在强背景荧光下测量弱信号的拉曼仪器的制作方法

专利名称：在强背景荧光下测量弱信号的拉曼仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于测量在生物组织中发现的化合物的水平的方法和装 置，尤其涉及生物组织中类胡罗卜素或其它选定分子的水平的非侵入性检 测以及测量。
背景技术：
类胡罗卜素是可从饮食中获取的植物色素，它对人体起到重要作用。 例如，许多类胡萝卜素被认为对免疫功能有积极作用，这在抗癌中十分关 键。类胡萝卜素还具有抗心脏病的抗氧化作用。此外，某些研究已经揭示， 类胡萝卜素有助于降低变性疾病的风险，诸如与年龄相关的黄斑变性。
近来，研究人员聚焦在类胡萝卜素a-胡萝卜素(胡萝卜中)、番茄红 素(诸如番茄和红辣椒的红色水果和蔬菜中)、P-隐黄素(桔子中)、以 及叶黄素和玉米黄素(椰菜和绿叶蔬菜中)。某些研究显示，缺乏这些物 质的人更容易患上特定类型的癌症，尤其是肺癌，从而支持以下理论增 加这些类胡萝卜素的食用可以抗癌，进而对这些物质缺乏的鉴定可以向个 人提醒可能的健康因素。 一项研究特别考察了叶黄素，可在许多蔬菜和水 果中找到的一种类胡萝卜素，包括菠菜、椰菜、莴苣、番茄、桔子、胡萝 卜、芹菜和青菜。这项研究对患有结肠癌的将近2000人进行评估，发现该研究群体中叶黄素摄取量大大低于没患癌症的人。
类胡萝卜素针对提供某种程度的生物保护来对抗在各种组织中形成恶 性肿瘤，这已经得到证实。例如，在动物模型中已经示出，类胡萝卜素可 预防在诸如皮肤、唾腺、乳腺、肝脏和结肠的组织中形成癌。另外，低水 平的类胡萝卜素和诸如类维生素A的相关物质已被评定为恶性损害的高风 险因素。例如，具有低水平的类胡萝卜素番茄红素与前列腺和子宫颈癌相
关；类胡萝卜素叶黄素、玉米黄素、a-胡萝卜素以及(3-胡萝卜素与肺癌相 关；而|3-胡萝卜素与口腔癌相关。因此，对这些类胡萝卜素、类维生素A 或其它相关物质的化学浓度的定量测量提供了癌症的风险或存在的指示。
在美国，皮肤癌是最常见的癌症。用以提供对与皮肤相关的恶性肿瘤 相关联的化学物质的水平的测量的方法十分有助于医师和医务人员对皮肤 癌的早期诊断和治疗。
皮肤中的类胡萝卜素提供对抗皮肤恶性肿瘤的生物保护，这已经得到 理论化。用于检测存在与皮肤癌相关联的化学物质的现有方法主要是通过 分析由活组织检査或其它侵入性过程获得的组织。目前用于测量类胡萝卜 素的标准方法是通过高性能液相色谱法(HPLC)技术。这些技术要求从病 人切除大量组织样本以备随后分析和处理，这通常花费至少二十四小时来 完成。因而，这些技术是侵入性的，缓慢且昂贵。
在美国专利No. 5,873,831中描述了用于测量眼睛的黄斑组织中类胡萝 卜素水平的非侵入性方法，其中使用拉曼光谱法来测量类胡萝卜素和相关 物质的水平。拉曼光谱法可标识特定化合物的存在和浓度(只要进行适当 的校准)。近单色光入射到待测量的样本上，对波长与入射光不同的非弹 性散射光进行检测和测量。入射光与散射光之间的波长偏移称为拉曼偏移， 并且该偏移与作为特定分子的振动和转动能态的"指纹(fingerprint)"的 能量相对应。通常，分子呈现若干特征拉曼活性振动或转动能态，由此对 分子的拉曼光谱的测量提供了分子的指纹，即提供了分子专有的一系列尖 锐的光谱振动或旋转峰。拉曼散射光的强度与感兴趣分子的浓度直接对应。
与拉曼光谱法相关联的一个难题是拉曼散射光所固有的极低信号强 度。众所周知，散射光的强度与波长的四次方成比例。较弱的拉曼信号必需与瑞利散射信号区分开，该瑞利散射光是波长与入射光相同的弹性散射 光并且构成了总体散射光的大部分。可通过使用滤光器、光栅或其它波长 分离器件，将瑞利散射光与拉曼信号分离；然而，由于在光通过波长分离 器件时发生的额外衰减，这会有进一步弱化所测量的拉曼信号的效果。实 际上，拉曼散射光是非常难以检测的。可以尝试通过增加对组织样本的入 射光来增大拉曼信号。激光已被用作光源来增加光强，但是这可能会导致 样本灼伤或退化。
为了克服这些难题，使用如在上文所引用的美国专利No. 5,873,831中 所述的称为共振拉曼光谱法的技术。在美国专利No. 4,832,483中也描述了 这种技术。在共振拉曼光谱法中，所用的入射光具有与对应于感兴趣分子 的电子能量跃迁相对应的共振波长。这具有大大增强拉曼输出信号的效果， 而无需使用较高强度的输入信号，由此避免了可能由于激光灼烧而引起的 样本损伤。而且，这些共振拉曼信号具有比非共振拉曼信号更高的强度， 实际上这些非共振拉曼信号在不会损坏人体组织的功率水平下是不可见 的。因此，在共振拉曼光谱法中，仅获取属于感兴趣种类的那些拉曼信号。
在以上所引用的美国专利No. 5,873,831中，共振拉曼技术用于测量类 胡萝卜素叶黄素和玉米黄素一与人眼的健康黄斑组织相关联的两种化学物 质一的水平。以上所引用的美国专利No. 4,832,483使用共振拉曼光谱法来 测量血浆中的特定类胡萝卜素，并推荐使用拉曼光谱峰的强度比作为指示 存在各种恶性疾病的方法。
与拉曼测量相关联的又一难题是在皮肤中感兴趣的物质不仅散射入射 光，而且会吸收并在随后发出相当强度的荧光。这种荧光常常包括光谱较 宽的极强信号，这种信号常常"淹没"或掩盖拉曼光谱峰，从而增加了标 识和量化这些物质的难度。
荧光光谱法本身是另一种可用于测量生物组织中化合物的量的技术。 例如，美国专利No. 5,697,373公开了使用荧光和/或拉曼光谱法来检测子宫 颈的组织异常。荧光测量的缺点是由于许多不同分子在宽波带上荧光，这 些测量不能用于明确标识特定物质的存在或浓度。
美国专利No. 6,205,354示出了一种系统，它使用激光来激发诸如手上的皮肤区域的组织并通过观测所得散射光的光谱来测量类胡萝卜素水平。 窄带的弱拉曼信号必须从光谱中宽带荧光背景(通常亮ioo倍以上)区分 出来。专利No. 6,205,354中的系统使用一种技术，该技术通过对靠近期望 拉曼峰任一侧的光谱部分而非峰的部分进行曲线拟合来估算在拉曼峰之下
的荧光(或背景光)水平。这种分析所需的光谱分辨率苛刻地限制了使用 该系统所依赖的标准光谱仪从组织收集的光量。它要求受激发的组织区域 很小，仅为几分之一毫米。激光是一种可被聚焦成小光斑以进行拉曼激发 的良好单色光源，但是波长在所需蓝绿光谱范围内的激光十分昂贵，并且 在物理条件变化的环境中比较难以保持稳定。此外，基于对峰任一侧的光 的测量估算拉曼峰之下的背景光的水平易于存在可随特定硬件可变性改变 的误差。
因此，提供用以使用具有足以适应相对较大的组织激发面积的光谱测 量灵敏度且无需使用激光或对拉曼峰之下的荧光水平进行基线估算的拉曼 光谱法来测量组织中的化学浓度的装置和方法是一个相当大的进步。这种 装置可对生物组织中以不同程度存在的类胡萝卜素以及其它类似化合物进 行应用更广泛的安全、非侵入、快速、精确和专业的测量。
发明概述
一种用于测量组织中的化学物质浓度的方法具有两个测量步骤。第一， 生成第一光并使用该第一光对组织的一部分进行照射；从该组织捕捉第一 反射光；将该第一反射光引导至多个光传感器，每个光传感器测量不同波 长的光，该波长接近组织中化学物质的期望拉曼偏移的波长；以及从光传 感器的每一个获得一测量值，每个测量值针对通过该光传感器的第一反射 光。第二，生成第二光并使用该第二光对组织的一部分进行照射；从该组 织捕捉第二反射光；将该第二反射光引导至多个光传感器，每个光传感器 测量不同波长的光，该波长接近组织中化学物质的期望拉曼偏移的波长； 以及从光传感器的每一个获得一测量值，每个测量值针对通过该光传感器 的第二反射光。第一反射光的测量值和第二反射光的测量值被用于计算组 织中化学物质的浓度。虽然公开了多个实施例，但是根据以下示出和描述了本发明的示例性 实施例的详细描述，本发明的其它实施例对于本领域技术人员而言，是显 而易见的。如将要实现的，本发明能够在各个显然的方面进行更改而全都 不背离本发明的精神和范围。相应地，附图和详细模式被认为在实质上是 示例性的而非限制性的。
附图简述


图1是装置的基本光处理组件的示意图。
图2是从装置的前视图以及其控制计算机及其电源的示意图。 图3是从光谱仪的主要组件的内部外壳的后端观看的示图。
图4是装置的主要组件的内部外壳的俯视图。
图5是从装置的主要组件的内部外壳的前端观看的示图，并且还示出 了支承组件和冷却风扇的上电路板的位置。
图6是从装置的主要组件的内部外壳的后端观看的示图，并且还示出 了用于支承组件和冷却风扇的上电路板的位置。
图7是装置的主要组件的内部外壳的左视图。
图8是装置的主要组件的内部外壳的右视图。
图9是从装置的外部前端观看的示图。
图IO是从装置的外部后端观看的示图。
图11是装置的外部背视图。
图12是从装置内部的左视图和横截面图。
图13是从装置内部的俯视图和内视图。
图14是从装置内部的齿背角示图和内视图。
图15是与装置一起使用的方法的高层流程图。
图16是与装置一起使用的场校准过程的流程图。
