专利名称：与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药技术领域或蛋白质多肽类药物领域，特别涉及一组 与整合素av|33具有高结合活性的多肽及其制备方法和应用。
二背景技术：
整合素(lntegrin)是广泛存在于细胞表面的一类细胞黏附分子，由a和p两 个亚单位形成if争膜异二聚体，迄今已发现约18种a亚单位和8种p亚单位，它 们按不同组合构成24种整合素。整合素通过胞外区识别结合细胞外基质成分、 可溶性配体如纤维蛋白原以及一些细胞表面分子中整合素结合位点如精氨酸-甘 氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-asparticacid, RGD )结合，通过整合素连接蛋白激 酶和磷脂酰肌醇3磷酸激酶信号转导通路，进行细胞和细胞之间、细胞与细胞 外基质之间的双向信号转导，从而调节细胞的生物学行为。
结締组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF )是近年来发现的 具有多种生物学活性的细胞因子。研究表明，多种信号分子通过不同的传导机制 能诱导大多数胶质分子的合成，抑制其降解，并能调节整合素基质受体的表达从 而导致组织和器官的纤维化。在所有这些信号机制活化通路中，CTGF可能是起 关键作用的细胞因子。
CTGF是高度保守的CCN多肽家族(CTGF， CYR61, Nov)成员之一，蛋 白结构主要分为4个区为胰岛素样生长因子结合蛋白区，von Willebrand因子 C型重复区，血小板反应蛋白(thrombospondin) I型重复区以及生长因子半胱 氨酸群，Mr38000,主要由成纤维细胞和内皮细胞等合成分泌，它与皮肤瘢痕的 形成，动脉粥样硬化，组织和器官的纤维化，创伤修复以及肿瘤的形成和转移密 切相关。CTGF基因属即刻早期基因，定位于染色体6q23.1，有5个外显子，4 个内含子，编码的蛋白具有明显的丝裂原性和趋化性，可诱导成纤维细胞增殖和 分泌细胞外基质(ECM),参与调节细胞增生、分化、胚胎发育以及伤口愈合。 CTGF可显著增加NRK (normal rat kidney)成纤维细胞中I型胶原，整合素a 和纤连蛋白基因的转录。
CTGF能与成纤维细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白Ax2-巨球蛋白受体 (LRP )及细胞表面的a邻l整合素，内皮细胞的avP3，血小板的allb(i3结合； 同时，CTGF的N端能与胰岛素样生长因子(IGF)结合形成复合物，刺激心肌
3成纤维细胞的分化，产生大量的胶原和其它的ECM; CTGF的C端能与BMP4 和TGF-pi结合，发挥生物学效应。CTGF包含的von Willebrand因子与基质蛋 白有相似序列，因此可剂量依赖地促进血管内皮细胞的黏附，增殖和迁移，同时 诱导血管内皮细胞形成管状，其作用强于碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮生 长因子。
研究表明，整合素在肿瘤细胞转化、生长、侵袭、转移、凋亡和肿瘤血管生 成过程中起重要作用，肿瘤细胞从原发部位脱落，迁移至远处的靶器官过程中， 肺瘤血管的形成为肿瘤细胞生长增殖提供营养成分，并为转移构建通路。其中， av|33、 a5pl和avp5整合素在肿瘤血管内皮细胞中的高表达，在肿瘤血管系统的 形成中起主要作用。这些研究结果均为整合素靶向药物治疗肿瘤提供了理论依 据。目前整合素靶向治疗药物主要有整合素单克隆抗体、整合素肽类抑制剂、整 合素基因靶向调节以及整合素介导的其他治疗等。其中，整合素肽类抑制剂由于 作用耙点明确，分子量较小而易于透过组织，制备简单等优点备受关注。整合素 一般与配体分子中的RGD序列结合而发挥整合素对细胞活性的调节。RGD肽 包括环形和线性两类，不仅竟争结合整合素受体，阻止肿瘤细胞和(或)内皮细 胞与细胞外基质黏附，且激活细胞凋亡蛋白酶，直接诱导肿瘤细胞和(或)内皮细 胞凋亡，阻断整合素-斑点黏附激酶途径，诱导内皮细胞和(或)肿瘤细胞黏附、 增殖、侵袭、转移，调节肿瘤血管的形成。如西仑吉肽(cilengitide， EMD2121974) 含有环状RGD肽，耙向作用于ctv(33和av(35整合素，通过阻止整合素与细胞 外基质中纤维粘连素和粘蛋白的相互作用诱导内皮细胞和肿瘤细胞的移行、分 化、增殖、凋亡，抑制血管生成和肿瘤的发展；去整合素(salmosin和contortrostatin) 是从蝮科毒蛇蛇毒中提取的含RGD序列的可溶性线性肽，与细胞外基质竟争结 合avP3整合素，特异性阻断整合素av亚基与纤维粘连素纤维粘连素和变性胶 原蛋白作用，解离黏附斑点与肌动蛋白的连接，使细胞转变为圆形，彼此间解散， 并阻断依赖黏着斑激酶的信号转导途径，引起细胞凋亡。ATN2161是从纤維粘 连素辅助结构域衍生的非环状五氨基酸肽，与avp3和a5(31整合素作用，抑制 棵鼠乳腺癌细胞和溶骨性移植瘤生长，使肿瘤细胞逆转，瘤体减小。S247为av卩3 整合素抑制剂，促使血管内皮细胞凋亡，抑制血管形成。
