抗分泌因子对于治疗高眼压的应用的制作方法

专利名称：抗分泌因子对于治疗高眼压的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含抗分泌因子的药物合成物对于治疗和/或防止高眼压的 应用，这种应用的优选特征是，使导致眼内压升高的体液外流受到抑制。本 发明提供用于治疗和/或防止这种病症、调节眼内压至可接受水平(任选等
于或小于21毫米汞柱)的新颖途径。本发明还涉及通过给予包含抗分泌因 子的药物合成物从而治疗和/或防止高眼压的方法。
背景技术：
眼内压水平升高是由于眼内体液产生增多或外流受到抑制、或者这两种 因素的组合导致的。多物种哺乳动物的眼内压(IOP)类似，都为11-21毫 米汞柱左右，如10-20毫米汞柱、12-18毫米汞柱。对于人类，正常范围约 为11-21毫米汞柱。如果较长时期地超过20毫米汞柱，如21毫米汞柱、21-24 毫米汞柱、或22-30毫米汞柱，则认为是高眼压。通过形成体液(房水，AH) 可以调节IOP水平，房水来源于血液并经由睫状突传递至眼后房中。AH通过 眼后房中的玻璃体和晶状体，然后通过瞳孔进入眼前房中。大部分AH最终 流至虹膜-角膜角并经由Schlemm管、房水静脉、巩膜和巩膜上静脉通过小 梁网流出眼外。在AH和例如眼后房中的晶状体与眼前房中的角膜之间存在 体液和代谢物的交换。 一小部分AH进入葡萄膜巩膜途径，即虹膜、睫状肌 和巩膜，最终与局部产生的组织液混合，然后流出眼外(Jermial， Hansson &Bill， 1990; Oyster, 1999)。 IOP主要通过体液外流调节，而人们认为成 人AH的形成不怎么变化。IOP的主要调节因素是小梁网的内皮、管旁内皮网 (the juxtacanalicular endothelial meshwork)、禾口 Schle 管的内壁内 皮(Lutjen—Drecoll 1998; Sacca等，2005)。后者对于调整和调节由眼前房至血管系统的流动非常重要。在内皮细胞中形成有内陷(称为"细胞膜穴
样内陷")，其中充满AH，然后主要作为巨液泡传递通过内皮细胞，最终清空 它们的内含物至Schlemm管中。IOP升高导致形成大量这样的巨液泡，如果 IOP降低则反之(Jerndal， Hansson & Bill, 1990; Lutjen-Drecoll 1998)。 另外，这些细胞可以暂时地具有调节它们的细胞容积的能力，从而进一步影 响AH的细胞外泄(the paracellular leakage) (Starner等，2001)。图la 显示人眼的示意图，图lb是成人眼虹膜-角膜角的扫描电子显微照片。
在医疗实践中，使用术语"高眼压"作为IOP超过20毫米汞柱(如21-24 毫米汞柱、22-30毫米荥柱)的慢性病的诊断。高眼压病人可能患有该病症 而不产生任何后发病(如视野丧失)信号或其他视网膜信号和视神经异常。 IOP急剧升高会在例如咳嗽、高工作负荷、眼球外伤和咽鼓管充气检査 (Valsalva's manoeuvre)之后瞬时发作。IOP通常具有日夜变化，对于人类， 每日早间的IOP最高。成人每分钟形成约2-3微升AH，所以眼中AH约每1. 5 小时更新一次。这意味着必须在很窄的时间限度内对AH的形成和外流进行 调节，从而将I0P保持在正常范围内。IOP必须既不太高也不太低。AH的主 要功能是为例如晶状体和角膜提供营养素、氧气、离子和体液，并且排出代 谢物和废物。而且，IOP和AH相互作用从而保持眼的光学性质和形状。可以 通过几种方法揭示AH的产生，例如通过确定AH的周转量及其外流。通过例 如压力测量法可以精确确定眼内压。
可以证明一些青光眼病人存在不正常的IOP。不过并非所有青光眼病人 都显出高眼压信号。因此，必须不要将术语"高眼压"与青光眼的医疗诊断 混淆起来。与高眼压不同，确定青光眼作为一种疾病的特征是，随着时间的 流逝，因为视网膜神经细胞的持续损失和视神经的退化，导致恶化并且最终 失明。术语"青光眼"包括多种病症，它们的共同特点是最终都会导致视力 恶化(Ritch等，1996)。因此，青光眼的诊断与视觉损失相关，与IOP不正 常无关。
IOP主要通过AH从眼前房外流至通过虹膜角膜角的静脉到达Schlemm 管进行调节。如果AH从眼流出受到抑制或甚至受到阻碍，IOP就会升高。对 外流的阻力(正常情况下导致IOP为10-20毫米汞柱，如12-18毫米汞柱) 主要位于小梁网和Schlemm管的内皮衬中。小梁网和Schlemm管中的内皮细胞相互作用，调节AH的外流(Alvarado等，2005; Jerndal等，1991)。在 眼前房和Schlemm管(包括巩膜和巩膜上静脉)之间没有直接联系。对于高 眼压，小梁网的特征是退化至不同程度，积聚源自鞘膜的斑样物质，以及 增大对AH外流的阻力(Rohen等，1993)。而且，在某些情况下，色素和脱 落物质以及血细胞和凝块的积聚也会增加阻力并进一步抑制外流，使IOP升 高。分泌过多(即AH形成过多)是高眼压的唯一原因。因此，对AH的周转 量进行改善的持续控制，特别是控制AH通过虹膜角膜角的外流，对于降低 IOP使其趋于正常从而控制高眼压是非常重要的。
在临床实践中，治疗高眼压的现有疗法的目的是优先增加AH的外流， 但是一些药物(例如杜塞酰胺和布林佐胺)会减少AH产生。 一些目前使用 的药物同时影响形成和外流途径。需要强调的是，AH的组成和周转量都很重 要，因为AH为例如晶状体和角膜提供营养素、体液和氧气，并且处理形成 的多种产物。目前使用的药物很多都有副作用，经常会抑制治疗的充分性。 另外，现有药物还不能充分治疗高眼压。因此，需要提出降低IOP至正常水 平的治疗方法。
抗分泌蛋白是41kDa蛋白，最初描述为能防止腹泻和肠炎(综述参见 Lange和Lonnroth， 2001)。已知抗分泌蛋白的序列，并且克隆了其cDNA。 抗分泌活性似乎主要由位于1-163之间(或者更具体地说，是位于抗分泌蛋 白氨基酸序列上35和50点位之间)的肽行使。免疫化学和免疫组织化学研 究显示，抗分泌蛋白由体内大部分组织和器官呈现，并且也可以由它们合成。 已经表征了包含抗腹泻序列的合成肽(W0 97/08202; W0 05/030246)。已经 揭示抗分泌因子能够使病态的体液传输和/或炎性反应正常化，例如用霍乱 菌毒素激发之后在肠管和中枢神经系统的脉络丛中的情况(W0 97/08202)。 因此，在W0 97/08202中建议可以在食物和词料中添加抗分泌因子来治疗水 肿、腹泻、脱水和炎症。W0 98/21978揭示具有酶活性的产物用于制造诱导 抗分泌蛋白形成的食物的应用。W0 00/038535进一步揭示富含这种抗分泌蛋 白的食品。
还显示，在治疗细胞损失和/或增益相关病症时，抗分泌蛋白及其片断 能够改善神经组织的修复以及干细胞和祖细胞及其衍生细胞的增殖、凋亡、 分化和/或迁移(W0 05/030246)。本发明的发明人惊异地发现，抗分泌因子蛋白及其同系物和肽片断能够
降低对AH通过眼的虹膜角膜角外流至静脉系统的阻力。这种发现提供了抗 分泌蛋白及其同系物和片断的新的治疗应用，即，这种蛋白和片断在制备用 于治疗和/或防止高眼压的药剂中的应用。

发明内容
本发明涉及包含抗分泌因子的药物合成物对于治疗和/或防止高眼压的
应用。本发明基于以下发现抗分泌因子(即抗分泌蛋白及其具有抗分泌活 性的肽、衍生物、同系物和片断)能够增加眼内体液的外流，从而降低眼内压。
在第一方面，本发明涉及抗分泌蛋白，或其具有抗分泌活性的同系物、 衍生物或片断，或其药物学可接受盐，对于制造用于防止和/或治疗高眼压 的药物合成物的 应用。