图17是与装置一起使用的场校准过程的自动调谐部分的流程图。
图18是用于收集组织测量中的读数的数据采集和初步计算的流程图。
图19是用于执行用以提供可被分析以产生最终拉曼散射值的测量所 需的两次扫描的流程图。波长下测量的PMT比的绘制的图表和使
用这些比值所构造的抛物线。 发明的详细描述
提供了一种用于测量诸如活体皮肤的生物组织或目标样本中的类胡萝 卜素和其它相关物质或其它选定分子的水平的方法和装置。该装置包括激 发部分、分析器部分和校准部分。该装置实现对组织中的类胡萝卜素(包 括其同分异构体和代谢物)以及类似物质的非侵入、快速、安全和精确确
定。这些信息可作为类胡萝卜素或其它抗氧化剂化合物可提供有用信息的 条件的标记。
可使用本发明的技术非侵入地测量的生物组织示例包括人体手上的皮 肤。预期可针对子宫颈、结肠和肺进行测量。通过添加适当的样本呈现附 件，期望可被测量的体液将包括唾液、全血和粘液。
方法总览
该方法和装置使用用于标识和量化诸如皮肤的组织中的类胡萝卜素和 类似物质或其它选定分子的存在的共振拉曼光谱法。单色或近单色的激发 光(例如，来自发光二极管)被引导到组织或其它目标上，并且在光谱上
过滤和检测散射光。这个过程是基于这样的前提当通过特征波长的光入 射在目标上来激发时，目标中的特定分子结构将发射不同特定波长的光。 由分子结构发射的非弹性散射光子一拉曼发射一的强度是偏离单色激发源
的波长的波长间隔或拉曼偏移的函数。例如，当曝露在473.0纳米的光下时， 类胡萝卜素中的碳或碳共轭双键将发射509.8纳米的光。
如以下将全面描述的，约473.0纳米的近单色激发光可被引导到目标 上。从该目标发射出散射光，包括瑞利和拉曼散射光以及来自该目标的荧 光。瑞利光是经弹性散射的光(或波长与入射激发光相同的散射)。
光的剩余的小部分以非弹性方式散射并因此具有与入射激发光不同的 波长，形成拉曼信号。当光源使用473.0纳米的光激发类胡萝卜素时，类胡 萝卜素发射以509.8纳米为中心的拉曼信号，并且其强度与组织中类胡萝卜素的量相关。瑞利和拉曼散射光在波长上不同。许多激发光还在目标处被
吸收，并导致来自该目标的荧光发射。拉曼测量的难题在于移除这种.509.8 纳米附近的非拉曼荧光混淆成分，该荧光通常比拉曼信号强100倍。对拉 曼信号的分析包括从测量中移除背景光(荧光和瑞利发射)。
激发光与拉曼散射光之间的波长差称为拉曼偏移并且通常以波数或 波长之差来测量，而且可被转换成对应的波长偏移。拉曼偏移与所用的入 射光的波长无关。因而，例如，当激发波长为473.0纳米时，类胡萝卜素分 子的拉曼峰出现在509.8纳米处，而当激发波长为471.3纳米时，拉曼峰出 现在507.8纳米处。从激发光的波长偏移的量是当前分子类型的指示，并且 拉曼峰的强度直接对应于导致该偏移的当前分子的浓度。如前面间接提到 的，特定波数偏移对应于这些化学结构的某些振动或旋转模式。因此，虽 然该方法和装置是关于提供约471.3纳米和473.0纳米的激发光的光源进行 讨论的，但是较宽的激发波长范围在对应波长偏移下同样工作良好。
如上所讨论的，在组织中使用较短的可见波长的拉曼光谱法由于极高 的固有荧光(尤其在皮肤组织中)而变得复杂，这些荧光遮蔽了较弱的拉 曼信号。为了将背景荧光(比拉曼信号亮至少50倍一通常100倍)与拉曼 信号区分开，可进行能够移除背景荧光的两个测量。在第一测量中，将组 织短暂地曝露在473.0纳米的激发波长下。在第二测量中，将组织曝露在 471.3纳米的激发波长下。这两个波长之间的确切间隔并不关键，就如同确 切的波长值并不关键一样。因此，可使用其它波长和/或其它波长间隔。通 常，较佳地使两个激发波长彼此靠近或相邻，但相距足够远以使得它们不 会由于滤光器(包括例如以下讨论的激发带通滤光器和PMT带通滤光器) 的带宽而融合在一起。在此所讨论的特定实施例中，激发滤光器相距1.7 纳米，滤光器宽度为0.8纳米。这使得对应于两个激发波长的拉曼峰相距2 纳米，并由于激发滤光器的带宽而带有某种展宽。PMT之前设计成观测拉 曼光的带通滤光器的带宽为1纳米，这实际上引入进一步的峰展宽。在滤 光器带宽的限制下，期望波长间隔尽可能地紧密。此外，如果有需要，滤 光器间隔可以更宽，例如，3纳米。
由于引导到组织上的光的差别相当小，在第一和第二测量中从组织发射的光呈现类似的荧光水平。对每个激发波长473.0纳米和471.3纳米，测 量接近并包括拉曼信号峰的若干波长的发射光，例如，505.8纳米、507.8 纳米、509.8纳米和511.8纳米。即，获取从约505纳米到约512纳米的波 长范围内的四个发射样本。波长范围或特定采样波长被选择成包括在与选 定分子和每个激发波长相关联的特征发射波长Fc处或附近的值，接近特征 波长Fc但充分地置于该波长之下以排除由于这种激发波长照射而引起的拉 曼发射的至少一个样本，以及接近特征波长Fc但充分地置于该波长之上以 排除由于这种激发波长照射而引起的拉曼发射的至少一个样本。这些测量 随后被用于计算组织中的类胡萝卜素(与该拉曼偏移相关联的化学物质) 的浓度。更具体地，随后将两个激发波长下从组织发射的各个波长的测量 值自身相除。因为对于两个激发波长，测量值基本上相同，所以对于在拉 曼信号峰波长附近观测到的每个波长，比值接近l。这样，通过除法可以移 除较强的荧光背景以及检测器响应的可变性。然而，由于对于两个激发波 长，由类胡萝卜素引起的拉曼峰出现在不同的波长下，所以并未被除掉。 因此，使用这种方法和装置，即使存在较强的固有荧光，也可以确定类胡 萝卜素水平
装置总览
装置生成多个波长的光，这些波长产生具有作为类胡萝卜素的特征的 波长偏移的拉曼响应。该装置具有允许其对由两个激发波长(通常在约470 与475纳米之间进行选择)引起的发射光进行测量的组件，并将光引导到 组织或其它目标上，但是也可使用其它波长。采集来自组织的弹性和非弹 性散射光以及荧光，其中非弹性散射光具有特征能量偏移和产生与组织中 的类胡萝卜素相对应的拉曼信号的可量化强度。形成拉曼信号的非弹性散 射光的强度形成通过分析两个测量来量化。
光处理组件
图1示意性地示出了装置10的组件。装置10包括激发部分12、分析 器部分14和校准部分16。激发部分12生成组织或其它目标所被曝露的光。分析器部分M接收从目标返回的光，并测量特性波长的光量。校准部分16 收集可用于分析原始数据并计算类胡萝卜素量的最终量度的数据。计算机 (未在图1中示出)用于控制装置IO并执行分析。可在计算机接收到所有 原始数据之后在其上执行对最终类胡萝卜素水平值的计算，或者在驻留于 该装置中帮助收集原始数据的处理器中执行该计算。在后一情形中，可将
少量经分析的数据和结果传送到计算机以进行显示和存储。数据分析的位 置并非本方法的重点。
激发部分12包括两个光源20、 22。光源20、 22可包括例如发光二极 管(LED)。在一个实施例中，LED 20、 22是相似的，并发射涵盖470-475 纳米波长范围的波长范围内的光。为了获得两个不同的特定波长，来自光 源20、 22的每一个的光穿过相关联的非球面准直透镜28、 30和窄带滤光 器24、 26。准直透镜和滤光器仅是示例光学组件和聚焦结构，并且可使用 其它组件或不使用，只要到达目标的光具有期望质量。因此，例如，来自 第一光源20的光穿过473.0纳米的窄带滤光器24。来自第二光源22的光 穿过471.3纳米的窄带滤光器26。然而，应当理解，本发明并不限于在这 些波长内生成光。光源也并非一定是LED;它们可以是例如制成以两个单 独波长发射的激光器。
来自第一光源20的准直光撞击并透过分束器32，而来自第二光源22 的准直光撞击同一分束器32的相反侧并从其反射。在所示的实施例中，分 束器是50:50分束器。这使来自两个光源的光进入共同光路，但损失一半光。 分束器32仅用于建立光路并将光从光源20、 22引导到目标，而且在光通 过其它装置(诸如光纤或具有移进和移出准直光路的两个窄带滤光器的单 个光源)引导到组织的实施例中，无需设置分束器。光随后通过激发阻挡 器36，该阻挡器用于从光源中更完全地消除波长在待生成拉曼信号附近的 光。激发阻挡器阻挡除感兴趣波长之外的波长。更具体地，激发阻挡器可 阻挡要从组织采集的波长。因而，例如，如果来自组织的反射光包括蓝绿 光，则由激发阻挡器阻挡蓝绿光。光电二极管38用于监视光源的强度，观 测由50:50分束器32所浪费的光，并且可与校准过程结合以校正光源中可 能发生的强度变化。源自任一光源20、 22的光随后被二向色性分束器34反射，该分束器被设计成对激发波长的光高度反射但对期望拉曼峰附近的 波长高度透射。
由二向色性分束器34反射的激发光沿轴60传播，并通过非球面聚光 透镜61聚焦在导光棒40的末端，该导光棒在光到达组织之前用作光束均 质器。这消除了原本会使测量恶化的光源和滤光器的偏差的影响。棒40将 光引导到组织上或组织中并在组织上照射一光斑。在一个实施例中，棒40 是照射直径大致为两毫米的光斑的玻璃棒。如参照图2和12所见，棒40 可略延伸穿过装置IO的开口 71，以确保该棒40与组织或目标13接触。组 织或目标13可以是例如手，如图1中所示。
