专利名称：：治疗心脑血管疾病的中药提取物的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种治疗心脑血管疾病的中药提取物的制备方法。技术背景心脑血管系统疾病是人类最为常见的一类疾病，已成为当今世界人口的第一大死因。在我国，随着人口老龄化加速，人民生活水平提高，生活节奏加快，饮食习惯向高热、高脂化发展，人群中高血压、高血脂、心力衰竭、脑卒中等心血管系统疾病也已成为危害人类健康及生命的严重疾病之一。心血管疾病的高发生率与死亡率，引导了药物研发与生产的方向，在世界药品市场中，该类药物的研发、生产和市场状况日益受到制药企业、医药商业企业、投资机构和广大人民的关注。乌药(XzWera(aggreg她(Sims)Kosterm)系樟禾斗(Lauraceae山胡椒属(X/"cfera)植物，其膨大块根入药，具有温中散寒、理气止痛的功效。而乌药叶在民间及其临床也被广泛使用，具有抗菌、消炎作用。通过对乌药叶化学成分的系统研究及文献整理，我们发现乌药叶主要含有两类成分黄酮类及内酯类，这与市场上公认的对心脑血管疾病有良好治疗效果的银杏叶提取物成分类型极为相近，且成分比例也较为近似。乌药叶提取物的这些特征，激发了我们进一步研究其药理活性的兴趣。药理试验进一步证实，乌药叶提取物在抗氧化、扩张血管、降低血清胆固醇、增加冠脉流量、抗心率失常等方面均表现出良好的作用，可用于制备治疗心脑血管疾病的药物。专利CN1857610(—种含乌药叶提取物的保健品及其制备方法)公开了采用乌药叶提取物与多种中药材配伍职称保健品的方法，其中所采用的乌药叶的提取物系采用简单的方法提取而成，有效成分含量低(总黄酮含量18。％，倍半萜内酯0.1848%)，。
发明内容本发明的目的是提供一种治疗心脑血管疾病的中药提取物的制备方法。它是乌药叶加612倍体积百分比浓度为20%95%乙醇，冷浸或加热回流提取14次，每次0.512小时，提取液过滤，合并，浓縮至0.251.0§生药/mL，过滤或离心分离后通过AB-8或DuM大孔树脂柱，乌药叶与大孔树脂的重量比为1:15，上柱流速l4BV/h，树脂柱径高比为1:31:9;用水洗涤树脂38BV，洗脱流速为24BV/h，水洗脱液弃去；用体积百分比浓度为20%95°%乙醇洗脱，流速为24BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮，减压或喷雾干燥，粉碎，即得乌药叶提取物。所述的提取所用乙醇的体积百分比浓度优选30%95%。所述的洗脱树脂所用乙醇的体积百分比浓度优选30%95%。乌药叶提取物用于制备治疗心脑血管疾病的药物。本发明采用大孔树脂精制的方法制备乌药叶提取物，提取物中有效成分含量显著提高，其总黄酮含量不低于20%(以芦丁计)；总内酯含量不低于1%(以乌药醚内酯计)。该提取物具有抗氧化、扩张血管、降低血清胆固醇、增加冠脉流量、抗心率失常等作用，可用于制备治疗心脑血管疾病的药物。具体实施方式治疗心脑血管疾病的提取物的制备方法是乌药叶加612倍体积百分比浓度为20%95%乙醇，冷浸或加热回流提取14次，每次0.512小时，提取液过滤，合并，浓缩至0.251.0g生药/mL，过滤或离心分离后通过大孔树脂AB-8或Dun大孔树脂柱，乌药叶与大孔树脂的重量比为1:15，上柱流速l4BV/h，树脂柱径高比为1:31:9;用水洗涤树脂38BV，洗脱流速为24BV/h，水洗脱液弃去；用体积百分比浓度为20%95%乙醇洗脱，流速为24BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮，减压或喷雾干燥，粉碎，即得乌药叶提取物。所制备的乌药叶提取物中总黄酮含量不低于20%(以戸丁计)，倍半萜内酯不低于1%(以乌药醚内酯计)。实施例1乌药叶加6倍30%乙醇，加热回流提取l次，提取时间为0.5小时，提取液过滤，合并，浓縮至0.25g生药/mL，过滤后通过AB-8大孔树脂柱，乌药叶与AB-8大孔树脂的重量比为1:1，上柱流速lBV/h，树脂柱径高比为1:3;用水洗涤树脂3BV，洗脱流速为2BV/h，水洗脱液弃去；用30%乙醇洗脱，流速为2BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮，减压或喷雾干燥，粉碎，即得乌药叶提取物。该提取物中总黄酮的含量为21%，倍半萜内酯的含量为1%。