在第二方面，本发明涉及治疗和/或防止哺乳动物高眼压的方法，其中， 该方法包括给予需要的哺乳动物有效量的药物合成物，该合成物包含抗分泌 蛋白，或其具有抗分泌活性的同系物、衍生物或片断，或其药物学可接受盐。
附图简要说明
图la显示人眼(1-1)的示意图。在较高放大倍数下能看到Schwann管 (Sch)，通过小梁网(T) (1-2)与眼前房(AC)分开。还显示出，各小梁 (Tr)被内皮细胞(EC) (1-3)包围。房水在睫状突形成，参见

图1-1中加
框区域右侧。！^晶状体；C二角膜；1=虹膜；S二巩膜；由R.V.Krstic， 1991修改。
图lb是55岁老年男性的眼的虹膜-角膜角的扫描电子显微照片，该男 性的眼因为眼球后肿瘤而摘除。可以看到，小梁网(标注为U)通过相当致 密的组织与Schlemm管分开。〔=角膜；Sp二巩膜突；1=虹膜；Cp,走状突; S二Schwalbe线。空气位于右上方。来自Jerndal等，1991。
图2分别显示根据实施例7用AF-16 (倒三角形)、药物Timolol (三 角形)和PBS载体(正方形)对兔眼进行局部治疗时的眼内压。
图3分别显示根据实施例7用AF-16 (倒三角形)、药物Timolol (三角形)和PBS载体(正方形)对兔眼进行5天局部治疗后的眼内压。
图4显示根据本发明SEQ ID NO 6的抗分泌蛋白氨基酸序列。该序列对
应于US 6344440的SEQ ID NO 2。 定义
在本申请中，"眼前房"定义为虹膜前表面和角膜内皮表面之间的空间， 在虹膜角膜角处连接。
"眼后房"定义为玻璃体与晶状体的前表面和虹膜后表面之间的空间。 眼后房和眼前房通过瞳孔连接。
本申请文本中的"抗分泌蛋白"指具有WO 97/08202和WO 00/38535中
所定义抗分泌性质的蛋白。
在本申请文本中，"抗分泌因子(AF)"指抗分泌蛋白或其具有抗分泌活 性的肽、同系物、衍生物和/或片断。在本申请文本中，这种肽、同系物、 衍生物或片断在治疗和/或防止高眼压时具有相似的生物活性。在例如WO 97/08202和WO 05/030246中揭示了抗分泌因子。在本申请文本中，术语"抗 分泌因子"、"抗分泌因子蛋白"、"抗分泌蛋白"、"抗分泌肽"、"抗分泌衍 生物"和"抗分泌片断"可以交换使用。术语"抗分泌因子"还意指SE 900028-2 和WO 00/38535中揭示的富含抗分泌因子的蛋黄，以下将进一步描述。
"房水，AH"指由血液在睫状突形成、流过眼后房和瞳孔进入眼前房、 然后主要经由小梁网和Schlemm管以及最终的静脉血管离开眼前房的水样体 液。
CNS是中枢神经系统，包括大脑和脊髓。
"水肿"指细胞、组织或浆膜腔中积聚过多量的水样体液(参见例如 Stedman's Medical Dictionary,第五版，Lippincott， Williams & Wilkins， Philadelphia, 2005)。
"青光眼"指一类疾病，其特征是，对视网膜和视神经的渐进性损伤导 致视野损失和变窄并最终丧失视力。
"眼内压(IOP)"是由眼球内的房水产生的压力。
"高眼压"是清醒对象眼球内压力超过20毫米汞柱(如21毫米汞柱、 22-30毫米汞柱)的病症。因此，在本申请文本中，"高眼压"和"眼内压不 正常"可以交换使用。"低眼压"指清醒对象眼球内压力小于11毫米汞柱，如10毫米汞柱。
"虹膜角膜角"是眼前房中、虹膜和角膜后部之间的连接处。
PBS是磷酸盐缓冲盐水。
在本申请文本中，术语"治疗"或"处理"涉及为了治愈或减轻高眼压 病症的医疗治疗。在本申请文本中，还意指"防止"高眼压，其与为了避免 发生高眼压的预防性治疗相关。
"小梁网"指衬有内皮细胞的小梁的网络和胶原结缔组织的片层，该片 层在位于眼前房和Schlemm管之间的虹膜角膜角处插入。
"Schlemm管"指位于眼的异组织边缘区域处内巩膜沟外部的环形静脉 管，其经由房水管连接至眼的静脉排出系统。Schlemm管是房水从眼前房外 流的主要系统。
蛋白(质)是由氨基酸残基通过肽键连接在一起构成的生物大分子。蛋 白(质)(作为氨基酸的线形聚合物)也称为多肽。蛋白(质)通常具有50-800 个氨基酸残基，因此分子量约为6000至几十万道尔顿或以上。小型的蛋白 (质)称为肽或寡肽。在本申请文本中，术语"蛋白(质)"和"肽"可以 交换使用。
在本申请文本中，"药物合成物"指包含治疗活性量的抗分泌蛋白、任 选组合有药物学活性赋形剂(例如载剂或载体)的合成物。所述药物合成物 为适当的给药途径配制，给药途径根据病人情况以及其他因素(如年龄或优 选选项)变化。包含抗分泌蛋白的药物合成物作为药物递送系统发挥作用。 给予的药物合成物为病人或动物体提供活性物质。以下进一步描述适用于本 发明的药物合成物。
发明详细说明
本发明基于以下惊异的发现，抗分泌因子(AF)(例如抗分泌蛋白及其 同系物、衍生物或片断)能降低对房水通过眼的虹膜角膜角外流至静脉系统 的阻力，这种降低作用增加了眼内异常积聚的体液的外流。从而增加房水外 流，导致眼内压降低。这种发现为抗分泌蛋白及其片断提供了一种新的治疗 应用，即，这种蛋白和片断对于制备用于治疗和/或防止高眼压的药物合成 物的应用。根据本发明的药物合成物的应用非常适合可能发生或已患有高眼 压的病人。如上所述，房水外流主要通过虹膜角发生，通过形成小梁网的细胞调节。
大部分房水经由Schlemm管传输离开眼部。房水封闭在通过小梁网细胞的小 泡中传输至Schlemm管，从某种程度上说，这种传输是跨细胞的。另外，一 小部分AH通过虹膜和巩膜的角结构离开眼。眼房水外流时，其中"一小部 分"液体是一次传输的，这与例如肠管中离子和水的传输有根本性的不同， 在肠管中，肠管上皮细胞的离子泵和水泵一次传输一个分子。因此，虽然以 前建议将抗分泌因子用于治疗水肿、腹泻、脱水、青光眼和炎症之类的病症 (W0 97/08202)，但是抗分泌因子在治疗这些疾病中的作用机理不同于其根 据本发明的作用机理，在本发明中，抗分泌因子降低了房水通过眼的虹膜角 膜角外流至静脉系统的阻力。不过，需要指出的是，高眼压在后期可能导致 青光眼，也可能不导致青光眼。
因此，在第一方面，本发明涉及抗分泌因子(即，抗分泌蛋白和/或其 具有抗分泌活性的同系物、衍生物或片段)和/或其药物学可接受盐对于制 造用于防止和/或治疗高眼压的药物合成物的应用。
抗分泌因子是体内自然产生的蛋白质。人抗分泌因子是41kDa蛋白，从 脑垂体分离时包含382个氨基酸。关于根据本发明的眼内压降低效应的活性 位点似乎位于接近蛋白质N端的区域中，定位于SEQ IDN0 6的氨基酸1_163， 或者定位于该区域片段。
本发明的发明人已经指出，抗分泌因子在某种程度上类似于蛋白S5a， 也称为Rpn 10，其构成所有脊椎细胞中占主要成分的亚单位，26 S蛋白酶 体，更具体地说是位于19 S/PA 700 cap中。在本发明中，抗分泌蛋白定义 为一类具有相同功能性质的类似蛋白。蛋白酶体具有多种与剩余蛋白以及短 寿蛋白、无用蛋白、变性蛋白、错误折叠蛋白和异常蛋白的降解相关的功能。 而且，抗分泌因子/S5a/RpnlO参与细胞成分(最明显的是指蛋白质)的细胞 分布和传输，常见教科书中有进一步的说明。
根据本发明的抗分泌蛋白的同系物、衍生物和片段和/或肽都具有类似 的、能够降低眼内压的生物活性。在本申请文本中，抗分泌同系物、衍生物 和片段包含天然产生的抗分泌蛋白的至少4个氨基酸，通过改变一个或多个 氨基酸可以进一步改性，从而优化治疗和/或防止高眼压的抗分泌因子的生 物活性。抗分泌蛋白的片段一般包含制备的肽/氨基酸序列或其片段，其中，该
制备中超过90% (如95%、 96%、 97%、 98%或99%)的蛋白是本发明的蛋白、 肽和/或其片段。
