专利名称：Ninj1蛋白在肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学特别是基因治疗领域，尤其是NINL1基因在癌症诊断 中的应用，及其在抗增殖和胞内信号转导中的应用。
背景技术：
细胞黏附分子(Cell adhesion molecules)是介导细胞与细胞间或细胞与基质间 相互接触和结合的一类蛋白分子，分布于细胞表面或细胞外基质中。细胞黏附分子 参与细胞的信号传导与活化、细胞的伸展和移动、肿瘤转移、创伤愈合等一系列重 要生理和病理过程[l]。按黏附分子的结构特点，可分为整合素家族、免疫球蛋白 超家族、选择素家族、钙黏蛋白家族及其它未归类的黏附分子[2]。
黏附分子参与肿瘤的浸润转移过程，调节杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤作用， 为临床提供肿瘤的诊断依据。对邻近正常组织的浸润及远处转移是恶性肿瘤一个重 要生物学特征。目前已知肿瘤的浸润及转移与其黏附分子表达的改变有关[3]。 一 方面，肿瘤细胞某些黏附分子表达的减少可以使细胞间的附着减弱，肿瘤细胞脱离 与周围细胞的附着，这是肿瘤浸润及转移的第一步；另一方面，肿瘤细胞表达的某 些黏附分子使已进入血液的肿瘤细胞得以黏附血管内皮细胞，造成血行转移[4]。 一些黏附分子的表达在正常细胞和肿瘤细胞或者不同类型的肿瘤细胞之间是不同 的，从而可以区分出肿瘤细胞以及不同的类型[5]。
此外，细胞黏附分子在胚胎发育，器官形成，受伤组织新生中都起重要作用[6]。 在神经系统中，粘附分子作为引导轴突方向的受体，在神经元连接的发育中起重要 作用[7]。在免疫系统，细胞表面分子介导不同的信号通路，在淋巴细胞的特异性 定向中起关键作用[8]。
NINJ1 (神经损伤诱导蛋白1)首次在施旺细胞中被发现[7]。四周神经受到损 伤后，轴突会降解，周围的施旺细胞的表型发生变化，这是神经再生的重要标志。 通过一系列的筛选发现，在轴索显微外科手术后，在神经元和施旺细胞中NINJ1 的表达大大升高。NINJ1位于细胞表面，通过同型相互作用使神经元细胞和施旺细胞相互作用，在神经突再生中起重要作用。进一步研究发现，NINJ1基因定位于人
9号染色体长臂22位(9q22)，这个位置被认为是遗传性感觉神经病变1型(HSN-1) 和多发性自然治愈型鳞状上皮癌(ESS1)定位的染色体区域，提示NINJ1也可能 参与肿瘤的发生[9, 10]。另一项研究表明，NINJ1在人肝细胞肝癌(HCC)中有高 表达，并与肝硬化和慢性的肝炎病毒感染有关，进一步增加了 NINJ1与疾病的相 关性[ll]。此外，也有研究表明NINJ1还和急性白血病及多种硬化症有关。
已有研究发现，NINJ1在人肝癌细胞株Huh-7中的表达会引起细胞周期抑制 蛋白p21表达的升高，将细胞阻滞在G1期。此外，NINJ1过量表达的细胞出现细 胞衰老的特征，即衰老相关的(3半乳糖苷酶的活性上升，提示NINJ1可能在调节细 胞衰老的信号通路中起作用，增加了 NINJ1作用机制的复杂性[12]。
最新的研究表明，NINJ1和一个重要的基质金属蛋白酶(MMP)相互作用[B]。 MMP是一类细胞外蛋白酶，能切割一系列的底物，包括细胞外基质和信号传导分 子等。在多种肿瘤和炎症相关疾病中都有高表达，是重要的药物开发靶点[14]。对 MMP突变小鼠的研究表明MMP在组织重塑和炎症反应中都有重要作用[15]。 Shuning Zhang等通过一系列生化试验发现与NINJ1与MMP在体内存在相互作用， NINJ1能被MMP切割，使其胞外段被释放。释放的NINJ1胞外段会阻碍细胞间的 黏附作用，并引起细胞非自主性的死亡[13]。然而其具体的作用机制还需进一步的 研究。
人类很多疾病都与信号转导通路密切相关，如在肿瘤坏死因子(TNF)导致的炎 症(inflammation)反应中，肿瘤坏死因子通过结合受体激活一系列蛋白磷酸激酶之 间的相互作用，最終激活NF-kB而引起炎症反应。生物化学家以及不少公司都在 通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路的关键部位，并开发影响信号传 递的药物，以达到治疗疾病的目的。
鉴于信号转导通路在细胞增殖、分化和多种疾病发生过程中的重要、甚至决 定性的作用，设计和开发以信号通路为靶点的新药，通过调节、控制信号转导通路 治疗疾病，无疑是一种针对性强、高效的理想途径，具有治疗多种疾病的潜在前景。
肿瘤坏死因子(TNFa)是一个多功能的细胞因子，主要参与体内炎症反应和免 疫功能的调节，也能够调控某些肿瘤细胞的凋亡过程。TNFa与受体结合后，在效 应细胞中可以激活不同的细胞内信号通路，包括NF-kB、 JNK及细胞调亡途径的 活化，从而表现出不同的细胞效应。异常的TNFa产生和持续活化与多种人类疾病 有关，如败血症，休克，糖尿病，移植排斥，以及多发性硬化、类风湿关节炎和免疫性肠病等多种自身免疫疾病。在TNFa异常引起的炎症性疾病中，NF-kB通路 的活化是一个关键环节。后者是一类细胞转录因子，调节多种炎症相关耙基因的转 录。最近的研究也显示，在慢性炎症进展至癌前病变，导致肿瘤发生的过程中， NF-kB起了非常重要的促进作用。因此，在临床治疗当中，开发TNF(x的阻断剂， 或者拮抗TNFa激活NF-kB环节的药物，是未来抑制炎症药物的研究开发方向。 对于前者，全球最大生物技术公司Amgen的Enbrel，制药巨头强生公司的Remicade 和雅培公司的Humira，这些药物都是TNFa的基因工程可溶性受体，可以阻断与 细胞受体的结合；这些药物的年销售额突破了十亿美金，已经成为药物界名副其实 的新型"重磅炸弹"药物。针对于阻断TNFcc细胞内信号通路的药物开发，已成为下 一步药物开发的重点，目前尚无有针对性的药物报道。
