缀合疫苗的制作方法

专利名称：：缀合疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及改进的肺炎链球菌(&re;tococcz^/wewmo"/a)疫苗。
背景技术：
：不到2岁的儿童对大多数多糖疫苗不产生免疫应答，所以一直以来必须通过与蛋白栽体进行化学缀合使多糖成为免疫原性的。将作为非T细胞依赖性抗原的多糖与作为T细胞依赖性抗原的蛋白偶联赋予多糖T细胞依赖性特性，所述特性包括同种型转换、亲和力成熟和记忆诱导。然而，重复给予多糖-蛋白缀合物或将多糖-蛋白缀合物联合成多价疫苗可能有问题。例如，已有报道指出在一定剂量范围内测试了使用破伤风类毒素(TT)作为蛋白载体的乙型流感嗜血杆菌(//aewo;/2//^/"y/we"加e)多糖(PRP)疫苗，该疫苗与(游离的)TT和肺炎链球菌多糖-TT缀合疫苗按照标准婴儿免疫程序同时免疫。当肺炎链球菌疫苗的剂量增加时，对Hib缀合疫苗的PRP多糖部分的免疫应答降低，这表明很可能通过使用相同载体蛋白引起了多糖免疫干扰(Dagan等，InfectImmun,(1998);敏2093-2098)。已证实载体-蛋白剂量对针对蛋白自身的体液免疫应答的影响是多方面的。据报道在人类婴儿中增加四价破伤风类毒素缀合物的剂量导致对破伤风载体的应答下降(Dagan等，出处同上)。对于联合疫苗的这些效应的经典分析一直纟皮描述为载体诱导的表位抑制，这一点还没有完全弄清楚，但一般认为是由过量的载体蛋白引起的(Fattom,vaccine12:126(1999))。这似乎导致针对载体蛋白的B细胞和针对多糖的B细胞竟争Th细胞。如果针对载体蛋白的B细胞占优势，则没有足够的Th细胞可用于为多糖特异性B细胞提供必需的辅助。然而，观察到的免疫效果一直不一致，载体蛋白的总量在某些情况下增加免疫应答，在另一些情况下降低免疫应答。因此，将多种多糖缀合物组合成单一的、有效的疫苗制剂仍有技术难度。肺炎链球菌为革兰氏阳性细菌，可导致相当高的发病率和死亡率(尤其是对年纪小的人和上年纪的人)，引起诸如肺炎、菌血症和脑膜炎等侵袭性疾病以及与建群相关的疾病，如急性中耳炎。在美国，60岁以上的人患有肺炎链球菌性肺炎的比例估计为十万分之3-8。其在20%的病例中会引发菌血症和例如脑膜炎的其它情况，即便采用抗生素治疗死亡率也4妄近30%。肺炎链球菌被化学连接的多糖包裹，所述多糖赋予血清型特异性。有90种公知的肺炎链球菌血清型，荚膜是肺炎链球菌毒力的主要决定因素，因为荚膜不但保护细菌内表面不受补体影响，而且其本身是弱免疫原性的。多糖是非T细胞依赖性抗原，不能被加工或呈递到MHC分子上，从而不能与T细胞相互作用。但它们能通过一种涉及B细胞表面受体交联的替代机制来刺激免疫系统。一些实验表明，对侵袭性肺炎链球菌疾病的防护作用与荚膜特异性抗体的相关非常强，且该防护作用是血清型特异性的。肺炎链球菌是婴儿和儿童侵袭性细菌疾病和中耳炎的最常见致病因素。同样，老年人对肺炎链球菌疫苗的应答较弱[Roghmann等,(1987),J.Gerontol.42:265-270]，因此，在该人群中细菌性肺炎的发病率升高[Verghese和Berk,(1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]。肺炎链球菌引起的主要临床症状是公知的，并在所有的标准医学教科书中有论述(FedsonDS,MuscherDM.载于PlotkinSA,OrensteinWA编辑，Vaccines.第4版.PhiladelphiaWBSaundersCo,2004a:529-588)。例如，侵入性肺炎链球菌疾病(IPD)被定义为由血液或另一个正常情况下无菌的部位分离出肺炎链球菌的任何感染(MusherDM.14Streptococcuspneumoniae.InMandellGL,BennettJE,DolinR(编辑).PrinciplesandPracticeofInfectiousdiseases(第5片反).NewYork,ChurchillLivingstone,2001,2128-2147页)。慢性阻塞性肺病(COPD)被认为包括几种经常共存的病症(气流阻塞、慢性支气管炎、支气管炎或小气道病变和肺气肿)。患者遭受常与增加的呼吸困难相关的病症恶化，并经常出现咳嗽增多，该咳嗽可产生粘液或含脓的痰(Wilson,EurRespirJ200117:995-1007)。COPD在生理学上被定义为在患有慢性支气管炎和/或肺气肿的患者中存在不可逆的或部分可逆的气道阻塞(Standardsforthediagnosisandcareofpatientswithchronicobstructivepulmonarydiseases.AmericanThoracicSociety.AmJRespirCritCareMed.1995年11月；152(5Pt2):S77-121)。COPD的恶化经常由细菌(例如肺炎链球菌)感染引起(SethiS,MurphyTF,Bacterialinfectioninchronicobstructivepulmonarydiseasesin2000:astate-of-the-artreview.ClinMicrobiolRev.2001年4月；14(2):336-63)。尽管含有血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖的市售疫苗Prevnar，所述糖均缀合载体蛋白CRM197(—种无毒的白喉毒素变体)的，但几乎不知道有关该疫苗的生产方法或其糖的特征。已知O-或N-乙酰基在针对多种抗原性糖的保护性表位的形成中是重要的取代基。一般无法预测乙酰基团的存在对表位是有益还是有害。因此，本发明的目的是开发一种改进的多种血清型肺炎链球菌多糖缀合疫苗的制剂，具体地说，本发明的目的是开发一种具有有益的乙酰化特征的疫苗。具体地说，本发明人已惊奇地发现，血清型18C的荚膜糖的脱-O-乙酰化可有利于将免疫应答集中于骨架表位，这可能有利于提升抗高度O-乙酰化的18C菌林和O-乙酰化较差的18C菌林这二者的保护性免疫应答。附图简述图1:来自用SP1008或Prevnar免疫的小鼠的混合血清的ELISA15抑制。图2:来自用SP1008或含有PS18-DTAH或PS18-TTAH缀合物的实验制剂免疫的小鼠的混合血清的ELISA抑制。图3:来自用SP1008或含有PS18-DTAH或PS18-TTAH缀合物的实验制剂免疫的小鼠的混合血清的调理吞噬抑制。图4:来自用SP1008或Prevnar免疫的豚鼠的混合血清的ELISA抑制。图5:来自用SP1008或含有PS18-DTah或PS18-TTah綴合物的实验制剂免疫的豚鼠的混合血清的ELISA抑制。图6:来自用SP1008或含有PS18-DTAH或PS18-TTAH缀合物的实验制剂免疫的豚鼠的混合血清的调理吞噬抑制。图7:来自用SP1008和Prevnar免疫的11PnPD&Di007婴儿的混合血清的抑制作用。发明描述因此，在本发明的一个实施方案中，提供含有不同肺炎链球菌血清型的9种以上、IO种以上、11种以上或13种以上缀合载体蛋白的荚膜糖的肺炎链球菌免疫原性组合物，其中所述组合物包含0-乙酰化程度低于80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%或10%的缀合荚膜糖18C。。/oC)-或N-乙酰化意指给定糖样品乙酰化的相对于100%(其中每个重复单元就其乙酰化结构而言被完全乙酰化)的百分率。为易于参考，以下给出了多种糖重复单元的结构。PS1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>CH;。H可通过本领域已知的众多方法对糖进行脱-O-乙酰化。可通过本领域已知的多种方法;险测乙酰化；例如可以使用NMR。一方面，荚膜糖18C在其缀合前通过用酸处理进行脱-O-乙酰化。例如，用1M乙酸于60。C处理40小时(参见WO96/05859的实施例4)产生18C糖，依据NMR，约17%的该糖被O-乙酰化。于100。C类似处理5-6小时产生30-50%的O-乙酰化18C。来自乙酰化18C菌4木的天然18C倾向于被高度0-乙酰化(>90%)。在一个实施方案中，本发明的18C糖缀合破伤风类毒素(TT),任选地，其中18C为唯一缀合TT的肺炎链球菌荚膜糖。不同肺炎链球菌血清型的荚膜糖可以缀合2种以上不同的载体蛋白。在一个实施方案中，18C未缀合肺炎球菌溶血素。在另一个实施方案中，18C未缀合CRM197。本发明的18C荚膜糖可以通过许多已知方法(参见下文)缀合。在一个实施方案中，其不通过还原胺化化学法缀合，在又一个实施方案中，其通过还原胺化化学法缀合(参见下文)。通常，本发明的肺炎链球菌免疫原性组合物(或疫苗)含有荚膜糖抗原(优选缀合的)，其中所述糖衍生自至少9种或至少10种肺炎链球菌血清型。肺炎链球菌荚膜糖的数量可在9种或IO种不同血清型(或21"V"，价)至23种不同血清型(23V)的范围内。在一个实施方案中，有9、10、11、13或15种不同血清型。在本发明的另一个实施方案中，疫苗可含有缀合的肺炎链球菌糖和未缀合的肺炎链球菌糖。优选地，糖血清型的总数少于或等于23。例如，本发明可包含10种缀合的血清型和13种未缀合的糖。以类似的方式，疫苗可含有13种或16种缀合的糖，并相应地含有10种或7种未缀合的糖。在一个实施方案中，本发明的多价肺炎链球菌疫苗选自以下血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F,但要认识到的是，根据接受疫苗的接受者的年龄和将给予疫苗的地理位置，可以替换1种或2种其它血清型。例如，IO价疫苗可含有血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11价疫苗还可以包含血清型3的荚膜糖。12价或13价儿科(嬰儿)疫苗还可以包含血清型6A和19A、或6A和22F、或19A和22F、或6A和15B、或19A和15B、或22F和15B(分别针对10或11价制剂)，而13价老年疫苗可以包含血清型8和12F、或8和15B、或8和19A、或8和22F、或12F和15B、或12F和19A、或12F和22F、或15B和19A、或15B和22F(针对ll价制剂)。14价儿科疫苗可包括补加血清型3、6A、19A和22F;血清型6A、8、19A和22F;血清型6A、12F、19A和22F;血清型6A、15B、19A和22F;血清型3、8、19A和22F;血清型3、12F、19A和22F;血清型3、15B、19A和22F;血清型3、6A、8和22F;血清型3、6A、12F和22F;或血清型3、6A、15B和22F的上述10价制剂。在一个实施方案中，组合物包含衍生自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖(优选缀合的)。在本发明的又一个实施方案中，包含至少11种糖抗原(优选缀合的)，例如衍生自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖。在本发明的又一个实施方案中，包含至少12种或13种糖抗原，例如疫苗可22含有衍生自血清型l、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜糖，或者衍生自血清型l、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的荚膜糖，然而本发明还考虑到其它糖抗原，例如23价糖抗原(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。在一个实施方案中，在存在血清型4的荚膜糖的情况下，其N-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。在一个实施方案中，在存在血清型9V的荚膜糖的情况下，其N-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%和/或O-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。在一个实施方案中，在存在血清型14的荚膜糖的情况下，其N-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。在一个实施方案中，在存在血清型1的荚膜糖的情况下，其N-乙酰化程度超过500/。、60%、70%、80%、90%和/或O-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。在一个实施方案中，在存在血清型5的荚膜糖的情况下，其N-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。在一个实施方案中，在存在血清型7F的荚膜糖的情况下，其N-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%和/或O-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。在一个实施方案中，在存在血清型4的荚膜糖的情况下，在一个实施方案中，在存在血清型4的荚膜糖的情况下，本发明的疫苗可含有流感嗜血杆菌的D蛋白(PD)(参见例如EP0594610)，尤其是衍生自非分型流感嗜血杆菌(ntHi)的D蛋白。ntHi是中耳炎的关键致病生物，本发明人已表明，将该蛋白纳入肺炎链球菌疫苗中将提供针对流感嗜血杆菌相关性中耳炎的一定水平的保护(Prymula等,2006TheLancet367:740-748)。在一个实施方案中，疫苗组合物含有D蛋白。一方面，PD作为一种或多种糖的载体蛋白存在。另一方面，D蛋白可作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。又一方面，D蛋白作为载体蛋白和游离蛋白这二者存在。D蛋白可作为全长蛋白或作为片段使用(W00056360)。又一方面，D蛋白作为大部分糖的载体蛋白存在，例如6、7、8、9种以上的糖可与D蛋白缀合。在该方面，D蛋白也可作为游离蛋白存在。本发明的疫苗可含有2种以上的不同类型的载体蛋白。每类载体蛋白均可用作多于1种的糖的载体，所述糖可相同或不同。糖可以在同一反应中缀合同一载体，或者可以单独地缀合同一载体蛋白。例如，血清型3和4可缀合相同载体蛋白，或者缀合同一载体蛋白分子，或者缀合相同载体蛋白的不同分子。在一个实施方案中，2种以上的不同的糖可与相同载体蛋白缀合，或者缀合同一载体蛋白分子，或者缀合相同载体蛋白的不同分子。每种/任何肺炎链球菌荚膜糖都可独立地与选自以下的载体蛋白缀合TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtDE融合蛋白(尤其是在WO01/98334和WO03/54007中描述的那些)、解毒的肺炎链球菌溶血素和D蛋白。一方面，血清型19F的荚膜糖可以缀合DT或CRM197,优选DT。以下提供了可用于本发明缀合物的蛋白载体的更完整清单。本发明的免疫原性组合物中存在的缀合物中，与一种或多种肺炎链球菌荚膜糖缀合的载体蛋白任选为聚组氨酸三联体家族(Pht)蛋白成员、其片段或融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或Phffi蛋白可具有与WO00/37105或WO00/39299中公开的序歹^(例如与WO00/37105中关于PhtD的SEQIDNO:4的氨基酸序列1-838或21-838)共享80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。例如，融合蛋白由PhtA、PhtB、PhtD、PhtE中的2、3或4种的全长或片段组成。融合蛋白的实例为PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中所述蛋白在N末端与所提及的第一个连接(参见例如WO01/98334)。在使用Pht蛋白片段(独立的或作为融合蛋白的一部分)时，每个片段任选地含有一个或多个组氨酸三联体基序和/或这些多肽的巻曲24螺旋区。组氨酸三联体基序是多肽的一部分，具有序列HxxHxH，其中H为组氨酸，x为非组氨酸的氨基酸。巻曲螺旋区是通过"Coils"算法预测的区域(Lupus,A等，(1991)Science252;1162-1164)。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有一个或多个组氨酸三联体基序以及至少一个巻曲螺旋区。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有恰好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序(任选地，在所述2个或多个三联体之间具有天然Pht序列，或者具有三联体内序列，该三联体内序列与天然肺炎链球菌三联体内Pht序列一例如示于WO00/37105针对PhtD的SEQIDNO:4的三联体内序列的同一性超过50%、60%、70%、80%、90%或100%)。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有恰好或至少2、3或4个巻曲螺旋区。在一个实施方案中，本文公开的Pht蛋白包括连接信号序列的全长蛋白、除去信号肽(例如在N-末端的20个氨基酸)的成熟全长蛋白、Pht蛋白的天然变体和Pht蛋白的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WO00/37105或WO00/39299的氨基酸序列中至少15个或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够激发对WO00/37105或WOOO/39299中所述氨基酸序列的特异性免疫应答)。具体地说，本文使用的术语"PhtD"包括连接信号序列的全长蛋白、除去信号肽(例如在N-末端的20个氨基酸)的成熟全长蛋白、PhtD的天然变体和PhtD的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WOOO/37105或WOOO/39299的PhtD氨基酸序列中至少15个或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够激发对WOOO/37105或WO00/39299中所述PhtD^J^酸序列(例如WO00/37105中针对PhtD的SEQIDNO:4)的特异性免疫应答)。如果用于组合物中2种以上的糖的蛋白载体相同，则该糖可与所述蛋白载体的同一分子缀合(载体分子具有2个以上与其缀合的不同的糖)[参见例如WO04/083251]。或者，所述糖可各自独立地缀合所述蛋白载体的不同分子(每个蛋白载体分子均仅具有1类与其缀合的糖)。