以bullet试剂盒提供的具有5％胎牛血清和其他试剂的内皮细胞基础培养基中。在第3至8代时使用内皮细胞。3.细胞增殖测定法。为确定非细胞毒性剂量，进行剂量滴定研究。根据该初步研究，在长达4天中1000vp/细胞的Ad-mda对肺肿瘤细胞无细胞毒性而2000和3000vp/细胞的剂量具有细胞毒性。基于这些结果以1000vp/细胞使用Ad-luc或Ad-mda7进行下述所有随后的测定。将肿瘤细胞(H1299和A549)接种在6孔板(2×105个细胞/孔)中并用表达萤光素酶(luc)基因(Ad-luc)或Ad-mda7(1000个病毒颗粒[vp]/细胞)的腺病毒载体进行处理。用PBS处理的细胞用作对照。在图中所列的不同时间点收获细胞并将其接受先前所描述的细胞生存力测定法(Saeki等人，2000)。为分析来自Ad-mda7处理的H1299的条件培养基对内皮细胞增殖的影响，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种在6孔板(3×105个细胞/孔)中。在温育后24小时，用从用PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理的肿瘤细胞制备的条件培养基替换培养基。将HUVEC再温育3天，然后收获细胞并将其接受细胞生存力测定(Ramesh等人，2003；Mhashilkar等人，2001)。在分开的实验组中，用来自Ad-mda7处理的细胞的包含重组人VEGF165的条件培养基或抗MDA-7抗体(10μg/ml；IntrogenTherapeutics，Houston，TX)处理HUVEC，然后如上所述确定细胞生存力。4.Western印迹法。在处理后指定的时间点收获用PBS、Ad-luc或Ad-mda7处理的肿瘤细胞。如先前所述(Mhashilkar等人，2001；Saeki等人，2000)收集细胞裂解物并通过western印迹法分析进行分析。将下列抗人一抗用于检测VEGFR2(Chemicon，Temecula，CA)、磷酸化VEGFR2(pVEGFR2，Y1214；Biosource，Camarillo，CA)、VEGF(SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)、β肌动蛋白(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)、AKT、磷酸化AKT(pAKT)、胱天蛋白酶-3(CellSignalingTechnologyInc.，Beverly，CA)和MDA-7(IntrogenTherapeutics)。5.酶联免疫吸附测定(ELISA)。将肿瘤细胞接种在6孔板中并用PBS、Ad-luc或Ad-mda7(1000vp/细胞)进行处理。在处理后48小时和72小时收集条件培养基，然后将其在13,000rpm下离心15分钟以除去细胞碎片。使用商购可获得的ELISA试剂盒(QuantikinehumanVEGF，R&DSystems)以三份重复就人VEGF分析上清液。按照厂商的方案进行所述测定，确定VEGF浓度。Ad-luc或Ad-mda7处理的细胞的条件培养基中的VEGF浓度表示为相对于PBS处理的细胞的培养基中的VEGF浓度的抑制百分比。进行实验3次并将结果表示为3个分开的实验的平均值。6.Src激酶测定。如先前所述(Boyd等人，2004)进行Src激酶测定。简而言之，在放射免疫沉淀分析缓冲液中制备来自PBS、Ad-luc和Ad-mda7处理的肿瘤细胞的细胞裂解物，然后将其与抗c-Src单克隆抗体327(OncogeneScienceInc.，Cambridge，MA)反应。用兔抗鼠IgG和福尔马林固定的Pandorbin形成免疫复合物。通过加入10μCi的[γ-32P]ATP、10mMMg2+、10μg的兔肌肉烯醇化酶(Sigma)和100μM20mMHEPES中配制的原钒酸钠起始激酶反应。用十二烷基硫酸钠终止反应。在8％的聚丙烯酰胺凝胶中分离放射性标记的蛋白产物，然后将其接受放射自显影术。使用密度计对印迹进行半定量分析，将所述值表示为相对于PBS的抑制百分比。7.VEGF受体激活测定。将HUVEC接种在6孔板(5×105/孔)中，然后用包含1％FBS的无生长因子的培养基使所述细胞肌饿过夜。第2天，用从用PBS、Ad-luc、Ad-mda7、Ad-mda7+抗MDA7抗体、Ad-mda7+重组人VEGF(rhVEGF)处理的肿瘤细胞收集的条件培养基更换培养基。在不同的实验组中，也用用Avastin、Avastin+Ad-luc和Avastin+Ad-mda7处理的条件培养基处理细胞。未向其中加入条件培养基的HUVEC用作对照。在加入条件培养基后第5、10和60分钟收获细胞，制备细胞裂物并通过western印迹法分析VEGF受体的磷酸化和AKT(VEGF受体的下游靶)的磷酸化。8.体内分析为确定Ad-mda7+贝伐单抗组合是否在体内增强对肿瘤的生长抑制，将H1299肿瘤细胞(5×106)经皮下注射入无胸腺BALB/c雌性裸鼠(n＝50)的右下胁腹。将小鼠分组且当肿瘤大小达到50至100mM3时如下进行处理PBS(n＝8)、Ad-luc(n＝8)、Ad-mda7(n＝8)、贝伐单抗(n＝9)、Ad-luc+贝伐单抗(n＝8)、Ad-mda7+贝伐单抗(n＝9)。每周用Ad-luc或Ad-mda7皮下(1×1010vp/剂)处理小鼠2次。每周腹膜内提供贝伐单抗(100ug/身体)2次。如先前所述(Saeki等人，2002；Ramesh等人，2003)每周称取动物体重和每周测量肿瘤生长3次。在第一次处理后第28天，通过CO2吸入杀死所有动物，收集肿瘤以进行组织病理学检查和Western印迹分析。进行2组不同的实验。9.统计学分析。所有实验进行3次，使用Student’st检验和方差分析计算实验结果的统计学显著性。显著性水平设置在P＜0.05。B.结果1.Ad-mda7在NSCLC中以不依赖于其杀伤效应的方式抑制VEGF将H1299和A549培养在6孔组织培养板(2×105)中，然后用1000VP/细胞的Ad-mda7进行处理。用PBS和Ad-luc(1000vp/细胞)处理细胞并将其用作对照。在处理后48小时和72小时收集细胞提取物和培养上清液。与PBS和Ad-luc相比，Ad-mda7在两种NSCLC中显著减少VEGF的表达(图30A)。且观察到MDA-7蛋白的表达是时间依赖性的。细胞生存力测定显示1000vp/细胞的Ad-mda7在处理后长达72小时不显示对两种肺癌细胞系的任何杀伤作用(图31A-B)。培养物上清液中的VEGF的分析显示与Ad-luc相比，Ad-mda7在两种NSCLC中显著抑制VEGF(图30B，图31B)。这些数据表明Ad-mda7不依赖于其抗肿瘤细胞的毒性效应在NSCLC中抑制VEGF的表达。2.Ad-mda7在NSCLC中下调Src激活。以前的几个研究已显示c-Src(非受体激酶)在调控VEGF的表达中起着重要作用且已报道Src的高表达与增加的VEGF表达相关(Inoue等人，2005；Irby和Yeatman，2000；Bromann等人，2004)。基于这些报道我们通过Src激酶测定来检查在NSCL中Ad-mda7介导的VEGF抑制是否涉及c-Src。将H1299和A549细胞接种在6孔板中并在用PBS、Ad-luc和Ad-mda7处理后48小时收集裂解物。使用激酶检测试剂盒分析Src活性。Ad-mda7在两种NSCLC中显著减少Src的活性(图32)。该数据表明Ad-mda7抑制Src活性导致肺癌细胞中VEGF的下调。3.肺肿瘤细胞中MDA-7介导的VEGF抑制影响内皮细胞增殖和VEGF受体信号转导已显示VEGF是内皮细胞增殖和存活的至关重要的生长因子(Gerber等人，1998)。因此VEGF的抑制应当促使内皮细胞死亡。为调查肿瘤细胞减少的VEGF产量是否影响内皮细胞的增殖和信号转导，就VEGF受体信号转导对HUVEC进行细胞生存力检测和Western印迹分析。当数据以相对于PBS组的抑制百分比表示时，与用来自Ad-luc处理的肿瘤细胞的条件培养基处理相比(图33A)，使用从Ad-mda7处理的肿瘤细胞收集的条件培养基处理HUVEC显示显著的细胞增殖抑制作用(图33A)。为进一步评估HUVEC增殖的抑制是否是由于减少的VEGF造成的，如上所述处理血清饥饿的HUVEC并就VEGF受体信号转导对其进行分析。此外，加入过量体积的抗MDA7中和抗体以排除MDA-7蛋白的分泌形式可能影响HUVEC增殖的可能性。当用来自PBS和Ad-luc处理的肿瘤细胞的条件培养基处理HUVEC时，VEGFR2和AKT(VEGFR2信号转导途径的下游靶)被磷酸化。