基于还原异α酸蛋白激酶调节的癌症治疗的制作方法

专利名称：：基于还原异α酸蛋白激酶调节的癌症治疗的制作方法
技术领域：
：0021本发明主要涉及对蛋白激酶调节敏感的癌症进行治疗或抑制所需要的方法和混合物。具体地讲，本发明涉及多种方法和混合物，它们通常利用从酒花或植物类家族成员金伶^t羼或它的混合物中分离出的化合物或衍生物。
发明内容信号转导受体一般分为三类。第一类受体是渗入质膜并具有某些内在酶活性的受体。这类受体的典型代表包括酪氨酸激酶(例如PDGF、胰岛素、EGF和FGF受体)、酪氨酸磷酸酶(例如T细胞和巨噬细胞的CD45[集束行列式-45]蛋白质)、鸟苷酸环化酶(例如钠尿肽受体)和丝氨酸/苏氨酸激酶(例如活化素和TGF-P受体)。具有内在酪氨酸激酶活性的受体自身可发生磷酸化作用，还可磷酸化其它底物。具有内在酪氨酸激酶活性的许多受体通过磷酸化作用与其它的信号级联中的蛋白质发生相互作用。这些其它的蛋白质包括氨基酸序列域，它与首次在c-Src原癌基因中发现的域同源。这些域称为SH2域。009SH2域中的蛋白质与RTK或受体相关酪氨酸激酶相互作用会使该蛋白质酪氨酸磷酸化。由此引起的磷酸化会(积极地或消极地)改变活性。SH2中具有内在酶活性的若干蛋白质包括磷脂酶C-y(PLC-力、原癌基因c-Ras相关的GTP酶激活蛋白(rasGAP)、磷脂酰环己六醇-3-激酶(PI-3K)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1C(PTP1C)以及其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)Src家族成员。。。在B细胞中，可以通过接头蛋白(例如BCAP、CD19或Gabl)的磷化作用激活BCR刺激的PI3K，该激活产生用于PI3K调节亚基P85的结合位点。由许多IgG受体传递的信号需要Syk和PI3K的参与活动，并需要募集它们的集群受体点。在中性粒细胞和单核细胞中，有人建议将PI3K与FcgRIIA上磷酸化的免疫受体酪氨酸活化基序序列直接结合，作为受体的PI3K募集机理。而最近一篇文章报道了Syk和PI3K之间的分子直接相互作用[MoonKD，等乂，Syk蛋白质酪氨酸激酶和磷脂肌醇3激酶间直接相互作用的分子基础J.Biol.Chem.280,No.2,IssueofJanuary14,pp.1543-1551，(2005)]。大量研究表明COX-2活性抑制剂可减少PGE2的生成，并能有效缓解慢性关节炎(例如RA)患者的疼痛。既然COX-1禾BCOX-2参与组织(胃肠和心血管系统)的重要修复工作，COX抑制酶活性制剂的副作用就更令人担忧。所以，必须设计一个安全的、长期的治疗方法以缓解患者的疼痛。既然通过Syk、PI3K、p38、ERK1/2和NF-kB依赖性通路，COX-2和iNOS合成信号诱导剂，那么这些通路抑制剂会对自身免疫疾病尤其对RA患者关节发炎和变形病症产生疗效。在RAW264.7老鼠巨噬细胞炎症模型内抑制PGE2生成的筛选过程中，发现酒花衍生物p异a酸(RIAA)。在本发明中，我们对RIAA能否直接抑制COX酶活性和/或它能否抑制COX-2和iNOS的诱导作用进行研究。我们发现RIAA并不直接抑制COX酶活性，而是抑制NF-kB驱动的酶诱导，这引导我们对RIAA是否是一种激酶抑制剂进行研究。我们发现RIAA同时抑制Syk和PI3K，这使我们可测定针对各种自身免疫性疾病患者进行的试点研究的疗效。。越来越多的证据证实GSK-3在调节骨骼肌葡萄糖转运活动中存在副作用。例如，使用选择性GSK-3抑制剂，针对抗胰岛素的啮齿类动物进行的急性治疗，可提高全身胰岛素敏感度，并可增强作用在肌肉葡萄糖转运上的胰岛素效应。使用特定GSK-3抑制剂，针对抗胰岛素、前期糖尿病肥胖的Zucker大鼠进行的慢性治疗，可提高口服耐药量和全身胰岛素敏感度，改善血脂异常并增强骨骼肌中IRS-1依赖性胰岛素信号传导。这些结果有力地证明在肌肉中选择性使用GSK-3可对肥胖相关的胰岛素抵抗进行有效干预治疗。图5描绘了塞来昔布(图A)和MgRIAA(图B)对RAW264.7细胞中分析得到的LPS诱导的COX-2介导的PGE2生成的直接酶抑制作用。PGE2的测量单位用pg/ml表示。误差带表示标准偏差(n=8)。图11示意性描绘了相对于溶剂对照，利用.会合Jt處样品糾909提取物或作为阳性对照的吲哚美辛和曲格列酮处理3T3-L1脂肪细胞的非极性脂肪含量。误差带表示95%的置信区间(单尾)。图15是代表性条形图，描述了利用卩引哚美辛或i^^t厲样品H4909提取物诱发TNFa处理过的成熟性3T3-L1细胞的脂联素分泌。图中给出的数值是相对于溶剂对照的百分比；误差带表示95%的置信区间。*与仅用TNFa处理的结果有着显著性差异(p<0.05)。。所以，这显示Aktl在确定尺寸大小方面发挥重要作用，而Akt2参与胰岛素信号传导。对下面表3给出的86个选择性激酶，THIAA制剂分别在浓度大约为1、10、25和50ug/ml时，对激酶抑制(报告中以抑制百分比表示)测得的剂量反应。同样根据下面表4给出的实施例1中的方案，金合欢属制剂在浓度大约为1、5和25|ig/ml对230个以上的选择性蛋白激酶测得的剂量反应。异cx-酸(IAA)、六氢异oi-酸、p酸和黄腐粉制剂在浓度大约为10、25和50(ig/ml时针对86个选择性激酶分别测得的剂量反应结果分别显示在以下表5-8中。表2AmgRho对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表2BmgRho对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>EphBl15317719653ErbB41241257556Fer85412412Fes11213411657FGFRl109110110111FGFRl(V561M)971069192FGFR2126115587FGFR3112943916FGFR4122938358Fgr12112011047Flt41261198531IKKa139140140102JNKlcd71118118107JNK2a2949798101JNK3121785844KDR106107104126Lck9710512588LKB1145144140140MAPK299109112102Pim-l1031004444Pim陽21031098322PKA(b)10477320PKA1041019025PKBfi1171022733PKBa1031014950PKBy1071099933PKCp卯909387PKC肌9910710364PKCa110111112102PKCy86957762PKCS97938487PKCs76888890PKC;93100107103PKCri8299103卯PKC993958690PKQ779093134PRAK99812133PrKX92763238Ron1201109742Ros1051059493Rskl101874831Rsk2腦854014SGK981037977SGK21171104518Syk99935517TBK11011008256Tie210911510032TrkA10765301534<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>CKl(y)77323PAK21037916CKlyl517-4PAK34353CK1丫23151PAK4999158CKly349160PAK56962CK1S60156PAK677221CK2157162128PAR-lBa70208CK2ct2958351PASK13611426cKit(D816H)2772PDGFRB59199cKit(D816V)1119141PDGFRa(腦2V)60115cKit946824PDGFRa10010651cKit(V560G)4950PDGFRa(V561D)59117cKit(V654A)3083PDK1975716CLK333166PhKy2676216c-RAF105画87Pim-l4492CSK74191Pim-2821710cSRC99120PKA(b)104527DAPK1907212PKA998516DAPK275314PKBB619-IDCAMKL210710677PKBa98678DDR2849145PKBy86505DMPK105106116PKCn908144DRAK1924011PKCBI108112磨DYRK2835525PKCJ3II714730eEF-2K1039759PKCa753432EGFR76266PKC724727EGFR(L858R)99401PKCS1059463EGFR(L861Q)90491PKCe1089059EGFR(T7卯M)93297PKCC34102EGFR(T7卯M,L858R)74304PKCt!1079984EphAl106439PKC9883121EphA294826PKCi666963EphA3948350PKD2106雨81EphA455126PKG1B31165EphA51002810PKGla41187EphA7103806Plk3114106115EphA81138419PRAK181835EphBl116638PRK292358EphB2302PrKX491416EphB3109351PTK5999588EphB430113Pyk2卯459ErbB46180Ret23-l-2FAK106782RIPK21039564Fer10613428ROCK-I959054Fes1437443ROCK-II1006639FGFR1125263ROCK-II915939FGFR1(V561M)92502Ron3224FGFR273-2-5Ros954035FGFR32131Rse3514036FGFR43075Rskl4594Fgr78187Rskl7585FItl41121Rsk26043Flt3(D835Y)6515-lRsk378317Flt376163Rsk4712512Flt41232SAPK2a99106106Fms947319SAPK2a(T106M)11010680Fyn2351SAPK2b9910077GRK5969181SAPK31087940GRK611711794SAPK41038657GSK3B1354SGK89342GSK3a521SGK210236Hck8729-2SGK31039634HIPK111011262SIK115285HIPK2927124Snk939661HIPK31069256SRPK156146IGF陽1R14812241SRPK237154IKKB3063STK3310094641IKKa12086USyk223IR121123129TAK110510186IRAKI988549TA02976425IRAK41179547TBK137512IRR917028Tie297677Itk12111448TrkA2042JAK2836923TrkB2200JAK32471TSSK189105JNKlal11811075TSSK297292JNK2a299106102VRK2988867JNK352233WNK2967521KDR906018WNK31109838Lck929325Yes63333LIMK110810453ZAP-70571910LKB112612298ZIPK1048128表5IAA对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)激酶1ug/ml5ug/ml25ug/ml50ug/mlAbl(T3151)1041198456ALK492110113AMPK1221218649Aurora-A1031066120Bmx901251084337<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>MSKl991036661MSK295904445MSSKl90785252p70S6K94988458PAK391662111PAK510110810659PAK698109106102PhKy210310910266Pim-l1041067746Pim-21011088860PKA(b)1041158612PKA11010299106PKBJ31041105776PKBa981039172PKBy10310810476PKcmi10310310259PKCa1061048946PRAK99913818PrKX94929158Ron11711311340Ros1011088475Rskl961017248Rsk2951017636SGK10211010096SGK29912810560Syk8592537TBK11001058286Tie210112411340TrkA1121392420TrkB971119059TSSK29911210975ZIPK1021029573表6朋IAA对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)激酶1ug/ral5ug/ml25ug/ml50Abl(T3151)1131098438ALK4123121108AMPK13313013787Aurora-A1111076427Bmx10310210644BTK110105676139CaMKI14815114056CDKl/cyclinB1181159885CDK2/cyclinA1091128260CDK2/cyclinE83847088CDK3/cydinE11511910885CDK5/p25101946951CDK5/p351101037368CD認cyclinD311912411783CDK9/cyclinTl106966640CHK1127124140144CHK211911711082CKl(y)102102100CKlyl1051036830CKly299994549CKly3104982822CK151101158956cKit(D816H)1161