可用于本发明的载体蛋白的实例为DT(白喉类毒素)；TT(破伤风类毒素)或TT的C片段；DTCRM197(DT突变体)，其它DT点突变，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等，J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107以及由Nicholls和Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Frankel纟扁丰專，MaecelDekkerInc,1992中描述的其它突变；Glu-148缺失或突变为Asp、Gin或Ser，和/或Ala158缺失或突变为Gly，以及在US4709017或US4950740中公开的其它突变；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中至少一个或多个残基的突变，以及在US5917017或US6455673中公开的其它突变；或者在US5843711中公开的片段；肺炎链球菌性肺炎链球菌溶血素[Ply](Kuo等，(1995)InfectImmun63;2706-13)，包括以某些方式解毒的ply,例如以化学方式dPLY-GMBS(WO04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-曱醛；或遗传突变为较低毒性(利用例如本领域所知的突变)，PhtX,包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE以及Pht蛋白的融合体，例如PhtDE融合体、PhtBE融合体(WO01/98334和WO03/54007)(PhtA-E详述于下文)；OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常由脑膜炎奈瑟氏球菌(iV.wem"g/"afe)血清群B提取-EP0372501);PorB(得自脑膜炎奈瑟氏球菌)；PD(流感嗜血杆菌D蛋白-参见例如EP0594610B)或其免疫学功能等同物；合成肽(EP03788S1、EP0427347);热激蛋白(WO93/17712、WO94/03208);百日咳蛋白(WO98/58668、EP0471177);细胞因子；淋巴因子；生长因子或激素(WO91/01146);含有来自多种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等，(2001)EurJImmunol31;3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等，(2004)InfectImmun72;48S4-7);肺炎链球菌表面蛋白PspA(WO02/091998);铁吸收蛋白(WO01/72337);艰难梭菌(C4^"7e)的毒素A或B(WO00/61761)。Nurkka等，/W/aWc/"/ec"'owsD/seaseJowma/.23(77」..2004年11月描述了所有血清型均缀合PD的ll价肺炎链球菌疫苗。26然而，本发明人已表明，相比于缀合PD的19F,对于用具有缀合DT的19F的缀合物诱导的抗体的调理吞噬活性有改善。另外，本发明人已表明，用缀合DT的19F观察到对19A的更大交叉反应性。因此，本发明组合物的特征在于血清型19F与DT或CRM197缀合。一方面，血清型19F与DT缀合。余下的免疫原性组合物糖血清型可全部与一种或多种不是DT的载体蛋白缀合(即仅有19F缀合DT)，或者可以在一种或多种不是DT或CRM197的载体蛋白之间和DT或CRM197自身之间分摊。在一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，所有余下的血清型缀合PD。在又一个实施方案中，19F缀合DT或CRM197,余下的血清型在PD和TT或DT或CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，不多于1种(或2或3种)糖缀合TT。在该实施方案的一方面，所述1种(或2种)糖为18C或12F。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，不多于2种糖与TT缀合。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT和DT或CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT和肺炎链球菌溶血素之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT和CRM197之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在PD、TT、肺炎链球菌溶血素和任选的PhtD之间分摊。在本发明的又一方面，18C荚膜糖缀合TT[任选地具有1种或2种缀合TT的其它糖]，余下的血清型在PD、DT(或CRM197)、肺炎球菌溶血素和任选的PhtD之间分摊。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有来自流感嗜血杆菌的D蛋白。在该实施方案中，如果PD不是用于缀合任何糖的载体蛋白中的一种，则PD可在疫苗组合物中作为游离蛋白存在。如果PD是用于缀合本发明组合物中的糖的载体蛋白中的一种，则PD可任选地作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。27术语"糖"在整个本说明书中可表示多糖或寡糖，并包括这二者。多糖分离自细菌，并可以通过已知方法(参见例如EP497524和EP497525;Szu等，CarbohydrateResearch,152巻，7-20页(1986))调整尺寸至某种程度并优选通过微流化调整尺寸。可对多糖调整尺寸，以便降低多糖样品的粘度和/或改善缀合产物的过滤性。寡糖具有少量重复单元(通常5-30个重复单元)，并通常为水解的多糖。肺炎链球菌的荚膜多糖包含可含有至多8个糖残基的重复寡糖单元。关于关键肺炎链球菌血清型的寡糖单元的综述，参见JONES,Christopher.Vaccinebasedonthecellsurfacecarbohydratesofpathogenicbacteria.爿/i爿cad5ra义O&c.,2005年6月,第77巻,第2册，293-324页，ISSN0001-3765。在一个实施方案中，荚膜糖抗原可为天然或全长多糖(即由肺炎链球菌制备的多糖，未经任何尺寸调整或水解步骤)，但是在其它实施方案中其可为一个或几个重复单元(寡糖)，或者为比重复单元的天然长度的多糖或寡糖链短的。在一个实施方案中，疫苗中存在的所有糖都是多糖。全长多糖可^皮"调整尺寸"，即它们的尺寸可通过多种方法减小，例如酸水解处理；过氧化氢处理；通过emulsiflex⑧调整尺寸，然后过氧化氢处理，以产生寡糖片段；或者微流化。本发明人还已注意到，本技术的核心是使用易于生产缀合物的寡糖。本发明人已发现，通过使用天然的或稍微调整尺寸的多糖缀合物，可实现一个或多个以下优势l)具有高免疫原性的可过滤的缀合物，2)可改变缀合物中多糖对蛋白的比率，因而可增加缀合物中多糖对蛋白的比率(重量/重量)(其可对载体抑制作用有影响)，3)倾向于水解的免疫原性缀合物可通过使用较大的糖进行缀合来稳定。使用较大的多糖可导致与缀合物载体更多的交联，并可以减少由缀合物释放游离的糖。在先有技术中描述的缀合疫苗倾向于在缀合前解聚多糖，以便改善缀合。本发明人已发现，保留较大的糖尺寸的糖缀合疫苗可提供抵御肺炎链球菌疾病的良好免疫应答。本发明的免疫原性组合物因此可以包含一种或多种糖缀合物，其中在缀合前每种糖的平均尺寸(例如，重均分子量；Mw)在80xl03、100《103、200><103、300><103、400><103、500><103或lOOOxlO3(例如80xl03至100(^103;90><103至500><103;10(^103至40(^103;20(^103至300><103)以上。在一个实施方案中，本发明的一种或多种糖缀合物应具有的缀合前糖的平均大小为50-1600、80-1400、100-1000、150-500或200-400kDa(注意，在平均大小为Mw时，'kDa，单位在此应当用'x103，替代)。在一个实施方案中，缀合后的缀合物应可易于通过0.2(im滤器过滤，使得与过滤前样品相比在过滤后获得50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的收率。就本发明而言，"天然的多糖"是指未经处理(例如纯化后)的糖，该处理的目的是减小糖的尺寸。在常规纯化工艺中多糖的尺寸可被轻微降低。这样的糖仍是天然的。只要多糖经过调整尺寸的技术的处理，就不认为该多糖是天然的。就本发明而言，"以约x2的因数调整尺寸"是指对糖进行处理，以减小糖尺寸，但仍保留超过天然多糖尺寸的一半的尺寸。x3、x4等等以相同的方式解释，即对糖进行处理，以减小多糖的尺寸，但仍保留天然多糖尺寸的1/3、1/4等等以上的尺寸。在本发明的一方面，免疫原性组合物包含至少9种或10种血清型的缀合载体蛋白的肺炎链球菌糖，其中至少l、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或每种肺炎链球菌糖为天然多糖。在本发明的一方面，免疫原性组合物包含来自至少9种或10种血清型的缀合载体蛋白的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、lO种或每种肺炎链球菌糖-波以至多x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因数调整尺寸。在该方面的一个实施方案中，大部分糖，例如以至多x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因数对6、7、8种以上的糖调整尺寸。糖的分子量或平均分子量(或大小)在本文是指在缀合前检测的糖的重均分子量(Mw)，通过MALLS来检测。MALLS技术在本领域众所周知(如在实施例2中所述)。就肺炎链球菌糖的MALLS分析而言，可组合使用两种柱子(TSKG6000和5000PWxl),并用水洗脱糖。用光散射检测器(例如配有10mW488nm氩激光器的WyattDawnDSP)和干涉仪折射计(例如装备P100光电元件和498nm红色滤光片的WyattOtilabDSP)检测糖。在一个实施方案中，肺炎链球菌糖为天然多糖，或者为在常规提取步骤中己经减小了尺寸的天然多糖。在一个实施方案中，通过机械裂解，例如通过微流化或超声，调整肺炎链球菌糖的尺寸。微流化和超声具有充分减小较大天然多糖大小从而足以提供可过滤缀合物的优点。尺寸调整以不超过x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因数进行。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌缀合物，该缀合物由天然多糖和以不超过x20的因数调整尺寸的糖的混合物制备。在该实施方案的一个方面，大部分糖，例如6、7、8种或更多种糖以至多x2、x3、x4、x5或x6的因数调整尺寸。在一个实施方案中，肺炎链球菌糖通过接头例如双功能接头与载体蛋白缀合。任选地，接头为异双功能或同双功能接头，具有例如1个反应性氨基和1个反应性羧基、2个反应性氨基或者2个反应性羧基。例如，接头具有4-20、4-12、5-10个碳原子。可能的接头是ADH。其它接头包括B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever等,(1979)Med.Microbiol.Immunol.165;171-288)、卣代烷基囟化物(US4057685)、糖苷键(US4673574、US4808700)、己烷二胺和6-#J^己酸(US4459286)。在一个实施方案中，ADH用作缀合血清型18C的糖的接头。在本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可用任何己知的偶联技术制备。缀合方法可依赖于用l-氰基-4-二曱基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化糖而形成氰酸酯。由此，活化的糖可直接或经由间隔臂(接头)基团偶联至载体蛋白上的氨基。例如，间隔臂可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多糖，所述硫醇化多糖可经由与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用GMBS)或卣乙酰载体蛋白(例如使用碘乙酰亚胺[例如乙基碘乙酰亚胺HC1]或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸盐或SIAB、或SIA、或SBAP)反应后所获得的硫醚键与载体偶联。优选地，氰酸酯(任选地以CDAP化学法制备)可与己二胺或ADH偶联，并采用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学法经蛋白载体上的羧基使氨基衍生化的糖与载体蛋白缀合。这样的缀合物描述于PCT公开申请WO93/15760(UniformedServicesUniversity)以及WO95/08348和WO96/29094。其它的合适技术使用碳二亚胺、酰肼、活化酯、降水片烷、对硝基苯曱酸、N-轻基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多所述技术都描述于WO98/42721。缀合可涉及羰基接头，其可如下形成糖的游离羟基先与CDI反应(Bethell等，丄Biol.Chem.1979,254;2572-4,Hearn等，J.Chromatogr.1981.218;509-18)，再与蛋白反应，形成氨基曱酸酯键。该过程可涉及异头末端还原成伯羟基，任选地，涉及伯羟基与CDI的伯羟基反应的保护/去保护，以形成CDI氨基甲酸酯中间体，并将CDI氨基曱酸酯中间体与蛋白的氨基偶联。缀合物也可通过如US4365170(Jennings)、US4673574(Anderson)和WO96/05859所述的直接还原胺化法制备。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。进一步的方法涉及通过碳二亚胺缩合(ChuC.等，Infect.Immunity,1983245256)，例如使用EDAC，将溴化氰(或CDAP)活化的、被己二酰肼(ADH)衍生化的糖与蛋白载体偶联。在一个实施方案中，糖上的羟基(优选活化的羟基，例如被活化以制备氰酸酯的羟基(例如使用CDAP))直接或间接(通过接头)与蛋白的氨基或羧基连接。当存在接头时，糖上的羟基优选地与接头上的氨基连接，例如通过使用CDAP缀合。接头如ADH中的其余氨基可缀合蛋白上的羧酸基团，例如通过使用碳二亚胺化学，例如通过使用EDAC。在一个实施方案中，肺炎链球菌荚膜糖在接头与载体蛋白缀合之前先与接头缀合。或者，接头可在与糖缀合之前与载体缀合。还可以使用技术组合，一些糖-蛋白缀合物通过CDAP制备，一些通过还原胺化法制备。通常，蛋白载体上可用于偶^/缀合的化学基团的类型如下A)羧基(例如经由天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的氨基连接，或者用碳二亚胺化学法(例如用EDAC)与接头上的氨基连接。B)氨基(例如经由赖氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接与糖上的羧基连接，或者用碳二亚胺化学法(例如用EDAC)与接头上的羧基连接。在另一个实施方案中，该基团直接与糖上用CDAP或CNBr活化的羟基连接，或者与接头上的这些基团连接；与具有醛基的糖或接头连接；与具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头连接。C)巯基(例如经由半胱氨酸)。在一个实施方案中，该基团与溴乙酰糖或氯乙酰糖连接，或者用马来酰亚胺化学法与接头连接。在一个实施方案中，该基团用双重氮联苯胺活化/改性。D)羟基(例如经由酪氨酸)。在一个实施方案中，该基团用双重氮联苯胺活化/改性。E)咪唑基(例如经由组氨酸)。在一个实施方案中，该基团用双重氮联苯胺活化/改性。F)胍基(例如经由精氨酸)。G)吲哚基(例如经由色氨酸)。在糖上，能够用于偶联的通常是以下基团OH、COOH或NH2。醛基能够在本领域已知的不同处理后产生，所述处理例如高碘酸盐、酸水解、过氧化氢等。直接偶联法糖-OH+CNBr或CDAP-——>氰酸酯+NH2-Prot——〉缀合物32糖-醛+NH2-Prot——>席夫碱+NaCNBH3——>缀合物糖國COOH+NH2-Prot+EDAC-—>缀合物糖画NH2+COOH-Prot+EDAC——>缀合物通过间隔臂(接头)间接偶联的方法糖-OH+CNBr或CDAP—>氰酸酯+NH2——NH2——〉糖——NH2+COOH-Prot+EDAC——〉缀合物糖-OH+CNBr或CDAP——〉氰酸酯+NH2-國—國SH誦——〉糖——SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通过例如SPDP将蛋白的氨基改性后获得的天然蛋白)—一>糖-S-S-Prot糖画OH+CNBr或CDAP誦隱画〉氰酸酯+NH2——SH------->糖——SH+马来酰亚胺-Prot(氛基的改性物)-->缀合物糖-OH+CNBr或CDAP—〉氰酸酯+NH2-——SH—〉糖-SH+卣代乙酰胺-Prot——>缀合物糖-COOH+EDAC+NH2國-誦誦-NH2-—〉糖——NH2+EDAC+COOH-Prot——>缀合物糖-COOH+EDAC+NH2——SH-——>糖——SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通过例如SPDP将蛋白的M改性后获得的天然蛋白)—一〉糖-S-S-Prot糖-COOH+EDAC+NH2——SH-——>糖——SH+马来酰亚胺-Prot(氨基的改性物)--〉缀合物糖-COOH+EDAC+NH2——SH—〉糖-SH+卤代乙酰胺-Prot——〉缀合物糖國醛+NH2-誦陽隱國NH2陽—〉糖——NH2+EDAC+COOH-Prot—■隱>缀合物注意除了以上的EDAC，还可以使用任何合适的-灰二亚胺。总之，通常可以用于与糖偶合的蛋白载体化学基团的类型是氨基(例如赖氨酸残基上的)、COOH基团(例如天冬氨酸和谷氨酸残基上的)和SH基团(如果能够获得的话)(例如半胱氨酸残基上的)。优选地，载体蛋白对肺炎链球菌糖的比率在1:5至5:1(重量/重量)之间；例如在1:0.5-4:1、1:1-3.5:1、1.2:l國3:1、1.5:1-2.5:1(重量/重量)之间；例如在1:2-2.5:1、1:1-2:1(重量/重量)之间。