无论在哪里，在MDA7中和抗体存在或不存在的情况下在用来自用Ad-mda7处理的细胞的条件培养基处理的HUVEC中未观察到VEGFR2和AKT的激活。向来自Ad-mda7处理的细胞的条件培养基中加入rhVEGF165则恢复VEGFR2和AKT的激活(图33B)。4.Ad-mda7不显示对HUVEC的任何杀伤效应且Avastin抑制HUVEC细胞增殖但不影响H1299细胞的增殖进行研究以调查Ad-mda7和贝伐单抗组合是否有效地抗肺癌。为评估Ad-mda7和贝伐单抗抗肿瘤细胞和内皮细胞的毒性，进行细胞生存力测定。将H1299细胞(2×105/孔)和HUVEC(3×105/孔)接种在6孔板中。第2天，分别用PBS、Ad-luc(1000vp/细胞)、Ad-mda7(1000vp/细胞)和贝伐单抗(0.78ug/ml、1.56ug/ml、3,125ug/mi)、Ad-luc+贝伐单抗和Ad-mda7+贝伐单抗处理细胞。在处理后48小时和73小时，用胰蛋白酶处理细胞并使用台盼蓝细胞排斥测定法进行分析。与先前的数据相一致，1000vp/细胞的Ad-mda7对H1299和HUVEC未显示任何毒性。虽然贝伐单抗抑制HUVEC的生存力，然而贝伐单抗未显示对H1299的有害效应(图34).5.肺肿瘤细胞中MDA-7对VEGF的抑制和Avastin影响内皮细胞增殖当数据表示为相对于PBS组的抑制百分比时(图35)，与使用来自Ad-luc处理的肿瘤细胞的处理相比，使用从Ad-mda7处理的肿瘤细胞收集的条件培养基处理HUVEC显示细胞增殖的显著抑制(P＝＜0.05；图34)。6.当将Ad-mda7和贝伐单抗组合时，对HUVEC的VEGFR2信号转导的阻断被显著增强为评估Ad-mda7与贝伐单抗一起是否在HUVEC中增强对VEGFR2信号转导途径的抑制效应，除了将Ad-mda7和贝伐单抗组合外，进行如上所述的相同组的实验。同样，来自PBS和Ad-luc处理的肿瘤细胞的条件培养基激活VEGFR2信号转导。在用来自Ad-mda7处理的细胞和贝伐单抗处理的细胞的条件培养基处理的HUVEC中观察到较少的VEGFR2和AKT的激活。此外，贝伐单抗处理的上清液对HUVEC中VEGFR2和AKT激活的抑制效应与Ad-mda7处理的和Ad-luc+贝伐单抗处理的上清液的所述效应相似。当用用Ad-mda7+贝伐单抗处理的培养物上清液处理HUVEC时，VEGFR2信号转导的激活被显著减少(图36)。7.Ad-mda7+贝伐单抗组合在体内增强肿瘤生长抑制为评估Ad-mda7+贝伐单抗组合处理是否增强肿瘤生长抑制，使用异种移植物模型进行体内实验。与用PBS、Ad-luc、贝伐单抗或Ad-luc+贝伐单抗处理的小鼠相比，用Ad-mda7+贝伐单抗处理的小鼠显著抑制肿瘤生长。而且，未观察到与各药剂或组合相关的不良作用例如体重减轻、发病或死亡，表明所有处理都是可耐受的。为检查肿瘤抑制的分子机制，在最后一次处理后24小时对动物实施安乐死，然后收集肿瘤样品并快速冷冻或固定在福尔马林中。从快速冷冻肿瘤组织提取总蛋白并通过Western印迹分析就VEGF、MDA-7和胱天蛋白酶-3对其进行分析。成功地将mda-7基因转染入肿瘤细胞。Ad-mda7处理抑制肿瘤样品中的VEGF，而PBS和Ad-luc不抑制其(图37)。当用Ad-mda7+贝伐单抗处理肿瘤时，VEGF的表达显著减少。此外，在用Ad-mda7处理的肿瘤中观察到断裂的胱天蛋白酶-3。有趣的是，当用Ad-mda7+贝伐单抗处理肿瘤时，观察到更多的胱天蛋白酶-3裂解。就MDA-7、VEGF、CD31和TUNEL对肿瘤组织进行的免疫组织化学分析显示来自用AD-mda7和贝伐单抗处理的小鼠的肿瘤显示，与所有其他处理组相比，VEGF、CD31显著减少且TUNEL阳性染色增加。此外，观察到的效应与MDA-7蛋白表达相关。总之，Ad-mda7在NSCLC中通过抑制Src激酶的活性来抑制VEGF。当Ad-mda7和贝伐单抗组合时，显著增强对HUVEC的VEGFR2信号转导的阻断。肺肿瘤细胞中MDA-7介导的VEGF抑制影响内皮细胞增殖和VEGF受体信号转导。Ad-mda7+贝伐单抗的组合在体内增强肿瘤生长抑制。Ad-mda7+贝伐单抗的组合在体内增强对VEGF的抑制效应和肿瘤细胞凋亡。实施例10Ad-mda7+TNFα处理增强对前列腺肿瘤细胞的杀伤作用A.材料和方法1.重组腺病毒载体由IntrogenTherapeutics，Inc，Houston，Texas构建、纯化和提供Ad-mda7和Ad-萤光素霉(luc)载体。2.转导效率使用携带GFP(Ad-GFP)的腺病毒载体确定前列腺癌细胞系LNCaP。将细胞接种在6孔板中并用不同剂量的Ad-GFP(100、300、600和1200vp/细胞)处理。随后不处理或用重组人TNFα蛋白(10ng/ml)处理经Ad-GFP处理的细胞。在TNFα处理后24小时通过胰蛋白酶消化收获细胞，用PBS洗涤3次，重悬浮于PBS中，然后将其接受FACS分析。用PBS处理的细胞用作对照。3.细胞培养和试剂。如ATCC所推荐的培养前列腺癌细胞系LNCaP和DU145。4.细胞增殖测定法。将肿瘤细胞(LNCaP)接种在6孔(5×104)或96孔板(2×103个细胞/孔)，然后将表达萤光素酶(luc)基因(Ad-luc)或Ad-mda7(1500-2000个病毒颗粒[vp]/细胞)的腺病毒载体单独地或与TNFα(5ng/ml)组合处理所述细胞。用PBS处理的细胞用作对照。在处理后48和72小时，使用先前描述的XTT方法使细胞接受细胞生存力测定。5.Western印迹法在处理后24小时收获用Ad-mda7(1000-2000vp/细胞)、Ad-mda7+TNFα(10-20ng/ml)或Ad-mda7+抗TNFα抗体(0.5-1ug/ml)处理的肿瘤细胞。收集细胞裂解物并就MDA-7蛋白的表达通过western印迹法对其进行分析。6.细胞周期将肿瘤细胞(LNCaP)接种在6孔板中并用Ad-mda7或Ad-luc(1500vp/细胞)、Ad-mda7+TNFα(10ng/ml)、Ad-mda7+抗TNF抗体(1ug/ml)、Ad-luc+TNFα或Ad-luc+抗TNF抗体进行处理。在处理后48小时收获细胞并就SubG0/G1期的细胞数目通过流式细胞术对其进行分析。用PBS处理的细胞用作对照。B.结果1.Ad-mda7+TNF-α处理增强前列腺肿瘤细胞杀伤用PBS、TNFα、Ad-Luc、Ad-mda7、Ad-luc+TNF或Ad-mda7+TNF处理前列腺肿瘤(LNCaP)肿瘤细胞。以2000vp/细胞进行病毒处理和以5ng/ml进行TNF处理。在处理后48小时在明视野显微镜下显现细胞。与其他处理组相比，用Ad-mda7+TNF处理的细胞显示显著的细胞增殖抑制。2.Ad-mda7+TNFα处理抑制肿瘤细胞增殖用PBS、TNFα、Ad-Luc、d-mda7、Ad-luc+TNF或Ad-mda7+TNF处理前列腺肿瘤(LNCaP)肿瘤细胞。以1500vp/细胞进行病毒处理和以5ng/ml进行TNF处理。在处理后48小时和72小时将细胞接受XTT测定以确定细胞生存力。与其他处理组相比，用Ad-mda7+TNF处理的细胞显示显著的生长抑制(图37)。所述抑制效应是协同性的。3.Ad-mda7+TNFα处理增加外源MDA-7蛋白表达用Ad-mda7(1000-2000vp/细胞)、Ad-mda7+TNFα(10-20ng/ml)和Ad-mda7+抗TNF抗体(0.5-1ug/ml)处理接种在6孔板中的前列腺肿瘤细胞(LNCaP和DU145)。在处理后24小时收获细胞并就MDA-7蛋白的表达通过western印迹法对其进行分析。用Ad-mda7(2000vp/细胞)处理的LNCaP显示MDA-7表达。然而，用Ad-mda7+TNFα(20ng/ml)处理的细胞显示外源MDA-7蛋白表达的显著增加，其在抗TNF抗体(0.5ug/ml)存在的情况下被抑制。用Ad-mda7(1500vp/细胞)处理的LNCaP和DU145细胞显示MDA-7的表达。然而，用Ad-mda7+TNFα(10ng/ml)处理的细胞显示外源MDA-7蛋白表达的显著增加，其在抗TNF抗体(1.0ug/ml)存在的情况下被消除。4.TNFα增加转导效率在TNFα(10ng/ml)存在或不存在的情况下用100、300、600和1200vp/细胞的Ad-GFP处理肿瘤(LNCaP)细胞。不接受处理的细胞用作对照。在TNFα处理后24小时收获细胞，用PBS洗涤细胞3次，重悬浮于500ulPBS中并将其接受FACS分析。单独用Ad-GFP处理的细胞显示始于73.5％(对于100vp/细胞的Ad-GFP)的转导效率的剂量依赖性增加(图38)。