一种由包裹造影剂的脂质体及核酸组成的靶向制剂的制作方法

专利名称：：一种由包裹造影剂的脂质体及核酸组成的靶向制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及一种可用于诊断或治疗的由包裹造影剂的脂质体及核酸组成的靶向制剂及其制备方法。
背景技术：
：随着现代分子生物学的发展，人类获得了前所未有的治疗疾病的手段即基因治疗，其基本思路是将正常的遗传物质导入病人的体细胞并使之表达，产生有治疗作用的蛋白质，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗的一个关键步骤即基因传递系统的建立，目的基因要借助载体——基因传递系统来达到转染靶细胞的目的。目前在基因治疗中应用较多的是脂质体介导的基因转移，其中阳性脂质体(又称阳离子脂质体)具有毒性低、免疫原性以及潜在的致癌性都较低、转移的核苷酸大小范围广(从寡核苷酸到人工染色体均可)且质量控制较方便、制剂方法较简单、剂量可控等优势。(KostarelosK,MillerAD.Synthetic,self-assemblyABCDnanoparticles;astructuralparadigmforviablesyntheticnon-viralvectors[J].ChemSocRev.2005,34(ll):970-994.)阳性脂质体的基本组成是中性脂质成分和阳性脂质成分，其中中性脂质成分起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用，同时提供阳性脂质的细胞渗透功能。阳性脂质成分，又称细胞转染素(Cytofectin)，是具有不同化学结构的两性分子，一般由带正电的亲水基团通过中间连接基团与疏水基团连接而成。阳性脂质成分为整个脂质体提供正电荷，而且具有在体外稳定性好，在体内可生物降解的特点。除了以上的基本组成，还可利用不同性能的材料，如多糖、亲水性阳离子聚合物、寡肽、糖蛋白和表面活性剂等对脂质体进行表面修饰，可调控其在生物体内的过程从而提高其转染效率。目前阳性脂质体的制备方法通常是先将细胞转染素和中性脂质溶解混合，经旋转蒸发后加入水或含水的混合溶液，再用漩涡和/或超声振荡的方式来制成脂质体混悬液。(雷撼，阳离子脂质体的研究进展[J].第三军医大学学报2005,27(24):2475-2477.)靶向治疗也称靶向给药系统(targetingdrugsystem，TDS)，是指利用具有一定特异性的载体，将药物或其他活性物质选择性地运送到靶部位，把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的耙细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。磁性脂质体便是其中的一种形式磁性脂质体是在脂质体中掺入铁磁性物质制成，故当其进入体内后，利用体外磁场的效应可以引导药物在体内定向移动和定位集中的靶向给药，使其耙向性和专一性更强，诊断治疗更加准确，快速，从而达到高效，速效，低毒的效果。磁性脂质体中，脂质体具有被动靶向性，即其很容易被网状内皮系统(RES)摄取，通过正常生理过程运送至肝、脾、肺等器官，但到达其它的靶部位比较困难。基于这一特点，诊断学上，现已有将造影剂包入脂质体来增强造影剂的组织或器官特异性方面的专利申请(发明名称为"脂质体"，申请号为95193097.4)。在包入脂质体的造影剂中，超微超顺磁性氧化铁是一种具有磁场响应性能的磁共振耙向造影剂，将其包入脂质体中制得的磁性脂质体不仅具有靶向治疗的作用，还具有造影的诊断学作用。磁性靶向脂质体通常由铁磁性物质，抗癌药物及脂质体等组成，其制备方法主要有逆相蒸发法、冻融法及机械分散法等(李铁福，邓英杰，王雨青.磁性脂质体的研究进展[J].药学进展,2002,26(1):5-10.)。目前尚未见既用于诊断又用于基因治疗的由包裹造影剂的脂质体及核酸组成的靶向制剂。
发明内容本发明的目的在于提供一种由包裹造影剂的脂质体及核酸组成的靶向制剂，该靶向制剂不仅可用于诊断还可用于基因治疗。本发明以上述
背景技术：