在一个实施方案中，大部分缀合物，例如6、7、8、9种或更多种缀合物，具有大于1:1的载体蛋白对糖的比率，例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1,5:1或1.6:1。在一个实施方案中，使用CDAP和EDAC使至少一种肺炎链球菌糖经接头(例如ADH)与栽体蛋白缀合。例如，可使用如上所述的CDAP和EDAC使18C经接头(例如在其末端具有两个肼基的那些接头，例如ADH)与蛋白缀合。在使用接头时，CDAP可用于使糖与接头缀合，然后可使用EDAC使接头与蛋白缀合，或者可首先使用EDAC使接头与蛋白缀合，此后可使用CDAP使接头与糖缀合。通常，本发明的免疫原性组合物可含有的每种糖缀合物的剂量在0.1-20|Lig、l-10iiig或l画3pg净唐之间。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有剂量为0.1-20jxg、0.5-10吗、0.5-5叫或1-3iug糖的每种肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方案中，荚膜糖可以不同剂量存在，例如某些荚膜糖可以恰好1吗的剂量存在，或者某些荚膜糖可以恰好3(ig的剂量存在。在一个实施方案中，血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)的糖以高于其它糖的剂量存在。在该实施方案的一个方面，血清型3、18C和19F(或4、18C和19F)以近似或恰好3jig的剂量存在，而本发明的免疫原性组合物中的其它糖以近似或恰好1pg的剂量存在。"约"或"近似"就本发明而言被定义为在给定值的10%左右。在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白直接缀合(例如使用上述化学法中的一种)；优选地，至少一种肺炎链球菌荚膜糖通过CDAP直接缀合。在一个实施方案中，大部分荚膜糖，例如5、6、7、8、9种或更多种，通过CDAP与载体蛋白直接连接(参见WO95/08348和WO96/29094)。免疫原性组合物可包含肺炎链球菌蛋白，本文称为本发明的肺炎链球菌蛋白。这些蛋白可用作载体蛋白，或者可作为游离蛋白存在，或者可作为载体蛋白和游离蛋白这二者存在。本发明的肺炎链球菌蛋白或者至少在肺炎链球菌部分生命周期当中为表面暴露的，或者为由肺炎链球菌分泌或释放的蛋白。优选地，本发明的蛋白选自以下类别，例如具有LXXC的II型信号序列基序的蛋白(其中X为任何氨基酸，例如聚组氨酸三联体家族(PhtX))、胆碱结合蛋白(CbpX)、具有I型信号序列基序的蛋白(例如Spl01)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X为任何氨基酸，例如Spl28、Spl30)和毒素(例如Ply)。这些类别(或基序)中的优选实例为以下蛋白或其免疫学功能等效物。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种蛋白，所述蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Sp133。在又一个实施方案中，免疫原性组合物含有2种或多种蛋白，所述蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在又一个实施方案中，免疫原性组合物含有2种或多种蛋白，所述蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)、肺炎链球菌溶血素(Ply)和Spl28。Pht(聚组氨酸三联体)家族包括蛋白质PhtA、PhtB、PhtD和Phffi。该家族具有以下特征脂质化序列；由脯氨酸富集区和几个组氨酸三联体分隔开的两个结构域，可能涉及金属或核苷的结合或酶活性；(3-5)巻曲螺旋区；保守的N-末端和异源的C-末端。它存在于已检验的所有肺炎链球菌菌抹中。还已在其它链球菌和奈瑟氏球菌属中发现同源蛋白。在本发明的一个实施方案中，本发明的Pht蛋白为PhtD。然而，要理解的是，术语PhtA、B、D和E是指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白，以及其天然(和人工制备的)变体，所述变体与参比蛋白具有至少90%相同的序列同源性。优选地为至少95%相同，最优选97%相同。对于PhtX蛋白而言，PhtA在WO98/18930中公开，也称作Sp36。如上所述，其是来自聚组氨酸三联体家族的蛋白，并具有II型信号基序LXXC。PhtD在WO00/37105中公开，也称为Sp036D。如上所述，它也是来自聚组氨酸三联体家族的蛋白，并具有II型LXXC信号基序。PhtB在WO00/37105中公开，也称为Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解多肽，在WO00/17370中公开。该蛋白也来自聚组氨酸三聚体家族，并具有II型LXXC信号基序。优选的免疫功能等效物为在WO98/18930中公开的蛋白Sp42。PhtB截短物(约79kD)在WO99/15675中公开，它也被认为是PhtX家族成员。Ph伍在WO00/30299中公开，称作BVH-3。当本文提到任何Pht蛋白时，意味着可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提到的PhtX包括来自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。提到PhtD或PhtB也就提到了可见于例如WO0198334的PhtDE或PhtBE。肺炎链球菌溶血素是一种具有独特的溶细胞(溶血)作用和补体活化活性的多功能毒素(Rubins等，Am.Respi.CitCareMed,153:1339-1346(1996))。该毒素不由肺炎链球菌分泌，而是在肺炎链球菌于自溶素影响下裂解时释放。其作用包括例如刺激人体单核细胞产生炎性细胞因子，抑制人体呼吸上皮纤毛颤动，降低嗜中性粒细胞的杀菌活性和迁移性。肺炎链球菌溶血素最明显的作用在于红细胞裂解方面，该作用涉及与胆固醇结合。因为肺炎链球菌溶血素是一种毒素，因此在其可以体内给药前必须解毒(即以适于保护的剂量提供时对人无毒)。在本领域已知野生型或天然肺炎链球菌溶血素的表达和克隆。36参见例如Walker等(InfectImmun,55:1184-1189(1987))，Mitchell等(BiochimBiophysActa,1007:67-72(1989)和Mitchell等(NAR,18:4010(1990))。ply的解毒可以用化学方法进行，例如进行福尔马林或戊二醛处理或二者的组合(WO04081515,PCT/EP2005/010258)。这些方法在本领域众所周知用于多种毒素。或者，ply可以用基因方法解毒。因此，本发明包括肺炎链球菌蛋白衍生物，该衍生物可为例如突变蛋白。术语"突变的"在本文用于指已使用公知的定点诱变技术或任何其它常规方法缺失、增加或取代一个或多个氨基酸的分子。例如，如上所述，突变型ply蛋白可以被改变，以使其生物失活，但仍保持其致免疫表位，参见例如WO90/06951,Berry等，(InfectImmun,67:981-985(1999))和WO99/03884。要理解的是，此处所用的术语"Ply"是指适于医用(即无毒的)的突变或解毒的肺炎链球菌溶血素。关于胆碱结合蛋白家族(CbpX)，该家族的成员最初被鉴定为能用胆碱亲和层析纯化的肺炎链球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白都非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。虽然该蛋白质的确切性质(氨基酸序列、长度等)可以不同，但整个家族具有数个在结构上相同的区域。一般来说，胆碱结合蛋白包含N末端区(N)、保守重复区(R1和/或R2)、脯氨酸富集区(P)和保守的胆碱结合区(C)，该胆碱结合区由多个重复序列组成，约占该蛋白的一半。本申请中所用的术语"胆碱结合蛋白家族(CbpX)"选自W097/41151中所鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开于W097/41151,CbpD和CbpG公开于W000/29434,PspC公开于WO97/09994,PbcA公开于W098/21337。SpsA为WO98/39450中公开的胆石咸结合蛋白。优选地，胆^5威结合蛋白选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。另一个优选实施方案为CbpX截短物，其中"CbpX"在上文定义，"截短物"是指缺少50y。以上的胆碱结合区(C)的CbpX蛋白。优选地，这样的蛋白质缺少整个胆碱结合区。更优选地，这样的蛋白截短物缺少(i)胆碱结合区和(ii)该蛋白质的N末端一半的一部分，但保留至少一个重复区(R1或R2)。再更优选地，该截短物具有两个重复区(R1和R2)。这些优选实施方案的实例是在W099/51266或W099/51188中举例说明的NRlxR2和RlxR2，但是，其它没有相似的胆碱结合区的胆碱结合蛋白也包含在本发明的范围内。LytX家族是与细胞裂解有关的膜结合蛋白。N末端结构域包含胆碱结合域，但是，LytX家族并不具有在上述CbpA家族中发现的所有特征，因此，对于本发明来说，LytX家族被认为不同于CbpX家族。与CbpX家族相比，C末端结构域包含LytX蛋白家族的催化域。该家族包含LytA、B和C。对于LytX家族而言，LytA公开于Ronda等，EurJBiochem,164:621-624(1987)。LytB公开于WO98/18930，也被称为Sp46。LytC也公开于WO98/18930,还被称为Sp91。该家族的优选成员为LytC。另一个优选实施方案为LytX截短物，其中"LytX，，在上文定义，"截短物"是指缺少50%以上胆碱结合区的LytX蛋白。优选地，这样的蛋白质缺少整个胆碱结合区。本发明的又一个优选实施方案为CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合体)。优选地，该蛋白包含CbpX的NRlxR2(或RlxR2)和LytX的C末端部分(Cterm,即缺少胆碱结合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更优选地，CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。再更优选地，其为CbpA。优选地，Lytx为LytC(也^f皮称为Sp91)。本发明的另一个实施方案为PspA或PsaA截短物，其缺少胆碱结合域(C)，并与LytX—起表达为融合蛋白。优选地，LytX为LytC。PsaA和PspA这二者在本领域都是已知的。例如，Berry和Paton,InfectImmun1996年12月；64(12):5255-62已描述了PsaA和其跨膜缺失变体。例如US5804193、WO92/14488和WO99/53940公开了PspA和其跨膜缺失变体。38Spl28和Spl30公开于WO00/76540。Spl25是带有细胞壁锚定基序LPXTG(其中X为任何氨基酸)的肺炎链球菌表面蛋白的实例。具有此基序的这类肺炎链球菌表面蛋白中的任何蛋白在本发明范围内都已被发现是有用的，因此将其视为本发明的另一种蛋白。Spl25本身公开于WO98/18930，也称为ZmpB—锌金属蛋白酶。Spl01公开于WO98/06734(其中它的索引为#y85993)。其特征为I型信号序歹'〗。Spl33公开于WO98/06734(其中它的索引为存y85992)。其也以I型信号序列为特征。莫拉卡他菌(Morajce〃a0^厅/20//力蛋白抗原的实例为OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)];OMP21或其片段(WO0018910);LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)];TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)];CopB[HelminenME等，(1993)Infect.Immun.61:2003-2010];UspAl和/或UspA2[WO93/03761(德克萨斯大学)];OmpCD(EP737085);HasR(PCT/EP99/03824);PilQ(PCT/EP99/03823);OMP85(PCT/EP00/01468);lipo06(GB9917977.2);lipo10(GB9918208.1);lipoll(GB9918302.2);lipo18(GB9918038.2);P6(PCT/EP99/03Q38);D15(PCT/EP99/03822);OmplAl(PCT/EP99/06781);Hly3(PCT/EP99/03257);和OmpE。可包含在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎的联合疫苗)中的非分型流感嗜血杆菌抗原或其片段的实例包括丝束蛋白[(US5766608-俄亥俄州研究基金会)]和含有来自其的肽的融合体[例如LBl(f)肽融合体；US5843464(OSU)或WO99/64067];OMP26[WO97/01638(Cortecs)];P6[EP281673(纽约州立大学)];TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl;Hmw2;Hmw3;Hmw4;Hap;D15(WO94/12641);P2;和P5(WO94/26304)。本发明的蛋白也可以进行有益的组合。所述"组合"是指免疫原性组合物包含来自以下组合中的所有蛋白，其或者为载体蛋白，或者为游离蛋白，或者为二者的混合物。例如，在后文陈述的两种蛋白的组合中，两种蛋白都可以用作载体蛋白，或者两种蛋白都可以作为游离蛋白存在，或者两种蛋白都可以作为载体和游离蛋白存在，或者一个可作为载体蛋白和游离蛋白存在，而另一个仅作为载体蛋白或仅作为游离蛋白存在，或者一个作为载体蛋白存在，另一个作为游离蛋白存在。当给出3种蛋白的组合时，存在类似的可能性。优选的组合包括但不限于PhtD+NRlxR2、PhtD+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Spl28、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、PhtA+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NRlxR2+LytC、函xR2+PspA、NRlxR2+PsaA、顧xR2+Sp128、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Spl28、RlxR2+PhtD、RlxR2+PhtA。优选地，NRlxR2(或RlxR2)来自CbpA或PspC。更优选地，其来自CbpA。其它组合包括3种蛋白组合，例如PhtD+NRlxR2+Ply以及PhtA+NRlxR2+PhtD。在一个实施方案中，疫苗组合物包含作为载体蛋白的解毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE。在又一个实施方案中，疫苗组合物包含作为游离蛋白的解毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE。本发明还提供含有本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的H武形剂的疫苗。本发明的疫苗可被佐剂化，尤其是在计划用于老年人群时。适宜的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶(铝佐剂)或^^酸铝，而且可以为钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可为酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混悬液。优选选择佐剂为TH1型应答的优先诱导物。这些高水平的Thl型细胞因子倾向于支持诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而Thl和Th2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上，个体将支持被描述为以Thl为主或以Th2为主的免疫应答。然而，经常便利地根据Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT细胞克隆中所描述的(Mosmann,T.R.和Coffman,R丄.(1989)THlandTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties.(AnnualReviewofImmunology,7,145-173页)考虑细胞因子家族。传统上，Thl型应答与T淋巴细胞产生INF-y和IL-2细胞因子有关。经常与Thl型免疫应答的诱导直接相关的其它细胞因子不由T细胞产生，例如IL-12。相比之下，Th2型应答与Il-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。促进Thl为主的应答的适宜佐剂系统包括单力粦酰脂质A或其衍生物(或通常为解毒的脂质A-参见例如WO2005107798),尤其是3-脱-0-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)(关于其制备参见GB2220211A);以及单磷酰脂质A、优选3-脱-0-酰化单磷酰脂质A连同铝盐(例如磷酸铝或氬氧化铝)或水包油乳剂的组合。在这些组合中，抗原和3D-MPL包含在同一颗粒结构中，允许更有效地传递抗原性和免疫刺激性信号。研究表明，3D-MPL能够进一步增强铝吸附抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-Bl]。增强的系统包括单磷酰脂质A(或解毒的脂质A)和^苷衍生物的组合，尤其是如在WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者如在WO96/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。在WO95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，其包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL(或解毒的脂质A)和生育酚。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外含有皂苷，其可为QS21。