光路中的组件(例如，非球面聚光器28、 30和棒40)可具有抗反射 涂层以减小其表面的反射。
从组织返回的发射光在中心光轴63上通过棒40并通过非球面聚光器 和二向色性分束器34传播回到分析器部分14。(虽然在图1中返回光的轴 63被示为与中心轴60分开，但是这仅出于说明的目的；轴60、 63实际上 是重合的。)发射阻挡器41将光的光谱内容限制成跨越装置10的分析器 部分14中所用的波长。在所示实施例中，光通过发射阻挡器41，该阻挡器 减小激发波长的瑞利散射光。然后，光被引导通过有色玻璃滤光器43。该 有色玻璃滤光器是光谱阻挡器并且可被设置成吸收瑞利散射光。有色玻璃 滤光器的通带足够宽以传输要由分析器部分的传感器测量的波长。分析器 部分14将光引导到能够检测感兴趣范围内的若干波长的发射光强度(诸如 皮肤中类胡萝卜素的波长特征)的光检测系统。在所示实施例中，光检测 系统由诸如光电倍增管的多个单独的高灵敏度光电检测器构成。如果诸如 雪崩光电二极管、CCD (电荷耦合器件)检测器阵列或增强CCD检测器阵 列的其它高灵敏度器件具有足够的增益和低噪声水平，则可以使用它们。
在所示实施例中，光检测系统包括四个光电倍增管(PMT) 42、 44、 46、 48。光被分割成大致相等的量并被引导到每个PMT。 PMT是在诸如荧 光光谱法的低强度应用中有用的光检测器。由于较高的内部增益，PMT具 有以较高的灵敏度测量较低水平的光的能力。光电倍增管通常在抽空的玻 璃罩中包括光电阴极和一系列倍增极。撞击光电发射阴极的光子由于光电效应而发射电子。电子通过倍增极链得到加速，而级联效应对击中第一阴
极的每个电子生成105到107个电子。
分束器被设置成与每个PMT (图1中的PMT0-PMT3)相关联，使得 沿中心轴63引导的光在PMT42、 44、 46、 48之间等分。因而，在所示实 施例中，提供了四个分束器50a-50d。分析器滤光器54和聚焦透镜52被设 置在从每一个分束器50a-50d到每一个PMT42、 44、 46、 48的光路中。聚 焦透镜52可以是将光聚焦到PMT的有效区域的菲涅耳透镜。每个滤光器 54是仅透射特定波长光的带通滤光器。第一分束器50a将光的四分之一引 向PMT0 42。第二分束器50b引导剩余光的三分之一，以向PMT144提供 总发射光的四分之一。第三分束器50c引导剩余光的二分之一，以向PMT2 46提供总发射光的四分之一。第四分束器50d，即反光镜，引导全部剩余 光，以向PMT3 48提供总发射光的四分之一。这样，PMT42、 44、 46、 48 可各自测量等量发射光的强度并且可通过使用相关联的带通滤光器来各自 测量感兴趣波长范围的特定部分。在这种方法中，使得大部分可用光的为 相对较少的检测器所使用，从而在要测量的特定波长下提供增强的灵敏度。 此外，四个检测器的相对灵敏度对于该方法和装置并不重要，由此可以使 用对光极端敏感的PMT。
每个PMT 42、 44、 46、 48被曝露于不同特定波长的光下，并对这些 光进行测量，这些波长接近基于由光源20、 22发射的光的类胡萝卜素拉曼 信号的波长。因而，在LED 20、 22发射471.3到473.0纳米的光时，分析 器滤光器54可以以505.8、 507.8、 509.8和511.8纳米为中心。在特定实施 例中，每个滤光器54具有一纳米的通带宽度。然而，可使用不同通带宽度 和不同中心波长。相应地，第一PMT 42可测量505.8纳米的光；第二 PMT 44可测量507.8纳米的光；第三PMT 46可测量509.8纳米的光；第四PMT 48可测量511.8纳米的光。
来自每个PMT的输出被传递到装置的分析组件以确定组织中存在的 类胡萝卜素的水平。在特定实施例中，每秒对每个PMT的输出采样3000 次，并且使其通过模数转换器。PMT输出被传递到分析组件作为值从O到 IO伏的电压。该电压关联于与PMT所曝露的光量。测量如下进行过滤成471.3纳米的光源被接通，它对组织样本进行
照射，从而引起在507.8纳米生成的拉曼信号以及大量的非期望荧光背景 光。四个PMT测量从样本生成并发射的期望拉曼偏移波长附近的波长。例 如，四个PMT可分别测量505.8纳米的光、507.8纳米的光、509.8纳米的 光和511.8纳米的光。这些光大部分是荧光。然而，对507.8纳米的光进行 观测的PMT可以感知到由拉曼信号引起的少量附加光。在测量间隔期间获 得每个PMT的平均读数并对其进行记录。过滤成471.3纳米的光源随后被 关断，而过滤成473.0纳米的光源被接通。重复该测量。在每个PMT观测 到的荧光水平是相似的，但是现在少量拉曼信号作为附加光出现在测量 509.8纳米的PMT处。此测量序列可被重复并求平均以减小PMT的平均读 数中的噪声(总共八个读数，在使用八个光源对样本进行照射期间对每个 PMT进行读取)。接着，对样本使用471.3纳米的照射获得的四个PMT读 数分别除以对样本使用473.0纳米的照射获得的四个PMT读数。这生成其 值接近于1的四个数，因为这两组四个PMT读数中荧光占优势并且非常相 似。然而，对507.8纳米的光进行观测的PMT所生成数略大于l，例如1.005， 这是由于第一测次量中的额外拉曼信号，而对509.8纳米的光进行观测的 PMT所生成数由于第二次测量中的额外拉曼信号而将略小于l，例如0.995。 这种与1的偏差揭示了样本中拉曼峰与荧光的比值。随后与荧光的平均水 平相乘，得到与样本中的类胡萝卜素分子的量成比例的数。
虽然以上测量描述针对过滤成471.3纳米的第一光源和过滤成473.0纳 米的第二光源，但是应当理解，这些光源可被过滤成任何合适的波长。
校准部分16包括光源23，用于发射仅用于校准PMT响应以消除在温 度变化或所施加电压变化的情况下发生的漂移效应的光。由光源23发射的 光的波长通常与期望从组织接收以供分析器部分14处理的光的波长相对 应。因此，由光源23发射的光可以是范围从约505纳米到约512纳米的 LED光。该光通过滤光器56。该滤光器56可包括例如中性密度滤光器。 该中性密度滤光器56将光的功率减小到与拉曼测量中从组织返回的光可以 比拟的水平。在校准部分16中设置光电二极管。该光电二极管测量校准光 所通过的腔体内的光。来自光源23的光通过光束传输系统被引导到中心光轴并朝向分析器
部分14。光束传输系统可包括用于将光引导到PMT进行测量的光学组件的
任何组合。如所示，光束传输系统包括二向色性镜，即使它被设计成透射
505到512纳米范围内的光，但是该二向色性镜也可反射少量光。因此，来 自光源23的光穿过滤光器56并由二向色性镜34引导到中心光路60上并 到达分析器部分14。
图2-8示出体现了在图1中示意性示出的组件的商用产品的示例性物 理布局。这种布局包括用于所讨论的各个组件的内部外壳(概括为70)， 该内部外壳可随后被封装在适于产品的便携式版本的外部外壳900中。这 样的版本更易于将手或其它组织即时紧靠玻璃棒40的端部而放置。可在 PMT 42、 44、 46、 48处或附近设置温度传感器(未示出)以感测PMT的 温度。图9-14示出了外部外壳以及各个内部外壳和结构。虽然图9-14示出 了组件的一般位置，但是简便起见，它们并不尝试示出如图1中出现的光 路。
支持电气组件
以上描述的光处理组件使装置中所用的激发光被生成并被引导，并且 使得发射光被接收、引导和测量以产生原始发射值。这些组件具有包括软 件的相关联支持和控制组件，它们是执行以下讨论的操作方法所必需的。 支持和控制组件可被定位成部分在用于光处理组件的外壳900 (参见图9) 内，部分在与包含在用于装置IO的光处理组件的外壳内的支持和控制组件 通信的独立计算机200 (参见图2)或数据处理器上。可以包括风扇203 (参 见图5和6)以对这些组件进行冷却。
计算机200可控制这些功能，诸如对装置10通电或断电、调节PMT 的电压、调节光源的电流、接通或切断各个光源以及读取由PMT、光电二 极管和温度传感器输出的值。计算机200还可接收经数字化并为数据分析 的各个步骤做准备的原始数据。或者，数据处理组件(微处理器、DSP或 其它逻辑组件)可被定位在外壳900内的电路板1210、 1212和1214 (参见 图12)上。这些数据处理组件可进行全部或大部分处理，并将需要少量计算或无需进一步计算但可被显示以供用户查看、存储或进一步通信的一小 组结果数据传递到计算机200。
支持和控制组件的功能包括向激发光源20、 22以及校准光源16供 电并感测、控制和调节所提供的电流；向光电倍增器供电，并感测、控制 和调节所提供的电压；读取为PMT42、 44、 46、 48、光电二极管38和58 以及温度传感器(未示出)的输出的输出电压或其它值；数字化所感测的 电压和其它值，并对其进行格式化以传送到数字处理组件、驱动任何可能 的机械组件、存储和传送数据；以及对来自用户界面和来自控制装置以及 任何可用组件和系统测试的操作序列的软件的控制信号进行接收和执行。 这些可由配置成与实现以下所讨论的方法的控制软件以及以上所讨论的光 处理组件一起操作的常规组件来执行。
