硬化素与Wnt信号通路和骨形成的抑制的制作方法

专利名称：硬化素与Wnt信号通路和骨形成的抑制的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质硬化素(sclerostin)，该蛋白质是Wnt蛋白质的拮抗剂和/或 抑制剂。当硬化素结合LRP5受体或LRP6受体(LRP5/6)时，抑制Wnt信号并因此抑制骨形 成。本发明涉及硬化素在治疗骨折、骨疾病、骨损伤、骨异常、肿瘤或生长方面的治疗方法、 组合物和应用领域。更具体地，组合物和方法指向阻断硬化素的化合物，从而允许骨形成发 生。通过多种筛选方法和测定从美国国立癌症研究所(NCI)的数据库确定化合物。这些化 合物还可以被修饰来以创建在NCI数据库中或自然界中没有的但也具有有效功能的衍生 物或类似物。在本申请中引用的或指明的所有专利、专利申请、专利公开、科学文献等，都被整 体引入此处作为参考，来更全面的揭示发明所属领域的技术水平。
背景技术：
分泌性糖蛋白中的Wnt家族是发育中重要信号分子的主要家族之一，在胚胎诱 导、产生细胞极性和规范细胞命运中扮演重要角色。遗传和生化研究都表明frizzled(Fz) 和LRP5/6是传导经典Wnt (canonical ffnt)信号的共受体，最终导致β -连环蛋白 (β-catenin)稳定化并通过转录调控子调控基因转录，所述转录调控子包括淋巴增强 因子-I(LEF-I)和T细胞因子(TCF)。Wnt信号还受到一些天然产生的拮抗剂，包括 Dickkopf(Dkk)分子的调控。最初，第一个Dkk(Xen0pusDkk-l)最初被发现作为Wnt拮抗 剂在头部形成中扮演重要角色。到目前为止，在哺乳动物中已经确定了 4个Dkk成员。不 过只有前两个成员(Dkkl和Dkk2)作为经典Wnt信号拮抗剂的功能被研究比较透彻。Dkkl 和Dkk2通过同时结合LRP5/6和一个被称为Kremen的单独跨膜蛋白来拮抗经典Wnt信号。 进一步研究发现Dkkl和Dkk2的第二个(不是第一个)富含半胱氨酸结构域抑制经典Wnt 信号。许多证据表明增强LRP5/6介导的经典Wnt信号导致骨量增加。LRP5中发生失去 功能性突变引起人骨质疏松假神经胶质瘤综合征(0PPG，是一种常染色体隐性遗传疾病)， 据推测获得功能突变(包括谷氨酸171-缬氨酸替换)和人高骨量(HBM)表型相关。此外， 通过基因打靶使LRP5基因失活的小鼠显示出和OPPG患者相似的表型，并且在小鼠中转基 因表达LRP5emv导致HBM。并且，小鼠原代成骨细胞在缺乏LRP5时显示出降低的对Wnt的应 答性和低水平的增殖指数。并且，在类成骨细胞中，经典Wnt或激活的β-连环蛋白刺激经 典Wnt信号活性并诱导产生一种成骨细胞标志物-碱性磷酸酯酶(AP)。Wnt拮抗剂sFRPl失活增强小梁骨增长的发现进一步支持了经典Wnt信号增强骨形成的观点。Dkkl在分化的 成骨细胞和骨细胞中表达，并且LRP5中的G171V突变有可能通过衰减Dkkl对经典Wnt信 号的拮抗效果引起HBM表型。Itasaki等人揭示了一个新的Wnt拮抗剂，被称为WISE。WISE有可能是一种环境 依赖的(context-d印endenOWnt信号调节子；它在非洲蟾蜍中的不同检测中可以抑制或 刺激Wnt信号。WISE还显示出结合LRP6的活性，并且和Wnt8竞争结合LRP6。WISE和SOST 的基因产物硬化素具有38%的氨基酸一致性。SOST的失去功能性突变导致常染色体隐性 遗传硬化素骨病。以前的实验显示，硬化素在骨细胞中高表达，有可能是骨形态发生蛋白 (BMP)拮抗剂，不过另外的研究认为硬化素可能不是有功能的BMP拮抗剂，并且推测它可能 调节Wnt信号。在本报告中，我们现在清楚的证明硬化素能结合LRP5和LRP6，并且是Wnt 拮抗剂。因为成骨分化中硬化素表达发生在Wnt7b表达高峰之后，降低硬化素介导的Wnt 信号拮抗作用有助于增加SOST相关的骨量。发明概述本发明针对于解决与骨重建相关的一些问题的方法和组合物，例如骨质疏松和其 它骨疾病。本发明还提供了组合物在帮助治愈骨折或其它骨损伤或异常方面的应用。特别 的，发明提供了在哺乳动物受试者中促进骨形成的方法，包括向受试者给予有效量防止硬 化素的结合的化合物。本发明进一步提供了用于以骨形成不足为特征的临床病症的基因治疗方法，该方 法包括给予有效量的防止硬化素的结合的化合物或者通过引起硬化素表达降低。在本发明的其它方面，硬化素或相关蛋白的基因表达、检测和定量可用作多种骨 疾病的潜在诊断方法。本发明还指向解决肿瘤或其它骨生长的方法和组合物。本发明已经鉴定了化合物，当将所述化合物提供给细胞时，能结合、相互作用或装 配到(fitinto)参与刺激、增强、抑制或调节骨形成或骨重建的共受体的结构域中发现的 位点或空腔中。这些受体包括LRP5受体、LRP6受体、frizzled受体或任何其它的和LRP5 或LRP6 (LRP5/6)受体系统有关的受体。使用专利申请10/849，067所述的筛选方法鉴定化合物。发现这些化合物破坏硬 化素和LRP5/6的相互作用。其它化合物通过抑制Wnt结合LRP5/6来抑制Wnt信号。本发 明的化合物是非天然的或是细胞中不存在的但来自于外界来源的外源性化合物。具体而 言，发现鉴定的化合物IIIC3 (NCI8642)和IIC8 (NCI366218)能破坏硬化素和LRP5/6的相互作 用。如图5所示，加入111C3或11C8后，硬化素-AP(硬化素和碱性磷酸酯酶的融合蛋白) 和LRP5的结合下降。化合物结合于LRP5/6，并且因此防止硬化素的结合，阻断了 Wnt并有 可能抑制骨形成。发明详述因为WISE和硬化素具有同源性，进行实验来确定硬化素是否能对经典Wnt信号产 生效果。使用基于LEF-I的报告基因检测法在人胚肾(HEK)细胞中测定了含有小鼠硬化素 的调整后的培养基(CM)对Wnt3a诱导的经典Wnt信号激活的效果。含有硬化素的CM显示 出显著的剂量依赖方式的Wnt3a活性抑制(图1A)。因为对照CM在50微升下开始显示显著 的抑制作用，所以没有检测更高的剂量。为了进一步证实硬化素的这种效果，在HEK细胞中共表达硬化素和其它经典Wnt (Wntl)，且硬化素对共表达的Wnt-I的活性显示出高达60% 的抑制作用(图1B，柱2&4)。有趣的是，LRP5的共表达能消除硬化素对Wnt信号的拮抗效 果，并且在存在共表达的LRP5情况下还观察到硬化素轻微刺激Wntl信号(图1B，柱6&8)。 还在成骨细胞系MC3T3中检测了硬化素对Wnt信号的效果。在MC3T3细胞中表达硬化素还 显示出对Wnt-I激活的报告基因活性高达70%的抑制效果(图1C，柱2&4)。再一次，LRP5 的表达逆转该抑制(图1C，柱6&8)。不过，当使硬化素和LRP5与Wnt —起表达时，Wntl的 活性在MC3T3细胞中没有增加(图1C)。然而，所有这些结果清楚地表明，当LRP5以内源水 平表达时硬化素具有拮抗被经典Wnt激活的经典Wnt活性。为了了解硬化素如何拮抗经典信号，进行实验来确定硬化素是否直接结合到 LRP5/6上。