为基础，制备得到包裹有造影剂且带正电的脂质体，并通过静电作用使其与带有目的基因的核酸形成复合物从而得到具有诊断及治疗作用的靶向制剂。本发明提供一种由包裹造影剂的脂质体及核酸组成的靶向制剂，其中包裹造影剂的脂质体由中性磷脂、阳性脂质、胆固醇、a-生育酚和造影剂组成，且中性磷脂、阳性脂质、胆固醇、a-生育酚、造影剂的重量比为l一75:l—75:0—15:0—5:2—30份，脂质体的平均粒径是50—300nm，靶向制剂平均粒径是50—500nm。上述中性磷脂、阳性脂质、胆固醇、ot-生育酚、造影剂的重量比优选为15—50:15—50:0—10:1—4:10—25份。上述中性磷脂、阳性脂质、胆固醇、a-生育酚、造影剂的重量比最优选为30:30:1:1:15份。上述靶向制剂中包裹造影剂的脂质体所含的中性磷脂选自合成或半合成的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，或两者的组合。上述靶向制剂中合成或半合成的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺选自以下材料中的一种或两种以上的组合二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇一二棕榈酰磷脂酰胆碱。上述靶向制剂中包裹造影剂的脂质体所含的中性磷脂优选为二油酰磷脂酰乙醇胺。上述耙向制剂中包裹造影剂的脂质体所含的阳性脂质选自以下材料中的一种或两种以上的组合硬脂胺)、N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N—三甲基氯化铵、3p-[(N，,N，二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、2，3二油酰氧-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基-N，N-二甲基-l-丙基三氟乙酸铵、1,2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、十六烷基三甲基溴化胺、二甲基双十八烷基溴化胺。上述靶向制剂中包裹造影剂的脂质体所含的附性脂质优选为3卩-[(N，,N二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇。本发明的靶向制剂中的造影剂是一种磁共振成像造影剂，优选是含有三价铁或二价铁的铁磁性物质，最优选是三氧化二铁。本发明的耙向制剂中的核酸是质粒DNA、寡核苷酸、双链核酸化合物中的一种或其组合，最优选是质粒DNA。上述的质粒DNA为APO-AI基因的重组表达载体、SR-BI基因的重组表达载体，或两者的组合。本发明的另一目的是提供上述靶向制剂的制备方法。本发明以介导基因转染的阳性脂质体的基本组成以及磁性靶向脂质体的制备方法为理论基础，通过大量实验，提供一种制备上述靶向制剂的方法将中性磷脂、阳性脂质、胆固醇与a-生育酚按重量比，溶于有机溶剂中并与造影剂溶液形成W/O乳剂，然后在旋转蒸发器上蒸去有机溶剂，至凝胶形成，再加入分散介质常温下旋转至悬液形成后进行均质得到包裹造影剂的脂质体；将制得的包裹造影剂的脂质体混悬液与核酸溶液室温下培育15min—24hr即得。整个操作过程为无菌操作。所述的均质方法为过高压均质机、水浴超声或者过聚碳酸酯膜。所述的有机溶剂是氯仿、乙醚、甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、四氯化碳、二甲基亚砜或四氢呋喃中的一种或其组合。所述的分散介质为注射用水、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、0.9。/。NaCl溶液或5y。葡萄糖溶液。使用Zetasizer纳米粒径及zeta电位分析仪(NANO-S，英国马尔文仪器公司)测定本发明制得的靶向制剂平均粒径分布在50—500nm，并呈正态分布(见图1);〖-电位值在+30111￥以上(见图2);高分辨透射电镜(JEM-2010，日本电子株式会社)下观察，可见该靶向制剂的外观为圆形或似球形囊泡结构，造影剂及质粒DNA均包裹其中，且分散均匀，直径分布在50—200nm;同时还在高分辨透射电镜下对单个制备得到的靶向制剂用能谱分析仪(INCAOXFORD，英国OXFORD公司)进行分析，结果显示制备得到的靶向性制剂体内均含有硅和锰、锌、铁等成份，表明三氧化二铁磁性物质己被成功包入该靶向性制剂中(见图3)。由此可见，本发明制得的靶向制剂结构稳定、无毒、降解安全，完全符合靶向载体的要求。本发明通过将磁性物质包入脂质体中提高了脂质体作为基因载体的靶向性，同时还因包裹有造影剂具备诊断学功能。该制剂在体内的过程可以通过磁共振成像监测到，并且因脂质体的被动靶向性，某些病理学特征也可通过磁共振成像监测到。例如动脉粥样硬化的病理学特征之一即为不稳定斑块中含有大量的巨噬细胞，因此可利用该靶向制剂的被动靶向性实现对不稳定斑块的监测及随访。