因此，对该蛋白的功能和作用机制及其在生物学领域中的应用有进一步的需要。
发明内容
为了这种需求，本发明人通过研究，发现NINJ1能够对TNFa介导的NF-kB 通路的活性产生影响，并利用该机制确定了该蛋白对于癌症治疗的作用。
在本发明的一个方面，公开了 NINJ1基因的反义核酸探针的用途，其用于制 备诊断癌症的试剂盒。在一个优选实施方式中，癌症是肝癌。在另一个优选实施方 式中，癌症是肺癌。NINJ1的序列优选为SEQIDNO:l。
在本发明的另一个方面，公开了 NINJ1激动剂在制备下调NF-kB的药物中的 用途。在一个优选实施方式中，NINJ1激动剂是NINJ1过度表达的载体。
在该方面的一个优选例中，药物用于治疗TNFot异常引起的炎症性疾病。这些 炎症性疾病优选选自败血症、休克、糖尿病、移植排斥、多发性硬化、类风湿性关 节炎和免疫性肠病。
在该方面的另一个优选例中，药物用于治疗癌症，更优选的癌症选自肺癌和 肝癌。通过NINJ1过度表达促使癌细胞凋亡，从而能够对癌症有疗效。
在此，本文所指的"激动剂"是指能够增强NINJ1功能，或在一定的时间或 空间增加其存在量的那些物质。如本领域技术人员已知的，激动剂可以是过量表达 NINJ1的工程改造的载体。
图1显示了 NINJ1基因结构功能域和相关蛋白序列。
图2显示了不同病人的正常组织、肺癌、肝癌组织切片中NINJ1表达的RT-PCR结果。
图3和图4显示了不同病人的正常组织、癌症组织切片中NINJ1的免疫印迹 结果。
图5显示的是NINJ1的过量表达对于TNF-a介导的NF-kB的活性影响。 图6显示了转染后293 T细胞在不同时间下的氢代谢活力变化。 图7显示了 NINJ1过量表达对于Hela细胞的增殖的抑制。 图8显示了 NINJ1对于细胞凋亡的促进作用。
具体实施例方式
NINJ1广泛表达在许多组织中，如表皮组织，肾脏，胸腺，肾上腺等，提示 NINJ1作为黏附分子在不同组织中都起作用，其结构功能域和相关蛋白序列见图1。
本发明所指的"NINJ1"癌基因包括其完整的DNA编码序列，其RNA序列，其 突变体，以及其功能上活性的片段。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子 中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生的保守的氨 基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。
在得到了 NINJ1的核酸片段的情况下，可根据核苷酸序列来设计特异性探针。 核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获 得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅 读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方 法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要 进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通 常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中 分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。 通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生 物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明中，NINJ1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能 在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征 是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含NINJ1的DNA序列和合适的 转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成 技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动 子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转 录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择 转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗 性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨节青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用 于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；