采用Dkkl-AP中使用的相同方法测定了硬化素-碱性磷酸酶(AP)融合蛋白对 表达外源LRP5或LRP6的细胞的结合。如图2A所示，硬化素-AP显示出和Dkkl-AP相似的 LRP6结合曲线，提示硬化素-AP具有和Dkkl-AP相当的对LRP6的亲和力，对DKK-IAP的亲和 力已经在以前测定为亚纳摩尔级。硬化素-AP和Dkkl-AP结合到表达LRP5的细胞上表明硬 化素-AP和Dkkl-AP也具有相似的对LRP5的亲和力(图2B)。为了描绘LRP5的哪个结构域 用于结合硬化素-AP，我们检测了硬化素-AP结合分别缺乏第一个或最后一个双YWTD-EGF 重复结构域的两种LRP5突变体。这些突变体分别被命名为LRP5R12或LRP5R34(图2E)。 Dkkl-AP能结合两种LRP5突变体(图2D)，硬化素-AP只能结合LRP5R12，而不能结合 LRP5R34 (图 2C)。我们以前已经发现LRP5R12还能转导Wnt信号，表明这种LRP5突变体仍然保留有 Wnt结合序列。为了确定硬化素和Wnt是否互相竞争结合LRP5R12，在存在或不存在Wnt3aCM 的条件下测定硬化素-AP和表达LRP5R12的细胞之间的结合。Wnt3a的存在不影响硬化 素-AP和LRP5R12的结合(图3A)。相反，Dkkl的存在能完全阻断硬化素-AP和LRP5R12 的结合(图3B)。为了尝试进一步描绘LRP5上的硬化素结合序列，构建了另外两个LRP5 突变体，它们分别缺乏第二个到第四个YWTD-EGF重复结构域，和缺乏第一个、第三个和第 四个YWTD-EGF重复结构域。不过，这两个LRP5突变体既不能结合硬化素-AP也不能结合 Dkkl-ΑΡ,并且不能转导Wnt信号。这些结果暗示，硬化素结合于LRP5或者结合于错误折叠 的这些LRP5突变体需要第一、第二 YWTD-EGF重复结构域。已经发现一些第一 YWTD-EGF重复结构域的LRP5突变体和HBM相关。我们以前已 经表征了这些突变体中的一个(G171V)并且发现这个突变体干扰LRP5和它的伴侣Mesd的 相互作用，导致LRP5很少运输到细胞表面。因为该LRP5突变体还能够在细胞内传导用于 自分泌Wnts的信号，所以人们认为这种突变体可以通过保护细胞内LRP5受体免受细胞外 拮抗剂例如Dkkl的影响来增强Wnt信号，因为Dkkl在骨细胞中高表达。已知在骨和骨细 胞中表达的硬化素作为新型Wnt拮抗剂的发现可以为G171V突变的效果提供另一种解释， 所述突变位于第一个YWTD-EGF重复结构域并位于硬化素结合区域内部。这些解释中的一 个可能是G171V突变体直接干扰LRP5和硬化素的结合。为了检测这个可能性，我们测定并 比较了硬化素-AP、LRP5G171V之间的结合和Dkkl-ΑΡ、LRP5G171V之间的结合。如我们以 前所示，因为突变对伴侣功能的干扰，表达LRP5GV的细胞和Dkkl-AP的表观结合比表达野 生型LRP5的细胞低5倍(图3C)。相似的，表达LRP5GV的细胞也显示出相同程度的硬化 素-AP结合下降(图3B)。和G171V突变不直接干扰LRP5和Dkkl的相互作用一样，该突变也不太可能干扰LRP5和硬化素的相互作用。LRP5GV在和野生型LRP5相同的剂量范围内还 可以逆转硬化素介导的抑制Wnt活性作用(图1B、C)，这一观察进一步支持了 G171V突变 不干扰LRP5或LRP6和Dkkl的相互作用的观点。以前已经显示硬化素主要在骨细胞中表达。我们在原代颅盖成骨细胞分化过程中 检测了硬化素表达和Wnt7B表达的相关性。我们以前已经鉴定Wnt7b(—种能稳定β-连 环蛋白的经典Wnt)是唯一一个在原代骨髓成骨细胞分化中表达水平显示剧烈变化的Wnt。 相似地，在颅盖成骨细胞分化过程中Wnt7b的表达水平显示剧烈变化；第8天时Wnt7b表 达达到峰值，随后降低到低水平，在成骨标志物骨钙素和另一个Wnt拮抗剂Dkkl的表达之 前(图4A)。主要在小鼠long骨早期未分化成骨细胞中检测出Wnt7b mRNA(图4B)的原位 杂交，进一步证实了对于Wnt7b表达的结论。硬化素的表达显示出一种和骨钙素相似的时 间曲线，并且仅发生在分化后期阶段，推测此时矿化基质中的骨细胞正在形成(图4A)。硬 化素的这种表达模式和以前在体内观察到的硬化素在埋在骨基质中的骨细胞中表达是相 一致的，并且可能在机械负荷(mechanical loading)中起到一定作用。以硬化素和Wnt7b 的表达模式为基础，我们提出假说，认为硬化素促成G171V相关的HBM表型，纵使硬化素不 能直接干扰Wnt的结合或者突变不能影响硬化素结合到LRP5上。根据我们的假说，G171V 突变可以在不减小突变受体对自分泌Wnt的信号能力的情况下让受体回避旁分泌拮抗剂， 只由分化良好的成骨细胞或骨细胞产生的硬化素有可能是被认为是和野生型LRP5相比结 合LRP5G171V更差的这种旁分泌拮抗剂中的一种。因此，G171V突变不仅可以通过Dkkl，还 可以通过硬化素和骨中潜在的其它旁分泌Wnt拮抗剂减弱经典Wnt信号的拮抗作用来增强 Wnt活性。在以前的实验中，硬化素显示出充当BMP拮抗剂的角色。令人信服的表明硬化素 对BMP6和BMP7有合理的高亲和性。不过，只能通过在成骨细胞中加入配体后3_6天检测 BMP诱导的碱性磷酸酶(AP)活性来测定硬化素对BMP的生物学效果。这种AP活性信息显 示对于BMP活性不是特异性的。事实上，在这些类型的细胞中经典Wnt也能刺激AP活性。 相反，我们的Wnt报告基因检测对于经典Wnt是特异性的，并且在HEK细胞中不能被BMP激 活(数据没有显示)。此外，在检测中使用CM，我们测定了 6小时硬化素的效果(图1A)。 鉴于最近观察到硬化素不能抑制BMP引发的早期应答，我们相信更有可能情况的是硬化素 是生物学上的一种经典Wnt拮抗剂，并且它对骨量的效果可能主要是其对经典Wnt信号拮 抗效果的结果。如图2所示，硬化素结合到LRP5的第一个双YWTD-EGF重复结构域，这也是传导 Wnt信号所需要的。不过，我们的证据暗示，硬化素的拮抗效果不可能是因为和Wnt直接竞 争LRP结合，因为l)Wnt3a不能抑制硬化素-AP结合LRP5 ；2)LRP5能逆转硬化素对经典Wnt 信号的抑制效果。后面的现象暗示Dkkl对Wnt信号的效果(Wnt信号的Dkkl抑制)也能 被外源表达的LRP5/6所逆转。LRP5/6分子具有逆转Dkk效果的能力是因为Dkk介导的拮 抗作用需要另一种蛋白Kremen。当Kremen和LRP5/6共表达时，Dkk介导的抑制作用能被 恢复。虽然Kremen对硬化素介导的拮抗作用没有效果，不过我们猜测硬化素使用了相似的 机制来抑制Wnt信号。换句话说，有可能需要象Kremen这样的辅助蛋白来让硬化素发挥有 效的拮抗剂功能。最近，已经发现noggin直接和硬化素相互作用，并且抑制noggin的能力 来抑制BMP信号。因此，一旦noggin结合硬化素就有可能抑制硬化素的能力，来调节Wnt信号。此外，硬化素显示出在存在外源LRP5或LRP5GV情况下能轻微刺激LEF-I报告基因 的活性，这暗示硬化素在特定环境下甚至在哺乳动物系统中可能是部分激动剂。