图1本发明制备的靶向制剂的粒径分布2本发明制备的靶向制剂的zeta电位分布3透射电镜下单个本发明制备的靶向制剂内的能谱分析4A-5B动物实验中对照组及基因治疗组血管的病理切片5C-5D动物实验中基因治疗后肝组织的病理切片6A-6B动物实验中基因治疗后心、肺、脾、肾组织的病理切片图具体实施方式现结合附图和实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。「制备磁性靶向脂质体1.1精确称取二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，Fluka公司)20mg，33-[N-(N，，N，-二甲氨基乙基)]氨甲酰基-胆固醇(DC-Chol，Sigma公司)20mg，胆固醇(Chol，日本和光纯药工业株式会社)5mg以及a-生育酚(上海第二制药厂)lmg于250ml圆底烧瓶中，加氯仿8ml使其完全溶解。1.2将三氧化二铁酒石酸溶液加注射用水稀释至5mg/ml细胞粉碎机(JY92-IIN，宁波新芝生物科技股份有限公司)中超声(400w，每次5s，工作40次)，使其分散均匀，取1.5ml加入上述圆底烧瓶中，水浴超声波清洗机(SK5200LH，上海科导超声仪器有限公司)中超声(500w)30min使其形成稳定的W/0乳剂。1.3置旋转蒸发器(N-1001D-WA，日本东京理化)上在室温下，30rpm，0.09Mpa旋转蒸发除去有机溶剂，至凝胶形成。1.4加入Tris-HCl(美国Amresco公司)缓冲液10ml旋涡震荡使凝胶脱落，置旋蒸仪上继续旋蒸2hr至脂质体混悬液形成。1.5置水浴超声波清洗机中超声(500w)2hr，制得包裹有造影剂(三氧化二铁酒石酸溶液)的阳性脂质体混悬液，使用Zetasizer纳米粒径及zeta电位分析仪(NANO-S，英国马尔文仪器公司)测定脂质体粒径分布为50—250nm。2.构建表达质粒DNA2.1用TRIzol试剂(100mg/ml)从100mg大鼠肝组织中提取总RNA。并在低温条件下(4°C)匀浆组织；将匀浆放置于153(TC水浴中5min，加入0.2ml氯仿并振荡15s，放置于1530。C水浴中23min，随后在低温条件下(4°C)12000g/min离心15min;吸出上层水相，加入0.5ml异丙醇，置于1530。C水浴中10min，于低温条件下(4。C)12000g/min离心10min;吸弃上清，加lml75X乙醇，短暂涡漩后于4°C7500g/min离心5min，取出并于室温干燥10min;加入20)ilDEPC水溶解RNA于管底，一8(TC保存；2.2根据TAKARAOne-stepRT-PCR方法，用APO-AI引物P1、P2(P1:5，一AGGTACCGCCGCCACCATGAAAGCTGCAGTGTTG"3，，引入KpnI酶切点；P2:5，一TCTCGAGTCAAGCGTTCAGCTTCTTTTT一3,引入XhoI酶切点；上海生工生物技术服务有限公司合成)扩增出APO-AI的基因(李兰松，李维琪，信学雷等.大鼠SR-BI胞外域与ApoA-I蛋白相互作用的确认[J].微生物学通报，2006，33(2):68—73.)。RT-PCR条件为:50°C30min、94°C4min预变性后，94°C40s、55°C40s、72°C1min进行40个循环，72。C7min后停止反应。将PCR产物与pGEM-T载体(购自Promega公司)连接转化到大肠杆菌TG1(购自Invitrogen公司)中，酶切鉴定，筛选阳性克隆pGEM-T/APO-AI,由上海博亚公司测序鉴定。2.3双酶切pGEM-T/APO-AI,pcDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司)，胶回收pcDNA3.1(+)大片段和APO-AI目的基因片段，16'C连接过夜，转化JM110，挑取生长良好的菌落，小量抽提重组质粒pcDNA3.1(+)/APO-AI。双酶切重组质粒pcDNA3.1(+)/APO-AI，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。目的蛋白基因表达载体在大肠杆菌中繁殖扩增后，抽取重组质粒DNA。3.磁性脂质体与质粒的复合将上述制得的包裹有造影剂的脂质体混悬液与质粒溶液(重组表达载体pcDNA3.1(+)/APO-AI)等体积混合室温下培育30min得到靶向制剂，粒径分布为80—500nm。整个操作过程为无菌操作。