而且，对于与根据本发明的抗分泌蛋白、肽、同系物、衍生物和/或片 段的氨基酸序列有至少70% (如至少72%、 75%、 77%、 80%、 82%、 85%、 87%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%)相同的任何氨基酸 序列，也认为落在本发明范围之内。在本申请文本中，术语"类似"和"相 同"可以交换使用，即，与另一种氨基酸序列具有指定程度相同性的氨基酸 序列相对于指定的氨基酸序列具有相同程度的类似性。
本申请文本中的"衍生物"意指这样一种蛋白，其具有本文所定义的抗 分泌活性，直接或通过改性或部分取代衍生自另一种物质，其中一种或多种 氨基酸被另一种氨基酸取代，所述另一种氨基酸可以是改性的氨基酸或非天 然的氨基酸。这种改性的氨基酸和/或非天然的氨基酸是本领域技术人员众 所周知的。例如，根据本发明的抗分泌因子衍生物可以包含N端和/或C端 保护基团。N端保护基团的一个例子包括乙酰基。C端保护基团的一个例子 包括酰胺。
"相对于参比氨基酸序列具有至少例如95%相同性的氨基酸序列的蛋 白、同系物、衍生物、肽和/或其片段"意指例如这种肽的氨基酸序列与参 比序列类似，区别在于，该氨基酸序列在参比氨基酸序列的每100个氨基酸 中可以包括最多5个点突变。换言之，要获得相对于参比氨基酸序列具有至 少95%相同性的氨基酸序列的多肽，可以删除参比序列中最多5%的氨基酸或 者用另一种氨基酸取代，或者可以在参比序列中插入占参比序列中氨基酸总 数最多5%的氨基酸。
这些参比序列的突变可以在参比氨基酸序列的氨基或羧基端位置或者 这些端位之间的任何位置发生，独立地插入参比序列中的氨基酸之间或者作 为一个或多个邻接的基团插入参比序列中。
在本发明中，最适宜使用一种局部算法程序来确定类似性。局部算法程 序(例如Smith-Waterman)对一个序列中的子序列与另一个序列中的子序列 进行比较，找出子序列的组合以及那些子序列的队列，产生最高整体类似性 评分。允许时对内部空隙进行罚分。局部算法在比较具有共同的单个域或仅只一个结合位点的两个多域蛋白时能很好地工作。
确定相同性和类似性的方法编码成公开可用的程序。确定两个序列之间
的相同性和类似性的优选计算机程序方法包括但并不限于GCG程序包 (Devereux， J等(1994)) BLASTP， BLASTN和FASTA (Altschul， S. F.等 (1990))。 BLASTX程序由NCBI和其他来源公开(BLAST Manual, Altschul,
S.F.等，Altschul, S.F.等(1990))。各序列分析程序具有默认的评分矩阵
和默认的空隙罚分。 一般来说，分子学生物学家期望使用所选软件程序建立
的默认设置。
根据本发明的抗分泌蛋白、肽、或其具有抗分泌活性的同系物、衍生物 或片段可以具有4个或更多个氨基酸，例如具有5-16个氨基酸，6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20个氨基酸或更多。在其 他优选实施方式中，抗分泌因子由42、 43、 45、 46、 51、 80、 128、 129或 163个氨基酸组成。在优选实施方式中，抗分泌因子由5、 6、 7、 8或16个 氨基酸组成。
在另一个优选实施方式中，根据本发明的抗分泌蛋白、肽和/或其具有 抗分泌活性的同系物、衍生物或片段由根据下式的序列组成 XI-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5
其中XI是I、 SEQ ID NO 6的氨基酸1-35、或缺省，X2是H、 R或K， X3是S或L， X4是T或A， X5是SEQ ID NO 6的氨基酸43-46、 43-51、 43-80 或43-163、或缺省。
根据本发明的抗分泌因子可以体内产生或体外产生，例如通过重组产 生、化学合成、和/或从抗分泌因子的天然产生来源(如猪脑垂体或鸟卵) 分离。形成之后，可以对抗分泌因子作进一步处理，例如通过化学或酶解成 较小的抗分泌活性片断、或通过氨基酸改性作进一步处理。目前无法通过纯 化获得纯净形式的抗分泌因子。不过可以如W0 97/08202和W0 05/030246 中所述通过重组产生生物活性的抗分泌因子蛋白。W0 05/030246和W0 97/08202还揭示了这种蛋白的生物活性片断的产生。
根据本发明的抗分泌因子可以进一步包含N端和/或C端保护基团。N 端保护基团的一个例子包括乙酰基。C端保护基团的一个例子包括酰胺。
术语"药物学活性盐"指抗分泌蛋白的盐，其可以为基于所谓Hofmeiser系列的、由抗分泌蛋白衍生的任何盐。由于蛋白质和肽是两性的，因此，术 语"药物学可接受盐"作为例如三氟乙酸盐或乙酸盐进行贮存，该术语还指 根据本发明的抗分泌因子的更稳定形式，这并非是对本发明范围的限制。
本发明的药物合成物或药剂可以另外包含一种或多种药物学可接受载
体、接受体(recipient)或稀释剂，如本领域中已知的那些。
所述合成物或药剂可以为例如流体、半流体、半固体或固体合成物的形 式，例如但并不限于溶解的输液，例如灭菌盐水、各种盐溶液、葡萄糖溶液、 磷酸盐缓冲盐水、血液、血浆或水、粉末、微囊、微球体、纳米颗粒、喷雾 剂、气溶胶、吸入装置、溶液、分散体、悬浮体、乳剂、和它们的混合物。 所述合成物可以考虑肽或蛋白质的稳定性和反应性。
本发明的药物合成物可以根据传统制药实践进行配制，例如根据 "Remington- The science and practice of pharmacy", 第21版，ISBN 0_7817_4673-6或"Encyclopedia of pharmaceutical technology", 第2 版，Swarbrick J.编，ISBN: 0-8247-2152-7。
在本发明的一个优选实施方式中，抗分泌因子是具有如SEQ ID NO 6所 示氨基酸序列的抗分泌蛋白或其包含SEQ ID NO 6的氨基酸38-42的同系物、 衍生物和/或片断。
在本发明的一个优选实施方式中，抗分泌因子选自SEQ ID NO 6或是根 据SEQ ID NO 6的抗分泌蛋白的氨基酸序列(同样显示在图4中)，艮口 VCHSKTRSNPE丽GL (SEQIDNOl，在本申请文本中也称为AF-16)、 IVCHSKTR (SEQ ID NO 2)、 VCHSKTR (SEQ ID NO 3)、 CHSKTR (SEQ ID NO 4)、 HSKTR (SEQ ID NO 5)，这些序列中使用共同的单字母縮写表示氨基酸。在例如WO 05/030246中已经揭示了 SEQ ID NO 1、 2和3，在US 6344440中揭示了 SEQ ID NO 6。如所附序列表中指出的，可以用其他氨基酸代替以上列出的序列 中的一些氨基酸。在本段落的以下部分中，对特定氨基酸序列中的特定氨基 酸的位置进行计算，从左开始，将该特定序列中最靠近N端的氨基酸表示为 位置1。对于该序列中的任何其他氨基酸取代都可以独立地进行如下所示的 任何氨基酸取代。在SEQ ID NO 1中，位置2的C可以被S取代，位置3的 H可以被R或K取代，位置4的S可以被L取代，并且/或者位置6的T可以 被A取代。在SEQ ID NO 2中，位置3的C可以被S取代，位置4的H可以被R或K取代，位置5的S可以被L取代，并且/或者位置7的T可以被A 取代。在SEQ ID NO 3中，位置2的C可以被S取代，位置3的H可以被R 或K取代，位置4的S可以被L取代，并且/或者位置6的T可以被A取代。 在SEQ ID N0 4中，位置1的C可以被S取代，位置2的H可以被R或K取 代，位置3的S可以被L取代，并且/或者位置5的T可以被A取代。在SEQ ID NO 5中，位置l的H可以被R或K取代，位置2的S可以被L取代，并 且/或者位置4的T可以被A取代。
