专利名称：重组鲨肝刺激物质类似物用于治疗慢性肝脏疾病的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及鲨鱼肝脏来源的一种功能基因的重组产物(重组肝刺激物质类似物，r-sHSA)的医药用途。
背景技术：
鲨肝刺激物质类似物(Shark hepatic Stimulate Substance analogue，sHSA)是从鲨鱼再生24小时的肝脏组织中获得的一种新基因，Genbank中的登录号为AY099492。sHSA的扩增方法、基因序列及其表达产物(r-sHSA)序列已由发明人公开发表(叶波平等.鲨肝刺激物质类似物cDNA片段的克隆及序列分析[J].中国天然药物，2003，1(2)5-9)。
重组鲨肝刺激物质类似物(recombinant shark Hepatic Stimulate Substance Analogue，r-sHSA)是利用基因重组手段，在大肠杆菌中表达sHSA基因而获得的重组蛋白，分子量约为17,500Da；目前，发明人已确定了r-sHSA的发酵、纯化工艺，可获得纯度在95％以上的重组蛋白。r-sHSA高效表达载体的构建及重组蛋白的发酵和分离方法也已由发明人公开发表(王颖等.鲨肝刺激物质类似物基因在大肠杆菌中的表达.海洋科学，2004，28(6)37-41)。
发明人在前期的研究中通过CCl4所致小鼠急性肝损伤模型发现r-sHSA具有抗肝损伤功效(王颖等.r-sHSA对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用.中国药科大学学报，2005，36(4)368)。
近年来，各种慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎及脂肪肝等慢性肝病的发病率呈持续上升的趋势，肝脏疾病尤其是慢性肝病的治疗已成为世界性的医学难题。长期的研究发现在各种慢性肝病的发病过程中，肝纤维化(Hepatic Fibrosis)是其中的共同病理学基础，其持续发生将导致肝硬化甚至肝癌。现有的证据显示肝纤维化甚至许多病人的肝硬化过程是可以逆转的，这说明有效的抗纤维化治疗手段可阻断慢性肝病向肝硬化或肝癌发展的进程，大大改善多种慢性肝病的治疗效果。但是，目前市场上治疗肝纤维化的药物虽在一定程度上可以起到恢复肝功能和阻止肝硬化的作用，但是疗效并不显著，且有一定的毒副作用。因此，发现新型特效、低毒用于治疗肝纤维化和肝硬化的药物已成为国内外肝脏病治疗药物研究领域内的重点和热点。
发明内容
本发明公开了重组鲨肝刺激物类似物(以下简称r-sHSA)用于制备治疗慢性肝脏疾病药物的用途，所述肝脏疾病优选肝纤维化、慢性肝炎或肝硬化。r-sHSA也可用于保肝。
本发明的r-sHSA在治疗肝纤维化时可以将其制备成药剂学上蛋白类药物常规剂型，通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，如静脉注射、肌肉注射以及口服等，优选的给药方式是静脉注射和口服。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由医师根据实际情况(如病人的病情、体重等)而方便地确定。对于一般的成人，每日需要给药10-10000μg的量。
本发明的r-sHSA可以由构建的工程菌株诱导发酵制备，具体制备方法已有文献报道(王颖等.鲨肝刺激物质类似物基因在大肠杆菌中的表达.海洋科学，2004，28(6)37-41)，一般的方法如下1、工程菌株的诱导表达工程菌株接入LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中，37℃振荡培养过夜。以1％接种量转接至新鲜LB培养基(含硫酸卡那霉素)，37℃振荡培养至菌体密度OD600nm≈0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃，200rpm继续培养3小时后，离心收集菌体。
2、重组蛋白r-sHSA的分离纯化菌体经PBS洗涤后，以10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)重悬，0℃下间歇超声法破碎菌体，裂解产物中加入适量核酸酶(DNase和RNase)处理过夜，将上述蛋白样品按His·bind kits操作手册进行纯化。向纯化后的样品中加入凝血酶，23℃下酶切20小时后，经凝胶过滤纯化获得目的蛋白r-sHSA。