在前期研究中，我们发现CTGF C区的肽序列能与高表达av(33的人肝癌细 胞林BEL-7402高度结合，通过比对发现它是一种非RGD的小肽，该序列的发 现为进一步研发抗肿瘤新药或肿瘤显像剂拓宽了道路，同时也为设计合理的肿瘤 治疗方案提供理论基础。
发明内容
4技术问题
本发明的目的是提供一组与整合素avP3具有高结合活性的多肽及其氨基酸 序列，同时提供该种多肽作为新生血管结合剂或作为肿瘤治疗和显像的药物或载 体的应用。
技术方案本发明的技术解决方案为即
一种与整合素avP3具有高结合活性的多肽，具有SEQ ID NO:l氨基酸序列 Cys-Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-IIe-Ser-Lys-Pro-IIe-Lys-Phe-Glu-Leu-Ser-Gly;
一种与整合素avp3具有高结合活性的多肽，具有SEQ ID NO:2氨基酸序列 Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile隱Ser-Lys-Pro-Ile-Lys-Phe-Glu-Leu-Ser-Gly-Cys;
一种与整合素av|33具有高结合活性的多肽，具有SEQ ID NO:3氨基酸序列 Cys-Ile-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Ser-Lys-Pro-IIe-Lys-Phe-Glu-Leu-Ser-Gly-Cys;
上述任一项所述与整合素avp3具有高结合活性的多肽在制备新生血管结合 剂、肿瘤治疗或显像的药物中的应用。
上述任一项所述与整合素avp3具有高结合活性的多肽单独或组合作为药物 辅料或连接物的应用。
有益效果
本发明与现有技术相比具有如下
1. 提供了 一组多肽,扩大了与av(33结合肽的种类，获得了 一组具有较高av(33 结合活性的多肽。
2. 用基因工程技术制备具有较高avp3结合活性的多肽，适合于大规模工业 化生产。
3. 采用基因工程技术制备，对环境友好，无任何有害物质产生。
4. 生产成本较低。化学合成每毫克肽(18个氨基酸)需560元人民币，而 用本方法生产每毫克肽只需2元人民币，大规模制备时成本甚至更低。
5. 在表达载体构建中，在目的基因的上游引入了肠激酶切割位点 (DDDDK)，当用肠激酶切割后目的多肽不残留任何多余氨基酸，大大简化了
下游的纯化工艺。
6. 用邻苯二马来酰亚胺(N,N，-O-phenylendimaleimide, OPDM)作偶联剂将 多肽与巯基修饰的Fe304纳米颗粒连接，连接产物能与高表达avp3整合素的肝 癌细胞林BEL-7402特异性结合；未用肽修饰的纳米颗粒未见结合；用该多肽预 先与肝癌细胞孵育，再加入多肽标记的纳米颗粒，发现纳米颗粒的结合被多肽竟
5争抑制。
7. 3种多肽与人肝癌细胞抹BEL-7402共孵育，可促进肺瘤细胞的凋亡。
四
图1是融合蛋白SDS-PAGE分析其中l-分子量Marker、 2-含Plc菌体、3-含P118c破壁上请液、4-含P17c破壁
上请液、5-含Plc破壁上请液；
图2是小肽Tricine-SDS-PAGE电泳其中，6-胰岛素、7-纯化后小肽；
图3是Plc-SPIO与BEL-7402的结合图4是P17c-SPI0与BEL-7402的结合图5是P118c-SPI0与BEL-7402的结合图6是未修饰的SPIO与BEL-7402的结合图7是Plc-SPIO与BEL-7402的结合被Plc竟争抑制图;
图8是P17c-SPI0与BEL-7402的结合被P17c竟争抑制图9是P118c-SPI0与BEL-7402的结合被P118c竟争抑制图11是P17c促进BEL-7402的凋亡图10是Plc促进BEL-7402的凋亡图12是PI 18c促进BEL-7402的凋亡图;
图13是未加肽干预的BEL-7402细胞图。
五具体实施例方式