制剂还可以包含水包油乳剂和生育酚(WO95/17210)。含有寡核苷酸的未曱基化CpG(WO96/02555)和其它免疫调谐寡核苷酸(W00226757和WO03507822)也是TH1应答的优先诱导物，适用于本发明。具体的佐剂选自金属盐、水包油乳剂、Toll样受体激动剂(尤其是Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)、41皂苷或其组合。可用于本发明的疫苗组合物的佐剂为革兰氏阴性细菌菌抹的小泡或外膜嚢泡制备物，例如由WO02/09746教导的那些一尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌小泡。小泡的佐剂特性可通过在其表面上保留LOS(脂多糖)(例如通过用低浓度去污剂[例如0-0.1%脱氧胆酸盐]提取)而改善。LOS可通过WO02/09746所论述的msbB(-)或htrB(-)突变解毒。佐剂特性还可以通过保留脑膜炎球菌小泡的PorB(并任选地除去PorA)而改善。佐剂特性还可以通过截短脑膜炎^^菌小泡上的LOS的外核心的糖结构而改"i一例如经由WO2004/014417所论述的lgtB(-)突变。或者，前述LOS(例如分离自msbB(-)和/或lgtB(-)菌抹)可被纯化并用作本发明组合物中的佐剂。可用于本发明组合物的其它佐剂可选自皂苷、脂质A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳剂或其组合。其它优选佐剂为与另一种佐剂组合的金属盐。优选佐剂为Toll样受体激动剂，尤其是Toll样受体2、3、4、7、8或9的激动剂，或皂苷，尤其是Qs21。还优选佐剂系统包括以上列出的两种或多种佐剂。具体而言，组合优选包含皂苷(尤其是Qs21)佐剂和/或Toll样受体9激动剂，例如含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它优选组合包含皂苷(尤其是QS21)和Toll样受体4激动剂，例如单磷酰脂质A或其3脱酰衍生物3D-MPL，或急普(尤其是QS21)和Toll样受体4配体，例如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。特别优选的佐剂为3D-MPL和QS21的组合(EP0671948Bl)、含有3D-MPL和QS21的水包油乳剂(WO95/17210、WO98/56414)或者与其它载体一起配制的3D-MPL(EP0689Bl)。其它优选的佐剂系统包含如在US6558670、US6544518中描述的3DMPL、QS21和CpG寡核香酸的组合。在一个实施方案中，佐剂为(或包含)Toll样受体(TLR)4配体，优选地为激动剂，例如脂质A衍生物，尤其是单;粦酰脂质A，或者更具体地说为3脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL可得自北美葛兰素史克生物制品公司(GlaxoSm池KlineBiologicalsNorthAmerica),主要促进具有IFN-g(Thl)表型的CD4+T细胞反应。其可依据GB2220211A中公开的方法生产。在化学上，3D-MPL是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。优选地，在本发明的组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒径使得其可通过0.22ixm滤器除菌过滤。在国际专利申请号WO94/21292中描述了这些制备物。脂质A的合成衍生物是已知的，并纟皮认为是TLR4激动剂，其包括但不限于OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二酰氧十四酰基氨基]-4-o-膦酰基-P-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]-a-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二酰氧十四酰基氨基]-4-氧代基-5-氮杂-9(11)-[(11)-3-羟基十四酰基氨基]癸-1,10-二醇,1,10-双(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S,9R)-3-[(R)-十二酰氧十四酰基氨基]-4-氧代基-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰基氨基]癸-l,10-二醇，l-二氢磷酸酯10-(6-絲己酸酉旨)(WO01/46127)其它可用的TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，如在WO9850399或US6303347中公开的那些(还公开了用于制备AGP的方法)，或如在US6764840中所公开的AGP的药学上可接受的盐。有些AGP是TLR4激动剂，而有些是TLR4拮抗剂。两者都被认为可用作佐剂。另一个用于本发明的优选免疫刺激剂是QuilA及其衍生物。QuilA是从南美奎拉雅属皂树(QuilajaSaponariaMolina)中分离出来的皂苷制剂，并且由Dalsgaard等在1974年首次描述为具有佐剂活性("Saponinadjuvants",Archiv.fiirdiegesamteVirusforschung,44巻,SpringerVerlag,Berlin,243-254页)。通过HPLC已经分离了QuilA的纯化片段，其保留了佐剂活性，没有与QuilA相关的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21(也称为QA7和QA21)。QS-21是来源于查拉雅属皂树树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Thl细胞和占优的IgG2a抗体反应，在本发明背景下为优选皂苷。已经描述了特别优选的具体QS21制剂，这些制剂还包含固醇(W096/33739)。本发明的皂苷形成部分可以是独立的胶束形式、混合的胶束形式(优选但非仅具有胆汁盐)，或者当用胆固醇和脂质制备时可以是ISCOM基质(EP0109942Bl)、脂质体或相关胶体结构的形式，如似螺旋形或环形多聚体复合物或者油脂/分层的结构和薄片，或者是水包油乳剂形式(例如WO95/17210)。皂苷优选可与金属盐结合，诸如氢氧化铝或-舞酸铝(WO98/15287)。优选地，急苷以脂质体、ISCOM或水包油乳剂的形式存在。增强的系统包括单磷酰脂质A(或解毒的脂质A)和皂苷衍生物的组合，尤其是如在WO94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或如在WO96/33739中公开的其中QS21用胆固醇猝灭的反应原性车交低的组合物。在WO95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，其在水包油乳剂中包含生育酚，有或没有QS21和/或3D-MPL。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外含有皂苷，其可为QS21。还可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其它的Toll样受体(TLR)9激动剂。用于本发明佐剂或疫苗的优选寡核苷酸为包含CpG的寡核苷酸，其优选包含两个或更多个二核苷酸CpG基序，这些基序由至少三个、更优选至少六个或更多个核苷酸分隔。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鸟嘌呤核苦酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个优选实施方案中，寡核苷酸内的核苷酸间是二硫代磷酸酯键，或更优选为硫代磷酸酯键，但磷酸二酯键和其它核苷酸间键也在本发明范围内。还包括在本发明范围内的是具有混合的核苷酸间键的寡核苷酸。用于生产碌^代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。优选寡核苷酸的实例具有以下序列。这些序列优选包含辟u代z畴酸酯修饰的核苦酸间键。OLIGOl(SEQIDNO:1):TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)OLIGO2(SEQIDNO:2):TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)OLIGO3(SEQIDNO:3):ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGOLIGO4(SEQIDNO:4):TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006)OLIGO5(SEQIDNO:5):TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)OLIGO6(SEQIDNO:6):TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)备选的CpG寡核苷酸可包含以上的优选序列，因为它们具有序列内无关紧要的缺失或添加。本发明所用的CpG寡核苷酸可通过本领城已知的任一方法合成(例如参见EP468520)。为方便起见，这些寡核苷酸可利用自动合成4义合成。佐剂可为水包油乳剂，或者可以包含与其它佐剂组合的水包油乳剂。乳剂系统的油相优选地含有可代谢油。术语可代谢油的含义在本领域众所周知。可代谢油可被定义为"能够通过代谢转化的"(道兰氏图解医学词典，W.B.SandersCompany,第25版，(1974》。所述油可为任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对接受者无毒，能够通过代谢转化。坚果、种子和谷物是常见的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，可包括市售油，例如NEOBEE⑧等。鲨烯(2,6,10,15,19,23-六曱基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是不饱和油，可大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本发明的特别优选的油。鲨烯是可代谢油依据以下事实其是胆固醇生物合成的中间体(默克索引，第10版，编目流水号8619)。45母育酚(例如维生素E)也经常用于油性乳化佐剂(EP0382271Bl;US5667784;WO95/17210)。用于本发明的油性乳剂(优选地为水包油乳剂)的母育酚可以如EP0382271Bl所述配制，即母育酚可为母育酚液滴分散液，任选地含有乳化剂，优选地^f氐于1)Lim直径。或者，母育酚可与另一种油联合使用，以形成油性乳剂的油相。本文描述了可与母育酚联合使用的油性乳剂的实例，例如上述可代谢油。业已表明，水包油乳剂佐剂自身可用作佐剂组合物(EP0399843B),水包油乳剂和其它活性物质的组合也已被描述为疫苗佐剂(WO95/17210;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241)。已表述了其它油性乳化佐剂，例如油包水乳剂(US5,422,109;EP0480982B2)和水包油包水乳剂(US5,424,067;EP0480981B)。所有这些都构成了优选的油性乳剂系统(尤其是在掺入母育酚时)，以形成本发明的佐剂和组合物。最优选地，油性乳剂(例如水包油乳剂)还包含乳化剂，例如吐温80和/或固醇，例如胆固醇。优选的油性乳剂(优选地水包油乳剂)含有可代谢油；无毒性油，例如角莖烷、鲨烯或生育酚，例如a生育酚(和优选地鲨烯和ot生育酚这二者)，以及任选的乳化剂(或表面活性剂)，例如吐温80。还可以包括固醇(例如胆固醇)。生产水包油乳剂的方法是本领域技术人员熟知的。通常，该方法包括将含母育酚的油相与表面活性剂如PBS/吐温80tm溶液混合，然后用匀浆器进行匀浆，对本领域技术人员应显而易见的是，包括将混合物两次通过注射器针头的方法应适于匀化少量液体。同样地，本领域技术人员可修改在微射流仪(M110S微流体机器，在6巴的最大压力输入下在2分钟的时间段(输出压力为约850巴)最多通过50次)中的乳化方法，以产生更小体积或更大体积的乳剂。该修改可通过常规^实验完成，包括测量所得乳剂，直到得到具有所需直径的油滴的制剂。在水包油乳剂中，油和乳剂应处于水性载体中。水性载体可为例如磷酸緩沖盐水。在稳定的水包油乳剂中存在的油滴大小优选地可小于1微米，可在基本上30-600nm的范围内，优选地基本为约30-500纳米直径，最优选地基本为约150-500nm直径，尤其为约150nm直径，如按光子相关光谱法所测量的。在这点上，以数目计80%的油滴应在该优选范围内，更优选地以数目计超过90%的油滴和最优选地以数目计超过95%的油滴在限定的尺寸范围内。按照常规，本发明的油性乳剂中所存在组分的量为0.5-20%或2-10%的油(总剂量体积)，例如鲨烯；且如果有ot生育酚则为2-10%;以及0.3-3%的表面活性剂，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。优选地，油(优选鲨烯)母育酚(优选a-生育酚)的比率等于或小于l，因为这样提供更稳定的乳剂。诸如吐温80或司盘85的乳剂也可以以约1%的水平存在。在某些情况下，本发明的疫苗还包含有稳定剂可能是有利的。优选乳化系统的实例描述于WO95/17210、WO99/11241和WO99/12565,其公开了基于鲨烯、a生育酚和吐温80的乳化佐剂，其任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL—起配制。因此，在本发明的一个特别优选的实施方案中，本发明的佐剂可另外含有其它的免疫刺激剂l例如LPS或其衍生物|和/或皂苷。其它免疫刺激剂的实例描述于本文禾口"VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach"1995,PharmaceuticalBiotechnology,第6巻，Powell,M.F.和Newman,M丄编辑，PlenumPress,NewYorkandLondon,ISBN0-306-44867-X。在一个优选方面，本发明的佐剂和免疫原性组合物包含在上述油性乳剂中的皂香(优选QS21)和/或LPS衍生物(优选3D-MPL),任选地具有固醇(优选胆固醇)。另外，油性乳剂(优选地水包油乳剂)可含有司盘85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。含有水包油乳剂、固醇和皂苷的佐剂描述于WO99/12565。通常，对于人类给药而言，皂苷(优选QS21)和/或LPS衍生物(优选3D-MPL)在免疫原性组合物人用剂量中以1|ng-200iLig/剂存在，例47如lOjLtg-100pg/剂，优选10iLig/剂。通常，油性乳剂(优选地为水包油乳剂)包含2-10%可代谢油。优选地，其包含2-10%鲨烯、2-10%a生育酚和0.3-3%(优选地0.4-2%)乳剂(优选地吐温80[聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯])。在鲨烯和a生育酚这二者均存在时，优选地鲨烯:a生育酚的比率等于或小于1，因为这提供更稳定的乳剂。司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)也可以在用于本发明的乳剂中以0.5-1%的水平存在。在某些情况下，本发明的免疫原性组合物和疫苗还包含稳定剂可能是有利的，所述稳定剂例如为其它乳剂/表面活性剂，包括辛酸(默克索引第10版，编目流水号1739)，其中特别优选三辛酸甘油酯。在含有鲨烯和皂苷(优选为QS21)时，制剂还包含固醇(优选为胆固醇)是有益的，因为这可使乳剂中的总油量降低。这导致生产成本降低，接种的总体舒适性改善，还定量和定性地改善了所获免疫应答，例如改善了IFN-y的产生。因此，本发明的佐剂系统通常包含在200:1-300:1范围内的可代谢油皂苷(重量/重量)比率，还可以以"低油"形式使用本发明，其优选范围为1:1-200:1,优选为20:1-100:1，最优选基本为48:1，该疫苗保留了所有组分的有益佐剂特性和显著降低的反应原性曲线。因此，特别优选的实施方案具有的鲨烯QS21(重量/重量)比率在1:1-250:1的范围内，还优选20:1-200:1的范围，优选20:1-100:1，最优选基本为48:1。优选地，还包括以如本文所述的皂苦固醇比率存在的固醇(最优选地为胆固醇)。本发明的乳化系统优选地具有在亚微米范围内的小油滴尺寸。最优选地，油滴尺寸为直径120-750nm范围，最优选直径为120-600nm范围。特别有效的佐剂制剂(用于在本发明的免疫原性组合物中与A1P04最终组合)包括皂苷(优选QS21)、LPS衍生物(优选3D-MPL)和油性乳剂(优选在水包油乳剂中的鲨烯和a生育酚)，其描述于WO95/17210或WO99/12565(尤其是在实施例2表1中的佐剂制剂11)。TLR2激动剂的实例包括肽聚糖或或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如咪喹莫特和雷西莫特，是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的TLR激动剂(在人中的TLR8和在小鼠中的TLR7)，而双链RNA和聚合IC(聚肌芬酸-聚胞嘧啶核普酸，其为市售的病毒RNA的合成才莫拟物)是TLR3激动剂的示例。3D-MPL是TLR4激动剂的实例，而CPG是TLR9激动剂的实例。免疫原性组合物可以包含吸附在金属盐上的抗原和免疫刺激剂。免疫刺激剂基于铝的疫苗制剂描述于EP0576478Bl、EP0689454Bl和EP0633784Bl，其中抗原和免疫刺激剂3-脱-0-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)吸附于相同颗粒上。那么，在这些情况下，抗原首先吸附到铝盐上，之后将免疫刺激剂3D-MPL吸附到相同铝盐颗粒上。这些方法首先包括在水浴中通过超声悬浮3D-MPL，直至颗粒达到80-500nm的尺寸。典型地，在室温下搅拌1小时将抗原吸附在铝盐上。然后将3D-MPL悬浮液加入吸附的抗原，并将制剂于室温温育l小时，然后保持于4。C,直至使用。在另一种方法中，免疫刺激剂和抗原在单独的金属颗粒上，如在EP1126876中所述。改善的方法包括将免疫刺激剂吸附到金属盐颗粒上，接着将抗原吸附到另一种金属盐颗粒上，之后混合所述单独的金属颗粒，以形成疫苗。