专利名称：组织工程化静脉瓣及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物组织工程技术领域，是组织工程化静脉瓣及其制备方法。
背景技术：
原发性瓣膜功能不全、血栓形成完全再通后的瓣膜破坏以及先天性瓣膜缺乏等静脉疾患，静脉瓣移植常常是最后的选择。但是，自体静脉瓣移植除来源有限、损伤较大外，尚有瓣膜强度不足和带瓣静脉的管径往往难以符合要求等问题。近年来，心血管组织工程技术的发展为构建组织工程化静脉瓣膜提供了可能。研究证明，虽然每条深静脉的瓣膜有多对，但只要移植一对有功能的瓣膜就能明显改善血液逆流的问题，这就使得构建组织工程化静脉瓣更具有实用价值。目前组织工程化静脉瓣的研究国外尚处于起步阶段，国内还无人涉及，还有诸如细胞、支架的选择、细胞种植与黏附、体内过程等许多不明确、亟待解决的问题，因此，开展组织工程化静脉瓣构建的深入研究具有重要的理论和实际意义。
理想的组织工程化静脉瓣应该具有类似天然瓣膜的三层结构，有较强的力学性能，能够承受跨壁压力和血流对瓣膜的切应力；表面应该完全内皮化，有较好的抗血栓形成、抗血小板黏附的作用；无免疫原性；具有生长和修复功能等特点。构建组织工程化静脉瓣的关键问题是瓣膜支架的制备、种子细胞的选取以及细胞能否成功种植到支架上的制备方法。
Pavcnik等采用金属架支撑的去细胞异体小肠黏膜下层(SIS)作为静脉瓣膜移植物经皮送至绵羊颈外静脉，由于没有种植细胞和进行再内皮化，移植物出现了出血、血栓、钙化等严重并发症。天然瓣膜支架去除了细胞和可溶蛋白成分，保留了胶原蛋白和弹力蛋白等重要的支架成分，从而既消除了免疫原性，又具有三维空间结构和机械性能，而且与细胞具有良好的生物相容性，利于细胞黏附、嵌入生长，增加细胞覆盖面积，可适应血管腔内高压力、高流量等复杂多变的环境，是较为理想的瓣膜组织支架。可见，未种植细胞的瓣膜支架材料体内种植不是瓣膜移植的理想选择。
静脉瓣的细胞成分除表面的内皮细胞外，间质内主要有平滑肌细胞、成纤维细胞和肌纤维母细胞等。Teebken等应用组织工程学原理，采用同种异体去细胞绵羊带瓣静脉作为支架，利用生物反应器在其上种植受体绵羊静脉壁来源的肌纤维母细胞和内皮细胞构建组织工程化静脉瓣(Teebken OE，et al.Tissue-engineered bioprosthetic venous valvea long-term study in sheep.Eur J Vasc Endovasc Surg，2003，25305-312)，但是肌纤维母细胞没能长入支架内部，移植到受体绵羊颈外静脉后，虽然短期内多数移植瓣膜有功能，但12周时半数组织工程化静脉瓣失去功能，这可能与种植细胞的活性、寿命及制备方法相关。Teebken等，将绵羊去细胞静脉瓣支架放入生物反应器中，静脉瓣支架和反应器之间形成两个空间，将肌纤维母细胞悬液加入外腔，将内皮细胞注射到内腔中；结果肌纤维母细胞没能长入静脉壁和瓣膜内。Abilez等报道研发出新型三维培养系统，并用来培养小鼠的ES，发现细胞可以长入聚合物支架内。Buttafoco等发现动态培养的平滑肌细胞也可以长入聚合物支架。但是不同细胞所需的环境和参数并不相同，目前还没有一种生物反应器能够完全模拟生理环境，也未见细胞生长入天然去细胞瓣膜支架的报道。胚胎干细胞(ES)可以避免以上问题，但免疫原性及伦理等问题限制了其大规模的应用。选择适宜的种子细胞，是构建组织工程化静脉瓣必须解决的首要问题。
成体多能祖细胞(MAPC)是近几年从成年个体多种组织中分离出来的接近胚胎干细胞的成体祖细胞(Jiang Y，et al.Multipotentprogenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow，muscle，and brain.Exp Hematol，2002，30896)，MAPC具有的高活性和多分化优势，可以向三个胚层的细胞分化，类似全能性细胞。骨髓取材方便，祖细胞含量丰富，细胞分离培养相对简单，但未见选用骨髓来源的MAPC作为静脉瓣间质细胞的种子细胞的报道。