实施例2乌药叶加12倍95%乙醇，加热回流提取4次，每次2小时，提取液过滤，合并，浓縮至l.Og生药/mL,离心后通过Dun大孔树脂柱，乌药叶与Dnn大孔树脂的重量比为1:5，上柱流速4BV/h，树脂柱径高比为1:9;用水洗涤树脂犯V，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用95%乙醇洗脱，流速为4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮，减压或喷雾干燥，粉碎，即得乌药叶提取物。所制备的乌药叶提取物中总黄酮含量为80%(以芦丁计)，倍半萜内酯含量为12%(以乌药醚内酯计)。实施例3乌药叶加8倍70%乙醇，加热回流提取3次，每次1小时，提取液过滤，合并，浓縮至0.5g生药/mL，离心后通过AB-8大孔树脂柱，乌药叶与AB-8大孔树脂的重量比为1:2，上柱流速2BV/h，树脂柱径高比为1:5;用水洗涤树脂5BV，洗脱流速为3BV/h，水洗脱液弃去；用70%乙醇洗脱，流速为3BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮，减压或喷雾干燥，粉碎，即得乌药叶提取物。所制备的乌药叶提取物中总黄酮含量为53%(以卢丁计)，倍半路内酯含量为8%(以乌药醚内酯计)。实施例4乌药叶加10倍50乙醇，加热回流提取2次，每次2小时，提取液过滤，合并，浓縮至0.5g生药/mL,过滤后通过Dun大孔树脂柱，乌药叶与Dnn大孔树脂的重量比为1:3，上柱流速2BV/h，树脂柱径高比为1:7;用水洗涤树脂6BV，洗脱流速为3BV/h，水洗脱液弃去；用70%乙醇洗脱，流速为2BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓縮，减压或喷雾干燥，粉碎，即得乌药叶提取物。所制备的乌药叶提取物中总黄酮含量为24%(以芦丁计)，倍半萜内酯含量为6%(以乌药醚内酯计)。乌药叶提取物药效学试验通过对乌药叶提取物开展的一系列药理试验证明，乌药叶提取物具有良好的清除自由基、抗氧化的作用，同时，能有效的扩张冠脉血管，增加冠脉流量、明显改善心肌缺血缺氧、改善缺血脑组织损伤、延缓血栓形成和降低血黏度，具有作为防治心脑血管疾病的天然药物的巨大潜力。1、抗氧化作用取昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重(20士2)g，随即分为4组盐水组、小剂量组、大剂量组、银杏叶提取物组(EGb)，每天给药1次，连续给药1周后，腹主静脉取血lmL，离心分离出血清，测定MDA、NO及SOD含量。结果见表l。表l乌药叶提取物对小鼠血清MDA、NO、SOD含量的影响(》士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注与生理盐水比较，*P<0.05,**P<0.01试验证明，本品能使小鼠血清中SOD含量升高，具有清除氧自由基和抗氧化的能力。2、豚鼠离体心脏冠脉流量试验取豚鼠25只，每组5只，随即分为5组分别为生理盐水组、乌药叶提取物低、中、高3个剂量组，EGb对照组。击头致昏，迅速取心脏，在4。C任洛氏液中清洗，排除积血。将主动脉套入灌流装置的套管上，并结扎固定，以纯氧饱和的任洛氏液(Ringer-Locke，s)恒速灌流。灌流平衡10min后，连续测定3min的每分冠脉流量，以其平均值作为药前值。加药后，记录13min的每分冠脉流量，取极值，作为药后值，比较前后变化。表2乌药叶提取物对豚鼠离体心脏冠脉流量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与对照组相比*P<0.05,**P<0.01;与药前相比#P<0.05,##P<0.01试验证明，不同剂量的乌药叶提取物均可增加豚鼠离体心脏的冠脉流量。3、垂体后叶素所致大鼠心肌缺血试验取大鼠50只，雌雄各半，体重180-220g，随即分成5组分别为生理盐水组、乌药叶提取物低、中、高3个剂量组，EGb对照组。分别静脉注射给药，给药20min后，25乌拉坦5mL/kg.ip麻醉，固定于鼠台上，记录正常II导连心电图后，舌静脉注射垂体后叶素0.8单位/kg，5s注完。