在连接器1412处从例如电源201 (参见图2)向外壳900内的所有支 持和控制组件供电，同时在连接器1410处通过连接到外壳900的通信信道 进行通向或来自计算机200的通信。也可通过诸如电池的内部源来供电， 并且通信信道可以是物理或无线连接。
方法的讨论
如图15的高层流程图所示，用在装置的操作中使用的三中总体方法 是装置的校准，在框500处示出；测量根据两个激发波长从组织或另一 目标散射的光，在框502处示出；以及分析来自这两个测量的数据以获得 类胡萝卜素水平的最终值，在框504处示出。以下讨论这些方法的每一个
1.校准
校准过程将组件设置到其合适的操作参数，并收集用于分析和归一化 原始数据以计算例如类胡萝卜素(或其它分子)的化学物质的量的最终量
度的数据。最终量度可称为类胡萝卜素记分(Carotenoid Score)。该类胡 萝卜素记分可以在任何合适的范围上，并反映组织中的类胡萝卜素的水平。 合适的范围可以是O到100,000。如图16中所示，校准过程可包括(1): 寻找提供给PMT的电压和提供给光源的电流的最佳值，在框506和508处 示出；(2)测量在"暗扣除"过程中所用的在光学暗材料，在框510处示出；(3)测量产生与类胡萝卜素相对应的偏移发射波长的拉曼信号的参考 标准材料(因此，对应于约473纳米的光源，拉曼信号约为509纳米)， 在框512处示出；(4)计算用在将读数转换成类胡萝卜素记分的数据分析 中使用的线性方程的系数，在框514处示出；以及(5)收集在数据分析中 进行归一化的数据，在框516处示出。并非所有这些步骤应该一次性执行， 并且它们可以采用与所示次序不同的次序执行。参考标准材料可以是被设 计成用在校准过程中的已准备样本。例如可通过2004年11月3日提交的 题为 Process and Compositions for Synthetic Calibration of Bio-photonic Scanners (生物光子扫描仪的合成校准的过程和合成物)的美国专利申请 S/N 10/981139中讨论的方法并使用其中讨论的合成物或者通过本领域中公 知的其它方法来制备这些材料，其中该申请通过引用结合于此。
校准可按所需频度进行，但是通常在组织测量之前，并且以低于组织 测量的频度进行。校准得到的数据和操作参数可用于分析数据，如本文稍 后所述。
图17中图示了校准过程中称为"自动调谐"520的一部分。自动调谐 用于确定PMT输入电压和光源电流的最佳设置。通常，第一和第二光源20、 22在相同的条件下操作时产生不同的光输出水平。在特定实施例中，第一 和第二光源20、 22的电流以及每个PMT的输入电压被初始化成典型设置。
为确定最佳电压，从框522开始，使用光源20、 22之一对参考标准材 料进行照射。PMT输入电压被改变，如框524所示，直到PMT的最低输 出电压落在1.2伏的5%内，如在框526所确定的。在此输入电压下，PMT 将获得关于参考标准和大多数组织的优质读数(如以下所述，为了对具有 异常高荧光的组织进行测量，可能需要PMT电压的精细调谐)。因此，如 框528所示，这是最佳电压。
为了确定校准光源的最佳电流水平，从框520开始，调节校准部分16 的校准光源23的电流水平，如框532所示，直到如在框534所确定的，最 高读数的PMT的输出电压落在7.5伏的5%内。如框535所示，这是最佳 电流。
为了确定第一和第二激发光源20、22的最佳电流水平，从框536开始，调节用于第一和第二光源20、 22的光源电流，如框538所示，直到如在步 骤540所确定的，当第一光源接通时对参考标准材料进行照射的同时测量 的平均PMT输出电压落在当另一光源接通时的平均值的1%内。如框541 所示，这是最佳电流。
通常，自动调谐过程中导出的值仅略微逐天变化。该过程消除了在工 厂进行校准的需要，并且适应装置老化或者在不同的环境中操作。
对光学暗材料("暗扫描(dark scan)")的读取提供在没有外部荧 光源的情况下对光信号和电信号的基线测量。这成为"暗数据"。黑色阳 极化的透镜盖1211 (参见图12)可设有用作光学暗材料的装置。具有暗材 料作目标的PMT的输出值被保存，以备在后续数据分析中(在以下描述) 中使用。通过对光源进行开和关来对第一和第二光源20、 22的每一个捕捉 暗数据。从来自PMT的所有后续读数的原始数据中减去这些"暗数据"值。 与读取其它校准材料或组织时所捕捉的值相比，这些值通常较小。
测量参考标准材料可用于计算被称为"C"的未校准记分。使用该装置 来测量与高读数组织等效的具有509纳米拉曼响应的参考材料。分析来自 这种"高"参考材料的测量的数据，以计算未校准记分。将高参考材料的C 值用于计算用在数据分析中的线性方程的系数。校准过程也可使用高阶方 程进行数据分析。
在特定实施例中，校准过程根据组织测量的C值计算用于计算类胡萝 卜素记分的线性等式的系数和偏移量。以下相关于数据分析更全面地讨论 该等式。对先前称为高参考材料的高校准标准目标样本分配标称类胡萝卜 素记分77,000。该数字是任意的，并且可以是改变。然而，该数字允许较 宽的组织采样，以使用反映组织中相对类胡萝卜素内容的比例来在0与 100,000之间记分。在特定实施例中，C值通过作为直线的斜率截距公式的 简单线性方程映射到该比例。
类胡萝卜素记分=0值*系数+偏移量
通过将高参考标准的分配(标称)值除以在读取时获得的C值来计算 该系数。通常，可读取第二参考标准以给出在计算直线的系数和偏移量时 使用的两个点。然而，在读取不包含拉曼活性材料的参考样本时，装置获得充分接近零的C值，使得第二点可被假定为具有为零的分配值和为零的 C值。因此，计算系数的公式仅需要一个读数并且偏移量为零。该校准是 单点校准，而非更复杂和耗时的双点校准。可使用具有不同分配记分的标 准参考材料来进行附加测量以生成高阶校准方程。
在校准期间可捕捉若干其它值，以在数据分析期间在对原始数据进行
归一化时使用。这些包括但不限于(a)校准部分16的蓝绿色/绿色光电 二极管58的读数("绿光二极管校准读数")；(b)在校准光源23被自 动调谐时PMT的每一个的输出电压读数(称为"绿色校准数据")；以及 (c)在读取高参考材料期间对第一和第二光源20、 22捕捉激发部分12的 光电二极管38的读数(对第一和第二光源分别为"第一蓝光二极管校准读 数"和"第二蓝光二极管校准读数")。
可在校准过程结束时执行核对以确定装置是否"调零"。这测量机器 产生质量读数的能力。在读取具有荧光但没有与类胡萝卜素波长相同的拉 曼信号(例如509纳米)的参考材料时，适当调零的机器获得接近零的C 值。在自动调谐过程期伺捕捉用于作出该核对的数据。因为C值未被计算 直到暗数据以被捕捉之后，所以在校准过程结束时执行"调零"核对。
2.扫描和测量
图18概括地示出了扫描和测量的过程。在每次进行组织扫描之前，采 集数据，在框600处示出，以在数据分析(在以下描述)期间使用。如框 602处所示，通过校准部分16的绿色/蓝绿色光源23的照射、引导该光通 过分析部分14、以及使用PMT分析该光，来收集"绿色读数"。PMT的 每一个的输出被收集并且包括用于扫描的"绿色读数"。通过各个光源的 单独照射并在相关联的光电二极管38或58处获得值，来收集激发部分12 的第，光源20的"第一蓝光二极管读数"(框604)、激发部分12的第二 光源22的"第二蓝光二极管读数"(框606)和校准部分16的光源23的 "绿光二极管读数"(框60S)。
在装置10的操作期间，第一光源20被激活以生成第一激发光。该光 被引导通过激发滤光器(例如，窄带滤光器24)并通过光传输系统直至组织或其它目标。第一光源20的电流可被调节以控制其亮度。可提供较短的 延迟以使得来自第一光源20的输出能够稳定。来自组织的反向散射光通过
光采集系统到达分析器部分14。光被等分并引导到PMT。对每个PMT的 输出以例如每秒3,000个样本的速率在100毫秒的间隔内进行采样。将每个 样本的PMT输出进行模数转换并作为电压进行报告。对PMT的每一个采 集一值。然后，使用第二光源22重复此过程。
施加到第一和第二光源20、 22的每一个的电流可以不同。通常，期望 来自光源20、 22的每一个的、被引导至组织的光强相同。为了实现此目的， 可以采用不同的电流驱动光源，因为两个光源的亮度之间存在差异并且两 个激发滤光器的透射效率存在差异。可在校准过程的"自动调谐"部分确 定每个光源的最佳电流。如上所述，无需对每次单独扫描确定这种最佳电 流。