然而，在TNFα存在的情况下，转导效率增加且观察到对100vp/细胞的Ad-GFP的转导效率为92.8％。在TNFα存在的情况下，转导的增加似乎从300vp/细胞的Ad-GFP起饱和。5.Ad-mda7+TNFα处理导致SubG0/G1期的细胞数目增加用PBS、TNFα(10ng/ml)、Ad-Luc(1500vp/细胞)、Ad-mda7(1500vp/细胞)、Ad-luc+TNF、Ad-mda7+TNF、Ad-luc+抗TNF抗体(1ug/ml)或Ad-mda7+抗TNF抗体处理肿瘤(LNCaP)细胞。在处理后48小时收获细胞，用PBS洗涤3次，重悬浮于500ul包含碘化丙啶的PBS(0.5ug/ml)中。将细胞接受FACS分析。与其他处理组(范围从0.45％至26.3％)相比，观察到大量用Ad-mda7+TNF处理的细胞处于在标志凋亡细胞的SubG0/G1期(70％)。********在本公开内容的教导下，可制备和实施此处公开和要求保护的所有组合物和方法而无需过多的实验。尽管已以优选的实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说很明显的是可对此处描述的组合物和方法以及在所述方法的步骤中或所述方法的步骤的顺序中产生变化而不背离本发明的构思、精神和范围。更特别地，很明显的是可用化学和生理学相关的某些试剂替代此处描述的试剂而仍可获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员来说是显而易见的所有这些相似的替代物和修饰被认为在所附的权利要求定义的本发明的精神、范围和构思之内。参考文献下列参考文献，就其提供示例性程序或为此处补充其他详细内容的程度，特别地以参考引用方式并入本文。美国专利4,196,265美国专利4,262,017美国专利4,554,101美国专利4,797,368美国专利4,870,287美国专利5,139,941美国专利5,179,122美国专利5,187,260美国专利5,399,363美国专利5,466,468美国专利5,543,158美国专利5,641,515美国专利5,739,169美国专利5,760,395美国专利5,801,005美国专利5,824,311美国专利5,830,880美国专利5,846,225美国专利5,846,233美国专利5,846,945美国专利6,858,227美国申请09/575,473美国申请09/615,154美国申请10/017,472美国申请10/378,590美国申请10/391,068美国申请10/791,692美国申请10/791,692美国申请60/661,680美国公开号20030147966美国公开号20030223938美国公开号20050143336Agnew等人，J.Chromatogr.BBiomed.Sci.Appl.，755(1-2)237-243，2001.Aksentijevich等人，Hum.GeneTher.，7(9)1111-1122，1996.Alberts等人，J.Cell.Biochem.Supp.，(22)18-23，1995.Amat等人，B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560TrpArgCysArgLeuArgLeuLysSerPheThrSerMetAspSerArg65707580SerAlaSerHisArgSerThrArgPheAlaAlaThrPheTyrAspIle859095GluThrLeuLysValIleAspGluGluTrpGlnArgThrGlnCysSer100105110ProArgGluThrCysValGluValAlaSerGluLeuGlyLysSerThr115120125AsnThrPhePheLysProProCysValAsnValPheArgCysGlyGly130135140CysCysAsnGluGluSerLeuIleCysMetAsnThrSerThrSerTyr145150155160IleSerLysGlnLeuPheGluIleSerValProLeuThrSerValPro165170175GluLeuValProValLysValAlaAsnHisThrGlyCysLysCysLeu180185190ProThrAlaProArgHisProTyrSerIleIleArgArgSerIleGln195200205IleProGluGluAspArgCysSerHisSerLysLysLeuCysProIle210215220AspMetLeuTrpAspSerAsnLysCysLysCysValLeuGlnGluGlu225230235240AsnProLeuAlaGlyThrGluAspHisSerHisLeuGlnGluProAla245250255LeuCysGlyProHisMetMetPheAspGluAspArgCysGluCysVal260265270CysLysThrProCysProLysAspLeuIleGlnHisProLysAsnCys275280285SerCysPheGluCysLysGluSerLeuGluThrCysCysGlnLysHis290295300LysLeuPheHisProAspThrCysSerCysGluAspArgCysProPhe305310315320HisThrArgProCysAlaSerGlyLysThrAlaCysAlaLysHisCys325330335ArgPheProLysGluLysArgAlaAlaGlnGlyProHisSerArgLys340345350AsnPro<210>21<211>1758<212>DNA<213>智人<400>21ctgctgtctgcggaggaaactgcatcgacggacggccgcccagctacgggaggacctgga60gtggcactgggcgcccgacggaccatccccgggacccgcctgcccctcggcgccccgccc120cgccgggccgctccccgtcgggttccccagccacagccttacctacgggctcctgactcc180gcaaggcttccagaagatgctcgaaccaccggccggggcctcggggcagcagtgagggag240gcgtccagccccccactcagctcttctcctcctgtgccaggggctccccgggggatgagc300atggtggttttccctcggagccccctggctcgggacgtctgagaagatgccggtcatgag360gctgttcccttgcttcctgcagctcctggccgggctggcgctgcctgctgtgccccccca420gcagtgggccttgtctgctgggaacggctcgtcagaggtggaagtggtacccttccagga480agtgtggggccgcagctactgccgggcgctggagaggctggtggacgtcgtgtccgagta540ccccagcgaggtggagcacatgttcagcccatcctgtgtctccctgctgcgctgcaccgg600ctgctgcggcgatgagaatctgcactgtgtgccggtggagacggccaatgtcaccatgca660gctcctaaagatccgttctggggaccggccctcctacgtggagctgacgttctctcagca720cgttcgctgcgaatgccggcctctgcgggagaagatgaagccggaaaggaggagacccaa780gggcagggggaagaggaggagagagaagcagagacccacagactgccacctgtgcggcga840tgctgttccccggaggtaacccaccccttggaggagagagaccccgcacccggctcgtgt900atttattaccgtcacactcttcagtgactcctgctggtacctgccctctatttattagcc960aactgtttccctgctgaatgcctcgctcccttcaagacgaggggcagggaaggacaggac1020cctcaggaattcagtgccttcaacaacgtgagagaaagagagaagccagccacagacccc1080tgggagcttccgctttgaaagaagcaagacacgtggcctcgtgaggggcaagctaggccc1140cagaggccctggaggtctccaggggcctgcagaaggaaagaagggggccctgctacctgt1200tcttgggcctcaggctctgcacagacaagcagcccttgctttcggagctcctgtccaaag1260tagggatgcggatcctgctggggccgccacggcctggctggtgggaaggccggcagcggg1320cggaggggatccagccacttccccctcttcttctgaagatcagaacattcagctctggag1380aacagtggttgcctgggggcttttgccactccttgtcccccgtgatctcccctcacactt1440tgccatttgcttgtactgggacattgttctttccggccaaggtgccaccaccctgccccc1500cctaagagacacatacagagtgggccccgggctggagaaagagctgcctggatgagaaac1560agctcagccagtggggatgaggtcaccaggggaggagcctgtgcgtcccagctgaaggca1620gtggcaggggagcaggttccccaagggccctggcacccccacaagctgtccctgcagggc1680catctgactgccaagccagattctcttgaataaagtattctagtgtggaaaaaaaaaaaa1740aaaaaaaaaaaaaaaaaa1758<210>22<211>170<212>PRT<213>智人<400>22MetProValMetArgLeuPheProCysPheLeuGlnLeuLeuAlaGly151015LeuAlaLeuProAlaValProProGlnGlnTrpAlaLeuSerAlaGly202530AsnGlySerSerGluValGluValValProPheGlnGluValTrpGly354045ArgSerTyrCysArgAlaLeuGluArgLeuValAspValValSerGlu505560TyrProSerGluValGluHisMetPheSerProSerCysValSerLeu65707580LeuArgCysThrGlyCysCysGlyAspGluAsnLeuHisCysValPro859095ValGluThrAlaAsnValThrMetGlnLeuLeuLysIleArgSerGly100105110AspArgProSerTyrValGluLeuThrPheSerGlnHisValArgCys115120125GluCysArgProLeuArgGluLysMetLysProGluArgArgArgPro130135140LysGlyArgGlyLysArgArgArgGluLysGlnArgProThrAspCys145150155160HisLeuCysGlyAspAlaValProArgArg165170<210>23<211>11<212>PRT<213>褐鼠(Rattusnorvegicus)<400>23LysThrSerGlnAsnIlePheGluAsnLeuAla1510<210>24<211>7<212>PRT<213>褐鼠<400>24AsnAlaSerProLeuGlnAla15<210>25<211>8<212>PRT<213>褐鼠<400>25HisGlnTyrTyrSerGlyTyrThr15<210>26<211>10<212>PRT<213>褐鼠<400>26GlyPheThrPheSerAspTyrHisMetAla1510<210>27<211>17<212>PRT<213>褐鼠<400>27SerIleThrLeuAspAlaThrTyrThrTyrTyrArgAspSerValArg151015Gly<210>28<211>10<212>PRT<213>褐鼠<400>28HisArgGlyPheSerValTrpLeuAspTyr1510权利要求1.用于在患者中治疗癌症的方法，其包括给患者提供MDA-7和COX-2抑制剂。2.权利要求1的方法，其中通过给患者施用包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸的组合物来给患者提供MDA-7，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表达。3.权利要求2的方法，其中所述组合物是药物可接受的组合物。4.权利要求2的方法，其中所述核酸存在于载体中。5.权利要求4的方法，其中所述载体是病毒载体。6.权利要求5的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。7.权利要求5的方法，其中所述载体是腺病毒载体。8.权利要求7的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。9.权利要求2的方法，其中经静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用MDA-7核酸组合物。10.权利要求2的方法，其中所述MDA-7核酸组合物包含一种或多种脂质。11.权利要求10的方法，其中所述组合物包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。12.权利要求1的方法，其中通过给患者施用包含纯化的MDA-7蛋白的组合物来给患者提供MDA-7。13.权利要求12的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用纯化的MDA-7蛋白组合物。14.权利要求1的方法，其中给患者提供包含COX-2抑制剂和i)纯化的MDA-7蛋白或ii)具有编码MDA-7的序列的核酸的组合物。15.权利要求1的方法，其中在提供COX-2抑制剂前后24小时内给患者提供MDA-7。16.权利要求15的方法，其中在提供COX-2抑制剂前后2小时内给患者提供MDA-7。17.权利要求15的方法，其中在提供COX-2抑制剂之前给患者提供MDA-7。18.权利要求15的方法，其中在提供MDA-7之前给患者提供COX-2抑制剂。19.权利要求1的方法，其中通过给患者施用COX-2抑制剂来给所述患者提供COX-2抑制剂。20.权利要求19的方法，其中所述COX-2抑制剂是塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、lumiracoxib或艾托考昔或其组合。21.权利要求1的方法，其中通过给患者施用COX-2抑制剂前体药物来给所述患者提供COX-2抑制剂。22.权利要求19或21的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用COX-2抑制剂或COX-2抑制剂前体药物。23.权利要求1的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。24.权利要求1的方法，其中所述癌症包含上皮癌细胞。25.权利要求1的方法，其还包括使患者接受放射疗法和/或化学疗法。26.权利要求25的方法，其中使患者接受放射疗法。27.权利要求26的方法，其中在提供MDA-7和COX-2抑制剂各自至少一次之后使患者接受放射疗法。28.权利要求27的方法，其中使患者接受亚致死剂量的放射疗法。29.权利要求1的方法，其还包括切除患者的肿瘤的全部或部分。30.权利要求29的方法，其中在肿瘤切除后给患者提供MDA-7和/或COX-2抑制剂。31.权利要求30的方法，其中至少通过对所得的瘤床施用组合物来给所述患者提供MDA-7和/或COX-2抑制剂。32.权利要求1的方法，其中多次给患者提供MDA-7和/或COX-2抑制剂。33.用于在患者中治疗乳腺癌的方法，其包括给患者施用i)包含编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体，其中所述核酸序列在能够在该患者中表达的启动子的控制之下；和，ii)COX-2抑制剂。34.权利要求33的方法，其中所述患者呈HER-2/neu阴性。35.权利要求33的方法，其还包括切除患者的一个或多个肿瘤的全部或部分。36.权利要求33的方法，其中所述腺病毒载体和COX-2抑制剂存在于一种或多种药物可接受的组合物中。37.权利要求33的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。38.权利要求33的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。