专利名称：一种利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法
技术领域：
本发明属于生物分离工程技术领域，具体涉及利用纳滤技术从丁二酸发酵液中分离 提取丁二酸的方法。
背景技术：
丁二酸(Succinic Acid, Butanedioic Acid)又称琥珀酸，是一种重要的二元有机羧酸， 是微生物三羧酸循环及厌氧发酵的重要代谢产物，广泛用于可降解材料、制药、表面活 性剂、防护涂料、染料和其它工业中。而其盐——丁二酸二钠(干贝素)也是重要的食 品添加剂具有特殊的海鲜风味而广泛地应用于食品工业。从丁烷通过顺式丁烯二酐生产
丁二酸，因原料成本和环境污染等原因使得丁二酸作为基本化工原料的广泛应用受到限 制。厌氧发酵法制备丁二酸以成本较低的可再生的生物质和温室气体二氧化碳为原料， 污染少，能耗低，因此以微生物发酵生产丁二酸的研究与开发正在美国、日本、欧盟及 我国深入开展，而从发酵液中高效分离提取丁二酸是生物法制备丁二酸的重要技术。
目前公开专利及文献中涉及从微生物发酵液中提取制备丁二酸的方法主要有钙盐 法、溶剂萃取法、铵盐法、电渗析法、离子交换法、膜分离法。美国专利US5168055采 用钙盐中和法提取丁二酸，路线长、效率低下，产生大量硫酸钙废渣，酸碱消耗大，增 加了成本和环境污染。美国专利US5034105、 US5143834采用两级膜电渗析分离提纯丁 二酸的方法，但该法电渗析膜损耗及电能消耗极高，且不能处理二价离子。美国专利 US5958744采用铵盐法提取丁二酸，但其结晶过程操作条件苛刻，需要高温裂解硫酸盐， 步骤繁琐，难度大。LeeSY等人(Process Biochemistry 41 (2006):1461)采用溶剂萃取法 从发酵液中提取丁二酸，需使用昂贵而具有毒性的叔胺类萃取剂及助溶剂，残留溶剂的 毒性对食品级及医药级丁二酸的质量存在安全隐患，此外还有溶剂回收问题。中国专利 CN200810195852.5、 CN200810195851.0采用离子交换法处理并分离提取丁二酸，由于丁 二酸发酵液中含有大量杂质离子，导致树脂污染加重，交换容量迅速下降，树脂处理频 繁，存在再生困难、洗脱剂用量及排污量大等问题。中国专利ZL200610086003.7采用微 滤、超滤膜分离提取丁二酸，但由于发酵液酸化时产生大量硫酸镁，可能会导致产品硫 酸盐超标或提取收率下降。此外上述分离提取丁二酸过程中多采用价格较为昂贵的活性 炭进行脱色精制。总之，目前丁二酸的分离提取方法在简化工艺、提高产品质量及降低 成本等方面仍有待改进。
纳滤(NF)是近20年来发展起来的一种新型膜分离技术，纳滤膜是拥有纳米级微 孔的复合荷电膜，基于其筛分原理适合对分子量介于150~1000道尔顿有机分子进行分
4离，基于其电荷效应，适合将单价离子与多价离子及中性物质分离。近年来将纳滤应用 于生物产品分离已有专利报道，多涉及抗生素浓縮、中草药提取、多糖纯化等领域，如 中国专利CN1511839、 CN1202121、 CN1364764，其目标产品的分子量^250道尔顿，但 鲜有将纳滤用于分子量150道尔顿以下产品的专利报道，中国专利CN101265179将纳 滤用于乳酸(分子量90道尔顿)的提取，将乳酸透过纳滤膜与其它分子量较小的杂质 分离。丁二酸的分子量仅为118道尔顿，将纳滤技术用于其与小分子杂质及多价盐的分 离，并采用纳滤膜对其进行预浓縮，经专利检索还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用纳滤技术从丁二酸发酵液中分离提取 丁二酸的方法，以克服现有丁二酸提取方法存在的步骤多、收率低、排污大及产品质量 不易控制的缺点。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下
一种利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法，包括如下步骤