或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属的 细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当 宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收 获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。 如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的 DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体 包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根 据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主 细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的 方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细 胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离 和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包
括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效 液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在获得了核酸序列后，可根据核酸序列设计特异性核酸探针。设计探针的方
法是本领域常规的，可见Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述。检测生物样品中是否存在NINJ1蛋 白或核酸的示范性方法包括获得测试受试者的生物样品，使该生物样品接触能与 NINJlmRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。该核酸探针可以是，例如人 的核酸或及一部分，如长至少15、 30、 50、 100个核苷酸并能在严谨条件下与NINJ1 mRNA或基因组DNA充分杂交的核酸探针。用于本发明诊断试验的其它探针如本 文所述。
核酸探针与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团，但可被放 射标记。在另一个实施例中，探针连接到一种结合伴侣上，如抗体或生物素，或另 一种携带可检测结构域的结合伴侣上。
在传统的方法中，检测可通过Southern印迹以及与标记的探针杂交来进行。 Southern印迹所涉及的技术是本领域技术人员所熟知的(参见Sambrook等，1989)。 常规的检测还有生物芯片、荧光显影技术、细胞流式计数等。
在得知NINJ1与NF-kB的抑制有关时，还可用NINJ1来筛选NF-kB通道受 体。在细胞中转染表达NINJ1的载体，观察NF-KB表达的抑制；然后从细胞分离 NINJ1和其受体的结合体；分离NINJ1，测定其受体。所述分离可通过电泳、凝胶 选择带有标记的结合蛋白，或者通过NINJ1的单克隆抗体柱来进行。然后通过常 规方法使NINJ1与其受体分离，测定受体。
本发明也包括试剂盒，以进行这里描述的任何方法。在一个非限制的实例中， 所述试剂盒将以适当的容器形式包含这些试剂中的一种或多种。所述试剂盒也可包 含用于RNA分离、扩增细胞中RNA的纯化的试剂、标记等。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的 容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放 置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时， 试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。 然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种 用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料 容器，其中可保留所需的小瓶。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通