分别记录0，15，30，60s，3，8min后的II导连心电图，比较给予垂体后叶素前后，T波高度的变化，进行组间t检验。表3乌药叶提取物对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血的治疗效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>10mg/kg100.193±0.0200.257±0.027*#0.412±0.024*#0.298±0.022#0.235±0.018#0.221±0.02820mg/kg100.198±0.0220.231±0.030*0.359±0.036**##0.241±0.031*#0.223±0.029*0.214±0.01840mg/kg100.197±0.0210.214±0.019**0.274±0.033**絲0.215±0.026**0.209±0.019**0.200±0.015*EGb纟Jl100.195±0.0180.231±0.020*#0.344±0.025*##0.291±0.030*#0.229±0.035*0.201±0.020注与对照组相比*P<0.05,**P<0.01;与药前相比#P<0.05，##P<0.014、小鼠常压缺氧试验取小鼠50只，雌雄各半，体重(20士2)g，随即分成5组分别为生理盐水组、乌药叶提取物低、中、高3个剂量组，EGb对照组。尾静脉注射给药20min后分别放入盛有10g碱石灰的容量为250mL磨口瓶内，加盖密封。观察其存活时间，以呼吸停止为死亡特征。表4乌药叶提取物对小鼠常压缺氧存活时间的影响(》化)剂量ti生存时间(min)生理盐水1024.9土4.0Omg/kg1030.8土3.5*20mg/kg1036.4土5.4**40mg/kg1041.4土6.3**EGb组1037.3士5,3**与对照组相比叩<0.05,**P<0.015、乌药叶提取物对实验性大鼠脑梗死损伤的保护取大鼠(雄性，体重300350g)用戊巴比妥钠40mg/kgip麻醉，然后在右眼和右耳之间的中点作1.5cm长的切口，分开颞肌，暴露颧突和颞骨，在颧突之头端l2mm处，用牙科钻开一直径为2mm的小孔，将软脑膜开一小孔，暴露中脑动脉起始部位，用刮刀将脑组织轻轻移开，用微小双极电凝器灼断大脑中动脉，然后将颗肌和皮肤分层缝合。取手术成功的32只大鼠，分成4组:分别为生理盐水组、乌药叶提取物低、高2个剂量组，脑血栓片对照组。连续用药15d后，将动物处死，取其大脑，以均等间距横切5个断面，用1。/。四氮唑蓝(TTG)磷酸缓冲液在37"C染色10min后，分离梗死区与非梗死区，称重，用重量法计算梗死面积，最后将脑组织放入ll(TC烘箱内连续烘干24h，取出称脑组织干重，算出脑含水量。结果见表5。表5乌药叶提取物对大鼠实验性脑梗死得保护作用(》h)剂量n梗死百分率％含水量％生理盐水829.4±5.684.2±1.1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与对照组相比*P<0.01试验证明，乌药叶提取物对大鼠脑梗死模型的损伤有明显的保护作用，使病灶面积显著縮小，组织含水量减少，水肿程度明显减轻。6、对大鼠体内血检形成的影响取大鼠40只，雌雄各半，随即分成5组分别为生理盐水组、乌药叶提取物低、中、高3个剂量组，脑血栓片对照组，各组连续灌胃7d，于末次给药后lh进行体内血栓形成实验(戊巴比妥钠40mg/kgip麻醉大鼠，切开颈部皮肤，分离右侧颈动脉，在动脉近心端下放置刺激电极，远心端下放连接仪器的温度探头，开通体内血栓形成测定仪，通过刺激电极给予1.5mV直流电刺激7min，以损伤动脉内皮细胞，随着动脉管腔内血栓逐渐形成，血流逐渐被阻断，温度突降，仪器报警，记录堵塞形成时间。)最后将各组动物颈总动脉采血，肝素抗凝，测定血液黏度参数。结果见表6。表6乌药叶提取物对大鼠体内血栓形成时间集全血黏度的影响(》±"<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与对照组相比*户<0.05,**户<0.01试验说明乌药叶提取物能够明显延长大鼠体内血栓形成时间，同时各给药组动物的全血黏度均有不同程度的降低，说明乌药叶提取物具有较好的抗血栓和改善血液流变学的作用。7、乌药叶提取物对麻醉犬脑血流量及脑血管胆力的影响取犬20只，每组5只，分成4组分别为生理盐水组、乌药叶提取物低、高2个剂量组，脑血栓片对照组。