在本发明的一个优选实施方式中，所述片断包含如SEQ ID NO 1中所示 的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方式中，所述片断包含如SEQ ID NO 2中所示 的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方式中，所述片断包含如SEQ ID NO 3中所示 的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方式中，所述片断包含如SEQ ID NO 4中所示 的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方式中，所述片断包含如SEQ ID NO 5中所示 的氨基酸序列。
本发明还预期了根据本发明的任何抗分泌因子中的两种或更多种的组 合，任选还组合有富含有抗分泌因子的蛋黄。
在本发明的一个优选实施方式中，抗分泌因子用于制造一种药物合成 物，该合成物用于治疗和/或防止高眼压、或者该合成物用于治疗和/或防止 高眼压的方法中，其中，眼内压等于或大于21毫米汞柱，例如等于或大于 22毫米汞柱。在本发明的另一个优选实施方式中，眼内压为正常或甚至较低， 即小于21-24毫米汞柱，优选小于10-12毫米汞柱，例如为11-21毫米荥柱。 人们认为小于11毫米汞柱(如小于10毫米汞柱、小于10-12毫米荥柱)的 IOP低于正常值，即I0P较低。对于眼内压正常或甚至低于正常值的哺乳动 物，如果其眼内压在一天内具有峰值，则也可以给予根据本发明的药物合成 物，该合成物的有益效果是可以治疗和/或防止这种出现峰值的病症。在另 一个优选实施方式中，眼内压超过21毫米汞柱，例如为21-24毫米荥柱、 22-30毫米汞柱。本发明还预期了使用富含抗分泌因子的蛋黄来治疗和/或防止高眼压、
和/或来制备药物合成物的可能性。SE 9000028-2揭示了可以刺激在鸟的体 内形成抗分泌因子，然后通过蛋黄的消化回收或浓縮抗分泌因子。W0 00/38535进一步揭示了通过食物或词料、或者作为配制成药品的或多或少的 独立产品的形式给予动物或人这种回收或浓縮的抗分泌因子。因此，本发明 还预期了富含抗分泌因子的蛋黄对于制备产品(例如药物合成物)、对于治 疗和/或防止高眼压的应用，或者这种蛋黄在治疗方法中的应用。在一个优 选实施方式中，所述抗分泌蛋白以所述蛋黄中的至少1000FIL单位/毫升的 浓縮剂形式提供。在本申请文本中，FIL单位等于(相较于不提供抗分泌因 子的对照)肠液流的50%减少量，如W0 00/38535和SE 9000028-2中所揭示 的。因此，根据本发明的抗分泌因子也可以以"医疗食品"的形式给予。在 本申请文本中，"医疗食品"指用含有抗分泌蛋白的合成物制造的食品。所 述食品可以是任何合适的食品，为流体或固体形式，例如液体或粉末，或者 为任何其他合适的食品。这些物质的例子参见WO 00/38535。
在本发明的一个优选实施方式中，要治疗和/或防止的高眼压是由来自 眼前房的房水外流受到阻力引起的。
在另一个优选实施方式中，根据本发明使用的药物合成物，降低了来自 眼前房的房水通过小梁网和Schlemm管外流时的阻力。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明的药物合成物进一步包含药物 学可接受赋形剂。本领域技术人员通过试验可以轻易地确定药物学可接受赋 形剂的选择及其根据本发明使用的最佳浓度。根据本发明使用的药物学可接 受赋形剂包括溶剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、抗氧化剂、稳定剂、乳化剂、 悬浮剂和/或稀释剂。
药物学可接受赋形剂是对给予该合成物的个体基本无害的物质。这种赋 形剂通常满足国家药品管理署的要求。官方药典如美国药典和欧洲药典为众 所周知的药物学可接受赋形剂制定的标准。
以下是根据本发明使用的相关药物合成物的回顾。回顾的内容以特定给 药途径为基准。但是，应当理解，对于其中的药物学可接受赋形剂以不同剂 型或不同合成物的情况中，特定药物学可接受赋形剂的应用并不限于特定剂 型，也不限于特定的赋形剂功能。肠外合成物
对于全身性应用，根据本发明的合成物可以包含传统的非毒性药物学可 接受载体和赋形剂，包括微球体和脂质体。
根据本发明使用的合成物可以包括所有种类的固体、半固体和流体合成物。
药物学可接受赋形剂可以包括溶剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、抗氧化 剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂和/或稀释剂。以下给出具体试剂的例子。 各种试剂的例子
溶剂的例子包括但并不限于水、醇类、血液、血浆、脊髓液、腹水和淋 巴液。
缓冲剂的例子包括但并不限于柠檬酸、乙酸、酒石酸、乳酸、磷酸氢盐 (hydrogenphosphoric acid)、碳酸氢盐、磷酸盐、二乙胺等。 螯合剂的例子包括但并不限于EDTA钠和拧檬酸。
抗氧化剂的例子包括但并不限于丁基化的羟基苯甲醚(BHA)、抗坏血酸 及其衍生物、维生素E及其衍生物、半胱氨酸、以及它们的混合物。
稀释剂和崩解剂的例子包括但并不限于乳糖、蔗糖、EMDEX聚合糖、磷 酸钙、碳酸钙、硫酸钙、甘露醇、淀粉和微晶纤维素。
粘结剂的例子包括但并不限于蔗糖、山梨糖醇、金合欢胶、藻酸钠、明 胶、淀粉、纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯 基吡咯垸酮和聚乙二醇。
根据本发明使用的药物合成物或物质优选经由静脉内末梢注射或经由 肌肉内或皮下注射给药至病人体内，或者经由口腔、肺部、鼻、皮肤或口服 途径。而且，还可以通过外科插入病人脑室中的分流器给予药物合成物或药 物学活性物质。
在一个实施方式中，根据本发明的药物合成物是为眼内、鼻内、口服、 皮下和/或全身性给药而配制的。药物合成物可以每天给予一次或多次。在 本发明的一个优选实施方式中，针对作为喷雾剂、气溶胶通过喷雾器或吸入 器给药的目的配制药物合成物。在另一个优选实施方式中，本发明的合成物 作为悬浮体、或甚至更优选作为喷雾吸入粉末、气溶胶或鼻腔喷雾剂和/或 通过呼吸道给予。喷雾器是以气雾形式向气道递送液体药剂的医疗装置。喷雾压縮器迫使空气通过管道进入充满液体药剂的药剂杯。空气的压力使液体 分散成微小的气雾样颗粒，可以深深吸入气道中。在本申请文本中，术语"气 溶胶"指细小固体或液体颗粒的气相悬浮体。包含抗分泌因子的粉末形式药 物合成物在稳定性和剂型方面具有额外优势，并且干粉末可以用吸入器给 予。药物合成物还可以局部施用于眼、眼内、鼻内、口服、皮下和/或经由 血管全身性施用。在一个优选实施方式中，针对局部施用于眼的目的配制药 物组合物。通常，将本发明合成物局部施用于眼时，每天的施用浓度为每次