实施例21.5将制得的脂质体混悬液过高压均质机(Em-C3，加拿大Avestin公司)(15000psi，3个循环)进行均质，制得的包裹造影剂的阳性脂质体粒径分布为100—200nm。其余步骤同实施例l。实施例31.1精确称取二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DOPC，日本油脂株式会社)20mg，3P-[N-(N，，N，-二甲氨基乙基)]氨甲酰基-胆固醇(DC-Chol)30mg于250ml圆底烧瓶中加氯仿/乙醚(4，V/V)8ml使其完全溶解。1.2将三氧化二铁酒石酸溶液加注射用水稀释至3mg/ml细胞粉碎机中超声(400w，每次5s，工作40次)，使其分散均匀，取1.5ml加入上述圆底烧瓶中，水浴超声30min使其形成稳定的W/O乳剂。1,4加入磷酸盐缓冲液(pH7.4)10ml旋涡震荡使凝胶脱落，置旋蒸仪上继续旋蒸2hr至脂质体混悬液形成。其余步骤同实施例1。实施例41.1精确称取二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，日本油脂株式会社)30mg，1，2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵(DOTAP，Sigma公司)50mg于250ml圆底烧瓶中加氯仿/乙醚(4，V/V)8ml使其完全溶解。1.2将三氧化二铁酒石酸溶液加注射用水稀释至12mg/ml细胞粉碎机中超声(400w，每次6s，工作50次)，使其分散均匀，取1.5ml加入上述圆底烧瓶中，水浴超声30min使其形成稳定的W/O乳剂。1.4加入5。/。葡萄糖溶液10ml旋涡震荡使凝胶脱落，置旋蒸仪上继续旋蒸2hr至脂质体混悬液形成。其余步骤同实施例l。实施例51.5将制得的脂质体混悬液分别过450nm以及220nm的碳酸酯膜，制得的包裹造影剂的阳性脂质体粒径分布为100_200nm。其余步骤同实施例4。实施例61.1精确称取聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，日本油脂株式会社)40mg，2,3二油酰氧-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基-N,N-二甲基-l-丙基三氟乙酸铵(DOSPA，Sigma公司)60mg于250ml圆底烧瓶中加氯仿/乙醚(4，V/V)8ml使其完全溶解。1.4加入0.9%NaCl溶液10ml旋涡震荡使凝胶脱落，置旋蒸仪上继续旋蒸2hr至脂质体混悬液形成。其余步骤同实施例1。实施例71.1精确称取聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆碱(PEG-DPPC，日本油脂株式会社)50mg，十四烷基三甲基溴化胺(DTAB，Sigma公司)60mg于250ml圆底烧瓶中加氯仿/甲醇(4，V/V)8ml使其完全溶解1.2将三氧化二铁酒石酸溶液加注射用水稀释至4mg/ml细胞粉碎机中超声(400w，每次5s，工作40次)，使其分散均匀，取1.5ml加入上述圆底烧瓶中，水浴超声30min使其形成稳定的W/0乳剂其余步骤同实施例1。实施例82.2根据TAKARAOne-stepRT-PCR方法，用SR-BI的引物P1、P2、P3、P4(P1:5，一AGGTACCGCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAG—3,KpnI酶切点；P2:5，_TGCCCTGGAGCTGACGCCTCCTCTGGATATTATGAC-3，；P3:5'—GTCATAATATCCAGAGGAGGCGTCAGCTCCAGGGCA—3，；P4:5，—TTCTAGATCACAGCTTGGCTTCTTGCAG~3'，弓l入Xbal酶切位点)扩增出SR-BI的基因(李兰松，李维琪，、信学雷等.大鼠SR-BI胞外域与ApoA-I蛋白相互作用的确认[J].微生物学通报，2006，33(2):68—73.)。用SR-BI的引物1和2从含信号肽的质粒扩增获得信号肽。然后将信号肽基因和SR-BI基因进行Over-LapPCR获得含信号肽的SR-BI重组基因。RT-PCR条件为50°C30min、94°C4min预变性后，94°C40s、55°C40s、72°C1min进行40个循环，72°C7min后停止反应。将PCR产物与pGEM-T载体连接转化到大肠杆菌TG1中，酶切鉴定，筛选阳性克隆pGEM-T/SR-BI，由上海博亚公司测序鉴定。