常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 NINJ1的蛋白序列的获得和分析
为获得NINJ1基因的全长，设计了以下引物，以Smart cDNA文库为模版，通 过常规PCR，产物回收后进行酶切，再连接于含有Flag的真核表达载体pEF上， 构建了重组子pEF-NINJl ， pEF载体由Arthur Weiss博士 (University of California, San Francisco, CA).赠送。获得的全长459bp的NINJ1基因通过测序验证。NINJ1 全序列如SEQIDNO:l所示
调取基因的引物含有Sfil穿梭克隆位点和终止密码子，在该酶切位点之间是 NINJ1的编码序列；然后设计引物将该质粒中NINJ1的第29位色氨酸突变为丙氨酸。
克隆NINJ1正向引物
5'-ATATGGCCAATCCGGCCATGGACTCGGGAACCGAGGAG-3' (SEQ ID NO: 2)
克隆NINJ1反向引物
5'-AATTGGCCTCTAAGGCCCTGCTGGGGTGCCATGTCCATCAAGG-3' (SEQ ID NO: 3)
突变NINJ1正向引物
5'-ACGCCTCGCCGGCCCGCGCTGGCTGGAGGCACGGGCCCA-3' (SEQ ID NO: 4)
突变NINJ1反向引物
5'-TGGGCCCGTGCCTCCAGCCAGCGCGGGCCGGCGAGGCGT-3' (SEQ ID NO: 5)
根据分析NINJ1的蛋白序列，我们发现NINJ1含有两个跨膜区(81-102AA, 121-142AA)，是一个典型的跨膜蛋白分子。在NINJ1的N端存在一个与黏附相关的区域(28AA-37AA)，根据序列分析，第29位色氨酸可能在NINJ1发挥细胞 黏附作用中是关键氨基酸(见图1)。
实施例2 NINJ1和肿瘤发生的相关性
1. 癌组织中的RT-PCR检测
为了进一步确定NINJ1基因在肿瘤配对组织(即包括肿瘤组织及其对应的正 常组织)中的mRNA丰度情况，我们通过Q-PCR技术针对已有配对肿瘤组织进行
半定量研究。
采用Trizol —步法抽提各组织总RNA，并经过DNA酶消化后，作为RT的模 板。随后，设计并合成了以下引物
上游引物5'—ACCATTACGCCAGCAAGAAGA — 3， (SEQ ID NO: 6)
下游引物5， 一TGAAGATGTTGACTACCACGATGA—3， (SEQ ID NO: 7) 利用FAM-TAMRA标记的荧光探针实施Q-PCR，检测不同组织cDNA中 NINJ1的表达情况。 实验结果
通过RT-PCR检测法，验证了 NINJ1和肿瘤发生的相关性。利用已收集的肿 瘤组织资源，分别通过检测了 NINJ1在相关肿瘤组织和其配对的正常组织中的表 达量。通过RT-PCR检测方法，发现和正常组织相比，NINJ1在肺癌，肝癌中的表 达都有不同程度的升高，结果见图2。
图2左栏显示3对肺癌配对组织的mRNA水平电泳图谱及肿瘤的病理描述； 图2右栏显示3对肝癌配对组织的mRNA水平电泳图谱及肿瘤的病理描述。结果 表明NINJ1在肺和肝肿瘤组织中均有高丰度的mRNA水平。
2. 癌组织中的免疫印迹检测
釆用市售抗体抗-NINJl(BD公司，610776)和抗-P-肌动蛋白(sigma， A5441) 进行蛋白质印迹分析，从蛋白水平上反映NINJ1在各肿瘤配对组织中的表达差异。
肝和肺的肿瘤配对组织样品用lOx体积蛋白裂解缓冲液冰上匀浆裂解， 12000xg， 4°C， 20min离心收集上清上样，分别利用抗-NINJl和抗-P-肌动蛋白的 单克隆抗体，通过Western-blot方法检测NINJ1和内参|3-肌动蛋白蛋白的表达情况。 见图3，图4。
从图中可以看出，NINJ1蛋白在肺(图3)和肝(图4)的肿瘤组织中表达量有明显上调。
在肿瘤组织中表达检测显示NINJ1在多种肿瘤中都有高表达，提示NINJ1可
能和肿瘤的发生，侵入和转移有关。因此，发明人对NINJ1的肿瘤作用机制进行
了研究。
实施例3 NINJ1在肿瘤坏死因子(TNFa)介导的信号通路中的作用
根据发明人建立的基因网络分析，我们发现NINJ1可能在肿瘤坏死因子(TNF) 介导的信号通路中发挥作用，因此通过一系列的生化和分子生物学方法研究NINJ1 的具体作用机制。
本试验采用的细胞为293T细胞，属于人胎肾正常细胞，用腺病毒转化后可以 无限分裂，并携带一个热敏感的大T抗原。
细胞行为的改变(增殖，分化，凋亡，逆转等)都是一系列信号通路作用的 结果，其中NF-kB是调节多种炎症因子基因表达的枢纽，也是细胞凋亡相关的， 多种因素可以诱导NF-kb的活化，其中包括TNF-a。为确定NINJl是否参与NF-kB 信号通路，我们通过过量表达野生型NINJ1来检测其对TNF-a介导的NF-kB活性 的影响。
利用已经建立的应用荧光素酶作为报告基因检测哺乳动物细胞NF-kB活性的 筛选平台，利用报告基因与NINJ1共转染途径，检测报告基因荧光素酶活性，以 发现该基因是否能够影响NF-kB通路活性，进而发现其与肿瘤及自身免疫疾病是 否相关。