本发明所用内切酶、连接酶、其他分子生物学试剂购自Novagen公司。电泳、 感受态细胞制备、转化等分子生物学方法采用《分子克隆实验指南》的方法进行 (萨姆布鲁斯(Sambrool, J.)等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第3 版)，北京，科学出版社，2002， 8)。质粒提取，采用上海生工试剂盒K192,按 照使用说明进行。
实施例1:
表达栽体的构建和转化子的获得
根据大肠杆菌偏爱三联密码子设计合成多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )引物SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:9，根据引物不同配对，使用PCR方法合成带有肠激酶切割位点的Plc， P17c和P118c 3个基因Plc:
TGT; P118c: TGTATTCGGACTCCGAAGATTAGTAAGCCTATTAAGTTTGAGC TGTCGGGTTGT。 PCR反应条件为94°C 10分钟预变性，循环反应94°C 30 秒，72。C30秒，共25个循环，随后自然冷却至室温；将PCR产物用琼脂糖凝胶 电泳进行分离，胶回收，得到目的片段。将目的片段依照内切酶产品说明书用 Kpn I和Xho I分别进行酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段(《分子克隆》)， 按连接酶产品说明书用T4 DNA连接酶与相同酶切并回收的pET32a(+)相应片段 连接，获得含编码本发明多肽MA序列的表达载体；将表达载体转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞，筛选并鉴定转化子，用碱裂解法提取质粒，送上海Invitrogen 公司测序，测序结果与预期序列一致。所构建的质粒命名为pET32/ Plc， pET32a/P17c, pET32a/P118c。
表l引物序列
引物号
DNA序列
目的基因
SEQ ID 5'-GCGGTACCGACGACGACGACAAGTGTATTCGG N0.4 ACTCCGAAGATTAGTAAGCCTATT-3，
- Plc
SEQ ID 5 ， -CGCTCGAGTTAACCAGACAGCTCAAACTTAAT
N0.5 AGGCTTACTAATCTTCGG-3'
SEQ ID 5，-GCGGTACCGACGACGACGACAAGATTCGGAC NO.6 TCCGAAGATTAGTAAGCCTATT-3'
- P17c
SEQ ID 5 ， -CGCTCGAGTTATGTACC AG AC AGCTC A AACTT
N0.7 AATAGGCTTACTAATCTTCGG-3，
SEQ ID 5，-GCGGTACCGACGACGACGACAAGTGTATTCGG NO. 8 ACTCCGAAGATTAGTAAGCCTATT-3 ，
- P118c
SEQ ID 5 ，-CGCTCGAGTTATGTACC AGAC AGCTC AAACTT
N0.9 AATAGGCTTACTAATCTTCGG-3'
诱导表达，检测鉴定
将编码3个小肽的阳性质粒分别转化BL21 (DE3)感受态细胞，获得转化
7子，接种于含Amp ( 50吗/inl)的LB肉汤20ml中培养，当菌液OD值达到0.6 时，加入乳糖至终浓度8 mM, 37。C诱导表达6小时。5000 rpm离心IO分钟， 取沉淀，将沉淀溶于50mMTris-HCl、 10 mMNaCl (pH8.0)组成的緩冲液中，超 声破碎20 min。将超声后的溶液12000 rpm离心20 min,分另ll保留上清液和沉淀 用于电泳检测。在20KDa分子量附近有明显条带(见附图1 )，即为融合蛋白， 主要集中在溶液上清。融合蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的42% ( Pic ), 31% (P17c)和27% (P118c)。
发酵罐中试放大
按照下列条件对工程菌进行中试放大实验 发酵体系10L LB培养基(AmplOOpg/mL)
发酵方案挑取LB平板上(AmplOOpg/mL)保藏菌种单菌落转接至种子液， 37°C, 200 r/min摇床培养7h,按5: IOO(种子液培养基体积比)的比例转接 至发酵罐；37°C，固定通气量4L/min，培养约6小时至对数生长期，补料1LLB, 同时加入诱导剂(IPTG0.1mmol/L)后继续培养，5小时后放罐。结果显示，融 合蛋白表达量占菌体总蛋白的32% (Plc)， 21% (P17c)和30% (P118c)。