也可在自动调谐过程期间确定施加到PMT的电压。通常，PMT电压 被设置成一值，该值使PMT产生高得足以给出参考标准材料(在以上描述 的)的良好读数而又没有高到在读取具有较高荧光的组织时使数模转换器 饱和的输出。
使用两个测量来获得读数一一个来自第一光源20，而另一个来自第二 光源22。因此，在一个实施例中，为了获得读数，第一测量使用第一光源 通过471.3纳米激发滤光器来进行。因此，第一测量对应于使用第一波长 Fl的光来对目标进行照射。从第一测量保存四个PMT值，每个PMT—个。 第二测量使用第二光源通过473.0纳米激发滤光器来进行。因此，第二测量 对应于使用第二波长F2的光来对目标进行照射。从第二测量保存四个PMT 值，每个PMT—个。因此，读数使用八个值使用471.3滤光器测量的四 个PMT值和使用473.0滤光器测量的四个PMT值。(如为本领域技术人 员所显见的，可使用不同数量的PMT，于是对读数使用不同数量的值。特 征拉曼发射波长Fc与组织中要测量的选定分子相关联。每个PMT对期望 发射光波长处或附近波长的光强进行采样，并由此提供与目标上仅期望测 量的拉曼散射信号的波长附近的荧光有关的数据。)
同时读取多个PMT。针对使用第一光源20的测量捕捉来自PMT的值。然后，针对使用第二光源22的测量捕捉来自PMT的值。该对测量一起表
示单次读数。对每个光源20、 22执行多次读取，并且对结果求平均以收集 一次完整扫描的原始数据的八个值。这些值被采集并被求平均，以平滑掉 测量之间可能存在的小偏差。
因此，对使用第一波长F1的光照射目标所产生的光获得第一组采样强 度值，而对使用第二波长F2的光照射目标所产生的光获得第二组采样强度 值。每一组包括与选定分子以及相应波长Fl或F2相关联的特征发射波长 Fc处或者附近的值。每一组还包括靠近特征波长Fc但与该波长充分偏离以 消除由相应波长Fl或F2产生的拉曼发射的至少两个值。这些值的至少一 个在期望特征波长Fc之下，而且这些值的至少一个在期望特征波长Fc之 上。每组强度值包括来自每个强度传感器(例如，PMT)的值。因此，第 一组采样强度值包括来自多个传感器的、由第一波长F1的照射产生的值。 例如，第一组包括四个值SFIO、 SFll、 SF12、 SF13，四个传感器的每一个 产生一个值。该组值是一有序集合，并且这些值中的一个(例如SFll)是 在与选定分子相关联的特征波长Fc和第一波长Fl下的测量值。类似地， 第二组采样强度值包括来自多个传感器的、由第二波长F2的照射产生的值。 例如，第二组包括四个值SF20、 SF21、 SF22、 SF23，四个传感器的每一个 产生一个值。该组值是一有序集合，并且这些值中的一个(例如SF21)是 在与选定分子和第二波长F2相关联的特征波长Fc下的测量值。
因此， 一次完全扫描和测量包括(1)确定要执行的读取的次数，在 框610处示出(通常，为了获得良好的结果，在读取皮肤时比在读取参考 标准时采取更多次读取和更长的扫描；要执行的扫描次数很容易由本领域 技术人员根据普通经验来确定)；(2)将PMT的电压调节至在自动调谐 过程期间确定的值；(3)执行经确定的读取次数并保存从每次返回的八个 值，在框612、 614处示出；以及(4)对从每次测量返回的八个值的结果 求平均，在框616处示出。因此，来自一扫描的未经处理的原始数据包括 使用每个光源的情况下的每个PMT的总共八个值的平均值。(注意无需 执行调节PMT电压的步骤，除非自校准过程重新运行以来它己发生变化。)
如以下详细描述的，未经处理的原始数据进行数据分析以转换成类胡萝卜素记分。通常，从第一和第二组采样强度值导出与第一和第二波长F1
和F2中的每一个相关联的特征波长Fc之间的发射光的内插强度值。内插
强度值消除了由于非拉曼发射而产生的强度值成分。
应当注意呈现异常高荧光的组织可使PMT生成模数转换器无法正确
转换其值的高输出。当发生这种情况时，可将PMT电压减小约20伏并重 复扫描。可按约20伏的步长重复减小该电压直至扫描成功。可再次读取绿 光二极管信号并将其与先前的绿光二极管读数作比较以在PMT电压减小的 情况下下适当地校准组织读数。
3.数据分析
数据分析过程将读取中得到的原始数据转换成类胡萝卜素记分。该类 胡萝卜素记分可在任何范围内表示，并指示组织中类胡萝卜素的水平。在 一个实施例中，该范围从0到IOO，OOO。如前所阐述，类胡萝卜素记分的计 算是
类胡萝卜素记分=<:值*系数+偏移量
分析过程使用在校准期间收集的数据来处理来自当前扫描的原始数据。
如上所述，当前扫描获得多个值使用第一光源时每个PMT的值和使 用第二光源时每个PMT的值。因此，在所讨论的实施例中，扫描获得八个 值使用第一光源和471.3纳米滤光器时四个PMT的每一个的值以及使用 第二光源和473.0纳米滤光器时四个PMT的每一个的值。这些值各自包括 每个PMT的读数的平均，在由PMT及其带通滤光器覆盖的波长范围内不 同波长下表示样本。
可能由于正进行扫描的环境中的变化或者由于在正常操作期间机器和 PMT简单变热而导致温度偏差。对原始数据执行"绿色归一化"以校正PMT 光灵敏度的任何变化和PMT响应中的合成变化。绿色归一化包括通过绿色 校准数据(在校准时获取的校准部分光源的PMT读数，如图16的516所 示)除以绿色读数(在点亮校准部分的光源的情况下，扫描开始时采集的 PMT读数，如图18的602所示)来调节原始数据(相乘)。此过程将原始PMT读数调节成在校准期间进行扫描时的读数。
虽然针对PMT响应中的变化进行绿色归一化校正，但是进行亮度校准 以校正光源20或22的任一个的亮度。在一个实施例中，使用激发部分12 的第一和第二光源20、 22获得的PMT读数可通过将PMT信号乘以在校准 过程期间测量的对应蓝光LED信号与在组织读取期间测量的蓝光LED信 号的比值。
因此，针对可能在机器被校准时与扫描运行时之间发生的PMT响应 (例如由于温度变化)和光源亮度的变化，对原始数据进行校正。PMT电 压可使用校准部分16的光源23的读数变化来校正。使用蓝光光电二极管 38的读数变化来校正光源亮度。
光电二极管读数也可被校正。当光源20、 22、 23被切断时，系统中应 当不存在光，并且光电二极管应当读数为零。情况并非总是这样。因此， 在开始扫描时，光源20、 22、 23可被切断且在光电二极管38、 58处获取 非零电压的简要读数。随后可从在同一扫描中进行的所有后续光电二极管 读数中扣除所测量的非零电压。
在数据分析期间，所有PMT读数都是经"暗扣除"的。在暗扣除期间 使用来自暗扫描的暗数据。从归一化数据阵列中其对应方扣除从暗扫描保 存的原始数据值的每一个(即，从使用第一光源20和滤光器24时PMT42 处的归一化数据扣除使用第一光源20和滤光器24时PMT42处的暗值)。 在一个实施例中，在捕捉或施加时并未对暗数据进行归一化或校正。
对于每个PMT，将在第一光源被点亮(例如，在471.3纳米激发滤光 器的情况下)时捕捉的暗扣除比、绿色归一化的原始数据除以在第二光源 (例如，在473纳米激发滤光器的情况下)被点亮时的对等数据。在所示 实施例中，此过程生成四个归一化信号比，每个PMT—个。因此，这些比 值可包括SF10/SF20、 SF11/SF21、 SF12/SF22禾B SF13/SF23。使用这四个比 值来计算值"D"。
D是存在或不存在类胡萝卜素信号时PMT比值之间差异的量度。这是 类胡萝卜素添加到由机器测量的目标荧光上或之上的信号差异。参照通过 四个比值绘制的抛物线来计算"D"，如在图20中所示。该抛物线具有两个特性。第一，该抛物线通过第一和最后PMT的比值。第二，第二 PMT 的比值与抛物线之间的距离大小等于第三PMT处距离的大小。图20示出 了 PMT比值和从它们导出的抛物线。D是从PMT比值向下(对于PMT1) 或向上(对于PMT2)到曲线之间的距离。在所示算法实施例中，这些距离 是相等的。将在以下更全面的讨论用在内插算法中的抛物线方程。
通常，抛物线用于在两个已知端点之间(PMT0禾nPMT3)之间进行内 插以在PMT1与PMT2的中间找到目标荧光水平。此水平可用于确定D值。 PMT0和PMT3处测量的比值由此可用在抛物线内插算法中以确定在PMT0 与PMT3之间测量的光谱(波长采样范围)中点处的目标荧光。此过程返 回值D，它是在PMT1处测量的比值与背景荧光信号水平之间差值的大小 和/或在PMT2处测量的比值与背景荧光信号水平之间差值的大小。
另外声明，将曲线外推成对所计算的比值进行拟合，该曲线通过点(fO、 SF10/SF20)和(fO、 SF13/SF23},其中f0、 fl、 f2和f3的每一个是四个传感 器的相应第一、第二、第三和第四个的中心波长，并且该曲线到点(fl, SFll/SF21〉和(f2, SF12/SF22)是等距的。
