杨梅素在制备BMP-Smad通路小分子抑制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了杨梅素在制备BMP-Smad通路小分子抑制剂中的应用。实验发现，小分子杨梅素能显著抑制Smad1/5/8的磷酸化水平，进而抑制住BMP-Smad介导的下游信号通路。基于其天然、绿色、安全的特性，杨梅素为因BMP-Smad紊乱引起的疾病治疗提供了可能，特别在相关疾病的临床药物开发有着潜在的应用。
【专利说明】杨梅素在制备BMP-Smad通路小分子抑制剂中的应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及杨梅素在制备BMP-Smad通路小分子抑制剂中的应用。
(二)【背景技术】
[0002]骨形态发生蛋白(bone morphogehetic proteins, BMPs)是转化生长因子-ρ(transforming growth factor-β , TGF-β )超家族的一员，最初从矿化的骨骼中提取出来，并发现其能够诱导异位骨的生长。BMPs是分泌型蛋白，存在于细胞外，并且可以在血清中检测到。细胞外的BMPs与细胞膜上的BMP受体(BMPR)结合后导致受体激酶的激活，活化的受体会磷酸化细胞内的Smadl/5/8,其与Smad4形成复合物后进入到细胞核内，结合到DNA序列上，从而调节BMP靶基因的转录。BMP-Smad信号通路受到多种机制的精细调节，尤其是受到一些负反馈调节作用，如受体的内吞，Smads的去磷酸化和信号分子的降解等。
[0003]BMP-Smad信号通路调节干细胞的自我更新和分化，细胞的增殖、迁移和凋亡，以及胚胎发育和出生后组织体内稳态的维持。BMP-Smad信号通路在肿瘤发生中也起着十分重要的作用。最近越来越多的人和小鼠的遗传学研究已证明，BMP-Smad的自我平衡在机体的生理过程中扮演着重要的角色，如在骨代谢、干细胞、神经细胞、铁代谢以及肿瘤的形成中起着重要作用。因此，无论是增强或抑制BMP-Smad都有着重要的生理意义及应用，尤其是BMP-Smad通路的小分子抑制剂在干细胞研究、骨骼重塑治疗、异位骨化以及铁代谢治疗方面有着潜在的意义。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供杨梅素在制备BMP-Smad通路小分子抑制剂中的应用，为防治BMP-Smad紊乱引起的疾病提供新的药物。
[0005]本发明采用的技术方案是:
[0006]杨梅素在制备BMP-Smad通路小分子抑制剂中的应用。
[0007]杨梅素是一种天然的黄酮醇，是存在于许多水果、蔬菜、浆果及药材等植物中的黄酮类化合物。杨梅素是红葡萄酒中的酚类化合物之一。杨梅素可抗氧化。体外研究表明，高浓度的杨梅素可降低低密度脂蛋白胆固醇。芬兰的一项研究发现，高杨梅素摄入的人群其前列腺癌的发生率较低。一项历时8年的研究发现，山柰酚、槲皮素和杨梅素可降低吸烟者患胰腺癌的风险。目前，杨梅素被广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品。美国保健品药FYI使用杨梅素用作治疗预防关节炎和各种炎症，尤其对怀孕妇女和哺乳期婴儿适合使用。
[0008]此前，在人源肝癌细胞H印G2中，发明人发现小分子杨梅素能显著抑制BMP-Smad通路下游基因铁调素Hepcidin的表达。基于此，进一步研究发现，杨梅素能在体外显著降低Smadl/5/8信号通路的磷酸化水平， 进而抑制住下游通路基因的转录，并呈现较强的时间、剂量依赖性。通过BMP-Smad信号通路激动剂BMP6的刺激，实验发现杨梅素能显著抑制BMP6引起的Smadl/5/8的磷酸化水平的增加。此外，通过荧光素酶报告基因手段，实验发现杨梅素能够显著抑制BMP6对BMP-Smad通路下游通路基因的转录。[0009]综上，小分子杨梅素能显著抑制Smadl/5/8的磷酸化水平,进而抑制住BMP-Smad介导的下游信号通路。基于其天然、绿色、安全的特性，杨梅素为因BMP-Smad紊乱引起的疾病治疗提供了可能，特别在相关疾病的临床药物开发有着潜在的应用，如抑制因铁调素Hepcidin上升引起的铁代谢紊乱疾病；抑制产后骨骼的再生成疾病、抑制异位骨化如进行性肌肉骨化症等骨骼性疾病；促进如神经元干细胞、心肌干细胞等分化及其在干细胞再生医学中的应用；以及其在肿瘤方面的应用都有着重要的意义。
[0010]具体的，所述杨梅素可用于制备防治BMP-Smad紊乱引起的疾病的药物。
[0011]更为具体的，所述杨梅素可用于制备防治铁代谢紊乱疾病、抑制产后骨骼的再生成疾病、或者进行性肌肉骨化症等的药物。
[0012]本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了杨梅素在制备BMP-Smad通路小分子抑制剂中的应用，基于其天然、绿色、安全的特性，为因BMP-Smad紊乱引起的疾病治疗提供了可能，特别在相关疾病的临床药物开发有着潜在的应用。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为杨梅素显著抑制人肝癌细胞HepG2细胞Smadl/5/8的磷酸化水平；