用于本发明的佐剂可为包含免疫刺激剂的佐剂组合物，所述刺激剂吸附到金属盐颗粒上，其特征在于金属盐颗粒基本没有其它抗原。此外，本发明提供疫苗，所述疫苗特征在于免疫刺激剂吸附到基本没有其它抗原的金属盐颗粒上，并且吸附抗原的金属盐颗粒基本没有其它免疫刺激剂。因此，本发明提供含有已吸附到金属盐颗粒上的免疫刺激剂的佐剂制剂，该制剂特征在于所述组合物基本没有其它抗原。此外，该佐剂制剂可为中间体，如果使用这样的佐剂，则该中间体是生产疫苗所必需的。因此，提供一种生产疫苗的方法，该方法包括将作为一种或多种吸附到金属颗粒上的免疫刺激剂的佐剂组合物与抗原混合。优选地，抗原已预先吸附到金属盐上。所述金属盐可与吸附到免疫刺激剂49上的金属盐相同或相似。优选地，金属盐为铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。本发明还提供含有吸附到第一金属盐颗粒上的免疫刺激剂和吸附到金属盐上的抗原的疫苗组合物，其特征在于第一和笫二金属盐颗粒为单独的颗粒。本文描述的LPS或LOS衍生物或突变或脂质A衍生物设计得比天然脂多糖毒性低(例如3D-MPL)，就本文描述的这些部分的任何用途而言是可互换的等效物。它们可为如上所述的TLR4配体。其它这样的衍生物描述于WO020786737、WO9850399、WO0134617、WO0212258、WO03065806。在一个实施方案中，用于本发明的组合物的佐剂包含脂质体载体(通过已知技术由磷脂(例如二油酰磷脂酰胆碱[DOPC])和任选的固醇[例如胆固醇]制备)。这些脂质体载体可携带脂质A衍生物[例如3D-MPL-参见上文]和/或皂苷(例如QS21-参见上文)。在一个实施方案中，佐剂含有(每0.5mL剂量)0.1-10mg、0.2-7mg、0.3-5mg、0.4-2mg或0.5-1mg(例如0.4-0.6mg、0.9-1.1mg、0.5mg或1mg)石岸脂(例如DOPC);0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例々口0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如胆固醇)；5-60貼、10-50叫或20-30貼(例如5-15jug、40-50吗、10pg、20^g、30pg、40)xg或50(ig)脂质A衍生物(例如3D-MPL);以及5-60jxg、10-50pg或20-30jig(例如5-15pg、40-50|ug、10(xg、20(ig、30吗、40昭或50吗)皂苷(例如QS21)。该佐剂尤其适合于老年疫苗制剂。在一个实施方案中，含有此佐剂的疫苗组合物包含衍生自至少以下所有血清型的糖缀合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并还可以包含来自血清型3、6A、19A和22F的一种或多种糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或全部)疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显劣于Prevnar疫苗诱导的抗体效价。在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含由可代谢油(例如鲨烯)、乳剂(例如吐温80)和任选的母育酚(例如a生育酚)制备的水包油乳剂。在一个实施方案中，佐剂含有(每0.5mL剂量)0.5-15mg、1-13mg、2-11mg、4-8mg或5-6mg(例如2國3mg、5-6mg或10-11mg)可代谢油(例如鲨烯)；0.1-10mg、0.3-8mg、0.6-6mg、0.9-5mg、1-4mg或2-3mg(例如0.9-1.1mg、2-3mg或4-5mg)乳剂(例如吐温80);和任选的0.5-20mg、1-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg(例如11-13mg、5-6mg或2-3mg)母育酚(例如oc生育酚)。该佐剂任选地还可以包含5-60吗、10-50)ng或20-30|ug(例如5-15pg、40-50(xg、10jig、20|ug、30pg、40jxg或50iug)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。这些佐剂尤其适合于婴儿或老年疫苗制剂。在一个实施方案中，含有此佐剂的疫苗组合物包含衍生自至少以下所有血清型的糖缀合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并还可以包含来自血清型3、6A、19A和22F的一种或多种糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或全部)疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显劣于Prevnar⑧疫苗诱导的抗体效价。该佐剂任选地可含有0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如胆固醇)；5-60吗、10-50|ug或20-30)tig(例如5-15pg、40-50|ig、10pg、20|ig、30pg、40pg或50pg)月旨质A衍生物(例如3D-MPL);和5-60|ig、10-50吗或20-30(ig(例如5陽15jxg、40-50jxg、10pg、20)ig、30pg、40pg或50ng)皂苷(例如QS21)。该佐剂尤其适合于老年疫苗制剂。在一个实施方案中，含有此佐剂的疫苗组合物包含衍生自至少以下所有血清型的糖缀合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并还可以包含来自血清型3、6A、19A和22F的一种或多种糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或全部)疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显劣于Prevnar⑧疫苗诱导的抗体效价。在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包^^磷酸铝和脂质A衍生物(例如3D-MPL)。该佐剂可包含(每0.5mL剂量)100-750貼、200-500吗或300-400貼作为磷酸铝的Al，和5-60吗、10-50吗或20-30pg(侈寸长口5-15jxg、40-50pg、10|tig、20jxg、30jig、40pg或50)iig)脂质A衍生物(例如3D-MPL)。该佐剂尤其适合于老年或婴儿疫苗制剂。在一个实施方案中，含有此佐剂的疫苗组合物包含衍生自至少以下所有血清型的糖缀合物:4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并还可以包含来自血清型3、6A、19A和22F的一种或多种糖缀合物)，其中在人类接种者中针对一种或多种(或全部)疫苗组分4、6B、9V、14、18C、19F和23F诱导的GMC抗体效价不明显劣于Prevnar⑧疫苗诱导的抗体效价。通过将含有本发明的免疫原性组合物的疫苗制品经全身或粘膜途径给药，所述疫苗可用于保护或治疗对感染易感的哺乳动物。这些给药可包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经粘膜给予至口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。可将用于治疗肺炎或中耳炎的疫苗进行鼻内给药(由于能更有效地阻止肺炎链球菌的鼻咽携带，因此能在其最早期减弱感染)。尽管本发明的疫苗可作为单剂给予，但其组分也可以同时或在不同时间一起共给予(例如为了彼此之间免疫应答的最佳协调，肺炎链球菌糖缀合物可单独给予、同时给予或在给予疫苗的任何细菌蛋白组分之后l-2周给予)。对于共给予，任选的Thl佐剂可存在于任意的或全部的不同给药中。除了单一给药途径之外，还可使用2种不同的给药途径。例如，糖或糖缀合物可IM(或ID)给予，细菌蛋白可IN(或ID)给予。另外，本发明的疫苗可IM给予致敏剂量，IN给予加强剂量。疫苗中的蛋白抗原的含量通常在1-100pg的范围内，优选为5-50fig，最通常在5-25iLig的范围内。在初始接种后，受试者可接受1次或数次间隔时间足够的加强免疫。疫苗制剂一4殳4苗述于VaccineDesign("Thesubunitandadjuvantapproach"(PowellM.F.禾口NewmanM.J.编辑)(1995)PlenumPressNewYork)。Fullerton,美国专利4,235,877描述了在脂质体中的嚢化。本发明的疫苗可储存在溶液中或冻干储存。优选地，溶液在糖如蔗糖或乳糖存在下冻干。还优选它们;波冻干，并在使用前临时重配。冻干可产生更稳定的组合物(疫苗)，并在存在3D-MPL和没有基于铝的佐剂的情况下可能产生更高的抗体效价。在本发明的一个方面，提供一种疫苗试剂盒，其包括含有本发明的免疫原性组合物(任选地为冻干形式)的小瓶，并还包括含有本文所迷佐剂的小瓶。可预见的是，在本发明的该方面，佐剂将用于重配冻干的免疫原性组合物。尽管本发明的疫苗可通过任何途径给予，但将所述疫苗给予到皮肤中(ID)构成了本发明的一个实施方案。人皮肤含有外部"角质"表皮，叫做角质层，其覆盖表皮。在此表皮下面是叫做真皮的层，其又覆盖皮下组织。研究者已表明，将疫苗注射到皮肤中，尤其是真皮中，刺激免疫应答，其还可能与许多其它优势有关。用本文所述疫苗皮内接种构成了本发明的优选特征。皮内注射的常规技术"芒图操作(mantouxprocedure)"包括下述步骤清洁皮肤，然后伸出一只手，使小号针(26-31号)的斜面朝上，以10-15。的角度将针插入。一旦针斜面^皮插入，就降低针管并前推，同时轻压使其在皮肤下抬高。然后将液体非常緩慢地注入，这样便在皮肤表面上形成一个大包或肿块，接着緩慢抽出针。近来，已描述了特别设计用于皮内或经(across)皮肤给予液体制剂的装置，例如在WO99/34850和EP1092444中描述的装置，以及例如在WO01/13977、US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5，993，412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、53US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537中描述的喷射注射装置。疫苗制剂的真皮内给药替代方法可包括常规注射器和针，或设计用于固体疫苗的弹道式释药(ballisticdelivery)的装置(WO99/27961)，或经皮贴剂(WO97/48440;WO98/28037);或皮肤表面给药(经真皮或经皮传送，WO98/20734;WO98/28037)。当将本发明的疫苗给予至皮肤时，或更具体地说给予到真皮中时，疫苗为小液体体积，具体地说为约0.05ml至0.2ml的体积。本发明皮肤或皮内疫苗中的抗原含量可类似于肌内疫苗中存在的常规剂量(参见上文)。然而，皮肤或皮内疫苗的一个特点是制剂可以为"低剂量"。因此，"低剂量"疫苗中蛋白抗原的存在优选低至每剂0.1-10)iig或0.1-5)iig;糖(优选缀合的)抗原的存在可以为每剂0.01-1pg、伊C选0.01-0.5iuglt。此处所用的术语"皮内传送"是指将疫苗给至皮肤的真皮区域。然而，疫苗不一定仅定位于真皮内。真皮层是距离人体皮肤表面约1.0mm和约2.0mm的皮层，但个体之间和机体的不同部位之间存在一定量的差异。一般地，预计疫苗可以通过进入皮肤表面下1.5mm达到真皮层。真皮位于在表面的角质层和表皮以及下面的皮下层之间。根据给药模式，可以使疫苗最终仅存在于或主要存在于真皮内，或最终可分布于表皮和真皮内。本发明还通过加入为游离或缀合形式的流感嗜血杆菌蛋白(参见上文)如D蛋白，提供预防或减轻流感嗜血杆菌所致中耳炎的改良疫苗。另外，本发明还通过依靠向本发明的肺炎链球菌缀合组合物加入作为游离或缀合蛋白的一种或两种肺炎链球菌蛋白(参见上文)，提供在婴儿中预防或减轻肺炎链球菌感染(例如中耳炎)的改良疫苗。所述肺炎链球菌游离蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。一种或多种游离或缀合形式的莫4立卡他菌(A/oraxe〃acato厅/wto)蛋白抗原(参见上文)也可以包含在联合疫苗中。因此，本发在另一个实施方案中，本发明为通过给予安全有效量的本发明疫苗在婴儿(0-2岁)中激发(保护性)免疫应答的改良方法。此外，本发明的实施方案包括提供用于药物的本发明的抗原性肺炎链球菌缀合组合物以及本发明的肺炎链球菌缀合物在制备用于预防(或治疗)肺炎链^^菌疾病的药物中的用途。在又一个实施方案中，本发明为通过给予安全有效量的本发明疫苗，优选地连同一种或两种作为游离或缀合蛋白存在的肺炎链球菌蛋白，在老年人群(在本发明背景下患者年龄如果为50岁或以上、通常超过55岁以及更通常超过60岁，则被视为老年人)中激发(保护性)免疫应答的改良方法，所述游离的肺炎链球菌蛋白可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。本发明的又一方面是使人类宿主免疫肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病的方法，该方法包括给予宿主免疫保护剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒。本发明的又一方面为用于治疗或预防肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病的免疫原性组合物。本发明的又一方面为本发明的免疫原性组合物或疫苗或试剂盒在制备用于治疗或预防肺炎链球菌和任选的流感嗜血杆菌感染所致疾病的药物中的用途。在本发明的又一方面，提供本发明的免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防O-乙酰化血清型18C菌抹和脱-O-乙酰化血清型18C菌抹的肺炎链球菌感染所致疾病的药物中的用途。在本发明的又一方面，提供本发明的免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防血清型19A菌抹的肺炎链球菌感染所致疾病的药物中的用途，所述免疫原性组合物或疫苗包含血清型19F的荚膜糖缀合物，但不含血清型19A的荚膜糖。在所有情况下，本发明人都意欲用术语"由……组成"分别任选地取代本文的术语"包含"、"含有"和"包括"。55涉及本发明的"疫苗组合物"的本文的实施方案也适用于涉及本发明的"免疫原性组合物"的实施方案，反之亦然。在本专利说明书中提及的所有参考文献或专利申请都通过引用结合到本文中。为了可更好地理解本发明，提供以下实施例。这些实施例仅用于阐述目的，无意以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1:D蛋白的表达流感嗜血杆菌D蛋白用于D蛋白表达的遗传构建起始物质编码D蛋白的DNAD蛋白在所有血清型以及非分型的流感嗜血杆菌菌抹中都高度保守。含有编码整个D蛋白基因的DNA序列的载体pfflC348由A.Forsgren博士，DepartmentofMedicalMicrobiology,UniversityofLund,Malm6GeneralHospital,Malmd,Sweden处获得。D蛋白的DNA序列由Janson等，(1991)Infect.Immun.59:119-125发表。表达载体pMGl表达载体pMGl为pBR322衍生物(Gross等，1985)，其中导入了来源于噬菌体X的控制元件，该控制元件用于外源插入基因的转录和翻译(Shatzman等，1983)。此外，氨苄青霉素抗性基因被替换成卡那霉素抗性基因。大肠杆菌菌林AR58用预先在SA500衍生物(galE::TN10,入KircI857AHl)中生长的PI噬菌体原液转导N99产生大肠杆菌菌抹AR58。N99和SA500为大肠杆菌K12菌抹，得自国立卫生研究所(NIH)的MartinRosenberg博士实验室。表达载体pMGl为生产D蛋白，将编码该蛋白的DNA克隆到表达载体pMGl中。该质粒使用X噬菌体DNA的信号来驱动插入的外源基因的转录和翻译。该载体含有启动子PL、操纵子OL和2个可用位点(NutL和NutR)，从而在提供N蛋白时緩解转录极性效应(Gross等，1985)。将含有PL启动子的载体引入一种大肠杆菌溶原性宿主，以稳定质粒DNA。溶原性宿主菌林含有整合到基因组中的复制缺陷型人噬菌体DNA(Shatzman等，1983)。染色体中的人噬菌体DNA引导cl阻抑蛋白的合成，所述cl阻抑蛋白结合载体的OL阻抑物，阻止RNA聚合酶与PL启动子结合，从而防止插入基因转录。表达菌林AR58的cl基因含有温度敏感性突变，使得可通过温度变化来调控PL引导的转录，即提高培养温度可使阻抑物失活，并开始合成外源蛋白。该表达系统可使外源蛋白(尤其是可能对细胞有毒性的那些外源蛋白)受控合成(Shimataka和Rosenberg,1981)。大肠杆菌菌林AR58用于产生D蛋白载体的AR58溶原性大肠杆菌菌抹衍生自标准Nffl大肠杆菌K12菌林N99(F-siTgalK2，lacZ-thr-)。它含有缺陷型溶原性X噬菌体(galE::TN10,人KircI857AH1)。KiK表型防止宿主停止合成大分子。cI857突变赋予cl阻抑物温度敏感性损伤。AH1缺失去除人噬菌体的右侧操纵子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因座。用预先在SA500衍生物(gaffi::TN10,入Kil-cI857AH1)中生长的PI噬菌体原液转导N99产生AR58菌林。由于编码四环素抗性的TN10转座子存在于附近的galE基因中，因而利用四环素对N99中缺陷型溶菌原的导入情况进行选择。57载体pMGMDPPrD的构建使用含有流感病毒非结构性Sl蛋白编码基因的pMGl载体(pMGNSl)构建pMGMDPPrD。利用在5'和3'端分别含有Ncol与Xbal限制位点的PCR引物经PCR由pfflC348载体(Janson等，1991,Infect.Immun.59:119-125)扩增D蛋白基因。然后将NcoI/Xbal片段引入到pMGNSl的Ncol与Xbal之间，由此产生含有NS1蛋白的N端81个氨基酸并后接PD蛋白的融合蛋白。该载体称为pMGNSlPrD。基于上述构建体产生用于D蛋白表达的最终构建体。从pMGNSlPrD中除去BamHI/BamHI片段。该DNA水解反应除去除前3个N端残基之外的NS1编码区。在该载体重新连接时，产生编码具有以下N端氨基酸序列的融合蛋白的基因-隱一函PSSHSS画ANT画——NS1D蛋白D蛋白不含有前导肽或通常连接脂质链的N端半胱氨酸。