(1) 采用微滤或板框加压过滤的方法，对丁二酸发酵液进行预过滤，以除去菌体及 固体颗粒；
(2) 调节步骤(l)得到的滤液的pH值至4.0~6.0，进行超滤，以除去蛋白等生物大分 子，收集超滤透过液；
(3) 调节超滤透过液的pH值至3.0~4.0，进行纳滤，以除去色素、多价无机离子及 未消耗的底物，收集纳滤透过液；
(4) 调节含有丁二酸的纳滤透过液的pH值至6.0-7.0，再次进行纳滤，以除去甲酸、 乙酸等副产物及单价无机离子，收集纳滤截留液，实现预浓缩；
(5) 将步骤(4)得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓縮；
(6) 浓縮液50 70'C保温，用氢氧化钠或碳酸钠将浓縮液调节至pH8，再冷却结晶、 干燥，得丁二酸二钠；或者，浓縮液50 70'C保温，用浓硫酸或浓盐酸将浓縮液调节至 pH2.0 3.t)，冷却结晶、干燥，得丁二酸。
步骤(1)中，所述的丁二酸发酵液由产丁二酸的菌株发酵制备而得，丁二酸的浓度为 24~70g/L。
步骤(1)中，所述微滤方法，其微滤膜孔径为0.1~0.2nm，膜组件形式为中空纤维式 或管式膜，膜材质为有机膜或无机陶瓷膜，操作压力为0.1 0.2Mpa，操作温度为15~40°C;
所述板框加压过滤方法，发酵液中可加入适量的絮凝剂和助滤剂，板框预涂助滤剂，絮 凝剂为非离子型、阴离子型高分子絮凝剂或无机絮凝剂，助滤剂为珍珠岩或硅藻土。步骤(2)中，所使用的超滤膜截留分子量为5000 150000道尔顿，膜组件形式为巻式 或管式膜，其膜材质为有机膜或无机陶瓷膜，操作压力为0.2 0.4Mpa，操作温度为 25~40°C。
步骤(3)中，所使用的纳滤膜为巻式有机膜，纳滤膜截留分子量为150 350道尔顿， 优选为150~160道尔顿，操作压力为1.0 2.5Mpa，操作温度为25~40°C;当纳滤截留液 浓縮至初始进料体积的20%时，加入与纳滤截留液相同体积的去离子水进行渗滤，如此 重复2 3次，当收集的纳滤透过液为原超滤液体积的120~150%时，停止纳滤。
步骤(4)中，所使用的纳滤膜为巻式有机膜，纳滤膜截留分子量为150-160道尔顿， 操作压力为1.0 2.5Mpa，操作温度为25~35°C;当纳滤截留液浓縮至初始进料体积的20% 时，加入与纳滤截留液相同体积的去离子水进行渗滤，如此重复2 3次，直至纳滤截留 液再次浓縮至初始进料体积的20%时，停止纳滤。
步骤(5)中，将纳滤截留液在65~75°C、 -0.08~-0.lMPa条件下，减压蒸发浓缩至原 始纳滤截留液体积的1/2~1/3。
步骤(6)中，冷却结晶条件为4'C， 80rpm， 6~12h。 本发明利用纳滤从发酵液中分离提取丁二酸的方法流程图见图1。 有益效果本发明提供一种利用纳滤将生物法制备的丁二酸与发酵液中色素、未消 耗底物、副产的甲酸、乙酸等生物小分子及各种无机离子分离的方法；并将脱色、纯化、 脱盐及丁二酸的预浓縮在同一纳滤分离装置中完成，条件温和，操作简便，可縮短流程， 节省设备投资；分离提取丁二酸或丁二酸二钠过程中不使用任何有机溶剂与活性炭，原 料成本低；分离选择性好，产品质量高，安全性好，可直接用于食品与医药行业；环境 友好，可回收发酵液中未消耗的底物。该法具有广泛的社会和经济效益。
图1为利用纳滤从发酵液中分离提取丁二酸的方法流程图。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:
以葡萄糖为碳源制备的丁二酸发酵液，其中含丁二酸67g/L，乙酸12g/L，甲酸6g/L， 葡萄糖9g/L， pH6.7。