本发明提供了促进或调节骨形成或骨重建的方法，包括给予至少一种非天然化合 物、非天然化合物片段或它们的任何组合。非天然化合物的定义是在哺乳动物受试者中尤 其是在人体中非天然存在的一种化合物。非天然化合物还可以包括和在人体中天然存在的 化合物相同的人工制造化合物。当非天然化合物结合到涉及骨形成或骨重建的受体或共受 体上时，硬化素的结合被阻止，因此允许骨形成。两个或更多个非天然化合物可以通过交联直接连接在一起，例如，或通过连接臂 非直接地连接。每个这些连接的化合物可以被对接(dock)到相同的结合位点、蛋白质或受 体中的不同位置上。每个这些连接的化合物还可以被对接到不同的结合位点、蛋白质或受 体中的不同位置上。化合物或化合物的片段可以是小分子、蛋白质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分 子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学药物。化 合物或片段还可以是激动剂、拮抗剂、部分激动剂或上述的任何组合；化合物可以通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、 粘膜的、舌下、局部的、直肠的或皮下给药。本发明还提供了一种鉴定化合物或候选药物的方法，所述化合物或候选药物将能 够结合到参与蛋白-蛋白相互作用的信号肽或蛋白上抑制或促进后续事件的发生。特别 是，化合物或候选药物将结合到受体蛋白上来抑制或促进骨形成或骨重建。第一步包括通 过使用多种方法例如氨基酸测序、X射线衍射晶体分析、核磁共振、受体蛋白的类似物或衍 生物或者上述方法的任何组合来确定受体蛋白的实际或计算结构。在一个优选的实施例 中，蛋白是不溶的或膜结合的。下一步骤包括通过使用基于生物功能的实验，包括突变分析、化学修饰(例如对 氨基酸)、共结晶、核磁共振或上述方法的任何组合来确定受体蛋白中的特定的结合腔位点 或结构域。使用这些实验获得的结果(例如突变和化学修饰)确定化合物或候选药物将结 合的结合腔中的特定结合位点或结构域。整个结合腔或腔内特定结合位点可被用于筛选适 合(fit)并结合的化合物。使用UNITY 程序进行筛选。通过使用Flexx 程序使化合物对 接到腔内。随后使用Cscore 程序选择具有最高结合亲和力或最低结合能的化合物。最终 的目标是选择一种最适的化合物或候选药物。本发明的一个优选的实施方案是通过给予硬化素来防止或阻断哺乳动物受试者 中骨形成的方法。本发明的另一个优选的实施方案是治疗异常骨生长的方法，包括给予硬化素抗 体、或者给予任何其它的降低或清除硬化素的、或者降低或消除硬化素和参与骨形成或骨 重建的受体或共受体之间的亲和力的化合物或化合物片段。材料与方法细胞培养、转染、制备CM和荧光素酶检测如前所述地维持和转染人胚肾细胞系(HEK)A293T和小鼠成骨细胞系MC3T3。为 了进行荧光素酶检测，以5X IO4细胞/孔将细胞接种到24孔板中并使用Lipofectamine Plusdnvitrogen, CA)按照产品说明书以0. 5 μ g DNA/孔进行转染。通常使用LacZ质粒，使每个转染的DNA浓度相等。转染24小时后收集细胞提取物。如前所述进行荧光素酶检 测。根据GFP的荧光强度标准化发光强度。为了制备含有DKKl-AP和硬化素-AP的CMJf HEK细胞以4X IO5细胞/孔接种到6孔板中并以1 μ g DNA/孔转染。转染后48小时收集 CM。表达质粒的构建和诱变通过使用高保真耐热DNA聚合酶Pfu Ultra (Stratagene，CA)进行PCR制备人 LRP5、LRP6、小鼠Wnt 1、DKKl、硬化素和DKK-2野生型和突变形式。通过DNA测序验证核苷 酸序列。在全长和突变分子的C末端引入HA或Flag表位标签。通过CMV启动子驱动这些 分子的表达。Dr. Grosschedl提供了 LEF-I报告基因构建体。DKKl-AP和硬化素-AP结合检测用LRP5及其突变体转染24孔板中的HEK细胞。1天后，用冷的清洗缓冲液(含有 BSA和NaN3的HBBS)清洗细胞并在冰上和小鼠DKKl-AP或硬化素-AP CM孵育2小时。随 后，用清洗缓冲液清洗细胞3次并裂解。裂解产物在65°C加热10分钟，并用Tropix发光 AP检测试剂盒测定它的AP活性。基本上如前所述进行免疫沉淀检测。原代颅盖成骨细胞培养如前所述地制备来自于5天龄小鼠的小鼠颅盖成骨细胞培养物，并在存在SmM β -磷酸甘油和50ug/ml抗坏血酸的条件下诱导发生成骨分化。每2天更换培养基。定量PCR分析使用TRIzoI试剂(Invitrogen)根据产品说明书分离总RNA。为了进行QPCR分析， 使用用于RT-PCR的superscript 第一链合成系统(Invitrogen)对RNA进行逆转录。使 用 QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒(Qiagen)在 DNA Engine OPT I CON (MJ Research 公司制)仪器设备上进行QPCR。每个样品都使用肌动蛋白作为内部参照。使用以前所 述的公式，根据β -肌动蛋白mRNA水平标准化mRNA水平的相对变化。原位杂交使用Wnt7b的全长编码区合成反义和正义探针。使用RNALabeling试剂盒(Roche， Indianapolis, IN,USA)用Digoxigenin标记探针。来自于3周龄小鼠的胫骨切片脱蜡，再 水合并用4%多聚甲醛再次固定。用2%甘氨酸和蛋白酶K处理切片并用乙酸酐/TEA溶 液乙酰化，随后和digoxygenin标记的探针杂交。用50%甲酰胺、5XSSC、5% SDS在70°C 清洗切片两次，每次30分钟，随后用50 %甲酰胺、2XSSC在65 °C下清洗，随后切片和抗 digoxigenin碱性磷酸酶抗体孵育，随后和Nitro Blue etrazolium/4-溴-5-氯吲哚磷酸 盐孵育来产生蓝紫色。切片还用甲基绿(核)和橙黄G(细胞质)复染。