099168CSK100簡109112cSRC10511410337DAPK194673727DAPK272584647DRAK111011910369EphA210612711568EphA81331098974EphBl154162200164ErbB41411228514Fer90621320Fes13712611181FGFR2116120717Fgr12212711891Flt41351168858Fyn1041198281GSK3B138845110GSK3a89825818Hck93997377HIPK210310510098HIPK311712111829IGF-1R138173207159IKKJ51231169879IR1299510581IRAKI142140152120JAK31041036190Lyn1151135680MAPK1100885567MAPKAP-K2104997129MAPKAP-K31111099977MINK107102114123MSK1105101586940<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表7B酸对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>MSSKl95826167p70S6K89956944PAK3103401611PAK5103998144PAK6103988283PhKy21081037940Pim-l104975721Pim-21031016873PKA(b)120104513PKA10310510228PKBIi1141085652PKBa98958058PKBy10510410152PKCIiII10710510049PKCa1081049854PRAK105812411PrKX93866829Ron1081199844Ros1071038098Rskl103996917Rsk29896568SGK10911198100SGK2123113840Syk92816216TBK11101038078Tie211010010679TrkA97665318TrkB1051008611TSSK211210910362ZIPK1051108537表8黄腐粉对所选蛋白激酶的剂量反应效应(以抑制百分比表示％)激酶1ug/ml5ug/ml25ug/ml50ug/mlAbl(T3151)126115164ALK41161007149AMPK1221139081Aurora國A832738Bmx10897220BTK10957220CaMKI1428334CDKl/cyclinB118103461843CDK2/cyclinA10796576CDK2/cyclinE8286189CDK3/cyclinE101100378CDK5/p2597972487CDK5/p351031024144CDK6/cyclinD311079237CDK9/cyclinTl1101074531CHK1121126142149CHK22532CKl(y)9163379CKlyl101795026CKly292483012CK1丫398512215CK1S75321612cKit(D816H)944514CSK11311393100cSRC92502721DAPK1113854920DAPK2105884526DRAK11334019-5EphA212411312152EphA8103922919EphBl92122175161ErbB4132855227Fer5520101Fes13110610226FGFR211689364Fgr10136100Flt47410114Fyn104664218GSK31i12099253GSK3a1028111-4Hck8535170HIPK2110987537HIPK31061029059IGF-1R107113129139IKKB1451186144IR12010897103IRAKI1291048136JAK310484175Lyn974042MAPK191641917MAPKAP-K2999568MAPKAP-K310099177MINK421057MSK111492319MSK212661819MSSK147117544<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>00146THIAA对许多检测激酶活性抑制呈现剂量依赖性关系，在浓度为1、5、25禾口50吗/ml时对激酶FGFR2的抑制百分比分别为7%、16%、77%和91%。在浓度为1、5、25和50pg/ml时对激酶FGFR3(0%、6%、61%和84%)和TrkA(24%、45%、93%和94%)观测到类似的结果。参见表3。，这里以引用的方式并入本文。实验须在三个不同的时间段重复进行三次。每种剂量的抑制率均采用三组独立实验后取平均值的方法获得，并可用以计算已报道的半数抑制浓度。/^^J^^fZZi/z^V^^^7必逻一RAW264.7细胞(TIB-71)，从美国组织细胞培养收集中心(Manassas,VA)购得，并按例4中所述进行传代培养。在温度为37°C，C02浓度5%的培育条件下培育一整夜后，将培养基吸出并代之以200^不加FBS或青霉素/链霉素的DMEM培养液。用LPS剌激RAW264.7细胞，并过夜培养以诱导COX-2的表达。施加LPS-刺激18小时后，将测试材料加入到培养基中。60分钟后再加入钙离子载体A23187。将测试材料溶解在二甲亚砜中以制成250倍稀释的原液。先向1ml画EM培养液中加入4|al这种250倍稀释后的测试材料制剂，随后向细胞板上的八个孔中针对测试材料所需的不同剂量添加20(^1的这种溶液。30分钟后，抽取培养基上清液作为样品并进行PGE2测定。半数抑制浓度是根据例4中描述的两组独立实验所得的四个浓度中的最小值进行计算的。00165]#/定一本实验采用商业化的非放射性流程对PGE2进行定量分析(CaymenChemical,AnnArbor,MI)，实验完全按照例4中所述生产商的推荐流程进行，未进行任何更改。以及该实验室关于A549细胞系历史数据3.2pg/ml(95%置信区间=0.55-0.19)相一致。当向受LPS刺激的RAW264.7细胞中加入以下COX-2诱导物时，RIAA和IAA对PGE2只产生与剂量相关的普通抑制作用。测试材料浓度增加1000倍时，所观察到的RIAA和IAA的抑制率仅分别增加14%和10%。剂量反应曲线斜率的变缓导致RIAA(36mg/ml)和IAA(>1000mg/ml)的IC50值(表10)均在mg/ml范围内。实验中观察到的对以上三个对数单位剂量反应的极小变化，表明在此细胞基活性分析中所观察到的酒花衍生物PEG2抑制影响，可能只是对细胞的一个次要影响，而不是对COX-2的酶活性的直接抑制作用。图4A和图4B分别描述了RIAA和IAA(白色柱)以及本例(灰色柱)的剂量反应数据。加样顺序造成的影响非常明显，该结果支持了RIAA和IAA不是C0X-2酶直接抑制剂的推断。