发酵液中添加阴离子型絮凝剂，以硅藻土为助滤剂进行板框压滤，过滤温度70。C，除菌率为91%，蛋白去除率27%,收集滤液；用硫酸调节滤液至pH5.0，采用截留分子 量为150000道尔顿的管式无机膜进行超滤，温度35'C，操作压力0.3Mpa，蛋白去除率 75%，收集超滤液，脱色率27%;两次纳滤工序采用的纳滤膜截留分子量均为150道尔 顿，用硫酸将超滤液调节至pH3.0，进行纳滤分离，温度25'C，操作压力1.8Mpa， 丁 二酸透过率为97.3%，葡萄糖截留率为93%，硫酸根截留率为94%，镁离子截留率为88%， 氨基氮截留率为90%，蛋白截留率100%，膜平均通量为70L/m2'h，透过液为无色透明 状，脱色率为99.7%;用氢氧化钠将透过液调节至pH6.5，再次进行纳滤，温度35'C， 操作压力2.5Mpa，膜平均通量为42L/m2*h，氯离子去除率为78%,甲酸去除率为84.5%， 乙酸去除率为64.4%， 丁二酸截留率为97.4%， 丁二酸被预浓縮至230g/L。
将纳滤截留液在65匸下减压蒸发(真空度-O.l MPa),浓缩至原体积的1/3，保温 60'C，流加质量百分比为30。/。的氢氧化钠溶液将其调节至pH8，冷却结晶(4'C， 12h， 搅拌速度80转/分钟)，离心过滤晶体，干燥后获得产品丁二酸二钠(干贝素)，为白色 结晶粉末，纯度达99.5%，硫酸盐含量低于0.002%，各项指标均符合FCCIV标准。
实施例2:
以葡萄糖为碳源制备的丁二酸发酵液，其中含丁二酸45g/L，乙酸9g/L，甲酸5g/L， 不含葡萄糖，pH6.5。
用硫酸调节发酵液至pH4.5进行微滤，使用的管式无机微滤膜的孔径为0.175拜， 操作温度4(TC，操作压力为0.1Mpa,除菌率为99.8%，蛋白去除率41%，收集滤液； 用硫酸调节滤液至pH4.5，采用截留分子量为10000道尔顿的巻式有机膜进行超滤，温 度25。C,操作压力0.25Mpa，蛋白去除率90%，收集超滤透过液，脱色率68%;两次纳 滤工序采用的纳滤膜截留分子量均为160道尔顿，用硫酸将超滤液调节至pH4.0，进行 纳滤分离，温度25'C,操作压力1.5Mpa， 丁二酸透过率为98.8%,硫酸根截留率为90%, 镁离子截留率为84%，氨基氮截留率为95%，蛋白截留率100%，膜平均通量为35L/m2-h， 透过液为无色透明状，脱色率为100%;用氢氧化钠将透过液调节至pH6.0,再次进行 纳滤，温度4(TC，操作压力2.0Mpa，膜平均通量为62L/m2'h，氯离子去除率为91%， 甲酸去除率为81.0%，乙酸去除率为61.0%, 丁二酸截留率为99.0%， 丁二酸被预浓縮 至191g/L。
将纳滤截留液在7(TC下减压蒸发(真空度-0.09 MPa)，浓縮至原体积的1/2，保温 60'C，流加浓硫酸将其调节至pH2.8，冷却结晶(4°C， 8h，搅拌速度80转/分钟)，离 心过滤晶体，干燥后获得产品丁二酸，为白色结晶粉末，纯度达99.7%，硫酸盐含量低 于0.002%，氯化物含量低于0.005%，各项指标均符合FCCIV标准。实施例3:
以秸秆水解糖液为碳源制备的丁二酸发酵液，其中含丁二酸51g/L，乙酸llg/L，甲酸7g/L，不含葡萄糖，pH6.4，
用硫酸调节发酵液至pH4.0进行微滤，使用的中空纤维式有机微滤膜的孔径为O.ltim，操作温度20'C，除菌率为99.5%,蛋白去除率35%，收集滤液；用硫酸调节滤液至pH4.0，采用截留分子量为5000道尔顿的巻式有机膜进行超滤，温度40'C，操作压力0.3Mpa，蛋白去除率95%，收集超滤液，脱色率80%;两次纳滤工序采用的纳滤膜截留分子量均为160道尔顿，用硫酸将超滤液调节至pH3.0,进行纳滤分离，温度30°C ，操作压力2.0Mpa， 丁二酸透过率为98.8%，硫酸根截留率为89%，镁离子截留率为86%，氨基氮截留率为89%，蛋白截留率100%，膜平均通量为56L/m2*h，透过液为无色透明状，脱色率为100%;用氢氧化钠将透过液调节至pH7.(K再次进行纳滤，温度35t:,操作压力2.5Mpa，膜平均通量为30L/m2*h，氯离子去除率为95%，甲酸去除率为78.0%,乙酸去除率为65%， 丁二酸截留率为98.5%， 丁二酸被预浓縮至218g/L。