将293T细胞以8xl04/500jal的密度接种至24孔板，培养24小时后用 Lipofectamin2000试剂(购自Invitrogen公司)以厂商推荐方法进行转染。每孔转 染质粒量为0.5(ig，包括0.1昭NF-KB报告基因质粒和0.4ug的目的质粒。每个样 品做3个重复孔以消除实验误差；设立PEF-Bos空载体作为空白对照，DN-TRAF6 作为阳性对照。转染24小时后，吸干培养液，以200pl/孔，20ng/ml TNF-a进行刺 激。刺激12-16小时后，每孔加入100W lxPBL缓冲裂解液，在摇床上震荡30分 钟。置于冰上后，取出5pl裂解液，加入发光管中，在生物发光检测仪上进行检测。 PBL缓冲液和荧光素酶检测底物均来自"Promega Dual-luciferase assay system"(购 自Promega公司)。结果见图5。
结果表明NINJ1对TNF-a介导的NF-kB活性有明显的抑制作用。由于NF-kB 是调节多种炎症因子基因表达的枢纽，也是细胞凋亡相关的，从而表明NINJ1与 细胞凋亡密切相关。实施例4通过Alamar blue染色法分析NINJ1在细胞增殖中的作用
AlamarBlue染色法是检测细胞活力的常用方法。AlamarBlue为活细胞代谢指 示剂，易溶于水，在非还原状态下呈蓝色，无荧光性。进入细胞后经线粒体酶促还 原产生荧光及颜色变化，在特定波长下检测其荧光信号和吸收值，可以定量细胞活 力及增殖状态。我们采用293T细胞作为研究对象，在细胞中转染如实施例1中所 述，分别表达野生型NINJ1和优势负突变NINJ1的pEF-NINJl质粒后，用Alamar blue方法检测其对细胞增殖的影响。
将质粒用Fugene HD试剂(购自Roche公司)用推荐的方法悬浮转染293T 细胞。96孔板中，每孔转染质粒量125ng，将其与0.5ul Fugene HD试剂在50ul 细胞培养液中静置混匀20分钟后，向每孔中再加入50ul lxl05/ml 293T细胞。转 染2小时后向每孔中加入10ul Alamar blue试剂(购自Serotec公司)，并在转染后 6小时、24小时和48小时按该试剂盒指定激发光波长检测各孔中的荧光水平。每 个样品做6个重复孔以消除实验误差；设立pEF-Flag空载体作为空白对照 (MOCK)。结果见图6。
结果显示，与对照组相比，293T细胞中过表达NINJ1可以强烈抑制细胞增殖， 表明NINJ1能够抑制TNF-a诱导的NF-kB通路导致的增殖。而优势负突变NINJ1 的过表达也具有与野生型NINJ1类似的抑制增殖的效果，因此我们推测NINJ1介 导的细胞黏附在NINJ1发挥细胞增殖抑制中没有显著作用。
实施例5通过BrdU染色法分析NINJ1在癌细胞增殖中的作用
所用细胞Hela细胞(人宫颈癌细胞)
BrdU染色法，利用溴化脱氧尿嘧啶(BrdU)标记物作为胸苷类似物可以掺入 到新增殖细胞合成DNA中的特点，能够更准确的定量细胞增殖。我们采用HeLa 细胞株作为研究对象，转染过量表达野生型NINJ1研究它对Hela细胞增殖的影响。
将Hela细胞以5xl04/ml的密度接种至24孔板中，培养24小时后用Fugene HD 试剂(购自Roche)进行转染。各转染质粒(来源或名称，如上)均使用0.5pg， Fugene HD使用2jal， Mock对照使用pEF-Flag空载体(来源)。转染后24小时换无血清培 养基进行细胞同步化过夜。然后按5-溴-2'-脱氧尿嘧啶标记和检测试剂盒(购自 Roche)的厂商说明进行BrdU标记4小时(BrdU能掺入到增殖细胞的染色体中)， 然后Hoechst试剂避光染2分钟，使其进入所有细胞的核内，以显示全部细胞。通
12过荧光显微镜下计数，计算增殖百分率(BrdU阳性率)。为保证结果可靠，实验
采用一式三份进行。(图7)
结果表明在HeLa细胞中过表达NINJ1可以抑制细胞增殖。
实施例6利用FACS技术研究NINJ1对细胞凋亡的作用
与细胞增殖相对应的是细胞凋亡。已有研究表明NINJ1过量表达的细胞出现 细胞衰老的特征，提示NINJ1可能在调节细胞衰老的信号通路中起作用。我们已 建立了使用7-AAD/Annexin-V染色和流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡的技术平 台，利用这一技术平台我们检测了 NINJ1基因对HeLa细胞的凋亡。
将HeLa细胞以每孔1.5><105个细胞接种于6孔板，细胞贴壁后(一般隔天) 转染。每孔转染质粒量2pg，将其与6MFugeneHD试剂(购自Roche公司)在100jnl OPTI-DMEM无血清培养基中混合并室温静置，15分钟后滴加入到细胞中。培养 16-24小时后用胰酶消化细胞，lxPBS洗涤1次，lx结合缓冲液洗涤2次。在100pl 的lx结合缓冲液中分别用Annexin-V和7-AAD (BD公司的Annexin V—PE APOPTOSIS DETECTION KIT I)室温避光染色15分钟。上机前每个样品补加约 30(^1的lx结合缓冲液，并在1小时内上机分析样品，并用CELL QUEST软件分 析实验结果。实验中用转染pEF-bos组作为阴性对照，转染RIP作为阳性对照。结 果表明过量表达野生型pEF-NINJl和pEF-Rip的HeLa细胞均有明显的凋亡现象， 转染pEF-bos的对凋亡没有影响(见图8)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利 要求书所限定的范围。200810