因此，该蛋白不会被分泌到周质中，也不会被脂化，而是以可溶形式保留在细胞质中。通过于37。C热激将最终构建体pMG-MDPPrD导入到AR58宿主菌株中。在卡那霉素存在下选择含有质粒的细菌。用选定的内切核酸酶消化分离的质粒DNA来证实编码DNA插入序列的D蛋白的存在。重组的大肠杆菌菌株称为ECD4。D蛋白的表达处于入PL启动子/(\操纵子控制之下。宿主菌抹AR58的基因组中含有温度敏感性cl基因，该基因在低温下可通过与ol结合来阻断由人pl启动的表达。一旦温度提高，cI就由Ol幹放，D蛋白得以表达。小规模制备在发酵结束时，可将细胞浓缩并冷冻。如下进行收集细胞的提取和D蛋白纯化。将冷冻的细胞培养物沉淀融解，并重悬浮于细胞裂解液(柠檬酸盐緩冲液，pH6.0)中，使最终OD65。=60。使该悬浮液两次流经P-1000bar的高压勻浆器。通过离心澄清细胞培养物匀浆，并过滤去除细胞碎片。在笫一个纯化步骤中，将过滤的裂解物上样于阳离子交换层析柱(SPSepharoseFastFlow)。PD可通过离子相互作用与凝胶基质结合，并可通过增加洗脱缓冲液的离子强度的步骤洗脱PD。在第二个纯化步骤中，杂质保留在阴离子交换基质(QSepharoseFastFlow)上。PD未结合到凝胶上，并可收集在流出物中。两个柱层析步骤均利用OD监测分部收集物。通过超滤浓缩含有纯化的D蛋白的阴离子交换柱层析的流出物。最后，使含有D蛋白的超滤保留物通过0.2pm膜。大规厲制备如下进行收集细胞的提取和D蛋白的纯化。冷却收集的培养液，并直接通过约800bar压力的高压匀浆器2次。在第一个纯化步骤中，稀释细胞培养物匀浆物，并上样于阳离子交换层析柱(SPSepharoseBigbeads)。PD通过离子相互作用结合于凝胶基质，通过增加洗脱緩冲液的离子强度的步骤洗脱PD，并过滤。在第二个纯化步骤中，杂质保留在阴离子交换基质(QSepharoseFastFlow)上。PD未结合到凝胶上，并可收集在流出物中。两个柱层析步骤均利用OD监测分部收集物。通过超滤浓缩并渗滤含有纯化的D蛋白的阴离子交换柱层析的流出物。最后，使含有D蛋白的超滤保留物通过0.2pm膜。实施例lb:PhtD的表达PhtD蛋白是肺炎链球菌组氨酸三联体(Pht)蛋白家族的成员，其特征在于存在组氨酸三联体(HXXHXH基序)。PhtD是838个氨基酸的分子，具有5个组氨酸三联体(参见MedlmmuneWO00/37105SEQIDNO:4的氨基酸序列和SEQIDNO:5的DNA序列)。PhtD还在中部(氨基酸位置348-380)含有富集脯氨酸的区域。PhtD具有20个氨基酸的N末端信号序列，该序列含有LXXC基序。遗传构建体使用携带p入启动子的自制pTCMP14载体将成熟的MedlmmimePhtD蛋白(由氨基酸21至氨基酸838)的基因序列重组转移到大肠杆菌中。大肠杆菌宿主菌株为AR58,其携带cI857热敏感性阻抑物，允许热诱导启动子。实施聚合酶链式反应，以从Medlmmune质粒扩增p//D基因(如在WO00/37105中所述的携带肺炎链球菌菌抹Norway4(血清型4)的基因-SEQIDNO:5:)。仅对pM)基因特异的引物用于扩增两个片段中的p&D基因。引物或携带iVcfel和K，IP艮制位点，或携带^pwl和；^wl限制位点。这些引物不与该载体的任何核苷酸杂交，而是仅与特异性基因序列杂交。使用携带iVcfel限制位点的第一引物插入人工ATG起始密码子。然后将产生的PCR产物插入到pGEM-T克隆载体(Promega)中，并检验DNA序列。然后使用标准技术在TCMP14表达载体中实现片段亚克隆，并将载体转化入v4W5S大肠杆菌中。PhtD纯化如下实现PhtD純化□在卡那霉素存在下大肠杆菌细胞的生长于30。C生长30小时，然后于39.5。C诱导18小时。。在作为蛋白酶抑制剂的5mMEDTA和2mMPMSF存在下以OD±115破碎来自完整培养物的大肠杆菌细胞Rannie,2次通过，1000bar。d于室温(20。C)用膨胀床模式StreamlineQXL层析去除抗原捕获物和细月包石争片；柱子用NaCl150mM+Empigen0.25%pH6.5洗涤，并用NaCl400mM+Empigen0.25%的25mM磷酸钾緩冲溶液pH7.4洗脱。□用Sartobran150滤器(0.45+0.2pm)过滤。□在5mM咪唑存在下于4。C抗原结合在螯合Zn^的SepharoseFFIMAC层析柱pH7.4上；该柱用5mM咪唑和1%Empigen洗涤，并用50mM咪唑洗脱，二者均在25mM磷酸钾緩冲液pH8.0中。□以阳离子模式在FractogelEMDDEAEpH8.0(25mM磷酸钾)上于4'C进行弱阴离子交换层析；该柱用140mMNaCl洗涤，并用200mMNaCl洗脱，同时杂质(蛋白和DNA)仍吸附在交换剂上。。用50kDa膜以2mM磷酸钠/钾pH7.15浓缩和超滤。d纯化的半成品经0.2pmMillipak-20滤器除菌过滤。实施例lc:肺炎链球菌溶血素的表达如在WO2004/081515和WO2006/032499中所述地制备和解毒肺炎链球菌性肺炎链球菌溶血素。实施例2:缀合物的制备在本领域众所周知如何制备纯化的肺炎链球菌多糖。就这些实施例而言，多糖基本如EP072513所述地制备，或者通过紧密相关的方法制备。在缀合前，多糖可通过如下所述的微流化调整尺寸。活化和偶联条件对每一种多糖都是特异性的。这些条件在表l中给出。将调整过尺寸的多糖(PS5、6B和23F除外)溶解在2MNaCl、0.2MNaCl或注射用水(WFI)中。评估所有血清型的最佳多糖浓度。除血清型18C之外的所有血清型都如以下详述地与载体蛋白直接缀合。产生2种替代血清型22F缀合物；1种直"j妄缀合，1种通过ADH4妻头缀合。将CDAP在乙腈或乙腈/水50%/50%中的100mg/ml储备液(CDAP/PS比率为0.5-1.5mg/mgPS)加入多糖溶液。1.5分钟后，加入0.2M-0.3MNaOH，以获得特定活化pH。在此pH于25。C在3分钟内进行多糖的活化。将纯化的蛋白(D蛋白、PhtD、肺炎链球菌溶血素或DT)(其量取决于初始PS/载体蛋白的比值)加入活化的多糖中，在该特定pH于pH调节下进行至多2小时(取决于血清型)的偶联反应。为了猝灭未反应的氰酸酯基团，随后将2M甘氨酸溶液加入混合物。调节pH至猝灭pH(pH9.0)。于25。C搅拌溶液30分钟，然后在持续的緩慢搅拌下于2-8。C过夜。18C的制备18C经接头己二酰肼(ADH)与载体蛋白连接。多糖血清型18C在缀合前被微流化。用EDAC衍生化破伤风类毒素为衍生化破伤风类毒素，用0.2MNaCl将纯化的TT稀释至25mg/ml，加入ADH间隔臂，以便达到0.2M终浓度。当间隔臂完全溶解时，将pH调节至6.2。然后加入EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)，以达到0.02M终浓度，在pH调节下搅拌混合物1小时。通过于25°C增加pH至9.0保持至少30分钟终止缩合反应。然后渗滤(IOkDaCO膜)衍生化的TT，以便除去残余的ADH和EDAC试剂。最后除菌过滤TTAH块状物，直至偶联步骤，并储存于-70。C。TTah与PS18C的化学偶联详细的缀合参数可见于表1。以限定的浓度用水稀释2g微流化PS，并通过加入NaCl粉末调节至2MNaCl。加入CDAP溶液(IOOmg/ml，在50/50体积/体积乙腈/WFI中新鲜制备)，以达到适宜的CDAP/PS比率。通过加入0.3MNaOH将pH升高至活化pH9.0,并在此pH稳定，直至加入TTah。3分钟后，加入衍生化的TTah(20mg/ml的0.2MNaCl溶液)，以使TTah/PS比率达到2;将pH调节至偶联pH9.0。在pH调节下静置溶液l小时。为了猝灭，向混合物PS/TTah/CDAP加入2M甘氨酸溶液。调节pH至猝灭pH(pH9.0)。将溶液于25。C搅拌30分钟，然后在连续纟爰慢搅拌下于2-8。C静置过夜。PS22FM-PhtD缀合物在用于该糖的第二种缀合方法(第一种为表1中显示的直接PS22-PhtD缀合方法)中，22F与载体蛋白经接头己二酰肼(ADH)连接。多糖血清型22F在缀合前^皮微流化。PS22F衍生化活化和偶联在连续搅拌下于25。C在控温水浴中进行。稀释微流化的PS22F,以获得在0.2MNaCl中6mg/m的最终PS浓度，用0.1NHCl将该溶液调节至pH6.05±0.2。加入CDAP溶液(IOOmg/ml，在50/50的乙腈/WFI中新鲜制备)，以达到适宜的CDAP/PS比率(1.5/1重量/重量)。通过加入0.5MNaOH将pH升高至活化pH9.00±0.05，并稳定在此pH,直至加入ADH。3分钟后，加入ADH，以达到适宜的ADH/PS比率(8.9/1重量/重量)；将pH调节至偶联pH9.0。在pH调节下静置溶液1小时。浓缩并渗滤PSah右1"生物。偶联向PS22Fah衍生物加入10mg/ml在0.2MNaCl中的PhtD，以便达到4/1(重量/重量)的PhtD/PS22FAH比率。用HC1将pH调节至5.0±0.05。在10分钟内(250pl/分钟)手动加入EDAC溶液(20mg/ml的0.1MTris-HCl溶液，pH7.5),以达到1mgEDAC/mgPS22FAH。所获溶液在搅拌和pH调节下于25。C温育150分钟(尽管也可以使用60分钟)。通过加入1MTris-HClpH7.5(1/10终体积)中和溶液，并于25°C静置30分钟。在SephacrylS400HR上洗脱前，使用5pmMinisart滤器澄清缀合物。获得的缀合物具有4/1(重量/重量)的最终PhtD/PS比率，游离PS含量在1。/。以下，抗原性(ct-PS/ot-PS)为36.3。/。，抗PhtD抗原性为7.4%。缀合物的纯化使用经0.15MNaCl平衡的SephacrylS400HR凝胶过滤柱(对于18C为S500HR)通过凝胶过滤纯化缀合物，以除去小分子(包括DMAP)和未缀合的PS和蛋白。基于反应组分的不同分子大小，首先洗脱出PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎链球菌溶血素或PS-DT缀合物，之后洗脱出游离PS,然后洗脱出游离PD或游离DT，最后洗脱出DMAP和其它盐(NaCl、甘氨酸)。含有缀合物的级分通过UV28。nm检测。按照级分的Kd将其合并，除菌过滤(0.22pm),并储存于+2-8。C。测定缀合制备物中的PS/蛋白比率。PS肺炎链球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/PW缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件其中出现在行标题中的"fifluid"表示糖在缀合前通过微流化调整尺寸。微流化后的糖的尺寸在表2中给出。表lPS肺炎链球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/Plv缀合物的特异性活化/<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>备注pHa、c、q分别对应于活化pH、偶联pH和猝灭pH。鉴定对每一缀合物进行鉴定，它们都符合表2中描述的标准。用Resorcinol检测法检测多糖含量((iig/inl),用Lowry检测法检测蛋白含量Og/ml)。用浓度比值测定最终的PS/PD比值(重量/重量)。游离多糖含量(％):将缀合物与a-载体蛋白抗体和饱和硫酸铵温育，之后离心，得到上清液，在该上清液中测定保持于4。C或在37。C储存7天时缀合物的游离多糖含量。用a-PS/a-PSELISA对上清液中的游离多糖定量。也通过a-载体蛋白/a-PSELISA控制缀合物的不存在。抗原性用夹心型ELISA分析同一缀合物的抗原性，其中抗体的捕获和检测分别为a-PS和a-蛋白。游离蛋白含量(％):未缀合的载体蛋白可在纯化步骤中从缀合物分离。游离的残余蛋白的含量使用尺寸排阻层析(TSK5000-PWXL)继之以UV检测(214nm)来测定。洗脱条件可分离游离载体蛋白和缀合物。然后对比校准曲线(0-50jug/ml载体蛋白)测定缀合物原液中的游离蛋白含量。游离载体蛋白(％)如下获得％游离载体-(游离载体(iug/ml)/(通过Lowry法检测的相应载体蛋白的总浓度(吗/1111)*100%)。稳定性对于保持于4。C和于37°C储存7天的缀合物，用HPLC-SEC凝胶过滤CTSK5000-PWXL)检测分子量分布(Kav)和稳定性。10/11/13/14价特征在表2中给出(参见其下的注释)。蛋白缀合物可吸附到磷酸铝上，并合并，以形成最终疫苗。结论已生产出免疫原性缀合物，随后已表明其为有前景的疫苗的组表2-缀合物的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>天然PS微流化后的PS大小通过混合血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F缀合物(例如以每份人用剂量分别含l、3、1、1、1、1、1、3、3、l貼糖的剂量)制备10价疫苗。通过又加入表5的血清型3缀合物(例如以每份人用剂量含1pg糖)制备11价疫苗。通过又加入以上的血清型19A和22F缀合物(22F直接连接至PhtD，或者通过ADH接头连接)[例如以每份人用剂量各含3叫糖的剂量]制备13价疫苗。可以通过又加入以上的血清型6A缀合物[例如以每份人用剂量含1)iig糖的剂量]制备14价疫苗。实施例3:在本发明的免疫原性组合物中包含流感嗜血杆菌D蛋白可提供抵御急性中耳炎(AOM)的改善的保护作用的证据研究设计研究使用11Pn-PD疫苗，其含有血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F，每种血清型均缀合流感嗜血杆菌的D蛋白(参阅实施例4中的表5)。将受试者随机分为2组，以在约3、4、5和12-15月龄时接受4剂11Pn-PD疫苗或//aw/;c。所有受试者都在3、4和5月龄时伴随接受GSK生物制品公司的/w/aw/jc-/je;c<3(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。/"/a"h;c-/2ejca是在给药前混合的尸e^7hx和Hib的组合。在给予第3剂疫苗后2周开始"依照方案"的随访效力分析，并持续至24-27月龄。在选定的受试者亚组中评价肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的鼻咽携带情况。如果孩子生病、耳痛、鼓膜自发穿孔或自发耳溢液，则建议孩子的双亲咨询研究者。如果研究者怀疑AOM事件，则立即将孩子转移至耳鼻喉(ENT)专业医师处证实诊断结果。AOM的临床诊断基于目测鼓膜外观(即发红、膨胀、失去光反射)或存在中耳液体渗出(通过简易耳镜或气式耳镜或通过显微镜证实)。另外，必须存在以下迹象或症状中的至少两种耳痛、耳溢液、听力丧失、发烧、嗜睡、过敏、食欲不振、呕吐或腹泻。如果ENT专业医师证实临床诊断结果，则通过鼓膜穿刺术收集中耳液的标本进行细菌学检验。对于因复发疾病就诊的受试者，如果自先前的事件开始以后已过去了30天以上，则认为新的AOM事件已开始。另外，如果所分离的细菌/血清型不同于先前的分离林，则AOM事件^皮认为是新细菌事件，无论两个连续事件之间的间隔是多少。试验结果招募了总共4968名婴儿，11Pn-PD组中2489名，对照组中2479名。两组之间的人口统计特征或危险因素没有显著差异。临床事件和AOM病例定义在每个依照方案的随访期当中，在11Pn-PD组中记录到总共333件临床AOM事件，在对照组中记录到499件。表3提供了11Pn-PD疫苗和先前在芬兰测试的两种7价疫苗(Eskola等，NEnglJMed2001;344:403-409和Kilpi等，ClinInfectDis200337:1155-64)抗任何AOM事件和由不同肺炎链球菌血清型、流感嗜血杆菌、A/T州和莫拉卡他菌(Mcator/2afe)所致的AOM的保护效力。采用11Pn-PD，统计学显著性和临床相关性降低至整体AOM疾病负荷的33.6%,与病因无关(表3)。由于11Pn-PD疫苗中包含的11种肺炎链^^菌血清型中的任一种的抗AOM事件的整体效力为57.6%(表3)。该研究的另一个重要发现是由11Pn-PD疫苗提供的抗流感嗜血杆菌所致AOM的35.6%的保护作用(具体地说由NTHi提供35.3%的保护作用)。该发现具有重要的临床意义，其指出了在肺炎链球菌缀合物接种时代中流感嗜血杆菌作为AOM主因的重要性增加。与所提供的抗AOM保护作用相一致，11Pn-PD疫苗也降低了在生命的第2年在加强剂量后的流感嗜血杆菌的鼻咽携带情况。这些发现与先前在芬兰的观察结果相反，在芬兰，对于两种7价肺炎链球菌缀合疫苗，观察到归因于流感嗜血杆菌的AOM事件增加，(Eskola等和Kilpi等)，作为病因取代的证明。在归因于Hi的抗AOM事件的保护作用与抗载体蛋白D的抗体水平之间不能建立清晰关联，因为在仍保持无HiAOM事件的11Pn-PD接种者中的初免后抗PDIgG抗体浓度与在效力随访期当中发生至少一种HiAOM事件的llPn-PD接种者中检测的初免后抗PDIgG抗体水平基本相同。然而，尽管在疫苗的生物学影响和初免后IgG抗PD免疫原性之间不能建立关联，但可以合理地假定在流感嗜血杆菌菌林之间高度保守的PD载体蛋白较大程度地有助于诱导抗Hi的保护作用。对AOM疾病的作用伴随着对鼻咽携带的作用，后一作用对于疫苗血清型肺炎链球菌和流感嗜血杆菌具有相似的效果(图1)。在PD缀合物接种者中流感嗜血杆菌的鼻咽携带情况的下降支持以下假设PD缀合疫苗具有抗流感嗜血杆菌的直接保护作用，即便通过ELISA检测不能关联保护效力与抗PDIgG免疫应答。在以下的试验中，使用灰鼠中耳炎模型和用该实施例的11价制剂或实施例2的IO价疫苗(另参见表1和2以及其下的备注)免疫的婴儿的血清合并液。相对于免疫前血清合并液，两种合并液诱导的患有中耳炎的动物百分率均显著降低。在10价和11价免疫合并液之间没有显著差异。这表明两种疫苗在该;漠型中诱导抗非分型流感嗜血杆菌所致中耳炎的保护作用的潜力相似。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>NP=未公开；N=在ATP疗效组(e伍cacycohort)中的受试者数目；n-事件数目*疫苗肺炎链球菌血清型对于1lPn-PD=11种血清型，对于Prevnar和7v-0MP=7种血清型MEF=中耳液体实施例4:用于血清型19F的栽体蛋白的选择使用的ELISA测定22F抑制ELISA方法基本上基于Conc印cion和Frasch在2001年所提出的测定，并由Henckaerts等，2006,ClinicalandVaccineImmunology13:356-360报道。简而言之，纯化的肺炎链球菌多糖与甲基化人血清白蛋白混合，并于4。C过夜吸附到NuncMaxisorpTM(Roskilde,DK)高结合微量滴定板。该板用10。/。胎牛血清(FBS)的PBS溶液在搅拌下于室温封闭1小时。