图1.硬化素拮抗经典Wnt信号。A)硬化素CM对Wnt3a CM的效果。Wnt3a CM(25ul)和不同数量的硬化素CM(SCM) 或对照CM(CCM)混合并加入到用LEF-I报告基因转染的HEK细胞中。6小时后，裂解细胞， 测定荧光素酶活性。将没有SCM条件下的活性定为100%。Wnt3a CM使报告基因活性增 加5倍。通过抗Flag抗体(插入)检测带有Flag标签的硬化素的表达。B，C)在HEK (B) 和MC3T3(C)细胞中共表达的硬化素对Wntl信号的效果。用如图所示的编码Wntl、硬化素(Scl)、野生型LRP5 (Wt)或G171VLRP5 (GV)的cDNA和LEF-I受体基因以及GFP表达质粒转 染细胞。1天后，裂解细胞，测定GFP水平和荧光素酶活性并根据GFP水平标准化。图2.硬化素-AP结合LRP5及其突变体A, B) Dkkl-AP和硬化素-AP结合全长的LRP6、LRP5或LacZ。用全长LRP6 (A)或 LRP5 (B)转染HEK细胞。如方法中所述测定Dkkl-AP或硬化素-AP (Scl)的结合。和转染 有对照质粒LacZ的细胞的结合作为非特异性结合被减去。特异性结合列于表中。B，C) Dkkl-AP和硬化素-AP结合LRP5突变体。如所示用LacZ或LRP5突变体转染HEK细胞。测 定硬化素-AP (C)和Dkkl-AP (D)的结合。(E)LRP5突变体的图示。图3. Wnt3a、Dkkl和LRP5突变体对硬化素结合的效果。A)用LRP5转染HEK细胞。测定在存在对照CM(CCM)或Wnt3a CM(WCM, IOOul)的 情况下硬化素-AP (5ul)的结合。B)用LRP5R12转染HEK细胞。测定在存在缓冲液或重组 Dkkl (IOnM)的情况下硬化素_AP(50ul)的结合。C)用LRP5 (黑色条柱)或者LRP5G171V(白 色条柱)转染的HEK细胞。测定Dkkl-AP (Dkk)或硬化素-AP (Scl)的结合。在所有这些结 合检测中，转染有对照质粒LacZ的细胞的结合都作为非特异性结合被减去。特异性结合列 于表中。图4. Wnt7b、硬化素、Dkkl和骨钙素的表达。A)由5天龄小鼠建立原代颅盖成骨细胞培养物。在第5天加入分化诱导剂。如 方法中所述通过QRT-PCR测定Wnt7b、硬化素(scl)、骨钙素(OC)和Dkkl的相对表达水平。 B)使用原位杂交测定Wnt7b在小鼠long中的表达。Wnt7b (黑色染色)主要在成骨细胞中 检测到。核被复染为绿色。图5. IIIC3和IIC8对硬化素-AP结合LRP5的效果。A)骨形成的抑制和IIIC3存在的量呈负相关。加入的IIIC3越多，骨形成抑制百 分比越低。B)加入IIC8越多，骨形成抑制百分比越低。
权利要求
促进骨形成或骨重建的方法，包括给予防止硬化素与参与骨形成或骨重建的受体或共受体结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
2.促进骨形成或骨重建的方法，包括给予防止硬化素与LRP5或LRP6受体结合的至少 一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
3.促进骨形成或骨重建的方法，包括给予防止硬化素与LRP5或LRP6受体的同系物结 合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
4.促进骨形成或骨重建的方法，包括给予防止硬化素与LRP5或LRP6受体的至少一个 结构域结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
5.促进骨形成或骨重建的方法，包括给予防止硬化素与LRP5或LRP6受体的第一个或 第二个结构域结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组I=I ο
6.权利要求1到5的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或IIC8。
7.权利要求1到5的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3、IIC8或它 们的任意衍生物或类似物。
8.权利要求6或7的方法，其中所述两种或更多种化合物或所述化合物片段通过交联 直接地连接在一起，或通过连接臂间接地连接在一起。
9.权利要求8的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到相 同结合位点、受体或蛋白质上的第一个位置和第二个位置。
10.权利要求8的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 不同结合位点、受体或蛋白质上的第一个位置和第二个位置。
11.权利要求1到5的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通过连接臂或交联连接 到一起。
12.权利要求1到11的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白质、 肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖蛋 白、糖脂、脂蛋白、化学药品、或包括杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性 脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学药品的化合物的片段。
13.权利要求1到5的方法，其中所述给药步骤包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、肌 肉内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜的、舌下、局部的、直肠的或皮下给药或它们的任何 组合进行给药。
14.权利要求1到12的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一种激动剂、 拮抗剂、部分激动剂或它们的任何组合。
15.权利要求1到14的方法，其中所述化合物用下述方法鉴定，该方法包括a.使用UNITY 程序筛选适合进入受体上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序将所述化合物对接进入腔；和c.使用Cscore 程序获得具有最高结合亲和力的化合物。
16.治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常的方法，包括给予防止硬化素 与参与骨形成或骨重建的受体或共受体结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化 合物片段或它们的任何组合。
17.治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常的方法，包括给予防止硬化素与LRP5或LRP6受体结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
18.治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常的方法，包括给予防止硬化素 与LRP5或LRP6受体的同系物结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段， 或它们的任何组合。
19.权利要求16到18的方法，其中所述化合物包括IIIC3或IIC8。
20.权利要求16到18的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或IIC8。