将纳滤截留液在70'C下减压蒸发(真空度-0.1MPa)，浓縮至原体积的1/2，保温70°C ，流加浓盐酸将其调节至pH2.5，冷却结晶(4°C， 10h，搅拌速度80转/分钟)，离心过滤晶体,干燥后获得产品丁二酸，为白色结晶粉末，纯度达99.5%,硫酸盐含量低于0.002%,氯化物含量低于0.005%，各项指标均符合FCCIV标准。
实施例4:
以秸秆水解糖液为碳源制备的丁二酸发酵液，其中含丁二酸59g/L，乙酸13g/L，甲酸8g/L，葡萄糖12g/L， pH6.7。
发酵液中添加非离子型絮凝剂，以珍珠岩为助滤剂进行板框压滤，过滤温度80'C，除菌率为92%，蛋白去除率10%，收集滤液；用硫酸调节滤液至pH5.5，采用截留分子量为8000道尔顿的巻式有机膜进行超滤，温度35°C，操作压力0.2Mpa，蛋白去除率83%，收集超滤液，脱色率65%;两次纳滤工序采用的纳滤膜截留分子量均为150道尔顿，用硫酸将超滤液调节至pH3.0，进行纳滤分离，温度3(TC，操作压力2.5Mpa， 丁二酸透过率为99.1%，葡萄糖截留率为89%，硫酸根截留率为86%，镁离子截留率为80%，氨基氮截留率为96%，蛋白截留率100%，膜平均通量为55L/m2'h，透过液为无色透明状，脱色率为99.5%;用氢氧化钠将透过液调节至pH6.5，再次进行纳滤，温度30'C，操作压力1.7Mpa，膜平均通量为40L/m2'h，氯离子去除率为90%，甲酸去除率为88.5%，乙酸去除率为67%， 丁二酸截留率为98.0%， 丁二酸被预浓縮至200g/L。
将纳滤截留液在75'C下减压蒸发(真空度-0.08MPa)，浓縮至原体积的1/3，保温
860°C，流加质量百分比为30%的碳酸钠溶液将其调节至pH8，冷却结晶(4'C， 8h，搅拌速度80转/分钟)，离心过滤晶体，干燥后获得产品丁二酸二钠(干贝素)，为白色结晶粉末，纯度达99.8%，硫酸盐含量低于0.002%，各项指标均符合FCCIV标准。
实施例5:
以葡萄糖为碳源制备的丁二酸发酵液，其中含丁二酸63g/L,乙酸12g/L，甲酸6g/L，不含葡萄糖，pH6.5。
用硫酸调节发酵液至pH5.0进行微滤，使用的管式无机微滤膜的孔径为0.1pm，操作温度30'C，操作压力为0.15Mpa,除菌率为99.9%,蛋白去除率38%，收集滤液；用硫酸调节滤液至pH4.5，采用截留分子量为5000道尔顿的巻式有机膜进行超滤，温度30'C，操作压力0.3Mpa，蛋白去除率98%，收集超滤透过液，脱色率65%;采用的纳滤膜截留分子量为350道尔顿，用硫酸将超滤液调节至pH4.0，进行纳滤分离，温度25°C，操作压力1.8Mpa， 丁二酸透过率为99.3%，硫酸根截留率为85%，镁离子截留率为80%,氨基氮截留率为76%，蛋白截留率100%，膜平均通量为53L/m2'h，透过液为无色透明状，脱色率为100%;用氢氧化钠将透过液调节至pH6.0，再次进行纳滤，纳滤膜截留分子量为160道尔顿，温度4(TC，操作压力2.0Mpa，膜平均通量为62L/m2-h，氯离子去除率为91%，甲酸去除率为79.0%，乙酸去除率为68.6%， 丁二酸截留率为98.4%， 丁二酸被预浓縮至184g/L。
将纳滤截留液在65'C下减压蒸发(真空度-0.1MPa)，浓縮至原体积的1/2，保温70°C，流加浓硫酸将其调节至pH2.8，冷却结晶(4'C， 8h，搅拌速度80转/分钟)，离心过滤晶体，干燥后获得产品丁二酸，为白色结晶粉末，纯度达99.4%，硫酸盐含量低于0.002%，氯化物含量低于0.005%，各项指标均符合FCCIV标准。
权利要求
1、一种利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)采用微滤或板框加压过滤的方法，对丁二酸发酵液进行预过滤；(2)调节步骤(1)得到的滤液的pH值至4.0～6.0，进行超滤，收集超滤透过液；(3)调节超滤透过液的pH值至3.0～4.0，进行纳滤，收集纳滤透过液；(4)调节纳滤透过液的pH值至6.0～7.0，再次进行纳滤，收集纳滤截留液；(5)将步骤(4)得到的纳滤截留液进行减压蒸发浓缩；(6)浓缩液50～70℃保温，用氢氧化钠或碳酸钠将浓缩液调节至pH8，再冷却结晶、干燥，得丁二酸二钠；或者，浓缩液50～70℃保温，用浓硫酸或浓盐酸将浓缩液调节至pH2.0～3.0，冷却结晶、干燥，得丁二酸。