组织工程静脉瓣的再内皮化具有抗血栓形成、防止血小板黏附、防止白细胞黏附和阻止平滑肌细胞增生功能。所以保持血管内皮细胞层完整对于维持血管通畅，防止狭窄非常重要。骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)是多能干细胞，体外培养方法简单易行，细胞活性强，可连续增殖数十代而不出现衰老现象。其活性和增殖潜能均优于血管内皮细胞(EC)(Reyes M，et al.Origin of endothelial progenitors in humanpostnatal bone marraw.J Clin Invest.2002，109337)。到目前为止未见联合应用骨髓来源的MAPC和EPC作为组织工程瓣膜种子细胞的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种材料来源广泛、活性强、无免疫原性、不涉及伦理学问题，尤其适用于修复下肢深静脉瓣膜功能不全的组织工程化静脉瓣移植体。
本发明提供一种组织工程化静脉瓣移植体，由种子细胞和支架构成，所述的种子细胞是成体多能祖细胞(MAPC)和内皮祖细胞(EPC)，所述的支架是同种异体去细胞带瓣静脉。
上述成体多能祖细胞(MAPC)和内皮祖细胞(EPC)来源于自身骨髓成体。
上述种子细胞中成体多能祖细胞(MAPC)和内皮祖细胞(EPC)种植密度为≥106/ml。
本发明的另一目的是提供上述组织工程化静脉瓣移植体的制备方法。
该制备方法包括多能祖细胞(MAPC)和内皮祖细胞(EPC)的分离、培养、纯化、扩增和鉴定；MAPC向平滑肌细胞的诱导分化及鉴定；EPC向血管内皮细胞(EC)的诱导分化和鉴定；异体去细胞静脉瓣支架的制备及修饰；组织工程化静脉瓣的体外构建。
具体方法如下1.骨髓成体多能祖细胞(MAPC)和内皮祖细胞(EPC)的分离、培养、纯化、扩增和鉴定全骨髓培养法培养成年骨髓中MAPC和EPC。取成年个体骨髓10ml，注入条件培养基，弃去不贴壁细胞，传代培养获得MAPC(JiangY，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adultmarrow.Nature，2002，41841)和EPC(Kaushal S，et al.Functional smalldiameter neovessels created using endothelial progenitor cells expandedex vivo.Nature Medicine.2001，71035)，以尽可能高的密度(≥107/ml)接种到预铺纤维连接蛋白的培养皿上或培养瓶中。
2.MAPC向平滑肌细胞、EPC向血管内皮细胞(EC)的诱导分化和鉴定以含10％胎牛血清的DMEM培养液添加IGF、bFGF诱导MAPC，使之分化为平滑肌细胞(Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999，284143)。以I型胶原包被的培养皿，利用含15％胎牛血清的M199诱导EPC，使之分化为内皮细胞(Hur J，et al.Characterization oftwo types of endothelial progenitor cells and their different contributions toneovasculogenesis.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2004，24288)。