血清样品用含10%FBS、10吗/mL细胞壁多糖(SSI)和2|ig/mL肺炎链球菌多糖血清型22F(ATCC)的PBS稀释，并在微量滴定板上用相同緩沖液进一步稀释。以相同方式处理内标并加入每块板，在89-SF中使用各浓度的血清型特异性IgG对比标准血清89-SF校准所述内标。在洗涤后，使用缀合过氧化物酶的抗人IgG单克隆抗体(StratechScientificLtd.,Soham,UK)检测结合抗体，所述单克隆抗体用10。/。FBS(在PBS中)稀释，并在搅拌下于室温温育1小时。使用现成的单组分四甲基联苯胺过氧化物酶免疫测定底物试剂盒(BioRad,Hercules,CA，US)在暗室中于室温显色。用0.18MHbS04终止反应，于450nm读取光密度。通过对照内标血清曲线的限定限度内的光密度点计算样品中血清型特异性IgG浓度(ing/mL),该内标血清曲线通过用SoftMaxPro(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)软件计算的4参数逻辑斯蒂对数方程建立。在考虑检测限度和定量限度的情况下，对所有血清型的ELSIA截取值都为0.05pg/mLIgG。调理吞噬测定在2003年6月的WHO磋商会上，推荐使用如Romero-Steiner等，ClinDiagnLabImmunol200310(6):1019-1024页陈述的OPA测定。该方案用于在以下测试中检验血清型的OPA活性。缀合物的制备在研究llPn-PD&Di-001和11Pn國PD&Di画007中,包括3种11价疫苗制剂(表4),该研究中3ng的19F多糖缀合白喉类毒素(19F-DT)，而不是1吗多糖缀合D蛋白(19F-PD)。用于研究11Pn-PD、11Pn-PD&Di-001和11Pn-PD&Di-007的缀合参数分别公开于表5、6和7。在用这些19F-DT制剂初免后1个月的抗肺炎链球菌抗体应答和抗血清型19F的OPA活性分别示于表8和9。表10显示了22F-ELISA抗体浓度和在23价普通多糖加强接种之前和之后达到0.2pg/mL阈值的受试者的百分率。已表明用这些19F-DT制剂诱导的抗体的调理吞噬活性;波明显改善，这由初免接种后1个月时较高的血清阳性率(调理吞噬效价>1:8)和OPAGMT得以证实(表9)。在23价普通多糖加强接种之后1个月，19F抗体的调理吞噬活性仍显著好于用19F-DT制剂初免的儿童(表11)。表12提供了与连续第4剂尸"wa^)相比较，在预先用19F-DT或19F-PD缀合物初免的学步儿童中的11Pn-PD加强剂量之后的免疫原性数据。尽管已知在美国引入/Vew2a/^)后所报告的成就，在缀合DT载体蛋白时抗血清型19F的改善的调理吞噬活性可能对候选疫苗有利。表13提供了19F-DT缀合物对于交叉反应性血清型19A的ELISA和OPA数据。发现19F-DT诱导抗19A的低但显著的OPA活性。表4在临床研究中使用的肺炎链球菌缀合疫苗制剂制剂肺炎链球菌血清型吗/载体蛋白Al3+mg13456B7F9V1418C19F23F11Pn-PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD<0.819F-DT制剂13/PD3/PD3/PD3/PD10/DT3/PD3/PD3/PD3/PD3/DT5/DT《0.3519F-DT3/PD2/PD2/PD3/PD5/DT3/PD2/PD2/PD2/PD3/DT5/DT《0.3574<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表7用于11Pn-PD&Di-007研究的PS肺炎链球菌D蛋白/DT缀合物的特异性活^/偶联/猝灭条件<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表8在1照19F陽PD、3ng19F-DT或iVevwfl/"(2照19F陽CRM)初免接种后1个月19F抗体浓度>0.20fig/inL的受试者百分率和19F抗体几何平均抗体浓度(95%CI下的GMC;吗/mL)(总组)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>'在表4中提供不同制剂的组合物。表9在用1將19F-PD、3照19F-DT或(2吗19F-CRM)初免接种后1个月19FOPA效价>1:8的受试者百分率和19FOPAGMT(总组)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>在表4中提供不同制剂的组合物(表10在用1將19F画PD、3吗19F誦DT或iVev聰r(2吗19F画CRM)初免接种的儿童中于23价普通多糖加强接种之前和之后1个月19F抗体浓度>0.20吗/ml的受试者百分率和19F抗体GMC0ig/ml)(总组)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>'在表4中提供不同制剂的组合物。表11在用1吗19F誦PD、3將19F-DT或/Vev"flr(2吗19F-CRM)初免接种的儿童中于23价普通多糖加强接种之前和之后1个月19FOPA效价>1:8的受试者百分率和19FOPAGMT(总组)初免组别llPn-PD&Di-002在加强接种之前在23价PS加强接种后1个月N%》1:8(95%CI)GMT(95%CI)N8(95%CI)GMT(95%CI)11Pn-PD2927,6(12.7-47.2)10.9(5.0-23.7)2882.1(63.1-93.9)408.0(157.3-1058.3)19F-DT制剂lr1947.4(24.4-71.1)18.1(7.2-45.7)1894.4(72.7-99.9)1063.8(386.6"2927.5)19F-DT制剂2r2733.3(16.5-54.0)8.5(4.7-15.3)28100(87.7-100)957.6(552.8-1659.0)2412.5(2.7-32.4)8.1(3.4-19.6)2382.6(61.2-95.0)380.9(133.2-1089.5)'在表4中提供不同制剂的组合物。表12在用1照19F-PD、3|ng19F-DT或iVwflr(2吗19F-CRM)初免接种的儿童中于llPn-PD或Prevnar加强接种后1个月抗体浓度>0，2|ag/mL、OPA>l:8的受试者百分率和抗19F肺炎链球菌的GMC/GMT(总组)初免组别llPn-PD&Di-00222F-ELISA测定OPA测定N%》0.20|Hg/inLi(95%CI)GMC(吗/ml)(95%CI)N8(95%CI)GMT(95%CI)1lPn-PD70100(94.9-100)4.52(3.7-5.5)21100(83.9-100)255.6(135.5-481.9)19F-DT制剂lr6698.5(91.8-100)3.45(2.8-4.3)2395.7(78.1-99.9)374.0(192.6-726.2)19F-DT制剂2r7098.6(92.3-100)3.80(2.9-4.9)2996.6(82.2-99.9)249.1(144.7-428.7)6997.1(89.9-99.6)2.56(2.0-3.3)3196.8(83.3-99.9)528.7(319.4-875.2)'在表4中提供不同制剂的组合物。80表13在用1叫19F-PD、3將19F-DT或尸r^v"ar(2|ng19F-CRM)初免接种后1个月抗体浓度>0.2pg/mL、OPA^1:8的受试者百分率和抗19A肺炎链球菌的GMC/GMT(总组)<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>'在表4中提供不同制剂的组合物。实施例5:具有不同0-乙酖化水平的多糖对抗-PS18C抗体的抑制1.引言开发肺炎链球菌荚膜型特异性抗体(抗-PnPS抗体)抑制测定，以比较天然形式或缀合处理后的肺炎链球菌荚膜多糖(PS)表位。除了表征本发明人的缀合物以夕卜，这些测试还用于研究在Prevnar18C(-CRM)缀合物中存在的O-乙酰化水平。本文报告的实验的目标是在这些测定中比较天然多糖18C批次和在PS上存在不同水平O-乙酰基的其它18CPS。已应用了抗-SP1008(实施例3)、18C-TT(实施例2)、18C-DT和Prevnar血清。2.材fl"和方法多糖PS18Cox007:17%O-乙酰基含量(通过NMR)-按照在WO96/O5859的实施例4(通过乙酸水解)中描述的方法产生，之后用高碘酸盐氧化PS18Cox011:79%O-乙酰基含量(通过NMR)-由微流化的PS产生，之后用过氧化氬温和水解，并用高碘酸盐氧化血清通过合并用SP1008(11Pn-PD)或用Prevnar免疫的研究11PnPD&Di007的嬰儿的血清，获得型特异性抗体。由用SP1008、Prevnar或含有PS18-DTah或PS18-TTah(AH=具有ADH接头)缀合物的实验制剂免疫的动物获得小鼠和豚鼠混合血清。友逢ELISA:'用天然18CPS包被微量培养板。*通过与79%O-乙酰化或脱-O-乙酰化的PS的连续2倍稀释液预温育抑制抗-PnPS18C抗体，然后加入包被的微量培养板。然后按照通常的抗-PSElisa测定程序处理平板。计算抗-PnPS血清的抑制百分率(受抑制的对未受抑制的)，并将该百分率对抑制剂浓度作图。调理吞噬稀释抗-PnPS18C抗体，以在经典调理吞噬测定中获得对肺炎链球菌18C菌抹的95-100%的杀伤作用，所述抗体通过与79%O-乙酰化或脱-O-乙酰化的PS的连续2倍稀释液预温育而受抑制，并引入到调理吞噬反应混合物中。*随后，按照惯例实施对肺炎链球菌的调理吞噬测试。计算抗-PnPS血清的抑制百分率(受抑制的对未受抑制的)，并将该百分率对抑制剂浓度作图。3.结果为了确定0-乙酰化水平对18CPS的重要性，实施抑制ELISA和调理吞噬实验。通过乙酸水解和高碘酸盐氧化获得低O-乙酰化的18CPS。在抑制ELISA和OPA中测试的两种PS为PS18C007=17%O乙酰基，而PS18C011=79%0乙酰基。3.1小鼠ELISA和调理吞噬实验國得自用SP1008或Prevnar免疫的小鼠的混合血清的ELISA抑制(图1)。画得自用SP1008或含有PS18画DTah或PS18画TTah綴合物的实验制剂免疫的小鼠的混合血清的ELISA抑制(图2)。ELISA使用O-乙酰化的"天然"PS作为包被抗原，并使用增加浓度的PSOAc(01l)或脱-OAcPS(007)作为抑制剂。引人注目的是，抗-Prevnar抗体被79%0-乙酰化或脱-OAc的PS18C等同抑制，而与此相反，79%O-乙酰化的PS18C比脱-Oac的PS18C更易于抑制抗-18C-PD、抗-18C-TTah和抗-18C-DTah血清。这提示用PS18C-PD缀合物免疫的小鼠产生的抗体与PS的0-乙酰化表位和骨架表位反应。如果该缀合物的18CPS是高度O-乙酰化的并且Balb\c'j、鼠B-细胞库与0-乙酰化表位反应的倾向性，该发现是有意义的。尽管存在这种偏好性，但用Prewar免疫的小鼠几乎不产生与O-乙酰化表位反应的抗体(79%O-乙酰化的和脱-O-乙酰化的PS类似地抑制抗-Prevnar抗体与天然PS的结合)，这强有力地提示，PrevnarPS18C(-CRM)是非O-乙酰化的或低O-乙酰化的。-得自用SP1008或含PS18-DTah或PS18-TTah綴合物的实验制剂免疫的小鼠的混合血清的调理吞噬抑制(图3)。在OPA测定中，用高度0-乙酰化的多糖也观察到对所述抗体介导的杀伤作用的较高抑制作用。不过，在调理吞噬测定中使用的菌林的O-乙酰基含量是未知的。3.2豚鼠ELISA和调理吞噬实验-得自用SP1008或Prevnar免疫的豚鼠的混合血清的ELISA抑制(图4)。-得自用SP1008或含有PS18-DTah或PS18-TTah缀合物的实验制剂免疫的豚鼠的混合血清的ELISA抑制(图5)。-得自用SP1008或含有PS18-DTah或PS18-TTah綴合物的实验制剂免疫的豚鼠的混合血清的调理吞噬抑制(图6)。在豚鼠中，在抑制ELISA或在OPA中没有观察到明显差异，提示豚鼠产生的抗体主要针对多糖18C的骨架表位，不受该抗原的O-乙酰基含量影响。3.3人血清实验得自用SP1008或Prevnar免疫的11PnPD&Di007嬰儿的混合血清的抑制(图7)。如用小鼠抗血清所观察到的，用79%0-乙酰化的PS观察到婴儿抗-18C-PD抗体的更强的抑制作用。用于产生SP1008缀合物的18CPS是高度O-乙酰化的(超过90%)。这表明，婴儿不但针对18CPS的骨架表位产生抗体，而且针对18CPS的O-乙酰化表位产生抗体。抗-prevnar(18C-CRM)血清受到79%O-乙酰化的PS和脱-O-乙酰化的PS的类似抑制的观察结果表明，抗-Prevnar抗体几乎仅与骨架PS表位反应。该结果连同小鼠血清观察结果一起表明，在Prevnar18C-CRM缀合物中的18CPS是非0-乙酰化的，或者O-乙酰化非常低的。-4.—.过i金*在ELISA和调理吞噬这两个测定中，具有79%O-乙酰基的PS18C表现出比仅有17%O-乙酰基的PS18C更好地将小鼠和婴儿抗体84中和至11Pn-PD(SP1008)抗体的能力。*具有79%O-乙酰基和17%O-乙酰基的PS18C均显示出相同的中和Prevnar血清的能力。.这提示，相比于GSK18C缀合疫苗，Prevnar疫苗的PS18C的0-乙酰化非常低或未0-乙酰化。*使免疫应答集中针对骨架表位可能有益于激发针对高度0-乙酰化的和低度O-乙酰化的这两种18C菌抹的抗体应答。权利要求1.一种肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含9种以上、10种以上、11种以上或13种以上缀合载体蛋白的不同肺炎链球菌血清型的荚膜糖，其中所述组合物包含的缀合荚膜糖18C的O-乙酰化程度低于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或10％。2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述缀合荚膜糖18C没有缀合肺炎球菌溶血素。3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述缀合荚膜糖18C没有缀合CRM197。4.权利要求1-3中任一项的免疫原性组合物，其中所述缀合荚膜糖18C没有用还原胺化化学法缀合。5.权利要求1-3中任一项的免疫原性组合物，其中所述缀合荚膜糖18C用还原胺化化学法缀合。6.权利要求1-5中任一项的免疫原性组合物，其中所述荚膜糖18C在其缀合前通过酸处理脱-O-乙酰化。7.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述荚膜糖18C缀合TT，任选地，其中18C是唯一缀合TT的肺炎链球菌荚膜糖。8.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述不同肺炎链球菌血清型的荚膜糖缀合2种以上的不同栽体蛋白。9.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中18C荚膜糖直接缀合所述载体蛋白。10.权利要求1-8中任一项的免疫原性组合物，其中18C荚膜糖经接头与所述载体蛋白缀合。11.权利要求10的免疫原性组合物，其中所迷接头为双功能的。12.权利要求10或11的免疫原性组合物，其中所述接头为ADH。13.权利要求10-12中任一项的免疫原性组合物，其中通过石灰二亚胺化学法使所述接头与所述载体蛋白连接，优选使用EDAC。14.权利要求10-13中任一项的免疫原性组合物，其中在所述载体蛋白与所述接头缀合前使所述糖与所述接头缀合。15.权利要求10-13中任一项的免疫原性组合物，其中在糖与4妻头缀合前使载体蛋白与接头缀合。16.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中使用CDAP化学法使所述18C糖与所述载体蛋白或接头缀合。17.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中使用还原胺化使所述18C糖与所述载体蛋白或接头缀合。18.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中载体蛋白对18C糖的比率在1:5-5:1(重量/重量)之间、1:1-4:1(重量/重量)之间、1.5:1-3:1(重量/重量)之间或2:1-2.5:1(重量/重量)之间。19.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述18C糖的Mw高于20x103，任选地低于5x105。20.权利要求19的免疫原性组合物，其中所述18C糖的Mw在20xl()3-100xl03之间。21.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述18C糖或者为天然多糖，或者调整过尺寸。22.权利要求21的免疫原性组合物，其中所述18C糖已通过微流化调整尺寸。23.权利要求21的免疫原性组合物，其中所述18C糖已通过酸水解调整尺寸。24.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中18C糖缀合物的剂量在1-10貼、1-5蹄或1-3蹄糖之间。25.权利要求24的免疫原性组合物，其中所述18C糖缀合物的剂量为3jxg净唐。26.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含任选地作为肺炎链球菌荚膜糖的载体蛋白的流感嗜血杆菌(//aemop/H'/i^/wy/wewzae)的D蛋白。27.前述权利要求中任一项的肺炎链球菌免疫原性组合物，其中所述疫苗包含缀合白喉类毒素(DT)或CRM197的血清型19F荚膜糖，任选地，其中19F是组合物中唯一缀合白喉类毒素(DT)或CRM197的糖。28.权利要求27的免疫原性组合物，其中血清型19F荚膜糖与白喉类毒素缀合。29.权利要求27或28的免疫原性组合物，其中19F荚膜糖与所述载体蛋白直接缀合。30.权利要求27或28的免疫原性组合物，其中19F荚膜糖经接头与所述载体蛋白缀合。31.权利要求30的免疫原性组合物，其中所述接头为双功能的。32.权利要求30或31的免疫原性组合物，其中所述4^头为ADH。33.权利要求30-32中任一项的免疫原性组合物，其中通过石友二亚胺化学法使所述接头与所述载体蛋白连接，优选使用EDAC。34.权利要求30-33中任一项的免疫原性组合物，其中在所述载体蛋白与所述接头缀合前使所述糖与所述接头缀合。35.权利要求30-33中任一项的免疫原性组合物，其中在所述糖与所述接头缀合前使所述载体蛋白与所述接头缀合。36.权利要求27-35中任一项的免疫原性组合物，其中使用CDAP化学法使所述19F糖与所述载体蛋白或所述接头缀合。37.权利要求27-36中任一项的免疫原性组合物，其中载体蛋白对19F糖的比率在1.4:1-1.5:1(重量/重量)之间。38.