因此，值D表示当拉曼信号存在或不存在时PMT读数比值之差的量 度。这个差值是类胡萝卜素添加到由装置测量的目标荧光上或之上的信号 差。D是很小的数，反映了与背景荧光相比拉曼信号非常小这个事实。通 常，当读取不具有拉曼活性成分的参考标准时，D接近于零。当读取包含 产生显著拉曼信号的材料的参考标准时，D可超过0.02。皮肤组织的D通 常在0.0050到0.0100的范围内。特定值受到传感器或检测器(在此实施例 中为一组PMT)的光谱分辨率的影响。
通常，如以下将更全面讨论的，通过PMT比值绘制抛物线来计算D。 该抛物线具有两个特性。第一，该抛物线通过第一和最后一个PMT比值。 第二，第二 PMT的比值与的抛物线之间的距离等于第三PMT处的比值与 抛物线之间的距离。D是从PMT比值向下到曲线(对于第二PMT)或向上 到曲线(对于第三PMT)之间的距离(这些距离相等)。
因此，D度量了因存在拉曼信号而引起的PMT比值增大。由于D是使 用PMT信号的比值计算的，所以创建对存在的拉曼活性材料量的有意义的量度，需要将D乘以在第二光源照射第二滤光器时所测量的平均PMT电压。
此值称为C，并且是组织中拉曼活性材料量的最终的未校准量度。
在最后的步骤中，根据从扫描获得的c值以及由校准过程生成的系数
和偏移量来计算类胡萝卜素记分。这产生经校准的类胡萝卜素记分。校准 过程处理缓解机器内逐天或逐机器发生的变化。组件老化以及在机器之间 并不相同。校准过程防止这些对记分产生影响。
在读取参考标准时在活性材料的递增浓度与c值之间发现普通线性关
系。此线性方程由此用于计算扫描的最终结果
类胡萝卜素记分=(<:*系数)+偏移量
在另一实施例中，在活性材料的浓度递增的情况下表示校准材料读数 时，可使用更高阶多项式。
注意使用四个PMT测量值，曲线拟合只可能是线性或抛物线的。然
而，如果PMT的数量增加，则可创建(PMT数-2)阶多项式。因此，例 如，如果提供了五个PMT，则三阶多项式可被拟合。
此外，虽然使用两个激发波长，但是可使用任何数量的激发波长。
益处和用途
该方法和装置可用于检测和测量诸如人体皮肤的组织中的类胡萝卜素 含量。使用来自采用类似装备和校准的两百万次以上的扫描的数据，人体 皮肤的平均类胡萝卜素记分为26,000。水果和蔬菜含量高的饮食与类胡萝 卜素记分之间存在高度相关。具有健康饮食以及使用营养补充的人可得到 高于70,000的记分。具有不良饮食习惯或诸如吸烟行为的人有时获得低于 10,000的记分。
先前已在某些研究中证明皮肤中的类胡萝卜素、类维生素A和类似化 学物质的水平与特定健康条件相关。如果测到较低的类胡萝卜素水平，则 可采取预防性措施，诸如包括饮食补充的饮食纠正。
己被发现与良好健康相关联的若干类胡萝卜素包括全反式-(3-胡萝卜 素、番茄红素、a-胡罗卜素、？胡罗卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、 七异戊烯醇(septapreno)-!3-胡萝卜素、7，7，二氢-|3-胡萝卜素、虾青素、角黄素、玉米黄素、叶黄素、(3-脱辅基(apo)-8'-胡萝卜素醛、堇菜黄质 (violaxanthin)和若杜林素(rhodoxanthin)。这些是具有不同长度和附属 物的链状分子，全部都具有分别带交错碳双和单键的碳主链。可使用拉曼 光谱法检测到为所有类胡萝卜素所共有的这些键的振动。可从独立测量获 知，这些类胡萝卜素的波数偏移通常在从800到2000cm—1 (波数)的范围 内。例如，知道类胡萝卜素叶黄素和玉米黄素分别具有约1160 cm'1和1520 cm"的波数偏移。
类胡萝卜素是皮肤的抗氧化防御系统的重要成分，其中它们被认为充 当自由基和单氧清除剂。此外，类胡萝卜素保护皮肤抵抗大量有害活性氧 物质(ROS)，该有害活性氧物质是例如由于皮肤过分曝露于诸如来自阳 光的紫外(UV)线而形成的。 一旦形成，则ROS有效地与DNA、蛋白质 和不饱和脂肪酸发生反应，从而导致DNA绞链断裂和氧化性损伤，以及蛋 白质-蛋白质和蛋白质-DNA交联。脂类的氧化可导致形成脂类过氧化物， 该脂类过氧化物将相对长时间地存在于细胞中并且可由此引发自由基链反 应并增大氧化损伤。
该方法和装置提供了对各种人体组织和体液中类胡萝卜素水平的快 速、非侵入性评估，并具有其它有益用途。这些用途包括评估人体组织中 的总体抗氧化剂状态；提供对组织类胡萝卜素或其它抗氧化剂含量的饮食 监视；以及提供用于评估从化妆品化合物分散和摄取的类胡萝卜素的工具。
此外，该方法和装置可用于测量皮肤和皮肤损害中的类胡萝卜素水平。 从类胡萝卜素分子非弹性散射并形成拉曼信号的光强可与从正常生物组织 散射的拉曼强度进行比较，以对情况进行评估。拉曼信号的强度也可被量 化以评估组织的抗氧化剂状态。
导出"D"
以下讨论从抛物线方程式的一般形式和点的(x,y)对开始，其中该(x，y) 的值为PMT标号和使用471.3滤光器进行读取时的输出值除以在使用473.0 滤光器时的输出值的比值。该讨论示出了可用于计算D和基线抛物线的系 数的方程式的推导。应当参照图20。P0、 Pl、 P2和P3分别为PMT0到3的比值。抛物线上的四个点是公 知的。
(x。， y。) = (0, P0) (x^"(l，P,-D) (x2, y2) = (2， P2+D) (x3, y3) = (3, P3)
使用这些值和抛物线方程的一般形式(y-a^+bx+c)，可求解D。 当x0=0且y0= Po时， Po= a(02)+b(0)+c
当x「l且y产P广D时， P广D = a(l2)+b(l)+c 当x2=2且y2= P2+D时， P2+D = a(22)+b(2)+c 当x3=3且y3= P3时， P3= a(32)+b(3)+c
在第一方程式中，P『c。通过用c替代Po、将Po移到左侧以及乘出常
数来简化以上方程式
方程式1 P0=c 方程式2 P广D-PQ=a+b 方程式3 P2+D-PQ=4a+2b 方程式4 P3-P。=9a+3b
因此，求解出c的值。在求解a和b时消去D。首先，对方程式2和3 求解D。
P广D-P0=a+b 变成D= P广P。-a-b
P2+D-P0=4a+2b 变成D= P0_P2+4a+2b
由于D-D，这两个方程式可被设置成相等并重新排列。
P「P0+b= P0—P2+4a+2b
方程式5 -2Po+ P2=5a+3b
对方程式5求解a。
方程式6 a=(—2PQ+ P一 P2-3b)/5
对方程式2和3求解a。将a代入方程式以获得b。
P3-P0=9a+3b
3b= P3_P0—9a3b= P3-Po-9((—2Po+ P!+ P2—3b)/5)
15b=5P3-5Po-9(-2Po+ P2-3b)
15b=5P3—5P0+18Po—9P广9Pz+27b
—12=13P0-9P「9P2+5P3
方程式7 b-(-13Po+9P!+9P2—5P3)/12
已获得b，则可使用方程式2的简化版来获得D。
d=P「P0+b
将来自方程式6的a值代入。
d=P「P0-((-2P0+ P!+ P2-3b)/5)-b
5d=5P「5P0+2P0+ P!+ P2—3b)-5b
5cN5P广5P。+2P。-P广P2+3b-5b
5d=—3P0+4P「P2—2b
最后，插入方程式7的b值以获得D。
5D=—3Po+4P广P2—2((—13Po+9P!+9Pr5P3)/12)
3 0D=— 18Po+24P, —6P2—(-13 P。+9P,+9P2—5P3)
3 0D=_18P0+24P 「6P2+13Po-9P 「9P2+5P3
30D=—5P0+15P广15P2+5P3
6D=-P0+3P「3P2+P3
D=(—Po+3P广3P2+P3)/6
结果D可通过使用方程式3重复该过程来核对。 D=P0—P2+4a+2b
首先代入a=(—2Po+ Pi+ P2—3b)/5，然后代入b气一13Po+9P!+9P2—5P3)/12， 将对D产生相同结果。 D=P0—P2+4a+2b
D=P『P2+4*((-2P0+ P!+ P2-3b)/5)+2b 5D=5P0—5P2+4* (-2P。十P一 P2—3b)+10b 5D=5Po—5P2—8Po+ 4P!+ 4P2—12b+10b 5D=—3P0+ 4P广P广2b
5D=—3P0+ 4P广P2-2"(-13Po+9P!+9P2-5P3)/12)5D=—3P0+ 4P广P2+(26Po—18P广18P2+10P3)/12 60D=—36Po+48P广12P2+26Po—18P广18P2+10P3 60D=—10Po+ 30Pr30P2+10P3 D+Po+SP^P, P3)/6
注意从方程3导出的D的最一个方程式与从方程式2导出的相同。 注意"a"并非计算D所必须的，并且可不求解。如果要计算基线抛 物线，则可求解"a"。可使用任何原始方程式。例如，方程式4。 方程式4 P3-PQ=9a+3b
P3—Po=9a+3*((—13Po+9P一9Pr"5P3)/12)
12P3—12P0=108a+3* (-13Po+9P,+9Pr5P3)
12P3—12P0=108a—39P。+27P!+27P2—15P3
—108a=—12P3+12Po—39Po+27Pi+27P2—15P3