融合蛋白的酶切，分离纯化
将融合蛋白加入肠激酶緩冲液中，按l mg/lU用肠激酶(Novagen)进行切 割，酶切条件为25。C 16小时。酶切完成后，用DEAE-sephadex A25阴离子交 换柱(Pharmacia)分离，得到小肽粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC, C18柱)精制，获得纯品，其纯度达到95%以上。以胰岛素为对照，将产品按照 Tricine-SDS-PAGE电泳方法，^r测其分子量约为L9KDa (附图2)。
实施例2:
小肽与Fe304纳米颗粒(SPIO)的连接
用 pH 5.0, 0.1 M 的醋酸钠緩冲液将邻苯二马来酰亚胺 (N，N，-O-phenylendimaleimide， OPDM, Sigma)配制成0.75 mmol/L溶液。巯基 修饰的Fe304纳米颗粒(SPIO,制备方法见文献Zhang S, Bian Z, Gu C， et al. Preparation of anti-human cardiac troponin I immunomagnetic nanoparticles and biological activity assays. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 55 (2007) 143—148. 东南大学生物医学工程系张宇教授慧赠)5 mg悬浮于2 ml OPDM溶液中，37°C 孵育2小时，pH 5.0, 0.1 M的醋酸钠緩冲液洗涤3次后，用0.5 ml相同緩冲液悬浮，分别加入小肽Plc, P17c和P118c 1 mg, 37。C反应2小时，再用醋酸钠緩 冲液洗涂3次后，获得Plc-SPIO， P17c-SPIO和P118c-SPI0， 4。C保存备用。
实施例3:
小肽修饰的纳米颗粒与肝癌细胞结合试验
人肝癌细胞抹BEL-7402 (高表达avp3整合素，中科院上海细胞生物研究所) 扩增培养后，调整细胞浓度为L5xl0Vml，六孔细胞培养板每孔加2ml。分别加 入500 pl实施例2所迷的Plc-SPIO, P17c-SPI0, P118c-SPI0或500 pl未修饰的 SPIO, 37。C酵育3小时，磷酸盐緩冲液(PBS)洗涤3次后，用体积百分浓度为 4 %的多聚甲醛固定15分钟。用蒸馏水洗涤3次后，加7v染液(所述染液为由体 积百分浓度为20%的亚铁氰化钾溶液和浓盐酸按体积比为5: 1混合而成)，50 - 56。C温育45分钟。再用蒸馏水洗涤3次后，加入体积百分比为0.3 %的中性红 溶液，37。C孵育15分钟，蒸馏水洗涤3次后晾干，显微镜下观察并摄片。结果 显示，3种小肽修饰的纳米颗粒(Plc-SPIO, P17c-SPIOP和118c-SPIO)均能与 BEL-7402高度结合，与细胞结合的纳米颗粒被染成蓝色(见附图3、附图4、附 图5中的深色区域)，而未经修饰的纳米颗粒未见结合(附图6),说明Plc, P17c 和P118c 3个小肽均能与高表达otv|33整合素的人肝癌细胞抹BEL-7402结合。
实施例4:
竟争抑制试验小肽修饰的纳米颗粒与肝癌细胞结合试验 人肝癌细胞林BEL-7402 (高表达avp3整合素，中科院上海细胞生物研究所) 扩增培养后，调整细胞浓度为1.5xl05/ml，六孔细胞培养板每孔加2ml。分别加 入小肽Plc, P17c和P118c与细胞孵育30分钟后，再分别对应加入500 (xl的 Plc-SPIO, P17c-SPI0和P118c-SPI0, 37。C孵育3小时，磷酸盐缓冲液(PBS) 洗涤3次后，用4%多聚甲醛固定15分钟。用蒸馏水洗涤3次后，加入染液(染 液由体积百分浓度为20%的亚铁氰化钾溶液与浓盐酸按照体积比为5: 1混合而 成)，50 - 56。C温育45分钟。再用蒸馏水洗涤3次后，加入体积百分浓度为0.3 %的中性红溶液，37。C孵育15分钟，蒸馏水洗涤3次后晾干，显纟鼓《免下，见察并 摄片。结果显示，肝癌细胞预先加入3种小肽结合(即细胞膜表面的av(33整合 素与小肽结合饱和)后，不再与小肽修饰的纳米颗粒结合，细胞不再被染成蓝色 (黑白打印时与对照相比无明显变化)(见附图7,附图8,附图9),说明Plc， P17c和P118c 3个小肽与高表达av(33整合素的人肝癌细胞林BEL-7402的结合 具有高度选择性和特异性。实施例5:
促进肺瘤细胞的凋亡