[0014](A)不同浓度的杨梅素处理H印G2细胞，western blot检测BMP-SMAD通路蛋白变化水平，处理时间12小时；
[0015](B)浓度为50 u g/mL杨梅素从Oh至24h处理H印G2细胞对Ifepcidin表达通路相关蛋白的影响，western blot检测BMP-SMAD通路蛋白水平；
[0016]图2为杨梅素显著抑制BMP6诱导的BMP-Smad信号通路下游基因的表达；
[0017]A:杨梅素(50 ii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共处理H印G2细胞12小时，对H印G2细胞Hepcidin mRNA表达的抑制效果；
[0018]B:杨梅素(0~IOOii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共处理H印G2细胞12小时，对HepG2细胞Hepcidin表达的抑制效果，western blot分析磷酸化Smadl/5/8 ；
[0019]图3为杨梅素显著抑制BMP6诱导的BMP-Smad信号通路下游基因的转录；
[0020]不同浓度的杨梅素(O-lOOii g/mL)和BMP6 (10ng/mL)共处理H印G2细胞24小时，荧光素酶报告基因检测HAMP基因的转录情况。
(五)【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0022]实施例1:
[0023]1.材料和方法
[0024]1.1实验原料制备
[0025]Myricetin购自SIGMA公司。溶于无菌二甲基亚砜DMSO中，配置成所需浓度。人源BMP6购自R&D Systems公司。
[0026]1.2细胞株
[0027]人肝癌细胞株IfepG2及人肾脏细胞株HEK293由中国科学院上海生命科学院细胞库提供。培养条件:含10% FBS (GIBCO)的DMEM高糖型培养基(GIBCO)，37°C、5%C02饱和湿度培养箱。
[0028]1.3RNA 提取和 Realtime-PCR
[0029]Trizol (Life Technologies)法提取细胞和组织的RNA,具体操作按说明书进行。参考其次文献，NanodroplOOOSpectrophotometer 上检测 RNA 纯度(0D260/0D280 ~1.9 ~
2.1)及 RNA 浓度(ng/μ 1)，调整 RNA 浓度到 I μ g/μ I。2.0 μ g RNA 经 DNase (Promega)处理后，M-MLV 反转录酶(Promega)和 Oligo (dT)18primer (Takara Bio Inc.)进行反转录。CFX96Real_Time System (Bio-Rad)中进行 Realtime PCR,检测体积为 IOul,试剂米用iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad),引物序列如下:HAMP:
[0030]forward CAGCTGGATGCCCATGTTC
[0031]reverse CAGCAGCCGCAGCAGAA ；
[0032]ACTIN:
[0033]forward CACGGCATCGTCACCAACT
[0034]reverse CACGCAGCTCATTGTAGAAGGT ；
[0035]1.4Luciferase突光素酶报告基因检测
[0036]按照FuGENE? HD Transfection Reagent-Promega 转染系统说明，于转染前
I日接HEK293接种于24孔板，5 X IO4/孔，第2日当细胞约60%融合时，更新细胞培养液，共同转染HAMP-promoter2.7kb_pGL3和内参Renilla报告基因质粒。共转24h后，根据实验设计，加药处理不同的浓度、时间后，裂解收集细胞，离心取上清，用Dual-LuciferaseReporter Assay System 测定裂解细胞上清内 Luciferase (HAMP Luc 和 Renilla Luc)活性，计算HAMP Luc/Renilla Luc比值。每种处理各个设3复孔。
[0037]1.5ffestern blot
[0038]用含有PMSF (Sigma-Aldrich)和磷酸酶抑制剂(PhosSTOP，Roche)的 RIPA 裂解液(碧云天生物技术研究所)裂解细胞或组织后，提取总蛋白。细胞蛋白取30ug，肝组织蛋白取lOOug，经10%SDS-PAGE胶电泳后，转移至PVDF膜，该膜与特异性抗体4°C孵育过夜。洗漆三遍，与过氧化物酶标记的二抗(ant1-rabbit or ant1-mouse IgGl: 4000浓度稀释，Proteintech Group)室温孵育 I 小时后，Westernblot 试剂盒(ECL system,Pierce, ThermoScientific)显色。