3、r-sHSA的质量控制利用Folin-酚法测定纯化后的r-sHSA蛋白浓度，并以生理盐水配制成1mg/ml的无色澄清溶液，RP-HPLC鉴定r-sHSA的纯度至95％以上，并通过肽指纹图谱(PMF)和N端序列分析的方法鉴定目标蛋白。4℃保存。
药理学试验显示，r-sHSA具有治疗肝纤维化、慢性肝炎和肝硬化功能。r-sHSA也可用于保肝。
四氯化碳(CCl4)作为一种选择性肝毒性药物，其造成肝脏损伤的机制为CCl4进入肝脏后引起肝小叶内中央肝静脉周围细胞坏死，造成肝纤维增生，影响肝脏的正常生理功能，加重肝脏负担，并最终形成以肝脏持续损伤为特征的肝纤维化。从动物存活率上看，r-sHSA可显著提高动物存活率，可能与其对抗CCl4的毒性，保护肝脏功能有关。
血清转氨酶(ALT和AST)被认为是反映肝损伤的敏感指标，并被作为肝功能的评价指标广泛应用于肝病的临床诊断过程。ALT位于肝细胞胞浆内，AST则主要分布于肝细胞线粒体内，少部分位于胞浆。肝受损较轻时，细胞膜通透性增加，胞浆内ALT和AST释放进入血液，而线粒体内的AST则不释放，当肝细胞受损严重时AST才释放进入血液，故血清转氨酶的水平可在一定程度上反映肝细胞膜的受损程度。不同剂量的r-sHSA均表现出显著降低ALT和AST活性的作用，且其效果均不差于目前市场上常用的肝病治疗药物马洛替酯，这显示出r-sHSA作为抗肝纤维化药物开发的巨大潜力。
肝纤维化的发生是一个极其复杂的、多种因素共同参与的持续肝损伤过程，其中又以胶原蛋白含量的大幅增加为重要病因和主要表现特征之一。在纤维化过程中，I、III和V型胶原构成的总胶原含量提高3～10倍，细胞外基质(ECM)密度明显提高，同时降解速度减缓，导致ECM的大量蓄积，并在受损肝组织周围形成疤痕组织，加重肝脏代谢和合成等功能的负担，使其逐渐丧失正常功能，加速纤维化的发展进程。r-sHSA可有效降低肝脏内III型胶原蛋白的含量，说明r-sHSA可直接抑制ECM的过量形成及沉积，恢复肝脏正常功能，阻断肝纤维化进程。
羟脯氨酸是合成胶原蛋白的基础物质，因而肝脏中羟脯氨酸的含量可直接反映肝脏纤维化的程度。r-sHSA可显著降低CCl4诱导所致的肝脏中羟脯氨酸的异常增高，说明r-sHSA能有效对抗肝纤维化，抑制肝纤维化的进程，该结果也与组织病理学检测结果一致。
大量研究显示，肿瘤坏死因子TNF-α、肝细胞生长因子HGF及其表达抑制因子肿瘤生长因子TGF-β1的表达量在肝纤维化的发生过程中发生了特异性变化肝纤维化的持续发生促进了TNF-α和TGF-β1的大量表达，并降低HGF的表达，妨碍正常肝细胞增殖的同时，促进炎症加剧，减少胶原的降解，加速肝纤维化的发生和发展。通过r-sHSA对肝纤维化相关细胞因子表达调控作用的研究结果可以看出r-sHSA可抑制肝纤维化过程中TGF-β1和TNF-α表达量的病态升高，并提高HGF的表达量，这说明r-sHSA可通过降低肝损伤过程中炎症相关因子表达，消除持续损伤对正常细胞所造成的影响，并促进正常肝细胞增殖而起到显著对抗肝纤维化的作用。
综上所述，r-sHSA可以抑制CCl4诱导的血清转氨酶活性和炎症反应，显著降低肝脏中羟脯氨酸和胶原蛋白水平，抑制ECM的蓄积，从而促进肝细胞的分裂增生，消除纤维化对于肝脏正常代谢能力的影响，恢复肝脏的正常功能，对肝纤维化具有良好的治疗作用，且预后效果较好。
图1是r-sHSA对CCl4致肝纤维化模型大鼠肝组织病理变化的影响(×200倍)(A正常对照组；B模型组；C8.3mg/kg马洛替酯阳性对照组；D-F分别为高、中、低(70.0μg/kg、14.0μg/kg和2.8μg/kg)r-sHSA治疗组)。
具体实施例方式
实施例1r-sHSA对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的保护作用1、受试药物药物剂量r-sHSA高剂量组为70μg/kg，配制浓度7μg/ml，i.p 0.1ml/10g；中剂量组为14μg/kg，配制浓度1.4μg/ml，i.p 0.1ml/10g；低剂量组为2.8μg/kg，配制浓度0.28μg/ml，i.p 0.1ml/10g。
实验对照空白对照用生理盐水，按与给药组等体积静脉注射。
阳性对照马洛替酯。临用时根据需要加入蒸馏水配制成0.83mg/ml浓度，混悬均匀，4℃保存备用。