3.异体去细胞静脉瓣支架的制备及修饰选取异体成年双侧下肢相应静脉分割成数段，每段长2-4cm，保证每段均带有静脉瓣；采用超纯水浸泡、Triton-X-100、氨水处理、核糖核酸酶消化等步骤得到脱细胞静脉瓣支架(Seung-Woo Cho，et al.Small-Diameter Blood Vessels Engineered With Bone Marrow-DerivedCells.Ann Surg 2005，241506)。
4.组织工程化静脉瓣的体外构建将MAPC和EPC以高浓度(≥106/ml)按先支架壁内种植MAPC后支架内表面种植EPC的顺序将两种细胞与脱细胞静脉瓣支架复合，然后将复合了种子细胞的支架置于血管自动旋转脉动培养系统内进行体外构建4-6周，即成组织工程化静脉瓣。
发明效果体外构建静脉瓣经扫描电镜、免疫细胞化学及力学检测发现MAPC能够均匀生长入静脉壁及瓣膜内部，生长状况良好；EPC能够完成再内皮化；内膜部位VIII因子相关抗原、VCAM-1染色阳性；中膜α-actin、Desmin染色阳性；最大断裂强度、应变率、拉伸弹性回复率与正常静脉相似。术后经彩色超声和免疫组织化学检测，发现实验侧血流通畅，静脉管壁光滑；瓣膜和静脉壁结构与正常相似，静脉瓣完整，未见血栓；内膜VIII因子相关抗原、VCAM-1染色阳性；中膜α-actin、Desmin染色阳性，与正常静脉瓣相似。说明移植瓣膜具有功能、效果良好。
具体实施例方式
现结合实施例，对本发明作进一步描述。
实施例1体外构建犬组织工程化静脉瓣实验动物、材料与试剂杂交犬(雌性，6个月龄，体质量15kg)，购自上海海军医学研究所，动物使用许可证号SRXK(军)2002-044。
M199、DMEM-LG、CD13、bFGF(以上试剂均购自Gibco公司)MCDB-201、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸、ITS、FN、IGF-1、VEGF、FITC-二抗、Cy3-二抗(以上试剂均购自Sigma公司)EGM-MV2(购自PromoCell公司)胎牛血清(FCS)(购自Hyclone公司)rhEGF、rhPDGF-BB(购自R&D System公司)rhLIF(购自Prospec公司)CD44、CD45、CD133、MHC-II、VEGF、VE-cadherin、α-actin、Calponin、SM-MHC(以上抗体均购自Santa Cruz公司)CD14、CD31、KDR、VIII因子单克隆抗体、Desmin、VCAM-1(以上抗体均购自博士德公司)细胞/组织总RNA抽提试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)逆转录酶M-MLV(购自Promega公司)TaqDNA聚合酶(购自TaKaRa公司)引物序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成一、制备MAPC和EPC1.MAPC和EPC的体外分离、培养、扩增、鉴定1)MAPC体外分离、培养、扩增、鉴定雌性成年犬1只，髂后上棘处抽取骨髓10ml，直接添加扩增培养基60％DMEM-LG、40％MCDB-201、Penicillin(10000U/100ml)+Streptomycin(1000U/100ml)、FN(10ng/ml)、EGF(10ng/ml)、1×ITS(1ml)、Dexamethasone(10-9M/L)、Ascorbic acid2-phosphate(10-4M/L)、PDGF-BB(10ng/ml)、LIF(1000U/100ml)和2％胎牛血清组成扩增培养基，然后接种于培养瓶中培养扩增，共接种3瓶。取第3、5、10代细胞倒置相差显微镜观察细胞较大，形态为长多角形，集落样生长；免疫荧光染色CD34-、CD44-、CD45-、CD133-、CD13+、SSEA-1+；流式细胞技术检测阳性细胞百分率为CD13+细胞占7.03％，SSEA-1+细胞占8.27％。