39.权利要求33的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用腺病毒载体和/或COX-2抑制剂。40.权利要求33的方法，其中在施用COX-2抑制剂前后24小时内给所述患者施用腺病毒载体。41.权利要求40的方法，其中在提供COX-2抑制剂前后2小时内给所述患者施用腺病毒载体。42.权利要求33的方法，其中在施用COX-2抑制剂之前给患者施用腺病毒载体。43.权利要求33的方法，其中在施用腺病毒载体之前给患者提供COX-2抑制剂。44.权利要求33的方法，其中所述COX-2抑制剂是塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、lumiracoxib或艾托考昔或其组合。45.权利要求33的方法，其还包括使患者接受放射疗法、化学疗法和/或免疫疗法。46.权利要求33的方法，其还包括切除患者的肿瘤的全部或部分。47.权利要求46的方法，其中在肿瘤切除后给患者提供MDA-7和/或COX-2抑制剂。48.权利要求30的方法，其中给患者施用腺病毒和/或向所得的瘤床施用COX-2抑制剂。49.权利要求33的方法，其中多次给患者施用腺病毒和/或COX-2抑制剂。50.用于使癌细胞辐射敏化的方法，其包括给所述细胞提供一定量MDA-7和COX-2抑制剂。51.权利要求50的方法，其还包括使癌细胞接受辐射。52.权利要求51的方法，其中使所述癌细胞接受亚致死剂量的辐射。53.药物组合物，其包含a)COX-2抑制剂或COX-2抑制剂前体药物；和b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。54.权利要求53的药物组合物，其中所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。55.权利要求54的药物组合物，其中所述核酸是腺病毒载体。56.权利要求54的药物组合物，其中所述药物组合物包含COX-2抑制剂。57.权利要求56的药物组合物，其中所述COX-2抑制剂是塞来考昔。58.包含i)具有编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体和ii)COX-2抑制剂的药物组合物，其中所述核酸序列有效连接至启动子。59.用于治疗乳腺癌细胞的方法，其包括给患者提供MDA-7和COX-2抑制剂。60.用于在患者中治疗癌症的方法，其包括给患者提供MDA-7和Hsp90抑制剂。61.权利要求60的方法，其中通过给患者施用组合物来给所述患者提供MDA-7，所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表达。62.权利要求61的方法，其中所述组合物是药物可接受的组合物。63.权利要求61的方法，其中所述核酸存在于载体中。64.权利要求63的方法，其中所述载体是病毒载体。65.权利要求64的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至1013个病毒颗粒。66.权利要求64的方法，其中所述载体是腺病毒载体。67.权利要求66的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。68.权利要求61的方法，其中经静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用MDA-7核酸组合物。69.权利要求61的方法，其中所述MDA-7核酸组合物包含一种或多种脂质。70.权利要求69的方法，其中所述组合物包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。71.权利要求60的方法，其中通过给患者施用包含纯化的MDA-7蛋白的组合物来给所述患者提供MDA-7。72.权利要求71的方法，其中经静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用纯化的MDA-7蛋白组合物。73.权利要求60的方法，其中给患者提供包含Hsp90抑制剂和i)纯化的MDA-7蛋白或ii)具有编码MDA-7的序列的核酸的组合物。74.权利要求60的方法，其中在提供Hsp90抑制剂前后24小时内给患者提供MDA-7。75.权利要求74的方法，其中在提供Hsp90抑制剂前后2小时内给患者提供MDA-7。76.权利要求74的方法，其中在提供Hsp90抑制剂之前给患者提供MDA-7。77.权利要求74的方法，其中在提供MDA-7之前给患者提供Hsp90抑制剂。78.权利要求60的方法，其中通过给患者施用Hsp90抑制剂来给患者提供Hsp90抑制剂。79.权利要求78的方法，其中所述Hsp90抑制剂是格尔德霉素、或其衍生物或类似物、或其组合。80.权利要求79的方法，其中所述Hsp90抑制剂是格尔德霉素类似物。81.权利要求80的方法，其中所述格尔德霉素类似物是17-AAG。82.权利要求60的方法，其中通过给患者施用Hsp90抑制剂前体药物来给所述患者提供Hsp90抑制剂。83.权利要求78的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用Hsp90抑制剂或Hsp90抑制剂前体药物。84.权利要求60的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。85.权利要求60的方法，其中所述癌症包含上皮癌细胞。86.权利要求60的方法，其还包括使患者接受放射疗法和/或化学疗法。87.权利要求60的方法，其还包括切除患者的肿瘤的全部或部分。88.权利要求87的方法，其中在肿瘤切除后给患者提供MDA-7和/或Hsp90抑制剂。89.权利要求88的方法，其中至少通过向所得的瘤床施用组合物来给患者提MDA-7和/或Hsp90抑制剂。90.权利要求60的方法，其中多次给患者提供MDA-7和/或Hsp90抑制剂。91.用于在患者中治疗肺癌的方法，其包括给患者施用i)包含编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体，其中所述核酸序列在能够在该患者中表达的启动子的控制之下；和，ii)Hsp90抑制剂。92.权利要求91的方法，其还包括切除患者的一个或多个肿瘤的全部或部分。93.权利要求91的方法，其中所述腺病毒载体和Hsp90抑制剂存在于一种或多种药物可接受的组合物中。94.权利要求91的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。95.权利要求91的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。96.权利要求91的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管和/或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用腺病毒载体和/或Hsp90抑制剂。97.权利要求91的方法，其中在施用Hsp90抑制剂前后24小时内给患者施用腺病毒载体。98.权利要求97的方法，其中在施用Hsp90抑制剂前后2小时内给患者施用腺病毒载体。99.权利要求91的方法，其中在施用Hsp90抑制剂之前给患者施用腺病毒载体。100.权利要求91的方法，其中在施用腺病毒载体之前给患者提供Hsp90抑制剂。101.权利要求91的方法，其中所述Hsp90抑制剂是格尔德霉素、或其衍生物或类似物、或其组合。102.权利要求91的方法，其还包括使患者接受放射疗法、化学疗法和/或免疫疗法。103.权利要求91的方法，其还包括切除患者的肿瘤的全部或部分。104.权利要求103的方法，其中在肿瘤切除后给患者提供MDA-7和/或Hsp90抑制剂。105.权利要求88的方法，其中给患者施用腺病毒和/或向所得的瘤床施用Hsp90抑制剂。106.权利要求91的方法，其中多次给患者施用腺病毒和/或Hsp90抑制剂。107.药物组合物，其包含a)Hsp90抑制剂或Hsp90抑制剂前体药物；和b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。108.权利要求107的药物组合物，其中所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。109.权利要求108的药物组合物，其中所述核酸是腺病毒载体。110.权利要求108的药物组合物，其中所述药物组合物包含Hsp90抑制剂。