2、实验动物SPF级Wistar大鼠，全雄，体重160-180g。
3、其他实验材料分析纯四氯化碳；苯巴比妥钠注射液(0.1g/支)；鲁花牌纯正花生油；氯化钠注射液；转氨酶活性、肝脏羟脯氨酸检测试剂盒；III型胶原检测试剂盒；甲醛溶液(分析纯)。
4.实验方法4.1大鼠肝纤维化模型的建立与药物处理将115只SPF级Wistar大鼠按体重随机分为六组，除正常对照组(Control)为15只外，每组20只，即模型组(Model)、阳性对照组(malotilate，p.o 8.3mg/kg)和r-sHSA高、中、低剂量组(i.p，剂量分别为70、14和2.8μg/kg)。
利用CCl4结合苯巴比妥钠喂饲诱导模型动物肝纤维化为增加肝脏对CCl4的敏感性，除正常对照组给予白开水外，使用CCl4前两周给予造模动物300mg/L的苯巴比妥钠溶液作为唯一饮水。肝脏肿大至最大重量后模型动物以50％CCl4花生油溶液灌胃，正常对照组给予1∶1花生油和水混合液，给药体积均为2mL/kg，每周2次，共灌胃9次。建立大鼠肝纤维化模型。
肝纤维化形成后，停用CCl4，药物处理组隔日给药一次，连续4周，给药体积为10ml/kg，正常对照组给予等体积生理盐水。观察动物在实验过程中的体重和活动变化。
末次给药24h后大鼠眼眶取血，血清采用改良法赖氏法测定ALT和AST活性。断头处死动物，取出肝脏，左叶以甲醛固定，进行病理学检测；剩余部分于液氮冷冻，-80℃保存，供提取RNA和生化指标检测用。
4.2组织病理学检测各组大鼠离体肝脏用10％甲醛固定，经脱水、浸蜡、包埋，制成4μm厚石蜡切片，HE染色，光镜观察肝组织的病理变化情况。
4.3肝纤维化相关生化指标检测根据试剂盒说明书，分别检测各组动物肝脏的羟脯氨酸和III型胶原蛋白含量，分析造模和药物处理对于肝纤维化相关生化指标的影响。
4.4r-sHSA对肝细胞中细胞因子表达量的影响一步法提取离体肝组织中总RNA，逆转录获得cDNA，-20℃保存。
根据肝纤维化相关细胞因子(TGF-β1、HGF、TNF-α)和内对照基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的序列设计引物，引物序列和扩增区序列片段长度见表1。
表1 细胞因子引物序列
以逆转录获得的cDNA为模板，通过定量PCR方法分别扩增不同细胞因子的基因。PCR反应结束后取20μl反应液于8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，硝酸银染色。通过Labworks软件分析系统对电泳条带进行扫描积分计算，以目的基因与内对照的比值分析细胞因子的相对表达水平。
数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，结果进行t-检验，P＜0.05为差异显著。
5、结果5.1动物存活率统计CCl4是最广泛使用的化学性肝毒物，毒性剧烈，易造成动物死亡，因此实验过程中观察了动物的体重、行为，并统计存活率(表2)。结果显示模型组动物死亡率远较其他各组高，且身体瘦弱，皮毛无光泽，倦怠，精神不振；实验过程中各组存活动物体重均持续增加，从实验结果看，各药物处理组动物存活率较模型组显著提高，接近正常对照水平。
表2 药物处理对于模型动物存活率的影响
5.2血清转氨酶活性变化利用CCl4结合苯巴比妥诱导的肝纤维化损伤动物模型评价了r-sHSA对抗肝纤维化的药效作用，结果表明高、中、低不同剂量(70μg/kg、14μg/kg和2.8μg/kg)r-sHSA均表现出显著降低化学性损伤因素所致血清转氨酶ALT和AST病态升高的活性，且呈现明显的量效关系(表3)。其中2.8μg/kg剂量组的r-sHSA肝保护作用的效果与阳性药物马洛替酯的作用相当，且高、中剂量r-sHSA降低ALT和AST的效果均优于目前市场上常用的肝病治疗药物马洛替酯，其中70μg/kg剂量的r-sHSA给药组可降低血清转氨酶的含量接近正常水平，显示出极其显著的降酶保肝和抗肝纤维化作用。
表3 r-sHSA对CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清转氨酶的影响
与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与正常组相比△△△P＜0.001。