21.权利要求19或20的方法，其中所述两种或更多种化合物或所述化合物片段通过交 联直接地连接在一起，或通过连接臂间接地连接在一起。
22.权利要求21的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 相同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
23.权利要求21的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 不同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
24.权利要求16到18的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通过连接臂或交联连 接到一起。
25.权利要求16到24的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白质、 肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖蛋 白、糖脂、脂蛋白、化学药品、或包括杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性 脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学药品的化合物的片段。
26.权利要求16到18的方法，其中所述给药步骤包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、 肌肉内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜的、舌下、局部的、直肠的或皮下给药或它们的任 意组合进行给药。
27.权利要求16到25的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一种激动 剂、拮抗剂、部分激动剂或它们的任何组合。
28.权利要求16到27的方法，其中所述化合物用下述方法鉴定，所述方法包括a.使用UNITY 程序筛选适合进入受体上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序将所述化合物对接进入腔；和c.使用Cscore 程序获得具有最高结合亲和力的化合物。
29.治疗组合物，用于治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常，包括防止硬 化素与骨形成或骨重建中的受体或共受体结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然 化合物片段，或它们的任何组合。
30.治疗组合物，用于治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常，包括防止硬 化素与LRP5或LRP6受体结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它 们的任何组合。
31.治疗组合物，用于治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常，包括防止硬 化素与LRP5或LRP6受体的同系物结合的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物 片段或它们的任何组合。
32.权利要求29到30的组合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或 IIC8。
33.权利要求29到31的组合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3、IIC8 或它们的任意衍生物或类似物。
34.权利要求32或33的组合物，其中所述两种或更多种化合物或化合物片段通过交联 直接地连接在一起，或通过连接臂间接地连接在一起。
35.权利要求34的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 相同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
36.权利要求34的组合物，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接 到不同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
37.权利要求29到31的组合物，其中所述化合物或所述化合物片段通过连接臂或交联 连接到一起。
38.权利要求29到37的组合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白 质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖 蛋白、糖脂、脂蛋白、化学药品、或包括杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极 性脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学药品的化合物的片段。
39.权利要求29到31的组合物，其中所述给药步骤包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜 内、肌肉内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜的、舌下、局部的、直肠的或皮下给药或它们的 任意组合进行给药。
40.权利要求29到38的组合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一种激动 剂、拮抗剂、部分激动剂或它们的任何组合。
41.权利要求29到40的组合物，其中所述非天然化合物用下述方法鉴定，所述方法包括a.使用UNITY 程序筛选适合进入受体上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序将所述化合物对接进入腔；和c.使用Cscore 程序获得具有最高结合亲和力的化合物。
42.权利要求29到41的组合物，其中所述组合物进一步包括药学上可接受的载体。
43.权利要求29到41的组合物，其中所述组合物被配制为片剂、丸剂、锭剂、液体、凝 胶、胶囊、糖浆、膏剂或悬浮液。
44.调节骨形成或骨重建的方法，包括给予破坏硬化素和参与骨形成或骨重建的受体 或共受体之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的 任何组合。