111.权利要求110的药物组合物，其中所述Hsp90抑制剂是格尔德霉素或17-GAA。112.包含i)具有编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体和ii)Hsp90抑制剂的药物组合物，其中所述核酸序列有效连接至启动子。113.用于治疗肺癌细胞的方法，其包括给患者提供MDA-7和Hsp90抑制剂。114.用于在患者中治疗癌症的方法，其包括给患者提供MDA-7和MDA-7联合剂。115.权利要求114的方法，其中所述联合剂是COX-2抑制剂。116.权利要求114的方法，其中所述联合剂是Hsp90抑制剂。117.权利要求114的方法，其中所述联合剂是维生素E化合物。118.用于在患者中治疗癌症的方法，其包括给患者提供MDA-7和维生素E化合物。119.权利要求118的方法，其中通过给患者施用组合物来给所述患者提供MDA-7，所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表达。120.权利要求119的方法，其中所述组合物是药物可接受的组合物。121.权利要求119的方法，其中所述核酸存在于载体中。122.权利要求121的方法，其中所述载体是病毒载体。123.权利要求122的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。124.权利要求122的方法，其中所述载体是腺病毒载体。125.权利要求124的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。126.权利要求119的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用MDA-7核酸组合物。127.权利要求119的方法，其中所述MDA-7核酸组合物包含一种或多种脂质。128.权利要求127的方法，其中所述组合物包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。129.权利要求118的方法，其中通过给患者施用包含纯化的MDA-7蛋白的组合物来给患者提供MDA-7。130.权利要求129的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用纯化的MDA-7蛋白组合物。131.权利要求118的方法，其中对于每次治疗给患者提供大约5至500mg的维生素E化合物。132.权利要求118的方法，其中以固体或干粉的形式给患者提供维生素E化合物。133.权利要求118的方法，其中以包含一种或多种脂质体的组合物形式给患者提供维生素E化合物。134.权利要求118的方法，其中通过给患者施用包含生育酚或其酯化形式的组合物来给患者提供维生素E化合物。135.权利要求134的方法，其中所述生育酚是α生育酚。136.权利要求134的方法，其中所述酯化形式是生育酚醋酸酯或生育酚琥珀酸酯。137.权利要求136的方法，其中所述组合物包含α生育酚琥珀酸酯。138.权利要求118的方法，其中给患者提供组合物，所述组合物包含维生素E化合物，或其酯化形式，和i)纯化的MDA-7蛋白或ii)具有编码MDA-7的序列的核酸。139.权利要求118的方法，其中在提供维生素E化合物前后24小时内给患者提供MDA-7。140.权利要求139的方法，其中在提供维生素E化合物前后2小时内给患者提供MDA-7。141.权利要求139的方法，其中在提供维生素E化合物之前给患者提供MDA-7。142.权利要求139的方法，其中在提供MDA-7之前给患者提供维生素E化合物。143.权利要求134的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用维生素E化合物。144.权利要求118的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。145.权利要求118的方法，其中所述癌症包含上皮癌细胞。146.权利要求118的方法，其还包括使患者接受放射疗法和/或化学疗法。147.权利要求118的方法，其还包括切除患者的肿瘤的全部或部分。148.权利要求147的方法，其中在肿瘤切除后给患者提供MDA-7和/或维生素E化合物。149.权利要求148的方法，其中至少通过对所得的瘤床施用组合物来给患者提MDA-7和/或维生素E化合物。150.权利要求118的方法，其中多次给患者提供MDA-7和/或维生素E化合物。151.用于在患者中治疗癌症的方法，其包括给患者施用i)包含编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体，其中所述核酸序列处在能够在该患者中表达的启动子的控制之下；和，ii)α生育酚或α生育酚的酯化形式。152.权利要求151的方法，其中给患者施用α生育酚琥珀酸酯或α生育酚醋酸酯。153.权利要求151的方法，其还包括切除患者的一个或多个肿瘤的全部或部分。154.权利要求151的方法，其中所述腺病毒载体和α生育酚或α生育酚的酯化形式存在于一种或多种药物可接受的组合物中。155.权利要求151的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。156.权利要求151的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。157.权利要求151的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管和/或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用腺病毒载体和/或α生育酚或α生育酚的酯化形式。158.权利要求151的方法，其中在施用α生育酚或α生育酚的酯化形式前后24小时内给患者施用腺病毒载体。159.权利要求158的方法，其中在施用α生育酚或α生育酚的酯化形式前后2小时内给患者施用腺病毒载体。160.权利要求151的方法，其中在施用α生育酚或α生育酚的酯化形式之前给患者施用腺病毒载体。161.权利要求151的方法，其中在施用腺病毒载体之前给患者提供α生育酚或α生育酚的酯化形式。162.权利要求151的方法，其还包括使患者接受放射疗法、化学疗法和/或免疫疗法。163.权利要求151的方法，其还包括切除患者的肿瘤的全部或部分。164.权利要求163的方法，其中在肿瘤切除后给患者提供MDA-7和/或α生育酚或α生育酚的酯化形式。165.权利要求148的方法，其中给患者施用腺病毒和/或施用α生育酚或α生育酚的酯化形式至所得的瘤床。166.权利要求151的方法，其中多次给患者施用腺病毒和/或α生育酚或α生育酚的酯化形式。167.药物组合物，其包含a)维生素E化合物；和b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。168.权利要求167的药物组合物，其中所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。169.权利要求168的药物组合物，其中所述核酸是腺病毒载体。170.权利要求168的药物组合物，其中所述药物组合物包含为α生育酚或其酯化形式的维生素E化合物。171.权利要求170的药物组合物，其中所述α生育酚是α生育酚琥珀酸酯。172.包含i)具有编码MDA-7的核酸序列的腺病毒载体和ii)α生育酚或α生育酚琥珀酸酯的药物组合物，其中所述核酸序列有效连接至启动子。173.药物组合物，其包含a)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸，和b)MDA-7联合剂。174.用于在患者中治疗或预防肺癌的方法，其包括给患者施用包含编码MDA-7蛋白的多核苷酸、DOTAP和胆固醇的药物可接受的组合物。175.权利要求174的方法，其中编码MDA-7蛋白的多核苷酸包括表达构建体。176.权利要求174的方法，其中所述组合物包含脂质体。177.权利要求176的方法，其中所述脂质体是DOTAP胆固醇纳米颗粒。178.权利要求174的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌、小细胞肺癌或转移性肺癌。179.权利要求174的方法，其中所述方法是在患者中治疗转移性肺癌的方法。180.权利要求174的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管和/或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用组合物。