参考文献
1. Hood JD, Cheresh DA， Role of integrins in cell invasion and migration,Nat Rev Cancer， 2002 Feb; 2(2):91-100.
2. Mousa SA. Cell adhesion molecules: potential therapeutic & diagnostic implications. Mol Biotechnol' 2008 Jan; 38(l):33-40.
3. Weiss L. Cell adhesion molecules: a critical examination of their role in metastasis-Invasion Metastasis. 1994-1995; 14(l-6):192-7.
4. Swart GW， Lunter PC, Kilsdonk JW, Kempen LC. Activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM/CD166): signaling at the divide of melanoma cell clustering and cell migration Cancer Metastasis Rev, 2005 Jun;24(2):223-36
5. Kawaguchi T. Cancer metastasis: characterization and identification of the behavior of metastatic tumor cells and the cell adhesion molecules, including carbohydrates. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord. 2005 Feb; 5(1):39陽64
6. Takeichi M. Cadherins: a molecular family important in selective cell-cell adhesion. Annu RevBiochem. 1990;59:237-52
7. Goodman CS, Shatz CJ. Developmental mechanisms that generate precise patterns of neuronal connectivity.Cell. 1993 Jan;72-77.
8. Araki T， Milbrandt J. Ninjurin, a novel adhesion molecule, is induced by nerve injury and promotes axonal growth. Neuron. 1996 Aug;17(2):353-61
9. Goudie, D.， Yuille， M,， Leversha， M., Furlong, R,, Carter, N., Lush, M., Affara, N.，禾口 Ferguson-Smith, M. (1993) Multiple self-healing squamous epitheliomata (ESS1) mapped to chromosome 9q22 q31 in families with common ancestry. Natl. Genet. 3, 165 169.
10. Thomas， P. K. (1993) Hereditary sensory neuropathies. Brain Pathol. 3， 57 163.
11. Kim JW, Moon AR, Kim JH， Yoon SY, Oh GT, Choe YK, Choe IS. Up-Regulation of ninjurin expression in human hepatocellular carcinoma associated with cirrhosis and chronic viral hepatitis. Mol Cells. 2001 Apr 30;11(2):151-7
12. Toyama T, Sasaki Y, Horimoto M， Iyoda K, Yakushijin T， Ohkawa K, Takehara T, Kasahara A, Araki T, Hori M, Hayashi N. Ninjurin 1 increases p21 expression and induces cellular senescence in human hepatoma cells. J Hepatol. 2004 Oct;41(4):637-43
13. Zhang S， Dailey GM， Kwan E, Glasheen BM， Sroga GE， Page-McCaw A. An MMP liberates the Ninjurin A ectodomain to signal a loss of cell adhesion. Genes Dev. 2006 Jul 15;20(14):1899-910.