2)EPC体外分离、培养、扩增、鉴定雌性成年犬1只，髂后上棘处抽取骨髓10ml，接种到预铺纤维连接蛋白的培养瓶中，共接种3瓶，利用添加了LIF(1000U/100ml)的条件培养基EGM-MV2培养扩增。取培养至第3、5、10、15、20代细胞倒置相差显微镜观察刚贴壁时形态为类圆形，传代后细胞形态为短梭形，呈串珠样排列；免疫荧光染色CD14+、CD133+、CD34-、KDR+、VE-cadherin+；流式细胞技术检测阳性细胞百分率为CD14+细胞占31.47％、CD133+细胞占13.95％、KDR+细胞占1.34％。
2.MAPC和EPC的诱导分化和鉴定1)MAPC诱导分化为平滑肌样细胞及鉴定将第3、5、10代MAPC分别添加添加含IGF(10ng/ml)、bFGF(10ng/ml)和10％胎牛血清的DMEM培养基诱导培养。取诱导培养后第3代分化细胞进行免疫荧光染色，发现分化细胞均表达Calponin、SM-MHC和α-actin，说明已经分化为平滑肌样细胞。
2)EPC诱导分化为内皮细胞及鉴定将第3、5、10、15代EPC分别添加含15％胎牛血清的M199培养基诱导培养，接种到预铺I型胶原的培养皿上。取诱导培养后第3代分化细胞免疫荧光染色，发现分化细胞均表达CD31、VIII因子相关抗原，说明已经分化为内皮细胞。
二、脱细胞静脉瓣支架的制备选取成年犬1只，处死，取出双侧后肢股静脉分割成4段(每段长约3cm)，保证每段均带有静脉瓣。采用超纯水浸泡(2小时)，0.5％Triton-X-100+0.05％NH4OH处理(4℃ 3d持续振摇)，超纯水漂洗24h，DNase+RNase消化(37℃ 12小时)，PBS反复清洗。解剖显微镜下拍照，石蜡切片、HE染色结合扫描电镜和透射电镜检测发现完全移除瓣膜和静脉壁中的细胞，胶原纤维和弹性纤维保持完整。将制备好的支架-80℃保存。用前CO60辐照消毒，辐照剂量15K。
三、体外构建组织工程化静脉瓣1将静脉瓣支架浸入胎牛血清中12小时。取出支架，放入无菌培养皿中，接扎支架一端，将106/ml MAPC细胞悬液加压灌注到管腔中，然后接扎另一端，使瓣叶悬浮在静脉腔内，然后浸泡到MAPC悬液中，37℃、5％CO2、饱和湿度孵育4小时，再固定于血管自动旋转、脉动培养系统中，4rph旋转培养，1天后开放两结扎端，继续培养2周。2周后，将106/ml EPC细胞悬液灌入静脉瓣支架腔内，结扎两端，继续4rph旋转培养1天。然后开放两接扎端，用15％胎牛血清的M199培养基孵育，继续连接血管自动旋转、脉动培养系统，调节压力为3dyn/cm2，使细胞形态更接近正常静脉壁细胞形态。
2组织工程化静脉瓣的评价1)共培养2周后，取出细胞/支架复合物，扫描电镜观察发现MAPC能够均匀生长入静脉壁及瓣膜内部，生长状况良好，细胞轮廓清晰，细胞间借伪足相连；EPC在支架表面长成完整的一层，瓣膜壁腔两面均附有一层细胞，即再内皮化完全，EPC呈多边形伸展状态分布，并有增殖。
2)透射电镜检测发现细胞超微结构与正常细胞类似，可以观察到细胞间连接。
3)力学检测将待测试的标本置于含15％胎牛血清的M199中，37℃保温；测试时将标本两断端固定在特定的材料固定夹上，启动INSTRON力学测试仪，拉伸速度设定为50mm/min，走纸速度设定为100mm/min，测定最大断裂强度为17.37N，应变率为55.72％，拉伸弹性回复率平均为60.19％。
4)检测细胞功能测定NO分泌量为76.245μmol/L，内皮素分泌量、前列腺素分泌量为146.33pg/ml。
5)免疫组织化学染色见组织工程化静脉瓣内膜部位VIII因子相关抗原、VCAM-1染色阳性，且阳性细胞在静脉壁和瓣膜两侧形成完整的一层；中膜α-actin、Desmin染色阳性，且阳性细胞均匀分布于中膜内。
实施例2制备的犬组织工程化静脉瓣体内移植实验将制备的组织工程化静脉瓣以端端吻合术移植到受体犬左颈外静脉，右侧颈外静脉移植一段静脉瓣支架作为对照。