181.用于在患者中治疗癌症的方法，其包括给患者提供MDA-7和肿瘤坏死因子(TNF)。182.权利要求181的方法，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。183.权利要求182的方法，其中所述TNF是TNFα。184.权利要求181的方法，其中通过给患者施用组合物来给所述患者提供MDA-7，所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表达。185.权利要求184的方法，其中所述组合物是药物可接受的组合物。186.权利要求184的方法，其中所述核酸存在于载体中。187.权利要求186的方法，其中所述载体是病毒载体。188.权利要求187的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。189.权利要求186的方法，其中所述载体是腺病毒载体。190.权利要求189的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。191.权利要求184的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用MDA-7核酸组合物。192.权利要求184的方法，其中所述MDA-7核酸组合物包含一种或多种脂质。193.权利要求192的方法，其中所述组合物包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。194.权利要求181的方法，其中通过给患者施用包含纯化的MDA-7蛋白的组合物来给患者提供MDA-7。195.权利要求194的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用纯化的MDA-7蛋白组合物。196.权利要求181的方法，其中通过给患者施用组合物来给所述患者提供TNF，所述组合物包含具有编码TNF的序列的核酸，其中所述TNF在所述患者中表达。197.权利要求196的方法，其中所述组合物是药物可接受的组合物。198.权利要求196的方法，其中所述核酸存在于载体中。199.权利要求198的方法，其中所述载体是病毒载体。200.权利要求199的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至1013个病毒颗粒。201.权利要求199的方法，其中所述载体是腺病毒载体。202.权利要求201的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。203.权利要求196的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用TNF核酸组合物。204.权利要求196的方法，其中所述TNF核酸组合物包含一种或多种脂质。205.权利要求204的方法，其中所述组合物包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。206.权利要求196的方法，其中通过给患者施用包含纯化的TNF的组合物来给患者提供TNF。207.权利要求206的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用纯化的TNF组合物。208.权利要求181的方法，其中给患者提供组合物，所述组合物包含a)纯化的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7的序列的核酸；和b)纯化的TNF或具有编码TNF的序列的核酸。209.权利要求208的方法，其中给患者提供包含TNF和i)纯化的MDA-7蛋白或ii)具有编码MDA-7的序列的核酸的组合物。210.权利要求209的方法，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。211.权利要求210的方法，其中所述TNF是TNFα。212.权利要求181的方法，其中在提供TNF前后24小时内给患者提供MDA-7。213.权利要求212的方法，其中在提供TNF前后2小时内给患者提供MDA-7。214.权利要求212的方法，其中在提供TNF之前给患者提供MDA-7。215.权利要求212的方法，其中在提供MDA-7之前给患者提供TNF。216.权利要求181的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。217.权利要求181的方法，其中所述癌症包含上皮癌细胞。218.权利要求181的方法，其还包括使患者接受放射疗法和/或化学疗法。219.权利要求218的方法，其中使患者接受放射疗法。220.权利要求218的方法，其中在提供MDA-7和TNF各自至少一次后使患者接受放射疗法。221.权利要求220的方法，其中使患者接受亚致死剂量的放射疗法。222.权利要求181的方法，其还包括切除患者的肿瘤的全部或部分。223.权利要求222的方法，其中在肿瘤切除后给患者提供MDA-7和/或TNF。224.权利要求223的方法，其中至少通过对所得的瘤床施用组合物来给所述患者提供MDA-7和/或TNF。225.权利要求181的方法，其中多次给患者提供MDA-7和/或TNF。226.药物组合物，其包含a)纯化的且有活性的TNF或具有编码TNF的序列的核酸；和b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。227.权利要求226的药物组合物，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。228.权利要求227的药物组合物，其中所述TNF是TNFα。229.权利要求226的药物组合物，其中所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。230.权利要求229的药物组合物，其中具有编码MDA-7多肽的序列的核酸是腺病毒载体。231.权利要求226的药物组合物，其中所述组合物包含具有编码TNF的序列的核酸。232.权利要求231的药物组合物，其中具有编码TNF的序列的核酸是腺病毒载体。233.药物组合物，所述药物组合物包含i)具有编码MDA-7的核酸序列的第一腺病毒载体，其中所述核酸序列有效连接至第一启动子；和ii)具有编码TNF的序列的第二腺病毒载体，其中所述核酸序列有效连接至第二启动子。234.权利要求233的药物组合物，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。235.权利要求234的药物组合物，其中所述TNF是TNFα。236.包含具有编码MDA-7的第一核酸序列和编码TNF的第二核酸序列的腺病毒载体的药物组合物。237.权利要求236的药物组合物，其中所述TNF是TNFα、TNFβ、TNFγ、TNFδ或TNFε。238.权利要求237的药物组合物，其中所述TNF是TNFα。239.权利要求236的药物组合物，其中第一核酸序列和第二核酸序列有效连接至启动子。240.权利要求236的药物组合物，其中第一核酸序列有效偶联至第一启动子，且第二核酸序列有效偶联至第二启动子。241.用于在患者中治疗癌症的方法，其包括提供MDA-7和血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂。242.权利要求241的方法，其中所述抑制剂特异性结合VEGF或VEGF受体。243.权利要求242的方法，其中所述VEGF抑制剂是DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、蛋白、多肽、肽或小分子。244.权利要求242的方法，其中所述VEGF抑制剂是抗体。245.权利要求244的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。246.权利要求245的方法，其中所述单克隆抗体是抗VEGF或VEGF受体的单克隆抗体。247.权利要求246的方法，其中所述单克隆抗体是抗VEGF的单克隆抗体。248.权利要求246的方法，其中所述单克隆抗体是贝伐单抗。249.权利要求243的方法，其中所述VEGF抑制剂是小分子。250.权利要求249的方法，其中所述小分子是VEGF的酪氨酸激酶抑制剂。251.权利要求243的方法，其中所述VEGF的抑制剂是核酶。252.权利要求251的方法，其中所述核酶是特异性靶向VEGFmRNA或VEGF受体mRNA的核酶。