专利名称：一种新型抗癌复方药物的配伍方法
技术领域：
本发明属于中药新药研发的技术领域，确切地说是涉及一种新型抗癌药物 的研究。 技术背景目前肝癌的治疗仍以手术治疗为主,但手术仅适用于某些局部性肝癌早期和中期的治疗;而放疗和化疗常引起骨髓抑制、免疫低下等毒副反应,值得注意的是, 化疗药物的耐药性已成为目前临床肿瘤治疗中的难题之一。因此，从天然药物中 寻找既能杀伤肿瘤细胞,毒副作用又较少的活性药物分子或者有效部位,已成为 临床医学、药学领域关注的热点。中药乳香为橄榄科植物卡氏乳香(BoswemacarteriiBirdwood)的胶状树月旨，有 活血行气、通经止痛、消肿生肌等功效。主治心腹疼痛、风湿痹痛、经闭痛经、 跌打淤痛等。文献研究表明,乳香挥发油具有较强的抗白血病活性。细胞周期有若干个调节点，其中以Gl/S期转换最为重要。肿瘤细胞能顺利地 通过这2个关卡。因此,肿瘤细胞的特点是细胞周期运行失控,细胞群体主要处于 DNA合成活跃的S期;而分化细胞群体主要处于DNA合成静止的G0/G1期。本 实验结果表明，O 07 mg mL-l乳香挥发油作用24h,能明显抑制SMMC-7721细 胞增殖;作用48 h、 72h后，均能检测到细胞凋亡，且阻止细胞由Gl期向S期转变, 出现G0/ Gl期阻滞，DNA合成和分裂速度逐渐减慢，从而抑制细胞增殖,最终诱导 细胞凋亡。作用24 h时，未检测到凋亡,可能只是损伤细胞DNA。延长作用时间 后，则诱发了凋亡，核酸内切酶活化，双链DNA断裂成180-200bp片段。Bcl-2是主 要的抗凋亡基因，它可以抑制多种途径的凋亡，Bd-2蛋白主要分布于线粒体膜内 外侧，核膜、内质网膜也有分布。Bax是促凋亡基因和bcl-2都属于bcl-2基因家
族成员,通过编码相应功能蛋白起作用,Bax蛋白主要存在于胞质中。Bcl-2家族蛋 白质的活性形式一般是二聚体,Bax不仅能和Bcl-2形成异源二聚体抑制凋亡，而 且其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡。有研究表明,与Bax分离的Bcl-2失去 了抗凋亡能力,说明Bcl-2与Bax的结合是Bcl-2发挥作用的前提。而当Bax在细 胞内超表达,并形成同源二聚体时，细胞对死亡信号的反应增强。所以Bcl-2与Bax 的比例,即Bax-Bcl-2异源二聚体与Bax-Bax同源二聚体的比例，是决定细胞接受 致病信号刺激后成活与否的关键因素，较绝对量对于细胞的影响更为重要。作者 的实验证明,O 07 mg mL-l乳香挥发油诱导人肝癌细胞株SMMC-7721发生凋 亡时，促凋亡基因bax值升高,抑凋亡基因bcl-2值变化不明显,bax/ Bcl-2比值升 高。bcl-2与bax是细胞凋亡与否的上游调控因子，因此我们推测,bcl-2与bax的 表达变化是乳香挥发油诱导人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡，调控机制的一部分。现代药理研究表明,乳香提取物对急性非淋巴细胞白血病细胞有诱导分化作 用，能诱导急性非淋巴细胞白血病细胞凋亡，能降低HL-60细胞端粒酶活性。综 上所述,乳香挥发油能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖并诱导其凋亡。乳 香挥发油作为一种抗肿瘤的天然药物,有效果明显、毒副作用小的特点，作者正在 对它的化学成分、抗肿瘤作用及其机制做深入的研究。紫草为药典收戴临床常用传统中草药。它最初记载于《神农本草经》，属于紫草科多年生草本植物，根用于药，其中主要含有萘醌类色素、多糖两大类有效成 分。具有抗炎、抗肿瘤、保肝和免疫调节、避孕、杀菌抗病毒等作用。抗炎即 消炎、收敛和解毒，其水提物、醇提物、醚提物都有此作用。新疆紫草素是从新 疆紫草根中提取的萘醌类化合物。新疆紫草含P , 0 -二甲基丙烯紫草素、紫草素、乙酰紫草素、异丁酰紫草素、异戊紫草素等，据报道,紫草根对绒毛膜上皮癌、小 鼠腹水型肉瘤S180及恶性葡萄胎有一定疗效。路桂荣等的研究证明紫草素对人 胃癌细胞(BGC823)和人食道癌细胞(Egal09)具有明显的抑制作用。但紫草素对 肝癌细胞的抑制作用的研究还鲜见报道。我们的实验中，可以看出新疆紫草素三 个剂量10ug/ml、 5ug/ml、 2.5tig/ml均能不同程度抑制人肝癌细胞系增殖。对 SMMC-7721肿瘤细胞的杀伤作用中新疆紫草素组的杀伤活性分别为47.2%、 31.9%、 24.8%。新疆紫草素组对荷瘤小鼠的抑瘤率分别为66.32%、 53.30%、 50.02°/。。新疆紫草素10mg/kg、 5mg/kg、 2.5 mg/kg体重对小鼠肝癌具有明显抑 制作用，不同浓度的新疆紫草素均提高H22荷瘤小鼠NK细胞活性及淋巴细胞转 化率,并且与对照组相比10 mg/kg、 5mg/kg、 2.5 mg/kg体重组,提高NK细胞活 性具有统计学意义。而10mg/kg、 5mg/kg体重组提高淋巴细胞转化率具有统计 学意义。由此我们认为,新疆紫草素具有抗肿瘤效用,是一种调控机体免疫功能的 中药。