108a= 12P3-12P0+3 9P0-27P「27P2+15P3
108a=27P0_27P「27P2+27P3
a=(PQ—P广P2+P3)/4
因此，可计算出a、 b、c的值，并且使用以下公式对D给出PMT比值。
a=(P0_P「P2+P3)/4
b=(—13Po+9Pi+9P2-5P3)/12
c=P0
D=(—P0+3P「3P2+ P3)/6
可通过验证四个原始方程式的每一个来进行最后核对。 方程式1 Po=c 方程式2 P广D-P。=a+b 方程式3 P2+D—PQ=4a+2b 方程式4 P3-Pe=9a+3b
方程式1 Po=c 此为真方程式2 <formula>formula see original document page 36</formula>此为真
方程式<formula>formula see original document page 36</formula>此为真
尽管已参照优选实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应当认识 到可在形式和细节上作出变化而不背离本发明的精神和范围。
权利要求
1.一种测量目标样本中选定分子的水平的方法，包括使用第一波长F1的光对所述目标进行照射；使用邻近所述第一波长F1的第二波长F2的光对所述目标进行照射；从所述目标处接收由于在所述波长F1和F2每一个的照射下引起的发射光，并对在包括与所选定分子和所述照射波长每一个相关联的特征拉曼发射波长Fc的波长范围内对所述发射光的强度进行采样；产生由所述波长F1的照射引起的发射光的第一组采样强度值，所述样本包括与所选定分子和波长F1相关联的所述特征发射波长Fc处或附近的值，至少一个样本邻近所述特征波长Fc但向下充分偏离该波长以排除由所述波长F1的照射引起的拉曼发射，以及至少一个样本邻近所述特征波长Fc但向上充分偏离该波长以排除由所述波长F1的照射引起的拉曼发射；产生由所述波长F2的照射引起的发射光的第二组采样强度值，所述样本包括与所选定分子和波长F2相关联的所述特征发射波长Fc处或附近的值，至少一个样本邻近所述特征波长Fc但向下充分偏离该波长以排除由所述波长F2的照射引起的拉曼发射，以及至少一个样本邻近所述特征波长Fc但向上充分偏离该波长以排除由所述波长F2的照射引起的拉曼发射；以及从所述第一和第二组采样强度值导出与第一和第二波长F1和F2中的每一个相关联的所述特征波长Fc之间的发射光的内插强度值，所述内插强度值消除了由于非拉曼发射而引起的强度值成分。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产生由波长Fl的照 射引起的发射光的第一组采样强度值的步骤包括，对至少四个强度传感器 产生由所述波长Fl的照射引起的样本值(SFIO， SFll， SF12, SF13}，而所述 产生由波长F2的照射引起的发射光的第二组采样强度值的步骤包括，对至 少四个强度传感器产生由所述波长F2的照射引起的至少四个样本值(SF20, SF21, SF22, SF23}，其中(SFIO, SFll, SF12, SF13〉和(SF20, SF21, SF22， SF23)的每一个是有序的值集合，并且SF11是在与所选定分子和Fl相关联 的特征发射波长Fc下的测量值，而SF22是在与所选定分子和F2相关联的特征发射波长Fc下的测量值。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括自所述至少四个强 度传感器的校准以来，针对这些传感器的的输出偏差来调节(SFIO, SF11, SF12, SF13〉和(SF20, SF21， SF22, SF23〉的每一个。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括根据从由样本发射 的光中不具有拉曼散射的光学暗材料目标导出的暗值来调节(SFIO, SFll， SF12, SF13〉和(SF20, SF21， SF22, SF23〉的每一个。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述从第一和第二组采样 强度值导出内插强度值的步骤包括计算比(SF10/SF20, SF11/SF21, SF12/SF22 SF13/SF23)，并根据所述所得计算比值来通过曲线拟合进行外推 以找到通过点(f0， SF10/SF20)和(f3, SF13/SF23)的曲线，并且所述曲线与点 {fl, SFll/SF21)和(f2, SF12/SF22)等距，其中f0、 fl、 f2和f3的每一个分别 是所述四个传感器中相对应的第一、第二、第三和第四的中心波长。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述曲线拟合使用抛物线 作为所述曲线。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括根据所述所得计算比 值，在使用锚定在(f0, SF10/SF20)和(f3, SF13/SF23)的曲线的抛物线内插中 图示地确定一值，所述值处于所述四个传感器的波长范围的中点并位于所 述点(fl, SFll/SF21)和(f2, SF12/SF22)的中间。
8. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，包括根据所述所得计算比 值图示地确定位于所述点(fl， SFll/SF21)和(f2， SF12/SF22)的中间的一值， 所述值通过使用锚定在(fO, SF10/SF20)和(f3, SF13/SF23)的非线性曲线进 行曲线拟合来测量。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述从所述目标处接收由 于在所述波长Fl和F2每一个的照射下引起的发射光、并对在包括与所选定分 子和所述照射波长每一个相关联的特征拉曼发射波长Fc的波长范围内的发射 光的强度进行采样的步骤包括，在预定部分中将所述发射光引导到至少四个强 度传感器。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述在预定部分中将所述发射光引导到至少四个强度传感器包括等量引导所述发射光。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所选定分子是类胡萝卜素。
12. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标样本是人体组织。
13. 如权利要求1所述的方法， 其特征在于，所述目标样本是人体手上的组织。
14. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用具有邻近所述第一波长F1的第二波长F2并强度与所述第一波长F1的光有预定关系的光 对所述目标进行照射的步骤包括，使用强度与所述第一波长F1的光强基本 上相等的第二波长F2的光对所述目标进行照射。
15. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，F1和F2相隔小于三纳米。
16. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，F1和F2相隔小于两纳米。
17. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采样发射强度值覆 盖小于IO纳米的波长范围。
18. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采样发射强度值覆 盖小于7纳米的波长范围。
19. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括调节所述第一波 长Fl的光和所述第二波长F2的光的强度，以在各个光提供照射时从每个 光对所述目标提供相等的强度。
20. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一和第二波长F1 和F2大致是拉曼共振波长。