看来(1)在所有经过沐//抑制PGE2生物合成能力评估测试的天然产品中，酒花材料具有最高的抗炎活性；(2)基于RIAA和IAA对C0X-2诱导的抑制形式，可知它们似乎并不是C0X-2酶的直接抑制剂；(3)RIAA和IAA对C0X-2的选择性似乎是基于对C0X-2表达的抑制，而非C0X-2的酶抑制。该选择性不同于塞来昔布，塞来昔布的选择性是基于酶的分化抑制。表10施加LPS刺激过夜后加入测试材料时，RIAA和IAA在RAW264.7细胞中的半数抑制浓度。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>用LPS刺激RAW264.7细胞，并过夜培养以诱导COX-2的表达。施加LPS-刺激18小时后，将试验材料加入到培养基中，60分钟后再加入钙离子载体A23187。30分钟后，抽取培养基上清液作为样品并进行PGE2测定。半数抑制浓度是根据例4中描述两组独立实验中分别在四个浓度下重复测定八次所得的最小值进行计算的。实施例6酒花化合物及其衍生物并不是A549肺上皮细胞中环氧化酶的直接抑制剂。潘應一A549(人肺上皮)细胞购自美国组织细胞培养收集中心(Manassas,VA),并根据供应商提供的使用说明进行传代培养。将这些细胞在37°C,5%C02的培养环境中进行常规培养，所用培养液RPMI1640含10%FBS、50单位青霉素/ml、50pg链霉素/ml、5mM丙酮酸钠和5mML-谷氨酸盐。实验当天，收集以指数生长的细胞，并用不含血清的RPMI1640培养液冲洗。进行，未作任何修改，该流程也称WHMA-COX-2方案。简而言之，在植入A549细胞24小时后，加入白细胞介素-lfi(10ng/ml)以诱导C0X-2的表达。24小时后，用不含血清的RPMI1640培养液出冲洗细胞。随后，将溶于二甲亚砜和不含血清的RPMI中的测试材料加入孔中以获得25、5.0、0.5和0.05pg/ml的最终浓度。每个浓度重复两次。向对照孔中加入与测试孔中液体等体积的二甲亚砜。60分钟后，将A23187(50)uM)加入孔中以释放花生四烯酸。30分钟后从孔中取出25pl培养基进行PGE2测定。001761用肉眼评估细胞的存活率，结果所有被测试的化合物在其最高浓度下均未观察到明显毒性。培养基上清液中PGE2测定及报道如前面实施例4所述，PGE2合成半数抑制浓度(IC50)的计算如前面实施例4所述。00177^"菜一在所有已测试的剂量下，该试验方案未能得到任何酒花提取物或衍生物的半数有效浓度。由于该方案要求对C0X-2的表达刺激应在加入测试化合物之前进行，我们相信测试材料未能抑制PGE2合成的原因是它们的作用机理是抑制COX-2同工酶的表达，而不是直接活化。既然一些直接抑制作用是通过WHMA-C0X-2方案观察到的，该流程似乎不适合对酒花或酒花衍生物的抗炎特性进行评估。实施例7酒花衍生物抑制尘螨过敏原对A549肺上皮细胞中PGE2生物合成的活化001781众^^"^—本实施例中所用的酒花及酒花衍生物如实施例1所述，(1)a酒花(1%a酸，AA);(2)香型酒花0E(10%P酸和2%异构a酸)；(3)异构酒花(异构a酸，IAA);(4)P酸溶液(P酸BA);(5)金牌六氢异构酒花(六氢异构a酸，HHIAA);(6)还原异构酒花(还原异构a酸，RIAA);(7)四氢异构酒花(四氢异构a酸，THIAA)。其它所有化学品均从实施例4所述的供应商处购得。测试材料的最终浓度为10pg/ml，尘螨过敏原应在测试材料加入60分钟后加入。^^、过^^"分靡一務^:、艚是美国室内的尘螨。教4、麟在室温及75%湿度条件下词育，所用词料是PurinaLaboratoryChow(RalstonPurina,Co,St.Louis,M0)和弗莱希曼氏颗粒状干酵母(StandardBrands,Inc.NewYork,NY)以1:1的比例进行配制的。当活螨虫从培养基中迁出时，将其从培养瓶中吸出冷冻杀死，然后制成干粉并在0%湿度条件下贮存。在室温下用水萃取螨尘的过敏原成分。将500mg螨粉加入到装有5ml水(1:10w/v)的15ml的圆锥形离心管(VWR，Rochester,NY)中，振摇1分钟并在室温中静置过夜。次日，将水相用540.2)nm—次性注射式过滤器(Nalgene，Rochester,NY)过滤。滤液称为螨尘过敏原，用于在A549肺上皮细胞中对PGE2生物合成进行诱导测试。^度伊遂'一在缓冲液E中配制细胞提取物(50mMHEPES，pH7.0;150mM氯化钠；1%tritonX-100;1mM原钒酸钠；抑肽酶5ng/ml;抑肽素A1叫/ml;亮肽素5|^g/ml;苯甲基黄酰氟1mM)。简而言之，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)润洗细胞2次后加入缓冲液E。将细胞刮入一个干净的试管中，接着以每分钟14，000转的转速在4°C条件下离心作用10分钟，并将上清液取出作为全部的细胞提取液。用细胞提取物(50网)在预制的4%-20%三羟甲基氨基甲烷盐酸盐标准凝胶(Bio-Rad公司，赫拉克勒斯，美国加州)中做电泳，直至染色泳移前沿到达胶底部有5誦处为止。使用Bio-Rad公司(赫拉克勒斯，美国加州)的半干系统将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后用5%的干奶粉在室温下对膜进行1小时的冲洗和封闭。用第一抗体在室温下培育1小时后，再用第二抗体在室温培育1小时。通过将等体积的鲁米诺/增强剂溶液和稳定的过氧化物溶液在室温下培育5分钟的方法，使用PierceBiotechnology公司(罗克福德，美国伊利诺斯州)的SuperSignalWestFemto最大敏感性基质便可进行化学发光。用冷却的CCDKodak(罗彻斯特，美国纽约州)IS1000成像系统拍摄免疫印记的图像。使用Kodak软件运行密度仪。用免疫印记检测法对C0X-2和iN0S蛋白表达的百分比进行评估。用LPS刺激20小时后观察COX-2的表达。同对照溶剂DMS0相比，可观察到使用MgRIAA时COX-2蛋白的表达下降了55%(图6)。NF-kB的特异性抑制剂小白菊内酯，会抑制22.5%的蛋白表达，而PI3-激酶抑制剂会使C0X-2表达降低约47%(图6)。此外，用MgRIAA施加20小时的LPS刺激后，能观察到iNOS的蛋白表达下降了73%(图7)。实施例10NF-kB的核转位与DNA结合AF-"5-力yV力##合一核提取物的准备基本上根据Dignam等人的描述进行[NuclAcidsRes11:1475-1489,(1983)]。简单来讲，先将细胞用冷PBS液润洗两次，然后加入缓冲液A(10mM冊PES，pH7.0;1.5mMMgCl2;10mMKC1;0.1%NP-40;抑肽酶5吗/ml:胃酶抑素A1吗/ml;亮肽酶素5吗/ml;氟化磺酰甲苯1mM)并进行15分钟的冰浴。然后将细胞刮入一个干净的试管中，并循环冷冻与解冻三次。在4°C下10000xg加速度下离心5min所得上清液层即为细胞质的组分。