1微克至10毫克，例如每次1微克至1毫克，优选每天50-1000微克，例如 每天50-500微克、50-250微克、100-250微克、500-250微克、500-750微 克、或50-100微克，每天每只眼睛施用单剂量或重复多次施用。对血液进 行全身性给药时，其剂量通常为每次每千克体重每天0. 1微克至10毫克， 例如每次每千克体重每天0. 1微克至1毫克，优选每千克体重1-1000微克， 较优选每千克体重1-100微克，每天施用单剂量或重复多次施用。根据本发 明使用富含抗分泌因子的蛋黄时，优选口服给药。AF蛋白、肽、其片断和/ 或衍生物的重要特征是，即使在高剂量情况下，也不会发生局部或全身性副 作用，能够在不产生己知风险的情况下进行强效治疗。
本发明还涉及抗分泌蛋白、或其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/ 或片断、和/或其药物学可接受盐对于制造用于眼内给药的药物合成物的应 用。
本发明还涉及如SEQ ID NO 4中所示肽、其同系物、衍生物和/或片断 本身。本发明进一步涉及根据SEQ ID NO 4的肽的医疗应用。
本发明还涉及如SEQ ID NO 5中所示肽、其同系物、衍生物和/或片断 本身。本发明进一步涉及根据SEQ ID NO 5的肽的医疗应用。在相同申请人 的共同待审査申请中还揭示了这种肽对于制备用于治疗和/或防止间室综合 症的药物合成物的应用。
本发明还涉及用于治疗和/或防止哺乳动物高眼压的方法，所述方法包 括给予有效量的药物合成物，该合成物包含抗分泌蛋白、其具有抗分泌活性 的同系物、衍生物和/或片断、和/或其药物学可接受盐。用于这种方法的药 物合成物如上所述。
因此，本发明涉及用于治疗和/或防止哺乳动物高眼压的方法，所述方法包括给予有效量的药物合成物，该合成物包含抗分泌蛋白、其具有抗分泌 活性的同系物、衍生物和/或片断、和/或其药物学可接受盐。
在一个优选实施方式中，根据本发明的方法包括眼内给予所述药物合成物。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，所述药物合成物包含一种或
多种片断，该片断包含如SEQ ID NO l-6中所示的氨基酸序列。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，所述抗分泌蛋白由根据下式
的序列组成
XI-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5
其中XI是I、 SEQ ID NO 6的氨基酸1-35、或缺省，X2是H、 R或K， X3是S或L， X4是T或A， X5是SEQ ID NO 6的氨基酸43-46、 43-51、 43-80 或43-163、或缺省。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，抗分泌蛋白是具有如SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的蛋白、或其包含SEQ ID NO 6的氨基酸38-42的同 系物、衍生物和/或片断。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，所述抗分泌蛋白的片断包含 如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸序列。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，所述抗分泌蛋白的片断包含 如SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，所述抗分泌蛋白的片断包含 如SEQ ID NO 3中所示的氨基酸序列。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，所述抗分泌蛋白的片断包含 如SEQ ID NO 4中所示的氨基酸序列。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，所述抗分泌蛋白的片断包含 如SEQ ID NO 5中所示的氨基酸序列。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，所述药物合成物包含任何根 据本发明的抗分泌因子中的两种或更多种，任选还组合有富含抗分泌因子的 蛋黄。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，哺乳动物的眼内压等于或大 于21毫米汞柱。在根据本发明方法的一个优选实施方式中，眼内压为正常或低于正常值。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，抗分泌蛋白以富含这种抗分 泌蛋白的蛋黄提供，所述蛋黄中提供的所述抗分泌蛋白的浓度优选至少为
1000FIL单位/毫升。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，高眼压由来自眼前房的房水 外流受到阻力引起。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，药物合成物降低了来自眼前 房的房水通过小梁网和Schlemm管外流的阻力。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，药物合成物进一步包含药物 学可接受赋形剂。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，药物合成物针对眼内、鼻内、 口服、皮下和/或全身性给药的目的配制。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，药物合成物针对喷雾剂、气 溶胶，和/或通过喷雾器或吸入器给药的目的配制。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，药物合成物向血液全身性给 予的剂量为每次每千克体重每天0. 1微克至10毫克，优选为每次每千克体 重1-IOOO微克。AF蛋白、肽、其片断和/或衍生物的重要特征是，甚至在大 剂量情况下也不会产生局部或全身性副作用，能够在没有已知风险的情况下 进行强效治疗。
在根据本发明方法的一个同样优选的实施方式中，药物合成物向血液全 身性给予的剂量为每次每千克体重每天0. 1微克至10毫克，例如每次每千 克体重每天0. 1微克至1毫克，优选为每次每千克体重1-100微克。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，药物合成物针对眼的局部给 药目的配制。
在根据本发明方法的一个优选实施方式中，局部性给予药物合成物的剂 量为每次每天1微克至10毫克，优选为50-1000微克。
在根据本发明方法的一个同样优选的实施方式中，给予药物合成物的剂 量为每次每千克体重每天0. 1微克至10毫克，例如剂量为每次每天1微克 至1毫克，优选为50-250微克。在根据本发明方法的一个优选实施方式中，每天给予药物合成物一次或 多次。
具体实施例方式
本发明优选实施方式 实施例1
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对年轻成年兔(New Zealand White, NZW)的昼夜节律进行调节。从而了解 IOP动态，正常兔的IOP在黑暗期开始时增大。在眼球和Tenon囊之间单侧 沉积10-50微克AF-16 (SEQ ID NO 1)(溶解在PBS中，添加10%或50%乙醇)， 导致麻醉兔的IOP在2小时内瞬时降低2. 5毫米汞柱，该值借助TonoPen (Medtronic Inc. ， Minneapolis丽，USA)测得。静脉内注射染料荧光素 (Sigma-Aldrich， Inc., St. Louis, M0， USA;钠盐，溶解在PBS中)，用 手术显微镜(配备有裂隙灯装置)确定示踪剂的出现。在经过AF-16处理的 眼和只用载剂处理的对照眼之间，对于染料荧光素出现的时间没有差别。重 复所述过程，证明了相同的结果。用更高剂量(100微克)的AF-16获得类 似的IOP降低效果。因此得出以下结论AF-16处理显然不能明显影响AH 的产生，事实是，对于分别经过AF-16处理和载剂处理的眼，证明所用示踪 剂荧光素几乎同时出现。 实施例2