5.3肝组织的病理变化对不同处理组的大鼠肝组织病理变化情况进行分析(见图1)。与正常对照组相比，模型组大鼠肝细胞发生较明显的脂肪变性，细胞肿胀严重，汇管区可见明显的炎细胞浸润，小叶间纤维结缔组织明显增多，肝纤维化形成。而70μg/kg的r-sHSA处理后，肝小叶结构清楚；在肝脏的汇管区仅见少量中性粒细胞浸润，病变程度远较模型组为轻。14μg/kg和2.8μg/kg的r-sHSA处理后，大鼠肝脏内炎症细胞浸润和肝细胞脂肪变性均较严重，但未见较明显的纤维结缔组织增生，肝纤维化并未形成。
5.4肝脏组织中羟脯氨酸含量(HYP)的变化利用CCl4诱导的肝纤维化损伤动物模型评价了r-sHSA对抗肝纤维化的药效作用，结果表明70μg/kg、14μg/kg和2.8μg/kg剂量组的r-sHSA均可显著逆转CCl4引起的肝脏羟脯氨酸含量的增高，三个剂量组r-sHSA的对于降低羟脯氨酸含量的药效结果呈现出一定的量效关系(表4)。
表4 r-sHSA对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织中羟脯氨酸含量的影响
与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与正常组相比△△△P＜0.001。
5.4肝脏中胶原蛋白含量的变化III型胶原的大量沉积是形成和加剧肝纤维化的重要原因及特征，利用检测试剂盒通过ELISA法观察了r-sHSA对于肝纤维化大鼠肝脏组织中III型胶原蛋白含量的影响情况，结果显示各剂量组(70μg/kg、14μg/kg和2.8μg/kg)r-sHSA均可显著降低因肝纤维化引起的胶原蛋白异常增高(表5)，三个剂量组r-sHSA的对于降低胶原蛋白含量的药效作用表现出一定的量效关系，与其他生化指标呈现出明显的对应关系。
表5 r-sHSA对肝纤维化大鼠肝组织中III型胶原蛋白含量的影响
与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与正常组相比△△P＜0.01。
5.5肝再生相关细胞因子的变化针对肝纤维化相关基因TGF-β1、HGF、TNF-α和内参照基因GAPDH分别设计了特异性引物，经PCR扩增，获得了与设计扩增片段长度相一致的产物。以各目的基因与内参照基因的比值TGF-β1/GAPDH、HGF/GAPDH、TNF-α/GAPDH为指标，分析了r-sHSA对于肝纤维化相关基因表达量的作用影响，结果见表6。
表6 r-sHSA对CCl4致肝纤维化模型大鼠肝组织中细胞因子表达的影响
与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与正常组相比△P＜0.05，△△△P＜0.001。
从结果看来，在由CCl4所诱导的肝纤维化过程中，肝脏损伤导致TGF-β1和TNF-α表达量病态升高的同时，大大降低了HGF的表达量，同时，TGF-β1具有促进HSC的增殖并合成ECM的作用，同时，还可抑制胶原酶和蛋白酶的产生，促进组织抑制因子的分泌，而加重ECM的沉积。相对于模型组，不同剂量组r-sHSA均表现出显著逆转肝纤维化诱发的细胞因子病态变化的趋势，其中70μg/kg r-sHSA给药组对于细胞因子活性的作用明显优于阳性对照组，而4μg/kg和2.8μg/kg剂量组也表现出明显的治疗效果，这种量效关系体现了r-sHSA在作用水平上与其降低转氨酶和胶原蛋白含量等效果的一致性。
权利要求
1.重组鲨肝刺激物质类似物用于制备治疗慢性肝脏疾病药物的用途。
2.权利要求1的用途，其中的慢性肝脏疾病是肝纤维化。
3.权利要求1的用途，其中的慢性肝脏疾病是慢性肝炎。
4.权利要求2的用途，其中的慢性肝脏疾病是肝硬化。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，具体涉及鲨鱼肝脏来源的一种功能基因的重组产物即重组肝刺激物质类似物(r－sHSA)的医药用途，其可以用于治疗慢性肝脏疾病，特别是肝纤维化、慢性肝炎或肝硬化等疾病。
文档编号A61K35/60GK101041066SQ20071002128
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月25日 优先权日2007年4月25日
发明者叶波平, 王颖, 张伟, 金国虔, 丁选胜, 刘煜, 张玉斌, 吴梧桐 申请人:中国药科大学