21. —种用于测量目标样本中的选定分子的水平的装置，包括 第一光源，用于使用第一波长F1的光对所述目标进行照射； 第二光源，用于使用邻近所述第一波长F1的第二波长F2的光对所述目标进行照射；用于从所述目标接收由于在所述波长F1和F2每一个的照射下引起的发射 光、并对在包括与所选定分子和所述照射波长每一个相关联的特征拉曼发射波 长Fc的波长范围内的发射光的强度进行采样的装置；第一采样器，用于产生由所述波长F1的照射引起的发射光的第一组采样 强度值，所述样本包括与所选定分子和波长Fl相关联的所述特征发射波长Fc 处或附近的值，至少一个样本邻近所述特征波长Fc但向下充分偏离该波长以 排除由所述波长F1的照射引起的拉曼发射，以及至少一个样本邻近所述特征 波长Fc但向上充分偏离该波长以排除由所述波长Fl的照射引起的拉曼发射；第二采样器，用于产生由所述波长F2的照射引起的发射光的第二组采样 强度值，所述样本包括与所选定分子和波长F2相关联的所述特征发射波长Fc 处或附近的值，至少一个样本邻近所述特征波长Fc但向下充分偏离该波长以 排除由所述波长F2的照射引起的拉曼发射，以及至少一个样本邻近所述特征 波长Fc但向上充分偏离该波长以排除由所述波长F2的照射引起的拉曼发射； 以及用于从所述第一和第二组采样强度值导出与第一和第二波长Fl和F2中 的每一个相关联的所述特征波长Fc之间的发射光的内插强度值的逻辑，所 述内插强度值消除了由于非拉曼发射而产生的所述强度值成分。
22. 如权利要求21所述的装置，其特征在于，所述用于产生分别由波 长F1和波长F2的照射引起的发射光的第一和第二组采样强度值的采样器， 包括具有用以感测由所述波长Fl的照射引起的四个样本值(SFIO, SF11, SF12, SF13)的逻辑、和用以感测由所述波长F1的照射引起的四个样本值 {SF20, SF21， SF22, SF23)的至少四个强度传感器，其中(SFIO, SF11, SF12, SF13)和(SF20, SF21, SF22, SF23)的每一个是有序的值集合，并且SF11是 在与所选定分子和Fl相关联的特征发射波长Fc下的测量值，而SF22是在 与所选定分子和F2相关联的特征发射波长Fc下的测量值。
23. 如权利要求22所述的装置，其特征在于，还包括用于自所述至少 四个强度传感器的校准以来，针对这些传感器的输出偏差来调节(SFIO, SFll， SF12， SF13)和(SF20, SF21, SF22， SF23〉的每一个的装置。
24. 如权利要求22所述的装置，其特征在于，还包括根据从由样本发 射的光中不具有拉曼散射的光学暗材料目标导出的暗值来调节(SFIO， SF11 SF12, SF13)和(SF20, SF21, SF22, SF23}的每一个的装置。
25. 如权利要求21所述的装置，其特征在于，用于从第一和第二组采样强度值导出内插强度值的所述逻辑包括用于计算比值(SF10/SF20, SF11/SF21, SF12/SF22 SF13/SF23)并根据所述所得计算比值来通过曲线拟 合进行外推以找到通过点(fl), SF10/SF20)和(f3, SF13/SF23)的曲线的逻辑， 并且所述曲线与点(fl, SFll/SF21)和(f2, SF12/SF22)等距，其中f0、 fl、 f2和f3的每一个分别是所述四个传感器中相对应的第一、第二、第三和第四 个的中心波长。
26. 如权利要求25所述的装置，其特征在于，用于曲线拟合的所述逻 辑使用抛物线作为所述曲线。
27. 如权利要求25所述的装置，其特征在于，包括在基于锚定在(fO, SF10/SF20)和(f3, SF13/SF23)的曲线的抛物线内插中图示地确定一值的逻 辑，所述值处于所述四个传感器的波长范围的中点并位于所述点(fl, SFll/SF21〉和(f2, SF12/SF22)的中间。
28. 如权利要求21所述的装置，其特征在于，包括使用所述所计算比 值图示地确定位于所述点(fl, SFll/SF21)和(f2， SF12/SF22)的中间的一值 的逻辑，所述值通过使用锚定在(fO, SF10/SF20)和(f3， SF13/SF23)的非线性 曲线进行曲线拟合来测量。
29. 如权利要求21所述的装置，其特征在于，用于从所述目标接收由 于在所述波长Fl和F2每一个的照射下引起的发射光、并对在包括与所选定分 子和所述照射波长每一个相关联的特征拉曼发射波长Fc的波长范围内的发射 光的强度进行采样的所述装置包括，用于在预定部分中将所述发射光引导到至 少四个强度传感器的装置。
30. 如权利要求29所述的装置，其特征在于，用于在预定部分中将所 述发射光引导到至少四个强度传感器的所述装置包括用于等量引导所述发 射光的装置。
31. —种用于测量组织中的化学物质浓度的方法，包括 生成第一光并使用所述第一光对所述组织的一部分进行照射； 从所述组织捕捉第一反射光；将所述第一反射光引导到多个光传感器，每个光传感器测量一不同波 长的光，所述波长接近组织中所述化学物质的期望拉曼偏移波长的波长；从所述光传感器的每一个获得测量值，每个测量值针对通过所述光传感器 的所述第一反射光；生成第二光并使用所述第二光对所述组织的一部分进行照射； 从所述组织捕捉第二反射光；将所述第二反射光引导到所述多个光传感器，每个光传感器测量一不同波 长的光，所述波长接近所述组织中化学物质的期望拉曼偏移波长的波长；从所述光源的每一个获得测量值，每个测量值针对通过所述光源的所述第 二反射光；以及使用所述第一反射光的所述测量值和所述第二反射光的第二测量值来计 算所述组织中的所述化学物质的浓度。
32. 如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第一和第二光是由发 光二极管生成的。
33. 如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第一和第二光分别通 过第一和第二滤光器。
34. 如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第一滤光器仅透射471.3 纳米的光，而所述第二滤光器仅透射473纳米的光。
35. 如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述第一和第二反射光被 各自分成四等份并且其中所述等份被引导到四个光传感器。
36. 如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第一光传感器测量505.8 纳米的光、所述第二光传感器测量507.8纳米的光、所述第三光传感器测量 509.8纳米的光、而所述第四光传感器测量511.8纳米的光。
37. 如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第一和第二反射光被 引导到四个光传感器。
38. 如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述第一和第二反射光被 等分，并且每个光的等份被引导到各个光传感器。
39. 如权利要求31所述的方法，其特征在于，使用所述第一反射光的所 述测量值和所述第二反射光的所述测量值来计算所述组织中的所述化学物质 的浓度包括将来自与通过该光传感器的所述第一反射光相对的所述光传感器的每一个的测量值除以来自与通过该光传感器的所述第二反射光相对的对应光传感 器的测量值，以获得拉曼比值；以及将所述拉曼比值乘以来自所述组织的荧光的平均水平。
40. 如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述荧光的平均水平通过 在使用所述第二光照射所述组织一部分时测量的平均PMT电压来近似。
41. 如权利要求39所述的方法，其特征在于，来自所述组织的所述荧光 的所述平均强度水平比来自所述组织的拉曼偏移发射的强度大至少五十倍。
42. 如权利要求31所述的方法，其特征在于，还包括收集归一化数据并 使用所述归一化数据以及所述第一反射光的所述测量值和所述第二反射光的 所述测量值来计算所述组织中所述化学物质的浓度。
43. 如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述光传感器是光电倍增管。
全文摘要
一种用于测量组织中化学物质浓度的方法具有两个测量步骤。第一，生成第一光并使用该第一光对该组织的一部分进行照射；从该组织捕捉第一反射光；将该第一发射光引导到多个光传感器，每个光传感器测量一不同波长的光，该波长接近组织中化学物质的期望拉曼偏移波长的波长；以及从光传感器的每一个获得一测量值，每个测量值针对通过该光传感器的第一反射光。第二，生成第二光并使用该第二光对该组织的一部分进行照射；从该组织捕捉第二反射光；将该第二发射光引导到多个光传感器，每个光传感器测量一不同波长的光，该波长接近组织中化学物质的期望拉曼偏移波长的波长；以及从光传感器的每一个获得一测量值，每个测量值针对通过该光传感器的第二反射光。该第一反射光和的测量值和该第二反射光的测量值用于计算组织中化学物质的浓度。
文档编号A61B5/00GK101291616SQ200680037377
公开日2008年10月22日 申请日期2006年9月29日 优先权日2005年10月4日
发明者J·F·弗莱里克, J·皮特罗斯, S·D·伯格森, S·费古森 申请人:如新国际股份有限公司