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9颜期间进行光照， 对年轻成年NZW兔的昼夜节律进行调节。从而了解I0P动态。在两只麻醉兔 的眼球和Tenon囊之间临时性地通过注射单侧沉积10-50微克AF-16 (溶解 在50或100微升PBS中，添加10%或50%乙醇)，导致I0P在2小时内降低 约2. 5毫米汞柱，该值借助TonoPer^测得。然后通过睫状体扁平部在两兔眼 中注射20或50微升含有3% Evans蓝(Merck， Sigma)和2%牛血清蛋白(Sigma) 的PBS溶液，注射位置在眼后房和玻璃体之间的边界处。用眼科缝线封闭注 射位置以防止回流和漏出。观察到蓝色染料进入眼前房并通过巩膜上静脉离 开眼，在经过AF-16预先处理的眼中的速度大于在只经过载剂预先处理的对照眼中的速度。第二天再次重复该试验，得到相同结果。因此，由通过虹膜
角膜角进入Schlemm管及其连接静脉的白蛋白-染料-络合物发现，施用肽 AF-16似乎促进了 AH的外流。 实施例3
根据角膜缘周的(perilimbal)吸杯技术(一种确立和再三公开的方法) 确定麻醉成年兔的AH流动和外流阻力。可以采用其他方法确定这些参数。 从而获得关于AF-16对AH动态、以及正常动物和试验性升高了 IOP的动物 的IOP动态的影响的定量值和定性值。对于患有先天性高眼压的动物，也获 得这些定量值和定性值。
实施例4
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对年轻成年NZW兔的昼夜节律进行调节。因此，在黑暗期的前几个小时内， IOP升高若干毫米汞柱。在麻醉兔Tenon囊下方单侧注射50-250微升最高为 100微克的AF-16 (溶解在PBS中，添加10%乙醇)，导致I0P在1小时内显 著降低，降低值最多为5毫米汞柱(相较于对照眼的IOP，对照眼只沉积了 载剂(PBS和10%乙醇))。用AF-16处理之后，IOP的降低持续了至少4个小 时，然后与第二天测得的对照眼的值相等。连续三天对三只兔子进行重复试 验，都获得这些结果。得出以下结论AF-16能使正常眼的IOP有效降低几 个毫米汞柱，这种效果与目的，对于能够降低IOP的其他所报道过的药物获 得的效果相当。
实施例5
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对年轻成年NZW兔的昼夜节律进行调节。从而了解IOP的昼夜动态。在麻醉 兔的结膜下穹(cul-de-sac)以2分钟间隔两次单侧沉积25微克AF-16 (共 50微克，溶解在25微升磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)，导致I0P在1小时后 降低1. 5-2. 5毫米汞柱(相较于对照眼的IOP，对照眼只沉积了载剂PBS)。 用AF-16处理之后，10P的降低持续了至少4个小时，然后与第二天测得的 对照眼的值相等。连续两天对两只兔子进行重复试验，都获得这些结果。得 出以下结论在盲管(cul-de-sac)局部沉积AF-16能使正常兔的IOP瞬时降 低。实施例6
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对年轻成年NZW兔的昼夜节律进行调节。从而了解IOP的昼夜动态。在麻醉 兔的下部盲管(cul-de-sac)(结膜下穹)以2分钟间隔两次单侧沉积50微 克AF-16 (共100微克，溶解在50微升PBS中)，导致I0P在1小时后降低 2-4毫米汞柱(相较于对照眼的IOP，对照眼只沉积了载剂)。用AF-16处理 之后，10P的降低持续了至少4个小时，然后与第二天测得的对照眼的值相 等。连续三天对两只兔子进行重复试验，都获得这些结果。得出以下结论 用为实施例5中所述剂量两倍的AF-16局部处理正常眼同样能瞬时降低IOP， 不会产生明显的局部或全身性副作用。
实施例7
由Visionar AB， Uppsala, Sweden代表本申请人进行的本实验的目标 是研究用AF-16局部处理之后，兔眼IOP的动态，并将获得的效果与使用 药物Timolol (2.5毫克/毫升；Alcon Sweden AB， Stockholm, Sweden, 已知其能降低高眼压)的效果、使用载剂PBS的效果进行比较。购买20只 白化(Albino)雌性NZW兔(体重2. 1-2.4千克)，单笼喂养，随意进食(Kl， Lactamin， Stockholm, Sweden)和饮水。通过从9 AM至9 PM期间进行光 照，调节日间循环。在长达3周的适应期间，每天都在对兔子角膜施行局部 麻醉之后测量I0P的试验条件下对兔子进行训练。
将兔子随机分成两组
组l (n=10)。这些兔子的一只眼中施用两滴AF-16 (共50微克，在50 微升PBS中)，在对照眼中施用相同体积、2X25微升的载剂PBS。
组2 (n=10)。这些兔子的一只眼中施用一滴Timolol (50微升；125 微克)，在另一只眼中施用相同体积的PBS。己知Timolol⑧能降低兔的眼内 压，从而作为参比用来校验模型。对各角膜施用一滴Tetrakain Chauvin (Novartis 0phthalmics， Taby， Sweden)施行局部麻醉之后利用TonoPen XL (Medtronic)测量IOP。在最终确定的程序中，安排计划了这样的两个 系列测量。 一个系列是用AF-16和载剂进行局部处理5天之后，另一个系列 是用Timolol⑧或载剂进行局部处理之后。
在第一天的测量中，预计在第五次和第六次测量时能观察到Timolol 的IOP降低效果，因为估计IOP会因为昼夜循环而升高。在延长期内(兔笼 开始黑暗期之后1、 2、 3.25、 4.25、 5.5、 6.5、 7.75、 9和10小时)进行 最后一天的IOP测量，以确定能够在延长期内获得数据。结果列于附图3中。 5天处理时期开始时的I0P如图2中所示。在用AF-16进行处理时，没有观 察到局部或全身性的副作用或并发症。
由数据可知，AF-16对I0P有降低效果，与只用载剂PBS处理之后测得 的IOP明显不同。AF-16产生的明显效果与Timolo^产生的效果相当(图3)。 得出以下结论这些数据显示AF-16在降低兔的IOP方面与己知具有这种效 果的常用药(Timolol )同样有效。因此，AF-16可能适用于治疗人高眼压。
实施例8
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对两只年轻正常成年NZW兔(2.4-2.9千克，雌性)的昼夜节律进行调节。 从而了解I0P的昼夜动态。在麻醉兔的盲管下部(结膜下穹)以2分钟间隔 两次单侧沉积50或100微克合成六肽CHSKTR (共100-200微克，每次都在 50微升PBS中)，导致IOP在1小时后降低2-3毫米汞柱(相较于对照眼的 IOP，对照眼只沉积了载剂)。用六肽处理之后，10P的降低持续了至少2个 小时，然后与第二天测得的对照眼的值相等。对两只兔子进行的试验都获得 这些结果。得出以下结论用合成肽(沉积在下部泪囊，具有SEQ ID NO 6 的抗分泌蛋白的部分活性序列CHSKTR (SEQ ID NO 4))局部处理正常眼能降 低I0P。