将剩余物重新悬浮在缓冲液C(20mMHEPES，pH7.0;1.5mMKC1;420mMKC1;25%甘油；0.2MEDTA;抑肽酶5|ug/ml;胃酶抑素Al吗/nil;亮肽酶素5ng/ml;氟化磺酰甲苯lmM)中，并进行15分钟的冰浴。在4°C下10000xg加速度下离心5min后收集上层核提取物组分。细胞核提取物的NF-kBDNA结合分析使用ActiveMotif公司(卡尔斯巴德，美国加州)的TransAMNF-icB试剂盒并按照生产商的使用说明来完成。如图8所示，TransAM测试盒检测96孔细胞板上结合到共有序列上的NF-kB的p50亚基。然后测定蛋白质浓度(Bio-Radassay公司)并重复分析10核蛋白提取物。重复进行核提取物(10蛋白质)的分析并将结果以图9所示的图形表现出来。LPS(1pg/ml)的刺激会使NF-kB基因结合率增加两倍。用LY294002(—种PI3激酶抑制剂)进行处理会导致NF-kB结合率降低，这和以往文献的报道相符。小白菊内酯也能导致NF-kB结合率显著降低，这点和我们的预期是一致的。使用MgRIAA时也能观察到NF-KB的结合率大幅降低。以剂量反应的方式也能观察到这一影响。NF-kB结合力的降低可能导致包括COX-2、iNOS以及TNFci在内的目标基因翻译活性降低。，人们还可对试剂的胰岛素增敏和甘油三酸脂沉降能力进行研究。。噻唑烷二酮类，如曲格列酮和吡格列酮这类药物，已经显示出在脂肪细胞中能选择性刺激脂肪生成活性，从而得到更大的脂肪分解胰岛素抑制或将脂肪酸释放到血浆中[Yamauchi,T.，J.Kamon，等乂，杂合过氧化物酶体增殖激活受体Y(PPARy)缺乏和PPARy激动剂提高胰岛素抵抗性的机制JBiolChem276(44):41245-54，(2001);0akes，N.D.，P.G.Thalen,等乂，噻唑烷二酮类药物增加血浆-脂肪组织FFA交换容量并增强胰岛素介导游离脂肪酸体系控制的有效性，Diabetes50(5):1158-65，(2001)]。该行为使其他组织可利用的游离脂肪酸更少[Yang,W.60S.,W.J.Lee，^X.体重减轻会增加脂源型抗炎性蛋白质、脂联素的血浆水平。JClinEndocrinolMetab86(8):3815-9，(2001)]。因此，肌肉和肝脏中游离脂肪酸的胰岛素减感效应将由于噻唑垸二酮处理的结果而减弱。这些錄^/结果己在临床上得到证实[Boden,G.不饱和脂肪酸在胰岛素抵抗和非胰岛素依赖型糖尿病发病机理中的作用。Diabetes46(1):3-10，(1997);St咖voll,M.与H.U.HaringGlitazones:临床效果与分子机制.AnnMed34(3):217-24,(2002)]。。用PBS(磷酸盐缓冲液，Mediated!)润洗单层细胞，然后用10%甲醛固定10min。将三份0.6%油红0/异丙醇原液与两份水混合得到油红0工作液，并将己固定的细胞在其中染色1小时，然后水洗一次去除过量的染料。用异丙醇从细胞中提取出染色油滴，并使用光谱光度测量技术在540nm波长下对其进行定量分析(MEL312eBIO-KINETICSREADER,Bio-TekInstruments公司，文奴斯基，美国佛蒙特州)。实验材料和作为阳性对照的吲哚美辛以及曲格列酮的实验结果，以540nm下溶剂的相对吸光度表示。。简而言之，第6日，将细胞在含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)无血清的培养基中培养三个小时，接着利用1胰岛素/ml加溶剂或1吗胰岛素/ml加测试材料进行处理。将曲格列酮溶解在二甲基亚砜中以获得5、2.5、1.25和0.625pg/ml的浓度。.会洽^t富提取物测试浓度为50、25、12.5和6.25pg/ml。24小时后，对培养基上清液取样以进行脂联素测定。利用测试材料对细胞进行分化和处理的完整流程概述于图12中。以确定表观米氏常数和最大速度。利用自变量v/[S]替换{相对脂联素分泌/[浓度]},而利用应变量(v)替换{相对脂联素分泌}，生成一个y=mx+b的关系式。利用Y截距方法估算相对溶剂对照的脂联素分泌最大值，而利用斜率的负值计算测试材料必要的半最大值处的脂联素分泌浓度。錄菜一在抗胰岛素3T3-Ll细胞中，利用2.5吗/ml的浓度，相对溶剂对照2.44倍的最大刺激，作为阳性对照的曲格列酮所有测试浓度增加了脂联素分泌(图13)。50和25pg/ml浓度的会^Jt厲增加了脂联素分泌，分别为溶剂对照的1.76倍和1.70倍。虽然#_^^^的两个浓度均不等于利用曲格列酮测定的脂联素分泌最大值，但是它们可与浓度为1.25和0.625pg/ml曲格列酮作用相当。碧—菜一TNFa较大(p<0.05)降低了脂联素分泌，相对于溶剂对照而言，在浓度在10和2ng/ml情况下成熟3T3-L1细胞的降低比分别为65%和29%，而浓度在0.5ng/ml时对脂联素分泌并没有显著影响(图15)。TNFa浓度为10和2ng/ml时，在所有的测试剂量上与仅施加TNFa相比，吲哚美辛的加入提高了(p<0.05)脂联素分泌，但并不能将脂联素分泌恢复到溶剂对照的水平上。TNF(i浓度为10ng/ml时，加入.会会^t^进行处理与吲哚美辛相比，对脂联素分泌产生一个类似的、很微弱的增加。在逐渐增加的四种剂量上，会会Jt^和d引哚美辛之间对脂联素分泌的差值分别为14、20、32和41%。既然」会合^t羼和吲哚美辛剂量间的倍数是相同的，这些结果表明在上述生理浓度TNFa存在的情况下，在重新恢复3T3-Ll细胞脂联素分泌水平方面，吲哚美辛与金会^t虜中的活性物质相比具有更高的效力。m/[脂联素]F。，*来自TNFa溶剂反应的显著增加(p〈0.Q5)。一使用5/8"金属钻头在标准功率下对大片i合^t^乂Z茶心材样品貼669(每片重量在5-10克之间)进行低速钻孔。然后将刨花收集到研钵中，在液氮冷冻下研磨至细粉状。然后将粉末通过一个250微米的筛网进行筛分以得到大约10g的自由流动精细粉末。表14用于3T3-L1脂联素分析的-会^^^17L芬提取物样品描述<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>1胃液组成为2.90gNaCl、7.0ml浓縮HC1水溶液、3.2g胃蛋白酶(800-2500活性单位/mg)，并加入1000ml水进行稀释。最终pH为1.2。对于本提取操作，胃液-心材悬浮液要在40°C下保温一小时，随后在"^"^^^移除胃液。然后将剩余残留物溶解在甲醇中，通过0.45微米聚四氟乙烯注射式过滤器进行过滤并在真空中浓縮。002411将粉末分配到六个琥珀色玻璃定量瓶中(150mg/瓶)，然后在40°C下用2ml表14中所列溶剂提取大约IO小时。提取结束后，将心材/溶剂悬浮液进行离心分离(转速5800xg下离心IO分钟)。随后将离心分离所得上清液部分通过0.45微米聚四氟乙烯注射式过滤器过滤到各自的琥珀色玻璃瓶中。每个样品都要在真空中进行浓縮。如表7所示，二甲亚砜从」会^^tl7L茶植物心材中提取的原料最多，而三氯甲烷提取的量最少。所有提取物样品均在50、25、12.5和6.25(ag/ml浓度下进行测试。