2.3双酶切pGEM-T/SR-BI，pcDNA3.1(+)，胶回收pcDNA3.1(+)大片段和SR-BI目的基因片段，16。C连接过夜，转化JM110，挑取生长良好的菌落，小量抽提重组质粒pcDNA3.1(+)/SR-BI。双酶切重组质粒pcDNA3.1(+)/SR-BI，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。目的蛋白基因表达载体在大肠杆菌中繁殖扩增后，抽取重组质粒DNA。3.磁性脂质体与质粒的复合将上述制得的包裹有造影剂的脂质体与质粒溶液(重组表达载体pcDNA3.1(+)/SR-BI)等体积混合室温下培育30min得到靶向性制剂，粒径分布为80—500nm。整个操作过程为无菌操作。其余步骤同实施例1。实施例92.2、2.3、3同实施例8，其余步骤同实施例3。实施例103.磁性脂质体与质粒的复合将上述制得的包裹有造影剂的阳性脂质体与质粒溶液(重组表达载体pcDNA3.1(+)/AP0-AI和重组表达载体pcDNA3.1(+)/SR-BI的等质量混合溶液)等体积混合室温下培育30min得到靶向制剂，粒径分布为160—450nm。整个操作过程为无菌操作。其余步骤同实施例1。实验例11本发明建立了大鼠的动脉粥样硬化的模型，并制备得到由包含Apo-A-I基因或SR-BI基因的耙向制剂，用该制剂对大鼠进行基因治疗并检测其疗效。一.动物模型建立1.动物雄性Wistar大鼠42只，体重(210士10)g2.方法雄性Wistar大鼠喂食高脂饲料，即3°/。胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、8%猪油、83.3%基础饲料。每日每只喂养饲料120g，均自由摄水。饲养于第二军医大学清洁级动物房。二.对动物进行基因治疗1.动物分组按照完全随机的方法进行分组。共分四组，第一组(实施例1制得制剂》A组,12只，给予含Apo-A-I基因的靶向制剂；第二组(实施例8制得制剂)B组,12只，给予含SR-BI基因的靶向制剂；第三组(实施例IO制得制剂)C组,12只，给予含上述两种基因的靶向制剂；第四组D组,6只，做为空白对照，给予生理盐水。2.基因治疗各基因治疗组每只动物经尾静脉注入0.32ml包含基因的靶向制剂(相当于40Mg基因)，对照组每只动物亦经尾静脉注入0.32ml生理盐水。治疗后立刻在每只大鼠左肾上方绑缚铷铁硼稀土磁铁，并将动物固定在自制的木板上，4小时后取下。3.实验动物基因治疗后血生化指标的测定基因治疗后，基因治疗组及对照组动物分别在第3、6周清晨空腹，经眼眶静脉采血约2.0ml，6000rpm离心5min，取上层血清，测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDLC)。测定在日立全自动生物化学分析仪上进行，所有数据均以(^士S)表示，组间平均数采用t检验(见表l)。与对照组比较，可见3周、6周各基因治疗组的血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDLC)明显下降，统计学具有显著差异性(P<0.01)，高密度脂蛋白(HDLC)明显升高，统计学具有显著差异性(P<0.01)。4.病理切片的制作以及动脉粥样硬化斑块变化的观察对照组、基因治疗组均于基因治疗后3周、6周各处死6只大鼠，取出主动脉血管即心脏下方至腹主动脉分叉处约10cm，其中对照组2根血管，3周、6周各基因治疗组2根血管，做大体病理标本油红O染色，采用投影格子计数法分别计算每条主动脉内膜总面积、胸腹主动脉内膜面积以及油红O染色阳性的脂质条纹及隆起的纤维斑面积，求出各类病变面积百分比。其余血管做横断切片，做HE染色、油红O染色(脂肪染色)及茜素红染色(钙质染色)。对照组，D组(不含基因的磁性脂质体复合物)83层，3周时实验AJ且(含Apo-A-I基因的磁性脂质体/DNA复合物)80层、实验B}组86层、实验d组83层、6周时实验A2组82层、实验B2组83层、实验(32组88层。染色后切片由病理学专家判断有无斑块形成及斑块形成的分期，判断标准为；内皮细胞及弹力板完整性；有无凸向管腔内的斑块；斑块的内部成分。大体病理观对照组动物主动脉血管沿纵轴剪开，见血管管壁仍明显僵硬增厚，血管内膜表面多发不规则的红色隆起。投影格子计数法分别计算每条主动脉内膜总面积、胸、腹主动脉内膜面积以及油红O染色阳性的斑块面积，求出各类病变面积百分比，脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为32.25%和1.66%。