发明内容
本发明的一个目的基于上述开发的研究背景，独创将两种药物通过一定的 浓度配伍，以便开发出新型的抗癌复方制剂。 具体是实施方式 方法将乳香粉碎，超临界C02萃取实验仪以压力25MPa，温度55°C，萃取时间6h 的条件萃取。得到乳香SFE-C02萃取物。药物SFE-C02萃取物紫草素=0. 7mg: 10. 0 u g/ml(溶媒DMSO浓度0 '1%)。 给药方法MTT法取对数生长期细胞，以台盼蓝染色活细胞数大于95%。 0. 25%胰蛋白酶消化人肝癌S丽C-7721细胞，用含10%胎牛血清的RP-MI1640培养 液配制成单细胞悬液，以每毫升5X104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积 100 w 1。将培养板置于C02孵箱中，24小时后加入药物，每孔100 u 1，在37°C、5%C02饱和湿度下培养48小时。并设空白对照(不加药物)和溶媒(DM-S0)对照， 置于37。C含5 % C02孵箱中培养24 h后，每孔加MTT(5 mg mL-1)20 uL，作用4 h后弃上清。各孔加入150 uL DMSO，振荡10 min，使甲结晶物充分溶解。在酶标 仪570 nm波长处读取吸光度A值。纪录结果。
权利要求
1、一种新型抗癌复方药物的配伍，其特征在于配伍方法包括以下步骤乳香为橄榄科植物卡氏乳香(BoswelliacarteriiBirdwood)的胶状树脂，有活血行气、通经止痛、消肿生肌等功效。主治心腹疼痛、风湿痹痛、经闭痛经、跌打淤痛等。文献研究表明，乳香挥发油具有较强的抗白血病活性。紫草为药典收戴临床常用传统中草药。它最初记载于《神农本草经》，属于紫草科多年生草本植物，根用于药，其中主要含有萘醌类色素、多糖两大类有效成分。具有抗炎、抗肿瘤、保肝和免疫调节、避孕、杀菌抗病毒等作用。抗炎即消炎、收敛和解毒，其水提物、醇提物、醚提物都有此作用。新疆紫草素是从新疆紫草根中提取的萘醌类化合物。新疆紫草含β，β-二甲基丙烯紫草素、紫草素、乙酰紫草素、异丁酰紫草素、异戊紫草素等。1.1配伍方法将乳香粉碎(购于山东科信医药科技有限公司)，超临界CO2萃取实验仪以压力25MPa，温度55℃，萃取时间6h的条件萃取。得到乳香SFE-CO2萃取物。将乳香SFE-CO2萃取物与紫草素(由长春中医学院提供)按SFE-CO2萃取物∶紫草素＝0.7mg∶10.0μg/ml(溶媒DMSO浓度0·1％)的比例配伍1.2药物活性研究1.2.1实验仪器及药物药物SFE-CO2萃取物∶紫草素＝0.7mg∶10.0μg/ml(溶媒DMSO浓度0·1％)。细胞株、人肝癌细胞系SMMC-7721、小鼠肝癌细胞系H22均由吉林省肿瘤防治研究所提供。α-蒎烯对照品(中国药品生物制品检定所)；乙酸正辛酯(中国医药集团上海化学试剂公司，含量大于98％)；丙酮等为分析纯；四甲基唑氮蓝(MTT)购自SIGMA公司。动物 昆明种小鼠购自吉林大学新民校区动物部。1.2.2实验方法MTT法 取对数生长期细胞，以台盼蓝染色活细胞数大于95％。0.25％胰蛋白酶消化人肝癌SMMC-7721细胞，用含10％胎牛血清的RP-MI1640培养液配制成单细胞悬液，以每毫升5×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μl。将培养板置于CO2孵箱中，24小时后加入药物，每孔100μl，在37℃、5％CO2饱和湿度下培养48小时。并设空白对照(不加药物)和溶媒(DM-SO)对照，置于37℃含5％CO2孵箱中培养24h后，每孔加MTT(5mg·mL-1)20uL，作用4h后弃上清。各孔加入150uL DMSO，振荡10min，使甲结晶物充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度A值。由此测定药物抗癌细胞活性。
2、 根据权利要求1所述的抗癌药物的配伍方法，将乳香挥发袖与紫草素 配伍，其特征在于SFE-C02萃取物紫草素二0.7mg: 10.0ug/ml (溶媒DMSO浓 度0 1%)。将上述两种药材经上述比例配伍后，发现对S丽C-7721细胞的杀伤 率在90%以上。
全文摘要
本发明提供了一种新型复方抗癌药物的配伍方法。本发明将乳香挥发油与紫草素通过一定的比例配伍，研究其对抑制人肝癌SMMC-7721细胞株增殖及诱导凋亡的作用，发现配伍后的药物对肝癌SMMC-7721细胞株增殖有很强的杀伤作用可达90％左右。
文档编号A61K36/324GK101156884SQ20071011293
公开日2008年4月9日 申请日期2007年9月14日 优先权日2007年9月14日
发明者张岱州, 朱春花, 梁大连, 陈彤彤, 河 马 申请人:山东省医药工业研究所