漠逸y—这些实验中用到的是实施例11中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。实验所用的标准化学药品如实施例11和13所述。将3T3-L1脂肪细胞用浓度为10ng/ml的TNFa按实施例13所述方法进行处理。如实施例13详述在第6天取出培养基上清液并对脂联素进行分析。一金^^t^7L茶样品#5669根据以下流程进行提取将碱性异丙醇溶液，(含有1.5NNaOH的1%(体积比)异丙醇溶液，)加入到装有约50mg干燥金会^t^乂L芬心材粉末#5669的50ml试管中。然后将样品简单混合处理，超声降解30分钟，再离心分离一个小时使剩余固体材料成粒。随后将上清液用0.45微米滤纸进行过滤。实验中用到的碱性异丙醇pH为8.0，收集液的pH为7.0。将过滤后的清液部分在^^3^^进行干燥后得到白色固体。该样品称为干燥碱性提取物。，m/[脂联素]T,对照"值>1.11与TNFa对照(p<0.05)存在显著性差异。实施例18通过金洽Jt^样品水提取物的二甲亚砜可溶部分诱导TNFa-处理的3T3-L1脂肪细胞内白细胞介素-6分泌的减少。。人们已经在包括细菌和病毒感染、外伤、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及代谢综合征等若干病理状态中观察到这种血清浓度水平的提高[Arner，P.II型糖尿病中的胰岛素抵抗——脂肪素的作用。CurrMolMed.;5(3):333-9,(May2005)]。sm/[脂联素]T,付IL-6指数=[IL-6测试-IL-6对照]/[IL-6醫。-IL-6对照〗*这与TNFa对照有显著差异(p<0.05)。漠—在这些实验中，采用实施例U中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。所用的标准化学药品以及统计程序如实施例11和12所述。IL-6如实施例18所述进行分析。76样品#4909会以剂量相关的方式增加脂联素分泌(表18)。在佥会^t^乂L芬浓度仅为6.25Hg/ml时，通过减少IL-6分泌显示出其抗炎作用，曲格列酮在浓度为5.00和1.25^g/ml时具有促炎性，在另外两个浓度下未观察到任何效果。使用曲格列酮时，抵抗素分泌以剂量依赖的方式增加；然而，-会^^^^乂乙芬以同样的剂量依赖方式降低抵抗素的表达。w;/[脂联素]a岛素对照卞卞IL-6指数=[IL-6测试]/[IL-6胰岛素对照]卞忖抵抗素指数=[Resistin测试]/[Resistin胰岛素对照j*指数值表示平均值±95%置信区间，它是根据方差分析的剩余均方计算而来。大于或小于胰岛素对照±95%置信区间的数值与p<0.05时存在显著差异。实施例20使用源自酒花的植物化学成分增加脂肪细胞中的脂肪生成。。替换{相对脂联素分泌/[浓度]}，而利用应变量{v}替换{相对脂联素分泌}，生成一个y=im+b的关系式。利用Y截距方法估算相对溶剂对照的80脂联素分泌最大值，而利用斜率的负值计算测试材料必要的半最大值处的脂联素分泌浓度。002691君菜一在抗胰岛素3T3-U细胞中，阳性对照曲格列酮在浓度为2.5pg/ml时能最多能将脂联素分泌提高到溶剂对照的2.44倍(图19)。相对于溶剂对照，所有测试的酒花植物化学成分均证实对脂联素分泌有增强作用，其中异a酸能显著生成比曲格列酮更高的脂联素分泌(为对照的2.97倍)。实验中观察到测试的四个试剂中，异a酸、p异a酸、六氢异a酸和四氢异a酸可产生最大脂联素分泌的最大剂量为5pg/ml。对于黄腐酚、酒花残留物和六氢类蛇麻酮，脂联素分泌增加的最大值分别在其浓度为1.25、25和12.5)ag/ml时观察到。黄腐酚、p异a酸和酒花残留物的最大相对脂联素表达与曲格列酮相当，而六氢异a酸、六氢类蛇麻酮和四氢异a酸的最大相对脂联素表达则比曲格列酮低而比对照高。表20分别从v截距和Hofstee点斜率估算最大脂联素分泌量及半数最高脂联素分泌所需的测试材料浓度。最大脂联素分泌[i]半数最高分泌量时测试材料的浓度[Hg/ml]<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>[1]根据四种测试浓度的Hofstee点线性回归分析估算[2]忽略一个异常数据，使用其它三个浓度估计剂量反应测试/[脂联素]膀岛素对照忖IL-6指数^[IL-6测试]/[IL-6胰岛素对照J*指数值是平均值±95%置信区间，它是根据方差分析的剩余均方计算而来。对脂联素或脂联素/IL-6来说，数值<0.7或>1.3与胰岛素对照有显著差异；而对IL-6来说，数值<0.77或>1.23与胰岛素对照有显著差异。弁与胰岛素对照pO.05有显著差异。模至y—在这些实验中，采用实施例11和13中所述的3T3-L1小鼠成纤维细胞模型。混合在所有剂量下均显示协同作用，而金合欢属RIAA[10:1]在10和5.0(ig/ml浓度下显示协同租用，并在其它任何测试浓度下均未发生拮抗。金合欢属IAA[10:1]混合物在两个中等浓度下也呈现协同作用，并且未发生拮抗。而金合欢属IAA[5:1]在浓度为50pg/ml时具有协同作用，在浓度为5.0pg/ml时发生拮抗。00284类似地，所有混合物在一个或多个测试浓度下对增加脂联素分泌均显示协同作用(表23)。金合欢属IAA[10:1]混合在所有剂量下均显示协同作用，而金合欢属RIAA[5:1]和金合欢属RIAA[10:1]在三种剂量下显示协同作用，而在一种浓度下发生拮抗。金合欢属IAA[5:1]混合在浓度为1.0pg/ml时具有协同作用，在浓度高于10pg/ml时发生拮抗。表22抗胰岛素3T3-1模型中金会^t^乂乙芬和酒花衍生物诱发的脂肪生成反应的观测值和预期值。脂肪生成指数卞测试材料浓度[pg/ml观测值预期值结果金合欢属/RIAA[5:1]1501,050.98协同作用87<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>卞脂肪生成指数-[OD〗测试/[OD]廳)对照。O95%置信区间上限是1.03，最小显著性差值=0.03。2)95%置信区间上限是1.03，最小显著性差异=0.03。3)95%置信区间上限是1.07,最小显著性差值=0.07。4)95%置信区间上限是1.02,最小显著性差值=0.02。表23TNFa/3T3-1模型中1会-^#乂乙芬和酒花衍生物诱发的脂联素分泌观测值和预期值。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>金合欢属/RIAAno:"2501,291.11协同作用101.070.95协同作用5.00.941.06拮抗作用1.01.030.94协同作用金合欢属/IAA[IO:I]2501.280.82协同作用101.121.07协同作用5.01.110.99协同作用1.01.301.05协同作用t脂联素指数=[脂联素]纖/[脂联素]，。对照，1)95%置信区间上限是1.07，最小显著性差值=0.07。