45.调节骨形成或骨重建的方法，包括给予破坏硬化素和LRP5或LRP6受体之间的相互 作用的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
46.调节骨形成或骨重建的方法，包括给予破坏硬化素和LRP5或LRP6受体的同系物之 间的相互作用至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
47.调节骨形成或骨重建的方法，包括给予破坏硬化素和LRP5或LRP6受体的至少一个 结构域之间的相互作用至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段，或它们的任 何组合。
48.调节骨形成或骨重建的方法，包括给予破坏硬化素和LRP5或LRP6受体的第一个或 第二个结构域之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段，或它们的任何组合。
49.权利要求44到48的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或IIC8。
50.权利要求44到48的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3、或IIC8 或它们的任意衍生物或类似物。
51.权利要求49或50的方法，其中所述两种或更多种化合物或所述化合物片段通过交 联直接地连接在一起，或通过连接臂间接地连接在一起。
52.权利要求51的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 相同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
53.权利要求51的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 不同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
54.权利要求44到48的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通过连接臂或交联连 接到一起。
55.权利要求44到54的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白质、 肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖蛋 白、糖脂、脂蛋白、化学药品、或包括杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性 脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学药品的化合物的片段。
56.权利要求44到48的方法，其中所述给药步骤包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、 肌肉内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜的、舌下、局部的、直肠的或皮下给药或它们的任 意组合进行给药。
57.权利要求44到55的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一种激动 剂、拮抗剂、部分激动剂或它们的任何组合。
58.权利要求44到57的方法，其中所述化合物用下述方法鉴定，所述方法包括a.使用UNITY 程序筛选适合进入受体上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序将所述化合物对接进入腔；和c.使用Cscore 程序获得具有最高结合亲和力的化合物。
59.治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常的方法，包括给予破坏硬化素 和参与骨形成或骨重建的受体或共受体之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一 种非天然化合物片段或它们的任何组合。
60.治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常的方法，包括给予破坏硬化素 和LRP5或LRP6受体之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片 段或它们的任何组合。
61.治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常的方法，包括给予破坏硬化素 和LRP5或LRP6受体的同系物之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一种非天然 化合物片段或它们的任何组合。
62.治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常的方法，包括给予破坏硬化素 和LRP5或LRP6受体的至少一个结构域之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一 种非天然化合物片段或它们的任何组合。
63.治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常的方法，包括给予破坏硬化素 和LRP5或LRP6受体的第一个或第二个结构域之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
64.权利要求59到63的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或IIC8。
65.权利要求59到63的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3、IIC8或 它们的任意衍生物或类似物。
66.权利要求64或65的方法，其中所述两种或更多种化合物或所述化合物片段通过交 联直接地连接在一起，或通过连接臂间接地连接在一起。
67.权利要求66的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 相同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
68.权利要求66的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 不同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
69.权利要求59到63的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通过连接臂或交联连 接到一起。