权利要求27-37中任一项的免疫原性组合物，其中所述19F糖的Mw高于100x103，并任选地低于5xl05。39.权利要求38的免疫原性组合物，其中所述19F糖的Mw在125xl()3画150xl03之间。40.权利要求27-39中任一项的免疫原性组合物，其中所述19F糖或者为天然多糖，或者以不超过x5的因数调整过尺寸。41.权利要求27-40中任一项的免疫原性组合物，其中所述19F糖已通过微流化调整尺寸。42.权利要求27-41中任一项的免疫原性组合物，其中所述19F糖缀合物的剂量在1-10吗、1-5略或1-3昭糖之间。43.权利要求27-42中任一项的免疫原性组合物，其中所述19F荚膜糖的N-乙酰化程度超过50。/Q、60%、70%、80%或90%。44.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少8种荚膜糖缀合相同的载体蛋白。45.权利要求44的免疫原性组合物，其中所述相同的载体蛋白不是白喉类毒素和/或不是破伤风类毒素。46.权利要求44或45的免疫原性组合物，其中所述相同的载体蛋白为流感嗜血杆菌(//.,"y/wewzae)D蛋白。47.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有2种不同的载体蛋白。48.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有3、4或5种不同的载体蛋白。49.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含选自以下的一种或多种或全部载体蛋白DT、CRM197、TT、片段C、dPly、PhtA、PhyB、PhtD、PhtE、PhtDE、OmpC、PsaA、PspC、CbpA、PorB和流感嗜血杆菌D蛋白。50.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含作为载体蛋白的DT或CRM197。51.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含作为载体蛋白的TT。52.前述权利要求中任一项的免疫原性組合物，其中所述组合物包含作为载体蛋白的PD。53.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含肺炎球菌溶血素作为载体蛋白，或作为游离蛋白。54.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物包含PhtA、PhtB、PhtD、PhtE或PhtDE作为载体蛋白，或作为游离蛋白。55.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中至少血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖作为缀合荚膜糖存在。56.权利要求55的免疫原性组合物，其中血清型4荚膜糖的N-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。57.权利要求55或56的免疫原性组合物，其中血清型9V荚膜糖的N-乙酰化程度超过50。/0、60%、70%、80%、90%,和/或0-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。58.权利要求55-57中任一项的免疫原性组合物，其中血清型14荚膜糖的N-乙酰化程度超过50。/。、60%、70%、80%、90%。59.权利要求55-58中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有作为缀合荚膜糖的血清型1荚膜糖。60.权利要求59的免疫原性组合物，其中血清型1荚膜糖的N-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。61.权利要求59或60的免疫原性组合物，其中血清型1荚膜糖的0-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。62.权利要求55-61中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有作为缀合荚膜糖的血清型5荚膜糖。63.权利要求62的免疫原性组合物，其中血清型5荚膜糖的N-乙酰化程度超过50%、60%、70o/o、80%、90%。64.权利要求55-63中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有作为缀合荚膜糖的血清型7F荚膜糖。65.权利要求64的免疫原性组合物，其中血清型7F荚膜糖的N-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%，和/或0-乙酰化程度超过50%、60%、70%、80%、90%。66.权利要求55-65中任一项的免疫原性组合物，其中血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的荚膜糖全部缀合D蛋白。67.权利要求55或66的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有作为缀合糖存在的血清型3荚膜糖。68.权利要求67的免疫原性组合物，其中血清型3荚膜糖缀合D蛋白。69.权利要求55-68中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有血清型6A和/或15B的缀合荚膜糖。70.权利要求55-69中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有血清型19A的缀合荚膜糖。71.权利要求55-70中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有血清型22F的缀合荚膜糖。72.权利要求55-71中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有血清型8的缀合荚膜糖。73.权利要求55-72中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有血清型12F的缀合荚膜糖。74.权利要求55-73中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种荚膜糖与栽体蛋白直接缀合。75.权利要求55-74中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种芙膜糖经接头与所述载体蛋白缀合。76.权利要求75的免疫原性组合物，其中所述接头为双功能的。77.权利要求75或76的免疫原性组合物，其中所述接头为ADH。78.权利要求75-77中任一项的免疫原性组合物，其中通过石友二亚胺化学法使所述4妄头与载体蛋白连接，优选使用EDAC。79.权利要求75-78中任一项的免疫原性组合物，其中在所述载体蛋白与所述接头缀合前使所述糖与所述"l矣头缀合。80.权利要求75-78中任一项的免疫原性组合物，其中在所述糖与所述接头缀合前使所述载体蛋白与所述接头缀合。81.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中使用CDAP化学法使至少一种荚膜糖与所述载体蛋白和/或接头缀合。82.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中使用还原胺化使至少一种荚膜糖与所述载体蛋白和/或接头缀合。83.权利要求82的免疫原性组合物，其中使用还原胺化使荚膜糖3与所述载体蛋白和/或接头缀合。84.权利要求82或83的免疫原性组合物，其中使用还原胺化使荚膜糖1与所述载体蛋白和/或接头缀合。85.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中载体蛋白对糖的比率在1:2-2.5:1(重量/重量)之间。86.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述糖的Mw高于50x103，任选地低于lx106。87.权利要求86的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有Mw介于30(^103-400><103之间的血清型1荚膜糖。88.权利要求86或87的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有Mw介于75xlO、125xl()S之间的血清型4荚膜糖。89.权利要求86-88中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有Mw介于350xl0、450xl(^之间的血清型5荚膜糖。90.权利要求86-89中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有Mw介于1000><103-140(^103之间的血清型6B荚膜糖。91.权利要求86-90中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有Mw介于200><103-30(^103之间的血清型7F荚膜糖。92.权利要求86-91中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有Mw介于250><103-300><103之间的血清型9V荚膜糖。93.权利要求86-92中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有Mw介于20(^103-250><103之间的血清型14荚膜糖。94.权利要求86-93中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有Mw介于900xl0、1000xl(^之间的血清型23F荚膜糖。95.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有作为天然荚膜糖缀合物的血清型5、6B和23F。96.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中所述荚膜糖缀合物的剂量在1-10昭糖/缀合物、1-5吗糖/缀合物或1-3昭糖/缀合物之间。97.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物以3昭糖/缀合物的剂量含有血清型4、18C和19F的荚膜糖缀合物。98.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物以1昭糖/缀合物的剂量含有血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F的缀合物。99.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有未缀合的肺炎链球菌糖，该糖的血清型不同于那些已缀合的糖的血清型，以使已缀合的和未缀合的糖血清型的数目低于或等于23。100.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有一种或多种未缀合的或缀合的肺炎链球菌蛋白。101.权利要求100的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有一种或多种未缀合的肺炎链球菌蛋白。102.权利要求100或101的免疫原性组合物，其中所述一种或多种肺炎链球菌蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、解毒肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Sp133。103.权利要求100-102中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有肺炎链球菌溶血素。104.权利要求101-103中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有PhtX蛋白。105.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有作为游离蛋白或载体蛋白的肺炎链球菌溶血素(例如用于肺炎链球菌荚膜糖)。106.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有作为游离蛋白或载体蛋白的PhtX蛋白(例如用于肺炎链球菌荚膜糖)。107.权利要求106的免疫原性组合物，其中所述PhtX蛋白为PhtD或PhtBD或PhtDE融合蛋白。108.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还含有佐剂。109.权利要求108的免疫原性组合物，其中所述佐剂为Thl应答的优先诱导物。110.权利要求108或109的免疫原性组合物，其中所述佐剂包括选自QS21、MPL⑧或免疫刺激性寡核香酸的一种或多种组分。111.权利要求108-110中任一项的免疫原性组合物，其中所述佐剂包括QS21和MPL。112.权利要求111的免疫原性组合物，其中所述佐剂为脂质体制剂。113.权利要求111的免疫原性组合物，其中所述佐剂为水包油制剂。114.一种疫苗试剂盒，所述疫苗试剂盒含有权利要求1-107中任一项的免疫原性组合物，并还含有用于伴随或序贯给药的如在权利要求109-113中任一项中定义的佐剂。115.—种疫苗，所述疫苗含有权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。116.—种用于制备权利要求115的疫苗的方法，所述方法包括将权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。117.—种免疫人类宿主以抵雄卩肺炎链^求菌感染所致疾病的方法，所述方法包括给予宿主免疫保护剂量的权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗。118.用于治疗或预防肺炎链球菌感染所致疾病的权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗。119.权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗在制备用于治疗或预防肺炎链球菌感染所致疾病的药物中的用途。120.权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗在制备用于治疗或预防O-乙酰化血清型18C菌林和脱-O-乙酰化血清型18C菌林的肺炎链球菌感染所致疾病的药物中的用途。121.权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物或权利要求115的疫苗在制备用于治疗或预防血清型19A菌抹的肺炎链球菌感染所致疾病的药物中的用途，所述免疫原性组合物或疫苗含有血清型19F的荚膜糖缀合物，但不含血清型19A荚膜糖。122.—种在婴儿中激发抵御中耳炎的保护性免疫应答的方法，所述方法包括序贯或伴随给予作为单独组分或联合组分的(i)权利要求1-115中任一项的免疫原性组合物或疫苗，和(ii)来自流感嗜血杆菌的D蛋白，所述D蛋白可为游离的或缀合的。123.—种在嬰儿中激发抵御肺炎链球菌的保护性免疫应答的方法，所述方法给予前述权利要求中任一项的免疫原性组合物或疫苗。124.—种在老年人中激发抵御肺炎链球菌的保护性免疫应答的方法，所述方法序贯或伴随地联合给予(i)前述权利要求中任一项的免疫原性组合物或疫苗，(ii)一种或多种选自PhtX家族和肺炎链i^菌溶血素的肺炎链球菌表面蛋白。125.—种在婴儿中激发抵御中耳炎的保护性免疫应答的方法，所述方法给予前述权利要求中任一项的免疫原性组合物或疫苗。126.—种在婴儿中激发抵御中耳炎的保护性免疫应答的方法，所述方法序贯或伴随给予作为单独组分或联合组分的(i)前述权利要求中任一项的疫苗，(ii)选自PhtX家族和肺炎球菌溶血素的一种或多种肺炎链球菌表面蛋白。127.—种疫苗试剂盒，所述疫苗试剂盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有肺炎链球菌免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有9种以上、IO种以上、11种以上或13种以上缀合载体蛋白的不同肺炎链球菌血清型的荚膜糖，其中不少于和不超过l(或2或3)种荚膜糖缀合破伤风类毒素，所述第二容器含有DTPa或DTPw疫苗。128.—种疫苗试剂盒，所述疫苗试剂盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有肺炎链球菌免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有9种以上、IO种以上、11种以上或13种以上缀合载体蛋白的不同肺炎链球菌血清型的荚膜糖，其中不少于和不超过l(或2或3)种荚膜糖缀合破伤风类毒素，所述第二容器含有MenACWY(脑膜炎奈瑟氏球菌(Mmem"g/^fo)A、C、W135和Y的缀合荚膜糖)，其中第二容器中的一种或多种或全部缀合荚膜糖缀合破伤风类毒素。129.权利要求127或128的疫苗试剂盒，其中在第一容器中所述血清型18C荚膜糖与破伤风类毒素缀合。130.权利要求127-129中任一项的疫苗试剂盒，其中在第一容器中的免疫原性组合物为权利要求1-113中任一项的免疫原性组合物。131.—种用权利要求127-130中任一项的疫苗试剂盒免疫患者的方法，所述方法包括伴随给予免疫保护量的第一和第二容器的疫苗的步骤。全文摘要本发明属于肺炎球菌荚膜糖缀合疫苗领域。具体地说，提供具有多种(例如9种以上)不同肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型的缀合荚膜糖的多价肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)免疫原性组合物，其中所述组合物含有O-乙酰化程度低于80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或10％的缀合荚膜糖18C。文档编号A61K39/09GK101460193SQ200780021080公开日2009年6月17日申请日期2007年4月5日优先权日2006年4月7日发明者J·P·普里尔斯,J·普尔曼,P·德内尔,R·L·比曼斯申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司