2、 根据权利要求1所述的利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法，其特征在于步骤(l)中，所述的丁二酸发酵液，丁二酸的浓度为24~70g/L。
3、 根据权利要求1所述的利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法，其特征在于步骤(l)中，所述微滤方法，其微滤膜孔径为0.1 0.2nm，膜组件形式为中空纤维式或管式膜，膜材质为有机膜或无机陶瓷膜，操作压力为0.1 0.2Mpa，操作温度为15~40°C;所述板框加压过滤方法，发酵液中可加入适量的絮凝剂和助滤剂，絮凝剂为非离子型、阴离子型高分于絮凝剂或无机絮凝剂，助滤剂为珍珠岩或硅藻土。
4、 根据权利要求1所述的利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法，其特征在于步骤(2)中，所使用的超滤膜截留分子量为5000~150000道尔顿，膜组件形式为巻式或管式膜，其膜材质为有机膜或无机陶瓷膜，操作压力为0.2 0.4Mpa，操作温度为25~40°C 。
5、 根据权利要求1所述的利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法，其特征在于步骤(3)中，所使用的纳滤膜为巻式有机膜，纳滤膜截留分子量为150~350道尔顿，操作压力为1.0 2.5Mpa，操作温度为25 40'C;当纳滤截留液浓縮至初始进料体积的20%时，加入与纳滤截留液相同体积的去离子水进行渗滤，如此重复2 3次，当收集的纳滤透过液为原超滤液体积的120~150%时，停止纳滤。
6、 根据权利要求1所述的利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法，其特征在于步骤(4)中，所使用的纳滤膜为巻式有机膜，纳滤膜截留分子量为150-160道尔顿，操作压力为1.0 2.5Mpa，操作温度为25 35'C;当纳滤截留液浓縮至初始进料体积的20%时，加入与纳滤截留液相同体积的去离子水进行渗滤，如此重复2 3次，直至纳滤截留液再次浓縮至初始进料体积的20%时，停止纳滤。
7、 根据权利要求1所述的利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法，其特征在于步骤(5)中，将纳滤截留液在65 75'C、 -0.08~-0.1 MPa条件下，减压蒸发浓縮至原始纳滤截留液体积的1/2 1/3。
8、根据权利要求1所述的利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸及丁二酸二钠的方法，其特征在于步骤(6)中，冷却结晶条件为4'C， 80rpm, 6~12h。
全文摘要
本发明公开了一种利用纳滤从丁二酸发酵液中分离提取丁二酸的方法丁二酸发酵液经预过滤、酸性条件下超滤、超滤透过液酸性条件下纳滤、纳滤透过液中性条件下再次纳滤、纳滤截留液减压蒸发浓缩、浓缩液碱性条件下冷却结晶得丁二酸二钠或浓缩液酸性条件下冷却结晶得丁二酸。本发明在分离提取丁二酸或丁二酸二钠过程中不使用任何有机溶剂及活性炭，将丁二酸的脱色、纯化、脱盐及预浓缩等工艺在同一纳滤分离装置中完成。该方法具有条件温和、操作简便、选择性好、原料成本低、产品质量高、污染小等优点，并可回收发酵液中未消耗的底物，具有广泛的社会和经济效益。
文档编号C07C55/00GK101475464SQ20091002553
公开日2009年7月8日 申请日期2009年2月9日 优先权日2009年2月9日
发明者昊 吴, 忠 姚, 岷 姜, 鹏 左, 丹 雷, 萍 韦 申请人:南京工业大学