2)95%置信区间上限是1.03，最小显著性差异=0.03。会合^^f乂Zz芬和酒花衍生物p异a酸或异ct酸的混合显示具有协同作用，只有极少的混合会在提高脂肪细胞中的脂质成分并增加脂肪细胞中脂联素的分泌上显示拮抗作用。实施例25酒花衍生物在脂多糖/3T3-Ll脂肪细胞模型中的抗炎活性。100286一在这些试验中，采用实施例11和13中所述的3T3-L1小鼠脂肪细胞模型。IL-6指数卞抑制百分比％二甲亚砜对照一0.09*91*LPS对照±95%置信区间一1.00±0.300吲哚美辛5.000.47*53*曲格列酮10.00.31*69*吡格列酮5.000.37*63*p异a酸1.250.63*37*异a酸1.250.61*39*阿司匹林25.00.61*39*水杨酸50.00.52*48*布洛芬0.6250.46*54+塞来昔布2.500.39*61*将测试材料与100ng/ml的LPS—起加入到D53T3-L1脂肪细胞中。隔日，对培养基上清液取样进行IL-6测定。所有数值均如下所示对LPS对照取指数。表中所示的浓度代表能提供IL-6分泌最大抑制的剂量，那些小于0.70的数值显著(p<0.05)低于LPS对照。卞IL-6指数=[IL-6测试-IL-6x]/[IL-6LPS-IL-6对照]*这与LPS对照有显著差异(p0.05)。表25酒花衍生物和选用的非甾体抗炎药物对LPS/3T3-L1脂肪细胞中脂联素分泌的最大刺激。测试材料浓度[Hg/ml]脂联素指数卞刺激百分比％二甲亚砜对照一1.24LPS对照±95%置信区间—1.00吲哚美辛2.501.09*9曲格列酮0.6251.15*15吡格列酮1.251.12*12p异a酸0.6251.17*17异a酸0.6251.20*20阿司匹林1131.02NS水杨酸1730.96NS布洛芬0.6251.22*22塞来昔布5.001.05NS卞脂联素指数=[脂联素]测试/[脂联素]LPS对照91*数值大于1.07表示与LPS对照有显著差异(p<0.05)。NS二与LPS对照无明显差异。实施例26在TNFa/3T3-l模型中金^^t^J7^茶或酒花衍生物与姜黄素或黄腐酚混合时的协同效应。测试/[脂联素]TNF。对照1)95%置信区间从0.961到1.049，最小显著性差异=0.049。实施例27共轭亚油酸与酒花衍生物p异a酸混合在抗胰岛素3T3-L1脂肪细胞模型中对脂肪生成的体外协同作用。冴/试众合激i!必逻一实验中用到的标准化学药品如实施例11所述。为计算脂肪生成指数，3T3-L1脂肪细胞须在发生分化前按实施例11中所述进行处理。粉状CLA购自LipidNutrition(美国伊利诺斯州Channahon)公司，其药品为同分异构体c9tl1和tl0cl2的1:1混合物。CLA及CLA:RIAA的5:1的混合物在10、5、1.0和1.0pg/ml四个浓度下进行测试。为了计算预期的脂肪生成指数，将RIAA在10、l.O和O.1pg/ml三个浓度下按前述方法进行测试。^"菜—RIAA与CLA混合可协同增加甘油三酯含量。在所有剂量下均观测到协同作用(表27)。1501.261.15协同作用101.161.06协同作用5,01.161.10协同作用1.01.171.06协同作用卞脂肪生成指数=[OD]测试/[OD]斷。对照。1)95%置信区间上限是1.05，最小显著性差异=0.05。实施例28酒花植物化学成分抑制TNFct-处理后的3T3-L1脂肪细胞中NF-kB的活性。003001#^〃一在这些实验中，采用实施例11中所述的3T3-LI小鼠成纤维细胞模型。900301]邀^^i,^^7必潘一在3T3-L1脂肪细胞分化后将其置于后分化培养基中再培养40天。标准化学药品、培养基以及酒花化合物RIAA和黄腐酚如实施例13和20所述。在2.5和5.0pg/ml浓度下，对酒花衍生物和阳性对照吡格列酮进行测试。测试材料应在核提取物制备3小时和24小时前的1小时加入，随后用TNFa进行处理。00302^"^T虑疫级/^^/定一在3T3-L1脂肪细胞分化后将其置于生长培养基中培养40天。使用ActiveMotif(美国加州卡尔斯巴德镇)公司的TransAMNF-kB试剂盒对核NF-kBp65进行测定，未做任何修改。试剂盒中的Jurkat核提取物源自在含有50ng/mlTPA(佛波醇，12-豆蔻酸，13醋酸盐)和0.5钙离子载体A23187的培养基中培养的细胞，该细胞在收集前在37°C下培养2小时。00303]蛋白质分析一核蛋白使用ActiveMotif荧光蛋白定量试剂盒进行定量分析。测试化学药品及处理一二甲双胍购自Sigma公司(美国密苏里州圣路易斯市)。将测试材料在分化的当天加入二甲亚砜中，之后每2天添加一次，直至成熟期结束(第6/7天)。加入作为阳性对照的曲格列酮使其最终浓度达到4.4Hg/ml。将测试材料二甲双胍、金合欢属儿茶样品#5669以及二者1:1(w/w)混合物在50pg/ml的浓度下进行测试。分化后的3T3-L1细胞用0.2%的油红0染色，染色后的油滴用异丙醇溶解并在530nm下用分光光度法进行定量分析。结果显示溶剂对照中完全分化细胞的相对甘油三酯含量。提出。003101—会会^^f乂^芬提取物具有很强的脂肪生成能力，可将3T3-L1细胞中甘油三酯含量提高32%(图23)，从而获得1.32的脂肪生成指数。由于脂肪生成指数为0.79，单独使用二甲双胍并不能促进脂肪生成。实验观测到二甲双胍/金会^t^乂L芬提取物的混合物的脂肪生成指数为1.35。二甲双胍/会^^t,乂L芬提取物的脂肪生成指数为98，该值落在期望值95%置信区间上限的2%以外，因而表明有协同作用。,对照。1)95%置信区间上限是1.02，最小显著性差异=0.02。2)95%置信区间上限是1.05，最小显著性差异=0.05。实施例31。-异a酸和二甲双胍在TNFa/3T3-Ll脂肪细胞中的沐//协同作用IL-6指数卞抑制百分比％说明二甲亚砜对照一0.16——TNFa对照±95%置信区间一1.00±0.07*0—曲格列酮1.00.6634—RIAA1.00.7624—二甲双胍500.7822—二甲双胍/1RIAA500.6832协同作用二甲双胍100.7822二甲双胍/1吗RIAA100.8614拮抗作用二甲双胍5.00.964—二甲双胍/1吗RIAA5.00.919无效果二甲双胍1.00.919二甲双胍/1ngRIAA1.00.5644协同作用在指定浓度下将测试材料连同10ng/ml的TNFa加入到D53T3-Ll脂肪细胞中。隔日，对培养基上清液取样进行IL-6测定。所有值均对TNFa对照取指数。卞IL-6指数=[IL-6溯试-IL-6対照]/[IL-6t^-IL-6对照〗*数值小于0.93显著(pO.05)低于TNFa对照。实施例32测试化合物对癌症细胞錄》/增殖的影响^"兹一在RL95-2子宫内膜癌细胞模型(AKT激酶过度表达)、HT-29(组成性表达C0X-2)模型和SW480(组成性表达激活的AKT激酶)肠癌细99胞模型中检测本发明的测试化合物对癌细胞增殖的抑制效果。简而言之，将耙细胞植入96孔组织培养盘中使其不断生长直至接近汇合。