犬用戊巴比妥钠30mg/kgiv麻醉，气管插管，分离股动脉，插心导管至腹主动脉，与压力换能器相连，再接于多道生理记录仪记录血压波形，并读取主动脉收縮压(SAP)、舒张压(DAP)、平均动脉压(MAP)和心率(HR)，同时，记录标准II导程心电图;分离颈总动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉，将内径3mm的电磁流量计探头放置在颈总动脉上，以电磁流量计测定颈内动脉血流量(ICBF)。颈内动脉血管阻力(ICVR)=MAP/ICBF，手术后稳定2030min，待上述各项稳定后测正常值，然后进行十二指肠给药。给药后30,60,90和120min分别记录颈内动脉血流量及血管阻力。结果见表7、8。表7乌药叶提取物对麻醉犬ICBF的影响(用药后不同时间得ICBF值(ml/min-100g)剂量0min30min60min90min120min生理盐水9.7土0.99.7土0.89.9±1.010.歸.99.8土1.110mg/kg10.2±1.0lt).5土1.012.3±1.4*12.5士1.2*40tng/kg10.0±0.910.4±0.912.8±1.5"脑血栓片组59,9±0.8lt).4士0.910.9±0.9*12.5±1."12.6土1.3*与对照组相比*尸<0.05,**尸<0.01表8乌药叶提取物对麻醉犬ICVR的影响(》±"用药后不同时间得ICBF值(tnl/min-100g)剂量生理盐水10mg/kg40mg/kg脑血栓片组nOmin30min60min90min120min51.75±0.421.77±0.381.80±0.351.82±0.271.82±0.3051.77±0.291.72±0.331.68±0.29*1.55±0.36**1.57±0.25**51.74±0.341.69±0.291.60±0.31*1.51±0.22**1.48土0.19"51.72±0.211.68±0.261.66±0.31*1.56±0.27**1.54±0.21**与对照组相比*P<0.05，**尸<0.01与空白对照组相比，乌药叶提取物组在各用药时间点，对犬的血压、心电、心律均无明改变，但有增加其ICBF和降低ICVR的作用。权利要求1、一种治疗心脑血管疾病的提取物的制备方法，其特征在于乌药叶加6～12倍体积百分比浓度为20％～95％乙醇，冷浸或加热回流提取1～4次，每次0.5～12小时，提取液过滤，合并，浓缩至0.25～1.0g生药/mL，过滤或离心分离后通过AB-8或D101大孔树脂柱，乌药叶与大孔树脂的重量比为1∶1～5，上柱流速1～4BV/h，树脂柱径高比为1∶3～1∶9；用水洗涤树脂3～8BV，洗脱流速为2～4BV/h，水洗脱液弃去；用体积百分比浓度为20％～95％乙醇洗脱，流速为2～4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩，减压或喷雾干燥，粉碎，即得乌药叶提取物。2、根据权利要求1所述的一种治疗心脑血管疾病的提取物的制备方法，其特征在于提取所用乙醇的体积百分比浓度30%95%。3、根据权利要求1所述的一种治疗心脑血管疾病的提取物的制备方法，其特征在于洗脱树脂所用乙醇的体积百分比浓度30%95%。4、一种如权利要求1所述的治疗心脑血管疾病的提取物的用途，其特征在于用于制备治疗心脑血管疾病的药物。全文摘要本发明公开了一种治疗心脑血管疾病的提取物的制备方法。它是将乌药叶加乙醇，冷浸或加热回流提取，提取液过滤，合并，浓缩，过滤或离心后通过大孔树脂，先用水洗涤树脂，水洗脱液弃去；再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩，干燥，粉碎，即得乌药叶提取物。本发明采用大孔树脂精制的方法制备乌药叶提取物，提取物中有效成分含量显著提高。该提取物具有抗氧化、扩张血管、降低血清胆固醇、增加冠脉流量、抗心率失常等作用，可用于制备治疗心脑血管疾病的药物。文档编号A61P9/10GK101129466SQ20071007062公开日2008年2月27日申请日期2007年8月31日优先权日2007年8月31日发明者刘洪梅,孙铭遥,琳张,欣王,田景奎,镭罗,谷希达,金鉴璐申请人:浙江大学