70.权利要求59到69的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白质、 肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖蛋 白、糖脂、脂蛋白、化学药品、或包括杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性 脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学药品的化合物的片段。
71.权利要求59到63的方法，其中所述给药步骤包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、 肌肉内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜的、舌下、局部的、直肠的或皮下给药或它们的任 意组合进行给药。
72.权利要求59到69的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一种激动 剂、拮抗剂、部分激动剂或它们的任何组合。
73.权利要求59到72的方法，其中所述非天然化合物用下述方法鉴定，所述方法包括a.使用UNITY 程序筛选适合进入受体上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序将所述化合物对接进入腔；和c.使用Cscore 程序获得具有最高结合亲和力的化合物。
74.治疗组合物，用于治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常，包括破坏硬 化素和参与骨形成或骨重建的受体或共受体之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至 少一种化合物的片段或它们的任何组合。
75.治疗组合物，用于治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常，包括破坏硬 化素和LRP5或LRP6受体之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一种化合物片段 或它们的任何组合。
76.治疗组合物，用于治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常，包括破坏硬 化素和LRP5或LRP6受体的同系物之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至少一种化 合物片段或它们的任何组合。
77.治疗组合物，用于治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常，包括破坏硬 化素和LRP5或LRP6受体的至少一个结构域之间的相互作用的至少一种非天然化合物、至 少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
78.治疗组合物，用于治疗哺乳动物受试者骨折、骨疾病、骨损伤或骨异常，包括破坏硬化素和LRP5或LRP6受体的第一个或第二个结构域之间的相互作用的至少一种非天然化合 物、至少一种非天然化合物片段或它们的任何组合。
79.权利要求74到78的组合物，其中所述化合物包括IIIC3或IIC8。
80.权利要求74到78的组合物，其中所述化合物包括IIIC3、IIC8或它们的任意衍生 物或类似物。
81.权利要求79或80的组合物，其中所述两种或更多种化合物或所述化合物片段通过 交联直接地连接在一起，或通过连接臂间接地连接在一起。
82.权利要求81的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 相同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
83.权利要求81的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它们的任何组合，对接到 不同结合位点、受体或蛋白质的第一个位置和第二个位置。
84.权利要求74到78的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通过连接臂或交联连 接到一起。
85.权利要求74到84的组合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白 质、肽、多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖 蛋白、糖脂、脂蛋白、化学药品、或包括杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极 性脂质、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化学药品的化合物的片段。
86.权利要求74到78的组合物，其中所述给药步骤包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜 内、肌肉内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜的、舌下、局部的、直肠的或皮下给药或它们的 任意组合进行给药。
87.权利要求74到86的组合物，其中所述非天然化合物用下述方法鉴定，所述方法包括a.使用UNITY 程序筛选适合进入受体上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序将所述化合物对接进入腔；和c.使用Cscore 程序获得具有最高结合亲和力的化合物。
88.权利要求74到87的组合物，其中所述组合物进一步包括药学上可接受的载体。
89.权利要求74到87的组合物，其中所述组合物被配制为片剂、丸剂、锭剂、液体、凝 胶、胶囊、糖浆、膏剂或悬浮液。
90.通过给予硬化素防止或阻断哺乳动物受试者中骨形成的方法。
91.治疗哺乳动物受试者中异常骨生长的方法，包括给予硬化素的抗体或任意的减少 或清除硬化素的其他非天然化合物或化合物片段。
92.权利要求91的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白质、肽、 多肽、环状分子、杂环有机分子、核酸、脂质、带电脂质、极性脂质、非极性脂质、糖、糖蛋白、 糖脂、脂蛋白或化学药品。
93.权利要求91或92的方法，其中所述给药步骤包括通过吸入、口服、静脉内、腹膜内、 肌肉内、肠胃外、透皮、阴道内、鼻内、粘膜的、舌下、局部的、直肠的或皮下给药或它们的任 意组合进行给药。
94.权利要求90到92的方法，其中所述硬化素包括相关蛋白、带有类似功能的不相关 蛋白或者硬化素的任意同系物或衍生物。
95.治疗组合物，包含用于防止或阻断哺乳动物受试者中的骨形成的硬化素。