253.权利要求243的方法，其中所述VEGF抑制剂是可溶性VEGF受体。254.权利要求241的方法，其中通过给患者施用组合物来给所述患者提供MDA-7，所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸，其中所述MDA-7多肽在所述患者中表达。255.权利要求254的方法，其中所述组合物是药物可接受的组合物。256.权利要求254的方法，其中所述核酸存在于载体中。257.权利要求256的方法，其中所述载体是病毒载体。258.权利要求257的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。259.权利要求257的方法，其中所述载体是腺病毒载体。260.权利要求259的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。261.权利要求254的方法，其中经静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用MDA-7核酸组合物。262.权利要求254的方法，其中所述MDA-7核酸组合物包含一种或多种脂质。263.权利要求262的方法，其中所述组合物包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。264.权利要求241的方法，其中通过给患者施用包含纯化的MDA-7蛋白的组合物来给患者提供MDA-7。265.权利要求264的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用纯化的MDA-7蛋白组合物。266.权利要求241的方法，其中通过给患者施用包含具有编码VEGF抑制剂的序列的核酸的组合物来给所述患者提供VEGF抑制剂，其中所述VEGF抑制剂在所述患者中表达。267.权利要求266的方法，其中所述VEGF抑制剂是DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、蛋白、多肽、肽或小分子。268.权利要求267的方法，其中所述VEGF抑制剂是抗体。269.权利要求268的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。270.权利要求269的方法，其中所述单克隆抗体是抗VEGF或VEGF受体的单克隆抗体。271.权利要求270的方法，其中所述单克隆抗体是抗VEGF的单克隆抗体。272.权利要求271的方法，其中所述单克隆抗体是贝伐单抗。273.权利要求267的方法，其中所述VEGF抑制剂是小分子。274.权利要求273的方法，其中所述小分子是VEGF受体的酪氨酸激酶抑制剂。275.权利要求267的方法，其中所述VEGF抑制剂是核酶。276.权利要求274的方法，其中所述核酶是特异性靶向VEGFmRNA或VEGF受体mRNA的核酶。277.权利要求276的方法，其中所述VEGF抑制剂是可溶性VEGF受体。278.权利要求266的方法，其中所述组合物是药物可接受的组合物。279.权利要求266的方法，其中所述核酸存在于载体中。280.权利要求279的方法，其中所述载体是病毒载体。281.权利要求280的方法，其中，每次施用，给患者施用大约109至大约1013个病毒颗粒。282.权利要求280的方法，其中所述载体是腺病毒载体。283.权利要求282的方法，其中用鱼精蛋白配制腺病毒载体。284.权利要求266的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用所述组合物。285.权利要求266的方法，其中所述组合物包含一种或多种脂质。286.权利要求285的方法，其中所述组合物包含DOTAP和胆固醇或其衍生物。287.权利要求241的方法，其中通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管或通过灌洗直接局部灌注浸浴靶细胞来给患者施用生长因子的抑制剂。288.权利要求241的方法，其中给患者提供至少下列物质a)纯化的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7的序列的核酸；和b)特异性结合VEGF的单克隆抗体。289.权利要求288的方法，其中所述单克隆抗体是贝伐单抗。290.权利要求289的方法，其中在提供贝伐单抗前后24小时内给患者提供MDA-7。291.权利要求290的方法，其中在提供贝伐单抗前后2小时内给患者提供MDA-7。292.权利要求290的方法，其中在提供贝伐单抗之前给患者提供MDA-7。293.权利要求289的方法，其中在提供MDA-7之前给患者提供贝伐单抗。294.权利要求241的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、牙龈癌、舌癌、白血病、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。295.权利要求241的方法，其中所述癌症包含上皮癌细胞。296.权利要求241的方法，其还包括使患者接受放射疗法和/或化学疗法。297.权利要求296的方法，其中使患者接受放射疗法。298.权利要求297的方法，其中在提供MDA-7和贝伐单抗各自至少一次之后使患者接受放射疗法。299.权利要求297的方法，其中使患者接受亚致死剂量的放射疗法。300.权利要求241的方法，其还包括切除患者的肿瘤的全部或部分。301.权利要求300的方法，其中在肿瘤切除后给患者提供MDA-7和/或生长因子的抑制剂。302.权利要求300的方法，其中至少通过对所得的瘤床施用组合物来给所述患者提供MDA-7和/或生长因子的抑制剂。303.权利要求241的方法，其中多次给患者提供MDA-7和/或贝伐单抗。304.药物组合物，其包含a)VEGF抑制剂或具有编码VEGF抑制剂的序列的核酸；和b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。305.权利要求304的药物组合物，其中所述VEGF抑制剂是DNA、RNA、寡核苷酸、核酶、蛋白、多肽、肽或小分子。306.权利要求305的药物组合物，其中所述VEGF抑制剂是抗体。307.权利要求306的药物组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。308.权利要求307的药物组合物，其中所述单克隆抗体是抗VEGF或VEGF受体的单克隆抗体。309.权利要求308的药物组合物，其中所述单克隆抗体是抗VEGF的单克隆抗体。310.权利要求309的药物组合物，其中所述单克隆抗体是贝伐单抗。311.权利要求305的药物组合物，其中所述VEGF抑制剂是小分子。312.权利要求311的药物组合物，其中所述小分子是VEGF受体的酪氨酸激酶抑制剂。313.权利要求305的药物组合物，其中所述VEGF的抑制剂是核酶。314.权利要求313的药物组合物，其中所述核酶是特异性靶向VEGFmRNA或VEGF受体mRNA的核酶。315.权利要求305的药物组合物，其中所述VEGF抑制剂是可溶性VEGF受体。316.权利要求304的药物组合物，其中所述组合物包含具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。317.权利要求304的药物组合物，其中具有编码MDA-7多肽的序列的核酸是腺病毒载体。318.权利要求304的药物组合物，其中所述组合物包含具有编码VEGF抑制剂的序列的核酸。319.权利要求304的药物组合物，其中具有编码VEGF抑制剂的序列的核酸是腺病毒载体。320.药物组合物，其包含(a)贝伐单抗，和(b)纯化的且有活性的MDA-7蛋白或具有编码MDA-7多肽的序列的核酸。全文摘要本发明涉及包含MDA-7蛋白或编码MDA-7的核酸联合1)COX-2的选择性抑制剂例如塞来考昔、2)Hsp90的抑制剂例如格尔德霉素或格尔德霉素衍生物或类似物、3)用于治疗癌症的维生素E化合物、4)TNF例如TNFα、5)VEGF抑制剂或6)IL-10的抑制剂的方法和组合物。在某些实例中，提供了对乳腺癌的治疗法。在其他实例中提供了对肺癌的治疗法。在一些情况下，这些实例包括表达MDA-7蛋白的腺病毒载体。文档编号A61K38/17GK101166539SQ200680011374公开日2008年4月23日申请日期2006年2月8日优先权日2005年2月8日发明者K·K·亨特,Y-J·徐,S·G·斯威舍,A·巴特尔,R·拉米什,M·尚克申请人:得克萨斯大学体系董事会