一、术后4周行颈外动脉彩色超声检查，发现实验侧血流通畅，对照侧管腔变窄，血流较左侧细且慢。
二、处死受体犬，取出移植物，大体观察实验侧静脉瓣完整，静脉管壁光滑，未见血栓；对照侧静脉壁明显增厚，管腔变窄，静脉壁上数个附壁血栓，静脉瓣挛缩，瓣膜边缘可见小血栓。
三、制作石蜡切片，HE染色，发现实验侧瓣膜和静脉壁结构与正常相似，无明显内膜、中膜增生；对照侧见明显的内膜、中膜增厚，内膜和中膜之间见新血管形成，静脉瓣结构遭到破坏。
四、免疫组化染色见实验侧VIII因子相关抗原、VCAM-1染色阳性，且阳性部位限于内膜内层；α-actin、Desmin染色阳性，阳性部位为中膜，与正常静脉瓣相似；对照侧内膜VIII因子相关抗原、VCAM-1染色阴性，中膜α-actin、Desmin染色阴性。
权利要求
1.一种组织工程化静脉瓣移植体，由种子细胞和支架构成，其特征在于所述的种子细胞是成体多能祖细胞MAPC和内皮祖细胞EPC，所述的支架是同种异体去细胞带瓣静脉。
2.根据权利要求1所述的一种组织工程化静脉瓣移植体，其特征在于其中的成体多能祖细胞MAPC和内皮祖细胞EPC来源于自身骨髓成体。
3.权利要求1所述的一种组织工程化静脉瓣移植体，其特征在于其中的所述种子细胞中成体多能祖细胞MAPC和内皮祖细胞EPC种植密度为≥106/ml。
4.权利要求1所述的组织工程化静脉瓣移植体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤多能祖细胞MAPC和内皮祖细胞EPC的分离、培养、纯化、扩增和鉴定；MAPC向平滑肌细胞的诱导分化及鉴定；EPC向血管内皮细胞EC的诱导分化和鉴定；异体去细胞静脉瓣支架的制备及修饰；组织工程化静脉瓣的体外构建。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于具体步骤如下I.骨髓成体多能祖细胞MAPC和内皮祖细胞EPC的分离、培养、纯化、扩增和鉴定全骨髓培养法培养成年骨髓中MAPC和EPC，取成年个体骨髓10ml，注入条件培养基，弃去不贴壁细胞，传代培养获得MAPC，以≥107/ml的密度接种到预铺纤维连接蛋白的培养皿上或培养瓶中；II.MAPC向平滑肌细胞、EPC向血管内皮细胞EC的诱导分化和鉴定以含10％胎牛血清的DMEM培养液添加IGF、bFGF诱导MAPC，使之分化为平滑肌细胞，以I型胶原包被的培养皿，利用含15％胎牛血清的M199诱导EPC，使之分化为内皮细胞；III.异体去细胞静脉瓣支架的制备及修饰选取异体成年双侧下肢相应静脉分割成数段，每段长2-4cm，保证每段均带有静脉瓣，采用超纯水浸泡、Triton-X-100、氨水处理、核糖核酸酶消化步骤得到脱细胞静脉瓣支架；IV.组织工程化静脉瓣的体外构建将MAPC和EPC以≥106/ml的浓度按先支架壁内种植MAPC后支架内表面种植EPC的顺序将两种细胞与脱细胞静脉瓣支架复合，将复合了种子细胞的支架置于血管自动旋转脉动培养系统内进行体外构建4-6周，即成组织工程化静脉瓣。
全文摘要
本发明涉及生物组织工程技术领域。目前组织工程化静脉瓣的研究国外尚处于起步阶段，诸如细胞、支架的选择、细胞种植与黏附、体内过程等许多问题不明确、亟待解决。本发明的目的是提供组织工程化静脉瓣移植体，本发明的组织工程化静脉瓣移植体是由种子细胞和支架构成，所述的种子细胞是成体多能祖细胞(MAPC)和内皮祖细胞(EPC)，所述的支架是同种异体去细胞带瓣静脉。本发明还提供了上述组织工程化静脉瓣的制备方法。本发明为临床提供一种材料来源广泛、无免疫原性、不涉及伦理学问题，尤其适用于修复下肢深静脉瓣膜功能不全的的组织工程化静脉瓣。本发明经动物实验证明功能、效果良好。
文档编号A61F2/24GK101073678SQ20071004265
公开日2007年11月21日 申请日期2007年6月26日 优先权日2007年6月26日
发明者温昱, 张传森, 党瑞山, 李彬 申请人:中国人民解放军第二军医大学