96.防止或阻断哺乳动物受试者中骨形成的治疗组合物，包含硬化素抗体或任意的减 少或清除硬化素的其它非天然化合物或化合物片段。
97.权利要求91到96的方法或组合物，其中所述非天然化合物用下述方法鉴定，所述 方法包括a.使用UNITY 程序筛选适合进入受体上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序将所述化合物对接进入腔；和c.使用Cscore 程序获得具有最高结合亲和力的化合物。
98.鉴定促进或抑制蛋白_蛋白相互作用的候选药物或化合物的方法，包括a.确定受体蛋白的实际结构；b.鉴定所述受体蛋白中的特定结合腔；c.鉴定所述结合腔中的特异性位点；和d.筛选适合进入所述特异性位点的化合物。
99.权利要求98的方法，进一步包括使用Cscore 程序鉴定具有最高结合亲和力的化 合物的步骤。
100.权利要求98的方法，其中所述鉴定特定的结合腔的步骤包括根据化合物的生物 功能进行实验。
101.权利要求100的方法，其中所述实验包括突变分析。
102.权利要求98的方法，其中所述受体蛋白是不溶性的或膜结合的。
103.鉴定促进或抑制蛋白_蛋白相互作用的候选药物或化合物的方法，包括a.确定受体蛋白的实际结构；b.鉴定所述受体蛋白中的特定结合腔；c.鉴定所述结合腔中的特异性位点；和d.使用UNITY 程序筛选适合进入所述特异性位点的化合物；e.使用Flexx 程序所述将化合物对接进入腔内；和f.使用Cscore 程序获得具有最高结合亲和力的化合物。
104.权利要求103的方法，其中所述鉴定特定的结合腔的步骤包括根据化合物的生物 功能进行实验。
105.权利要求104的方法，其中所述实验包括突变分析。
106.权利要求103的方法，其中所述受体蛋白是不溶性的或膜结合的。
107.鉴定与参与骨形成或骨重建的受体蛋白结合的候选药物化合物的方法，包括a.确定不可溶受体蛋白的实际或计算结构，包括使用氨基酸测序、X射线衍射晶体分 析、核磁共振、所述受体蛋白的类似物或衍生物或者它们的任何组合；b.使用基于生物功能的实验，包括突变分析、氨基酸化学修饰、共结晶、核磁共振或它 们的任何组合来鉴定所述受体蛋白中的特定结合腔；c.根据突变或化学修饰鉴定所述结合腔中的特异性的结合位点；d.使用UNITY 程序筛选适合进入所述特异性位点的化合物；和e.使用Cscore 程序鉴定具有最高结合亲和力或最低能量的化合物来找到最造化合物。
108.鉴定与参与骨形成或骨重建的受体蛋白结合的候选药物化合物的方法，包括a.确定信号肽的实际或计算结构，包括使用氨基酸测序、X射线衍射晶体分析、核磁共 振、所述信号肽的类似物或衍生物或者它们的任何组合；b.使用基于生物功能的实验，包括突变分析、化学修饰、共结晶、核磁共振或它们的任 何组合来鉴定所述受体蛋白中的特定结合腔；c.根据所述实验获得的结果鉴定所述结合腔中的特异性的结合位点；d.使用UNITY 程序筛选适合进入所述结合腔或所述结合腔中的所述特异性位点的化 合物；e.使用Flexx 程序将所述化合物对接进入到所述结合腔或所述结合腔中的所述特异 性位点中；和f.使用Cscore 程序鉴定具有最高结合亲和力或最低能量的化合物。
109.鉴定与参与信号转导系统的蛋白相结合的候选药物或化合物的方法，包括a.提供或确定所述蛋白的实际或计算结构，包括使用氨基酸测序、X射线衍射晶体分 析、核磁共振、所述受体蛋白的类似物或衍生物或者它们的任何组合；b.使用多种实验，包括突变分析、氨基酸化学修饰、共结晶、核磁共振或它们的任何组 合来鉴定所述蛋白中的特定结合腔、位点或结构域；c.根据所述实验的结果鉴定所述结合腔、位点或结构域中的特异性的结合位点；和d.筛选候选药物化合物库来鉴定最适合于所述特异性结合位点或所述结合腔、位点或 结构域的候选药物或化合物。
110.鉴定与参与信号转导系统的不可溶蛋白或膜结合蛋白相结合的候选药物或化合 物的方法，包括a.提供或确定所述蛋白的实际或计算结构，包括使用氨基酸测序、X射线衍射晶体分 析、核磁共振、所述受体蛋白的类似物或衍生物或者它们的任何组合；b.使用多种实验，包括突变分析、氨基酸化学修饰、共结晶、核磁共振或它们的任何组 合来鉴定所述蛋白的特定结合腔、位点或结构域；c.根据所述实验的结果鉴定所述结合腔、位点或结构域中的特异性的结合位点；和d.筛选候选药物化合物库来鉴定最适合于所述特异性结合位点或所述结合腔、位点或 结构域的候选药物或化合物。
111.鉴定与参与Wnt信号传导途径的蛋白相结合的候选药物或化合物的方法，包括a.提供或确定所述蛋白的实际或计算结构，包括使用氨基酸测序、X射线衍射晶体分 析、核磁共振、所述受体蛋白的类似物或衍生物或者它们的任何组合；b.使用多种实验，包括突变分析、氨基酸化学修饰、共结晶、核磁共振或它们的任何组 合来鉴定所述蛋白的特定结合腔、位点或结构域；c.根据所述实验的结果鉴定所述结合腔、位点或结构域中的特异性的结合位点；和d.筛选候选药物化合物库来鉴定最适合于所述特异性结合位点或所述结合腔、位点或 结构域的候选药物或化合物。
112.鉴定与参与信号转导系统的蛋白相结合的候选药物或化合物以用于促进或抑制 骨生长的方法，包括a.提供或确定所述蛋白的实际或计算结构，包括使用氨基酸测序、X射线衍射晶体分析、核磁共振、所述受体蛋白的类似物或衍生物或者它们的任何组合；b.使用多种实验，包括突变分析、氨基酸化学修饰、共结晶、核磁共振或它们的任何组 合来鉴定所述蛋白的特定结合腔、位点或结构域；C.根据所述实验的结果鉴定所述结合腔、位点或结构域中的特异性的结合位点；和 d.筛选候选药物化合物库来鉴定最适合于所述特异性结合位点或所述结合腔、位点或 结构域的候选药物或化合物。
113.用于调节骨形成或骨重建的方法，包括给予减少或消除硬化素对参与骨形成或骨 重建的受体或共受体的亲和力的至少一种非天然化合物、至少一种非天然化合物片段或它 们的任何组合。
全文摘要
SOST基因产物硬化素丢失会导致特征为高骨量(HBM)的硬化性骨化病。在这个报告中，我们发现硬化素能拮抗人胚肾A293细胞系和小鼠成骨细胞MC3T3中的经典Wnt信号通路。这种硬化素介导的拮抗作用可以被过量表达Wnt共受体LRP5所逆转。另外，我们发现硬化素能与LRP5和LRP6结合，并且识别用于结合的LRP5的第一个双YWTD-EGF重复结构域。虽然诱导经典Wnt信号需要这两个重复结构域，不过经典Wnt没有显示出和硬化素竞争结合LRP5。在初期颅盖成骨细胞分化中检测硬化素和Wnt7b(自分泌经典的Wnt)的表达，发现硬化素在成骨细胞分化后期表达，和成骨标志物骨钙素的表达同时发生，并尾随在Wnt7b表达之后。因为大量的证据表明经典Wnt信号刺激成骨作用，所以我们认为与硬化素缺失相关的HBM表型有可能至少部分归因于硬化素介导的Wnt拮抗作用降低所导致的经典Wnt信号增强。
文档编号A61K38/17GK101888849SQ200680012943
公开日2010年11月17日 申请日期2006年3月17日 优先权日2005年3月18日
发明者D·D·吴, X·李 申请人:康涅狄格州大学