各基因治疗组部分血管管壁稍僵硬，弹性有一定程度恢复，管壁略增厚，血管内膜表面可见少量不规则的红色隆起。投影格子计数法分别计算每条主动脉内膜总面积、胸、腹主动脉内膜面积以及油红O染色阳性的斑块面积，求出各类病变面积百分比，A组脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为9.17%和1.39%。B组分别为9.23%和1.13%、C组分别为9.21%和1.05%镜下观察对照组动物主动脉管壁结构的完整性受到破坏，弹力板断裂；血管内皮细胞局灶性脱落，许多部位内皮细胞呈增生性修复状态，失去了其正常的单层有规律的结构，而呈多层紊乱状。脂质斑块镜下可见内膜下有富含脂质的泡沫细胞。纤维斑块的内皮细胞增生明显，纤维帽下可见大量泡沫细胞聚集，并斑块突向管腔内(见图4A、4B)。各基因治疗组动物显示内皮细胞局灶性脱落，并可见少量增生，排列稍紊乱，可见少许薄层斑块存在，斑块内可见少量泡沫细胞聚集，中层平滑肌细胞排列尚整齐(见图4C-5B)。5.肝脏及其他脏器病理观察取对照组、基因治疗组肝组织，做横断面切片，进行HE染色、油红O染色，观察肝细胞脂质沉积情况。取基因治疗组心肌、肺脏、脾脏及肾脏做横断面切片，进行HE染色。对照组大鼠肝脏仍呈现乳黄色，油红O染色可见肝细胞胞质内富含脂质，呈强阳性。基因治疗组大鼠肝组织内红染脂质颗粒减少(见图5C、5D);HE染色发现心肌、肺脏、脾脏及肾脏形态结构未见异常变化(见图6A-6D)。说明基因治疗是安全的，没有影响其他脏器。6.数据统计采用xz分析，各组分别清点有斑块的切片数和无斑块的切片数，采用SPSS11.5英文版软件处理分析。对照组，D组83层，发现斑块35层；3周时实验Ai组80层切片中发现斑块12层、实验Bj且86层切片中发现斑块15层、实验G组83层切片中发现斑块10层；6周时实验AJ且82层切片中发现斑块10层、实验B2组83层切片中发现斑块13层、实验C2组88层切片中发现斑块14层。基因治疗3周、6周各基因治疗组与对照组的斑块率的比较，P<0.01，差异有统计学意义(见表2、表3、表4)表l.对照组与基因治疗组血生化检査测定值(mmol/L，I±S)TCTGHDLLDL对照组10.68±0.231.28±0.320.23±0.014.20±0.510周3周10.68±0.301.31±0.170.22±0.034.19±0.266周10.69±0.141.33±0.240.23±0.114.21±0.18Apo-A-I组0周10.68±0.181.28±0.120.23±0.094.21±0.313周7.72±0,510.90±0.173.54±0.203.58±0.216周5.34±0.220.58±0.247.61±0.422.42±0.54SR-BI组0周10.67±0.131.28±0.190.23±0.124.21±0.113周7.73±0.400.88±0.203.56±0.323.64±0.346周5.30±0.120.56±0.117.59±0.332.37±0.51两基因组0周10.68±0.251.29±0.300.22±0.134.20±0.203周7.69±0.330.90±0.143.53±0.182.87±0.156周.38±0.290.57±0.277.63±0.122.46士0.16表2.基因治疗组A和对照组D切片发现斑块率的比较A<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3周X2=14.6533，P<0.01;6周X2=18.6835，P<0.01，有统计学意义表3.基因治疗组B和对照组D切片发现斑块率的比较BD合计时间3周6周3周6周有斑块的切片数15无斑块的切片数71133570485048119118切片数总计8683833周X2:12.396，P<0.01;6周X2=14.185，P<0.01，有统计学意义表4.基因治疗组C和对照组D切片发现斑块率的比较CD合计时间3周6周3周6周有斑块的切片数10无斑块的切片数73143574484549121122切片数总计8388833周X2=19.0542，P<0.01;6周X2=14.4071，P<0.01，有统计学意义。权利要求1、一种由包裹造影剂的脂质体及核酸组成的靶向制剂，其特征在于其中包裹造影剂的脂质体由中性磷脂、阳性脂质、胆固醇、a-生育酚和造影剂组成，且中性磷脂、阳性脂质、胆固醇、a-生育酚、造影剂的重量比为l一75:1—75:0—15:0—5:2—30份，脂质体的平均粒径是50—300nm，靶向制剂平均粒径是50—500nm。