实施例9
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对两只正常年轻成年NZW兔(2.4-2.9千克，雌性)的昼夜节律进行调节。 从而了解IOP的昼夜动态。在麻醉兔Tenon囊下的颞区位置单侧注射50或 100微克合成六肽CHSKTR (溶解在100微升PBS中，含有10%乙醇)，导致 IOP在30分钟后降低2-4毫米汞柱(相较于对照眼的IOP，对照眼只类似地 沉积了载剂)。用六肽处理之后，10P的降低持续了至少2个小时。两只兔的 IOP与第二天测得的对照眼的值相等。在之后的两天进行的试验都获得这些 结果。得出以下结论在眼球外部注射试验物质(合成肽，具有SEQIDN0 6 的抗分泌蛋白的部分活性序列CHSKTR (SEQ ID NO 4))局部处理正常眼能降低I0P，而不会引发任何局部或全身性的副作用。 实施例10
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对年轻成年NZW兔的昼夜节律进行调节。从而了解IOP的昼夜动态。对麻醉 兔静脉内注射AF-16 (剂量水平为每千克体重50或100或1000微克，溶解 在PBS中，添加有10%乙醇)，导致任一眼的IOP在1小时后降低2-3毫米汞 柱(相较于注射AF-16之前测得的I0P)。用AF-16处理之后，IOP的降低持 续了至少2个小时。这些兔子的左眼和右眼的IOP之间没有明显区别。第二 天对任一眼再次测量IOP，测得的值回到接近于前一天进行AF-16处理之前 的值的水平。没有观察到明显的副作用。得出以下结论经过验证，以每千 克体重50、 100或(更有效的)1000微克的剂量静脉内注射AF-16导致1 个小时后IOP降低，并且持续几个小时， 一天时间后IOP回到先前水平。 经过处理的兔子的两只眼睛都显示了相同的AF降低IOP的动态效果。结论 是静脉内(即全身性地)给予肽AF-16能够以可接受的程度有效降低IOP， 而不至于引起异常的低IOP。
实施例11
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对年轻成年NZW兔的昼夜节律进行调节。从而了解IOP的昼夜动态。对三只 麻醉兔鼻内沉积AF-16 (剂量水平为每千克体重50或100或1000微克，溶 解在PBS中)，导致任一眼的IOP在1小时后降低至少2毫米汞柱(相较于 在鼻孔中沉积AF-16之前测得的IOP)。用高剂量AF-16处理之后，IOP的降 低持续了 2和3个小时(进行研究的期间)。同一兔子的左眼和右眼的IOP 之间没有明显区别。第二天对任一眼再次测量IOP，证明测得的值回到接近 于前一天进行AF-16处理之前的值的水平。没有观察到明显的副作用。得出 以下结论经过验证，以每千克体重高达1000微克的剂量鼻内注射AF-16 导致1个小时后IOP降低，并且持续至少3个小时， 一天时间后IOP回到 先前水平。每只兔子的每只眼睛都显示了相同的眼内压动态效果。没有观察 到局部或全身性的副作用。
实施例12
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9細期间进行光照，对年轻成年NZW兔的昼夜节律进行调节。从而了解IOP的昼夜动态。在一般 麻醉的兔的胃中沉积10克富含AF-蛋白的冻干蛋黄(Salovum ，溶解在稀 释的市售橘汁中)。这样胃内沉积AF蛋白导致任一眼的IOP在1小时后发生 降低(相较于沉积Salovum 之前测得的IOP)。兔子的左眼和右眼的I0P之 间没有区别。第二天对任一眼再次测量IOP，测得的值回到接近于前一天进 行AF-16处理之前的值的水平。没有明显观察到可能存在的副作用。得出以 下结论经过验证，口服摄入富含抗分泌蛋白的蛋黄(例如Salovum )导 致约1个小时后IOP降低，并且持续几个小时， 一天时间后IOP回到先前水 平。两只眼睛都显示了相同的IOP动态效果。 实施例13
麻醉一只单侧轻微牛眼病(左眼球肿大)的年轻成年NZW兔，借助 TonoPei^眼压计测量IOP。重复测得，患有牛眼病的眼的IOP为30-32毫米 汞柱，而正常对照眼为11-12毫米汞柱。在麻醉兔的Tenon囊下部临时性地 单侧注射50微克AF-16 (在100微升PBS中，含有10%乙醇)，导致I0P在1 小时内降低14-16毫米汞柱。向对照眼注射相同量AF-16导致仅降低约2毫 米汞柱(用TonoPei^测得)。左侧患有牛眼病的眼的I0P在第二天增加到略 高于30毫米汞柱，即回到其初始水平。再次注射AF-16导致2小时后IOP 再次降至15-16毫米荥柱，而相同剂量的AF-16仅使右眼IOP降低1-2毫米 汞柱。没有观察到负面反应。因此得出以下结论在患有牛眼病的眼中通过 在眼球处注射进行局部沉积能够瞬时降低高眼内压值至正常水平。
实施例14
通过从9 AM至9 PM期间暴露于黑暗中、从9 PM至9 AM期间进行光照， 对年轻成年NZW兔的昼夜节律进行调节。使IOP的动态与IOP的昼夜变化同 步。如科学医疗国际期刊的近期出版物中所述(KraveU， Ho jer S & Hansson H.A.， European J Neuroscience， 21， 2867-2882， 2005)，目前的研究已 经揭示，使这些兔子接触弧矢光旋转加速脉冲会伤害眼睛还会导致弥漫性脑 损伤。使麻醉兔的头部接触强度高达200krad/s2的、从眼前房到眼后房或从 眼后房到眼前房的弧矢光旋转加速脉冲导致对眼睛施加机械变形和作用力 负荷。在以后的30分钟期间，麻醉兔的IOP增大至35-40毫米汞柱(用 TonoPen⑧眼压计测得)并保持该升高水平长达几个小时。在Tenon囊和眼颞区巩膜之间通过注射AF-16溶液(100微升PBS，含有10%乙醇)以每千克体 重100微克的剂量沉积AF-16,在进行弧矢光旋转加速冲击10-30分钟之后， l个小时之内，IOP大致回到正常水平。对照眼(没有接受任何AF-16处理) 的I0P保持升高的水平。
使兔子接触这种弧矢光旋转加速脉冲导致例如神经细胞和血管细胞发 生广泛的细胞骨架变化(Hamberger等，2003)。以前使猪脑接触高能负荷的 试验也证明了相同的情况(Suneson等，1990)。因此得出以下结论旋转加 速伤害引起小梁网和Schlemm管中细胞的膜和细胞骨架发生变化，导致对来 自眼前房的AH的外流产生瞬时削弱影响，使I0P瞬时升高。用肽AF-16进 行局部处理似乎能改善这种升高的IOP。
实施例15
单侧切除鼠的4条巩膜上静脉中的3条。这样，来自手术眼前房部分的 静脉血只能通过一条静脉流出。这种处理会在几周内导致手术眼的IOP升高。 用AF-16的PBS溶液对IOP升高的眼进行局部处理和/或全身性处理，确定 这种用AF-16进行的处理是否能使IOP正常化。由这些结果可以计算AH形 成速率以及外流性质，从而可以使AF-16的作用位置定位于AH流过眼睛的 路径中。
实施例16
在其他鼠的颞区巩膜上静脉中注射高渗盐水，瞬时切断其他3条巩膜上 静脉中的血流。这种处理会在几周内导致经过处理的眼的IOP升高，依据 Morrison等人在文献中已经描述了的情况。用AF-16的PBS溶液对IOP升高 的眼进行局部和/或全身性处理，以确定这种用AF-16进行的处理是否使IOP 正常化。由这些结果可以计算AH的形成速率和外流性质，从而可以使AF-16 的作用位置定位于AH流过眼睛的路径中。