人肝癌细胞林BEL-7402 (高表达avP3整合素，中科院上海细胞生物研究所) 扩增培养后，调整细胞浓度为1.5x105/ml,六孔细胞培养板每孔加2ml。分别加 入小肽Plc, P17c和P118c ( 450吗/ml)与细胞37。C孵育3小时后，磷酸盐緩冲 液(PBS )洗涤3次，用体积百分浓度为4 %的多聚甲醛固定15分钟。用蒸馏水 洗涤3次，加入体积百分浓度为0.3%的中性红溶液，37。C孵育15分钟，蒸馏水 洗涤3次后晾干，显微镜下观察并摄片。结果显示，肝癌细胞加入3种小肽后使 胂瘤细胞破裂(图10,图11，图12)，而未加肽的对照组细胞不受影响(图13), 说明Plc, P17c和P118c 3个小肽具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。
10序列表
<110>东南大学
<120>与整合素avf3 3具有高结合活性的多肽及其应用 <130>与整合素a v 3 3具有高结合活性的多肽及其应用 <160> 9
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Cys lie Arg Thr Pro Lys He Ser Lys Pro He Lys Phe Glu Leu Ser 15 10 15
Gly
<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> human
<400> 2
He Arg Thr Pro Lys He Ser Lys Pro He Lys Phe Glu Leu Ser Gly 15 10 15
Cys
11<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> human
<400> 3
Cys lie Arg Thr Pro Lys lie Ser Lys Pro lie Lys Phe Glu Leu Ser 15 10 15
Gly Cys
<210> 4
<211> 56
<212> DNA <213>合成的引物
<400> 4
gcggtaccga cgacgacgac aagtgtattc ggactccgaa gattagtaag cctatt 56
<210> 5
<211> 50
<212> DNA <213>合成的引物
<400> 5
cgctcgagtt aaccagacag ctcaaactta ataggcttac taatcttcgg 50
<210> 6 <211> 53 <212> DNA<213>合成的引物 <400〉 6
gcggtaccga cgacgacgac aagattcgga ctccgaagat tagtaagcct att 53
<210> 7
<211> 53
<212> DNA <213>合成的引物
<400> 7
cgctcgagtt atgtaccaga cagctcaaac ttaataggct tactaatctt egg 53
<210> 8
<211> 56
<212> DNA <213>合成的引物
<400> 8
gcggtaccga cgacgacgac aagtgtattc ggactccgaa gattagtaag cctatt 56
<210> 9
<211> 53
<212> DNA <213>合成的引物
<400> 9
cgctcgagtt atgtaccaga cagctcaaac ttaataggct tactaatctt egg 53
1权利要求
1. 一种与整合素αvβ3具有高结合活性的多肽，其特征在于具有SEQ ID NO1氨基酸序列。
2. —种与整合素avp3具有高结合活性的多肽，其特征在于具有SEQ ID NO:2 氨基酸序列。
3. —种与整合素avp3具有高结合活性的多肽，其特征在于具有SEQ ID NO:3 氨基酸序列。
4. 根据权利要求l-3任一项所述与整合素av卩3具有高结合活性的多肽在制备新 生血管结合剂、肿瘤治疗或显像的药物中的应用。
5. 根据权利要求1-3任一项所述与整合素av(33具有高结合活性的多肽单独或组 合作为药物辅料或连接物的应用。
全文摘要
本发明提供了一组具有SEQ ID NO1～SEQ ID NO3氨基酸序列的多肽，该种多肽与整合素αvβ3具有高结合活性；该种多肽可用于新生血管结合剂、肿瘤治疗或显像的药物的制备以及用作药物辅料或连接物。
文档编号C07K7/08GK101497656SQ20091002573
公开日2009年8月5日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者吴国球 申请人:东南大学