2、根据权利要求1所述的靶向制剂，其特征在于所述的中性磷脂、阳性脂质、胆固醇、a-生育酚、造影剂的重量比为15—50:15—50:0—10:1—4:10—25份。3、根据权利要求2所述的靶向制剂，其特征在于所述的中性磷脂、阳性脂质、胆固醇、a-生育酚、造影剂的重量比为30:30:1:1:15份。4、根据权利要求1所述的靶向制剂，其特征在于其中包裹造影剂的脂质体所含的中性磷脂选自合成或半合成的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺，或两者的组合。5、根据权利要求4所述的靶向制剂，其特征在于合成或半合成的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺选自以下材料中的一种或两种以上的组合二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇一二棕榈酰磷脂酰胆碱。6、根据权利要求1所述的靶向制剂，其特征在于其中包裹造影剂的脂质体所含的阳性脂质选自以下材料中的一种或两种以上的组合硬脂胺)、N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N—三甲基氯化铵、3(H(N，,N，二甲基胺乙基)胺基甲酰蜀胆固醇、2，3二油酰氧-N-[2-(精胺羧基酰胺)乙基-N,N-二甲基小丙基三氟乙酸铵、1，2-二油酰氧丙基-N,N，N-三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化胺、十四烷基三甲基溴化胺、十六烷基三甲基溴化胺、二甲基双十八垸基溴化胺。7、根据权利要求1所述的靶向制剂，其特征在于其中的造影剂是一种磁共振成像造影剂。8、根据权利要求7所述的靶向制剂，其特征在于其中的造影剂是含有三价铁或二价铁的铁磁性物质。9、根据权利要求8所述的靶向制剂，其特征在于其中的造影剂是三氧化二铁。10、根据权利要求1所述的靶向制剂，其特征在于其中的核酸是质粒DNA、寡核苷酸、双链核酸化合物中的一种或其组合。11、根据权利要求10所述的耙向制剂，其特征在于质粒DNA为APO-AI基因的重组表达载体、SR-BI基因的重组表达载体，或两者的组合。12、一种制备如权利要求1所述的靶向制剂的方法，其特征在于，将中性磷脂、阳性脂质、胆固醇与a-生育酚按重量比，溶于有机溶剂中并与造影剂溶液形成W/O乳剂，然后在旋转蒸发器上蒸去有机溶剂，至凝胶形成，再加入分散介质常温下旋转至悬液形成后进行均质得到包裹造影剂的脂质体；将制得的包裹造影剂的脂质体混悬液与核酸溶液室温下培育15min—24hr即得。13、根据权利要求12所述的制备靶向制剂的方法，其特征在于，所述的均质方法为过高压均质机、水浴超声或者过聚碳酸酯膜。14、根据权利要求12所述的制备靶向制剂的方法，其特征在于，所述的有机溶剂是氯仿、乙醚、甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、四氯化碳、二甲基亚砜或四氢呋喃中的一种或其组合。15、根据权利要求12所述的制备靶向制剂的方法，其特征在于，所述的分散介质为注射用水、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、0.9。/。NaCl溶液或5。/。葡萄糖溶液。全文摘要本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及一种可用于诊断或治疗的由包裹造影剂的脂质体及核酸组成的靶向制剂及其制备方法。本发明的靶向制剂可用于人体或动物疾病的治疗或诊断，是先制备得到包裹造影剂的脂质体，再将该脂质体混悬液与核酸溶液室温下培育15min-24hr，灭菌后即得。粒径分布、电镜观察、zeta电位等测定结果均表明本发明制得的靶向制剂结构稳定、无毒、降解安全，完全符合靶向载体的要求。同时本发明制备得到包含Apo-A-I基因或SR-BI基因的靶向制剂，用该制剂对大鼠进行基因治疗并检测其疗效，结果表明，该靶向制剂具有很好的基因治疗效果和较高的安全性。文档编号A61K48/00GK101120921SQ20071004364公开日2008年2月13日申请日期2007年7月10日优先权日2007年7月10日发明者何新红,吴轶娜,悦张,扬张,莹李,沈碧霞,郑肖利,丹郭,陆建平,陈建明,马小龙申请人:中国人民解放军第二军医大学