实施例17
培养一些高眼压发病率较高的啮齿类动物，其中一些是转基因的。评价 局部和/或全身性施用AF-16对IOP的效果。由这些结果可以计算AH的形成 速率和外流性质，从而可以使AF-16的作用位置定位于AH流过眼睛的路径 中。通过使用这些动物进行的试验建立评价以治疗高眼压为目的的药物的标 准方法。总结和结论
所述实验以不同程度揭示用抗分泌因子进行处理可以使哺乳动物眼睛 的升高的眼内压降低并且甚至正常化。这显示了包含抗分泌因子、蛋白、肽、 同系物和片段的实用药物在控制高眼压病人的升高的IOP的医疗实践中的应
用。通过实验揭示抗分泌因子AF-16能有效地使I0P升高的眼的眼压正常 化。AF-16的主要效果通过其促进房水外流的能力而产生。因此得出以下结 论已经揭示AF-16能够通过促进AH流过小梁网和Schlemm管中的细胞而 使高眼压降低并正常化。参考文献
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18. WO 05/030246
19. WO 97/08202 20: WO 98/21978 21. US 6344440
权利要求
1. 抗分泌蛋白，其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/或片段，和/或其药物学可接受盐，对于制造用于防止和/或治疗高眼压的药物合成物的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其所述抗分泌蛋白由根据下式的序列组成XI-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5其中，X1是I、 SEQ ID N0 6的氨基酸1-35、或缺省，X2是H、 R或K， X3是S或L， X4是T或A， X5是SEQIDN0 6的氨基酸43-46、 43-51、 43-80 或43-163、或缺省。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗分泌蛋白是具有如 SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的蛋白质、其包含SEQ ID NO 6的氨基酸38_42 的同系物、衍生物和/或片段。
4. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述片段包含如SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列。
5. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述片段包含如SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列。
6. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述片段包含如SEQ ID NO 3中所示氨基酸序列。
7. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述片段包含如SEQ ID NO 4中所示氨基酸序列。
8. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述片段包含如SEQ ID NO 5中所示氨基酸序列。
9. 如以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述药物合成物 包含如权利要求1-8中所述片段中的两种或更多种。
10. 如权利要求l-9中所述的应用，其特征在于，所述眼内压等于或大 于22毫米汞柱。
11. 如权利要求l-9中所述的应用，其特征在于，所述眼内压为22-30毫米汞柱。
12. 如权利要求l-9中所述的应用，其特征在于，所述眼内压力为正常 或较低。
13. 如权利要求1-12中所述的应用，其特征在于，所述抗分泌蛋白在 富含这种抗分泌蛋白的蛋黄中提供，在所述蛋黄中提供的所述抗分泌蛋白的 浓度优选至少为1000FIL单位/毫升。
14. 如以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述高眼压由来 自眼前房的房水外流受到阻力引起。
15. 如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述药物合成物降低了 来自眼前房的房水外流通过小梁网和Schlemm管时的阻力。
16. 如以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述不正常的眼 内压由眼中房水的形成受到扰动而引起。
17. 如以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述药物合成物 进一步包含药物学可接受的赋形剂。
18. 如以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述药物合成物 针对局部、眼内、鼻内、口服、皮下、经皮、粘膜和/或全身性给药的目的 配制。
19. 如以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述药物合成物 针对作为喷雾、气溶胶通过喷雾器或通过吸入器给药的目的配制。
20. 如权利要求1-19中所述的应用，其特征在于，所述药物合成物全 身性给药至血液的剂量为每次每千克体重每天0. 1微克至10毫克，优选为 1-1000微克。
21. 如权利要求1-20中所述的应用，其药物合成物针对局部给药至眼 睛的目的配制。
22. 如权利要求21所述的应用，其药物合成物给药剂量为每次每天1 微克至10毫克，优选为50-1000微克。
23. 如以上任一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述药物合成物 每天一次或多次给药。
24. 抗分泌蛋白，其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/或片段，和/ 或其药物学可接受盐，对于制造用于眼内给药的药物合成物的应用。
25. 如SEQ ID NO 4中所示的肽或其同系物、衍生物和/或片段。
26. 如权利要求25所述的肽的医疗应用。
27. 如SEQ ID NO 5中所示的肽或其同系物、衍生物和/或片段。
28. 如权利要求27所述的肽的医疗应用。
全文摘要
本发明涉及抗分泌因子(如抗分泌蛋白，其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/或片断)对于制造用于治疗和/或防止高眼压的药物合成物的应用。因此，本发明涉及包含抗分泌因子的药物合成物对于治疗和/或防止高眼压的应用，这种应用的优选特征是，导致眼内压升高的体液外流受到抑制。本发明提供了用于治疗和/或防止这种病症、调节眼内压至可接受水平(任选等于或小于21毫米汞柱)的新颖途径。
文档编号A61K38/17GK101432013SQ200780014996
公开日2009年5月13日 申请日期2007年4月27日 优先权日2006年4月27日
发明者埃娃·延尼斯歇, 斯特凡·朗厄, 汉斯阿尔内·汉松 申请人:兰特门内阿斯-法克托尔公司