[0039]所用一抗如下:兔抗anti_pSmadl/5/8antibody (1:1000 浓度稀释；CellSignaling Technology),兔抗 ant1-Smadlantibody (1:1000 浓度稀释；Cell SignalingTechnology)以及鼠抗 ant1-β-actin (1:2000 浓度稀释；Sigma-Aldrich)。
[0040]1.6统计方法
[0041]所用统计采用R软件分析，实验数据以MeaniSD表示。细胞和动物实验的组间比较采用Tukey’ s检验(AN0VA)，两组间比较以Student’s t-test检验，以P〈0.05认为有统计学意义。
[0042]2 结果
[0043]2.1杨梅素显著抑制人肝癌细胞HepG2细胞Smadl/5/8的磷酸化水平
[0044]用含有PMSF (Sigma-Aldrich)和磷酸酶抑制剂(PhosSTOP，Roche)的 RIPA 裂解液(碧云天生物技术研究所)裂解细胞或组织后，提取总蛋白。通过western-blot，检测信号通路BMP-SMAD表达情况，结果见图1。
[0045]Western Blot结果显不，随着杨梅素浓度的增加,磷酸化Smadl/5/8蛋白表达水平亦显著降低(图1A)，并且6小时后，Smadl/5/8蛋白磷酸化的水平显著被抑制(图1B)，表明杨梅素能显著降低Smadl/5/8的磷酸化水平。
[0046]2.2杨梅素显著抑制BMP6诱导的BMP-Smad信号通路下游基因的表达
[0047]BMP6是生理条件下最强的H印cidin刺激剂，为了探杨梅素对BMP6诱导的Hepcidin表达的抑制效果,将杨梅素(50 ii g/mL)先于BMP6 (10ng/mL)30min加入到HepG2细胞的培养液中，培养12小时后，检测Hepcidin mRNA表达量，结果见图2。
[0048]BMP6可使H印cidin mRNA表达量升高到正常值的4_5倍。杨梅素能够减弱BMP6的刺激作用，H印cidin mRNA的表达量仅为正常值的40%(图2A)。Western Blot结果显示，BMP6可明显增加Smadl/5/8蛋白磷酸化水平，随着杨梅素浓度的增加，BMP6刺激条件下的磷酸化Smadl/5/8蛋白表达水平亦显著降低(图2B)。
[0049]由此推测杨梅素通过祀向BMP-Smad信号通路中蛋白Smadl/5/8的磷酸化水平,进而抑制其通路下游信号基因的水平，如铁调素Hepcidin的表达。
[0050]2.3杨梅素显著抑制BMP6诱导的BMP-Smad信号通路下游基因的转录
[0051]利用HEK293 细胞株，按照 FuGENE? HD Transfection Reagent-Promega 转染系统，共同转染HAMP-promoter2.7kb_pGL3和内参Renilla报告基因质粒。共转24h后，不同处理后，裂解收集细胞，离心取上清，用Dual-Luciferase Reporter Assay System测定裂解细胞上清内 Luciferase (HAMP Luc 和 Renilla Luc)活性，计算 HAMP Luc/RenillaLuc比值，结果见图3。
[0052]为了探讨杨梅素对BMP诱导条件下，BMP-Smad通路下游基因HAMP的转录的抑制效果，将不同浓度的杨梅素(0-100 Ii g/mL)分别先于BMP6 (lOng/mL) 30min加入到转染后的HEK293细胞培养液中，24小时后，同样利用双荧光素酶检测报告基因检。
[0053]实验发现，BMP6可使HAMP Luc相对活性升高到约为正常值的2.5倍，显著增强HAMP基因的转录水平。不同浓度的杨梅素能够减弱BMP6的该种刺激作用，甚至使BMP6对HAMP基因转录的诱导作用消失(20-100 ii g/mL)，HAMP Luc相对活性约为正常值的7% (图3)。
[0054]基于此,杨梅素可显著抑制BMP-Smad信号通路中蛋白Smadl/5/8的磷酸化水平，进而调控其下游信号基因的表达及转录。
【权利要求】
1.杨梅素在制备BMP-Smad通路小分子抑制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述杨梅素用于制备防治BMP-Smad紊乱引起的疾病的药物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述杨梅素用于制备防治铁代谢紊乱疾病的药物。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述杨梅素用于制备防治抑制产后骨骼的再生成疾病的药物。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述杨梅素用于制备防治进行性肌肉骨化症的药物。
【文档编号】A61P21/00GK103655541SQ201310572080
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】王福俤, 穆明道, 伍爱民, 杜晓利, 安鹏, 吴谦, 邵丹丹, 沈筱筠 申请人:浙江大学