14. Egeblad， M.禾口 Werb, Z. 2002. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat. Rev. Cancer 2: 161—174.15. Li， Q.， Park, P.W., Wilson, C.L,禾口 Parks, W.C. 2002. Matrilysin shedding of syndecan-1 regulates chemokine mobilization and transepithelial efflux of neutrophils in acute lung injury. Cell 111: 635—646.序列表
<110>上海睿星基因技术有限公司
<120> NINJ1蛋白在肿瘤治疗中的应用
〈130〉 10806-211
<160> 6
<170> Patentln version 3. 2
<210〉 1
<211> 399
<212> 腿
<213〉 智人(Homo sapiens)
<220>
<221〉 misc—feature
<222〉 (1).. (399)
<223> NINJ1编码序列
〈400〉 1
atggactcgg gaaccgagga gtacgagctc aacggcggcc tgcctccggg cacacccggc 1
tccccggacg cctcgccggc ccgctggggc tggaggcacg ggcccatcaa cgtgaaccat 60
tacgccagca agaagagcgc agccgagagc atgctggaca tcgcgctgct gatggccaac 120
gcgtcccagc tgaaggccgt cgtggaacag ggccccagct tcgccttcta tgtgcccctg 180
gtggtcctca tctccatctc ccttgtgctg cagatcggcg tgggggtgct gctcatcttc 240
cttgtcaagt acgaccttaa caacccggac aagcacgcca agctggactt cctcaacaac 300
ctggccacgg gcctggtgtt catcatcgtg gtagtcaaca tcttcatcac ggccttcggg 360
gtccagaagc ccttgatgga catggcaccc cagcagtag 399
〈210〉 2
<211> 38
<212〉 副A <213〉人工序列
<220>
<221> misc一feature
<222〉 (1). . (38)
<223〉 引物
〈400〉 2
atatggccaa tccggccatg gactcgggaa ccgaggag 38
<210〉 3
<211> 43
<212> DNA <213〉人工序列
<220><221〉 misc一feature
<222〉 (1)..(43)
<223〉 引物
<400> 3
aattggcctc taaggccctg ctggggtgcc atgtccatca agg 43
<210> 4
<211〉 43
<212> 腿
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc一feature
<222〉 (1). ■ (43)
〈223〉 引物
<400〉 4
acgcctcgcc ggcccgcgct ggctggaggc acgggccca 39
<210〉 5
<211> 39
<212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc一feature
<222> (1)..(39)
<223> 引物
<400> 5
tgggcccgtg cctccagcca gcgcgggccg gcgaggcgt 39
<210> 6
<211> 11
<212> DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
〈222> (l)..(ll〉
<223> 引物
<400> 6
accattacgc cagcaagaag a 11
<210〉 7
<211〉 14
<212〉 腿 <213〉人工序列
<220〉<221> misc—feature <222〉 (1).,(14) <223> 引物
<400> 7
tgaagatgtt gactaccacg atga 1权利要求
1.NINJ1基因的反义核酸探针的用途，其特征在于，用于制备诊断癌症的试剂盒。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌症是肝癌。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌症是肺癌。
4. NINJ1激动剂在制备下调NF-kB的药物中的用途。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述NINJ1激动剂是NINJ1过度 表达的载体。
6. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗TNFoc异常引起的炎症性疾病。
7. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述炎症性疾病选自败血症、休克、 糖尿病、移植排斥、多发性硬化、类风湿性关节炎和免疫性肠病。
8. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗癌症。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述癌症选自肺癌和肝癌。
10. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物使癌细胞凋亡。
全文摘要
公开了NINJ1基因的反义核酸探针用于制备诊断癌症的试剂盒的用途。还公开了NINJ1激动剂在制备下调NF-κB的药物中的用途。
文档编号C12Q1/68GK101619345SQ20081004024
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月4日 优先权日2008年7月4日
发明者骏 吴, 孙筱清, 放 束 申请人:上海睿星基因技术有限公司