然后如实施例4所述用不同剂量的测试化合物将细胞处理72小时，并用CyQuant(Invitrogen公司，美国加州卡尔斯巴德)商用荧光分析仪测定细胞相对增殖情况。00322]潜菜一用10吗/ml的MgDHIAA(mgRho)、IAA、THIAA、TH-HHIAA(THIAA和HHIAA的1:1混合物)、Xn(黄腐酚)、LY(LY249002，PI3K抑制剂)、EtOH(乙醇)、alpha(a酸混合物)以及p(p酸混合物)对RL95-2细胞进行72小时处理。对细胞增殖的相对抑制情况如图24所示，相对于DMSO溶剂对照，黄腐酚的抑制程度要高于50%。图25和26所示是不同浓度的RIAA和THIAA对HT-29和SW480癌细胞各自的剂量反应结果。RIAA和THIAA对HT-29细胞系的半数抑制浓度分别为31和10^M，对SW480细胞系的半数抑制浓度分别为38pM和3.2nM。实施例33金会^t^yg罗和酒花衍生物对KK-Ay鼠糖尿病模型中的体外降血糖作用。——会^欢虜y^罗样品#5659如实施例14所述，而所用酒花衍生物p-异a酸、异a酸和黄腐酚如实施例20所述。金合欢属尼罗、RIAA和IAA每天按100rag/kg进行给药，而XN按20mg/kg进行给药。此外，将—会^100右罗和RIAA、IAA、以及XN以5:1和10:1配制混合物并按每天100mg/kg的剂量给药。结果—在3天的治疗期间，对照鼠的非空腹血糖含量升高2.6%，而胰岛素含量降低6.7%。罗格列酮、金会^t^y&罗、XN:Acacia[1:5]混合物、XN:Acacia[1:10]混合物、Acacia:RIAA[5:1]混合物、黄腐酚、Acacia:IAA[5:1]混合物、异a酸和p-异a酸均可降低非空腹血糖，而对胰岛素无效果。Acacia:RIAA[10:1]混合物和Acacia:IAA[10:1]混合物对血糖和胰岛素均无效果(表30)。本实验使用C57BLKS/Jm+/m+L印rdb(db/db)雄鼠对测试材料降低空腹血糖或胰岛素浓度的能力进行分析。这一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受体而对瘦素产生抗性。血浆胰岛素从第10天到第14天这段时间开始升高，血糖从4到8周开始升高。在测试时(9周)动物体重显著增加50±5g，并呈现胰岛肥大的迹象。003301一阳性对照二甲双胍和罗格列酮连续三天每天分别按300mg/kg和.Omg/kg的剂量给药。i会Jt^yg^7样品#5659、酒花衍生物和它们的混合物如前文所述进行给药。混合物最有效，使血清胰岛素水平降低21%，而二甲双胍只能使胰岛素浓度降低17%，噻唑烷二酮类罗格列酮使其降低15%。金合欢属RIAA[5:1]混合物的反应要高于两者中的单独成分，从而可显示协同作用。单独使用j会会^t^^芕不能减少血清葡萄糖或血清胰岛素，而RIAA减少血清胰岛素的程度与二甲双胍相近。在剩余测试材料中，金合欢属IAA[10:1]混合物还可有效降低血清胰岛素浓度。00333]在db/db鼠2型糖尿病模型中，由p-异a酸造成的血清胰岛素含量快速下降以及由黄腐酚造成的血糖含量下降，表明它们在治疗与胰岛素不敏感症和高血糖症有关的人类疾病方面具有潜在的临床疗效。此外，p-异a酸和金合欢属儿茶的5:1混合物在db/db鼠糖尿病模型中呈现协同效应。p-异a酸、黄腐酚和金合欢属:RIAA[5:1]成分对2个独立的糖尿病动物模型和3个錄^/模型的阳性反应表明它们可用于降低血糖或提高胰岛素敏感性的临床表现中。表31金会^t^yg罗和酒花衍生物对db/db糖尿病鼠体内非空腹血糖和胰岛素的效应。剂量t葡萄糖胰岛素测试材料[mg/kg-每天[预治疗百分比％][预治疗百分比％]对照(临界值)-103.6(98.4)94.3(84.9)金合欢属RIAA10099.679.3#1二甲双胍30067.6#83.3#p-异a酸100102.383.抑金合欢属IAA100104.384.4#1罗格列酮1.083.0#84.7#XN:金合欢属[1:10]100101.591.1i^欢虜y^罗样品100100.491.9#5659金合欢属RIAA100101.693.51异构ct酸100100.895.8黄腐酚2097.8#101.6XN:金合欢属[1:5]1100104.1105.6金合欢属IAA[5:1]1100102.7109.1卞对每组中的5个动物连续3天每天施加l次剂量。弁显著低于各自的对照(p<0.05)。实施例35在糖尿病db/db鼠模型中金会欢虜yg罗和酒花衍生物比值的沐A优化本实施例证实MgRho和THIAA这两种酒花化合物在类风湿性关节炎模型中减少炎症和关节炎症状的疗效，目前己知这种炎症和症状部分由许多蛋白激酶介导。计算空腹胰岛素和血糖的HOMA得分。^"兹一将大肠癌细胞系接种在96孔细胞板上，密度为3xl03个细胞/孔，过夜培养以使细胞贴壁生长。在每个浓度下对测试材料重复测定8次。72小时后，利用CyQUANT细胞增殖检测试剂盒分析细胞中活细胞总数。然后计算相对于二甲亚砜溶剂对照所观察到的活细胞减少百分数。塞来昔布和RIAA或THIAA混合物的细胞毒性效应的预期值用下列关系式进行估算1/[T]c=X/[T]x+Y/[T]y，式中T=毒性，其代表生长受抑制或被杀死的细胞所占分数，X、Y是测试混合物每种成分的相对分数，且X+Y=l。图示观察值是在95%置信区间内所得8个观察值的平均数。当估计的百分数下降落于相应观察分数的95%置信区间之下时，就表示具有协同作用。本实验旨在确定口服剂量后THIAA是否经新陈代谢并可探测。003641方法一前剂量血清提取后，5粒软胶囊(188mgTHIAA/每粒软胶囊)以游离酸形式释放的940mgTHIAA(PRTetra独立软胶囊。OGft2210KP-247.LotC42331111)被吸收，紧接着用水果酸奶容器收集。除了脱咖啡因咖啡外，在服下THIAA后四个小时内并没有其它食物被吸收。每隔45分钟取一次样并置入没有凝块催化物的血清分离管中。让样品在室温下凝结45分钟，并在4°C下1800xg加速度下离心10分钟。然后加入含有0.5%HOAc的0.9ml的MeCN的0.3ml血浆并在-20°C下放置45-90分钟。此混合物在4°C15000xg加速度下离心10分钟。离心作用后出现明显的两相；从0.6ml的上相中取样以进行HPLC分析。利用加样确定回收率，该值大于95%。/#菜一该结果显示在图44-46中。图44显示摄入940mgTHIAA后在血清中测定的THIAA随时间的变化情况。图45显示摄入THIAA225分钟后，血清中测定的THIAA各水平相对于测定的体外THIAA水平的情况。图46显示通过CYP2C9*1产生的THIAA新陈代谢的变化情况。[00366现在本发明已充分描述完毕，显而易见本领域的技术人员在不背离随附权利要求的精神和范围内均可对本发明做出变更和修改。权利要求1.用以治疗哺乳动物中对其所需蛋白激酶调节敏感的癌症方法，其中所述方法包括使用有效治疗剂量的还原异α酸给哺乳动物用药。2.权利要求1的方法中，还原异a酸选自以下组群中二氢异律草酮、二氢异类律草酮、二氢聚律草酮和p异a酸。3.权利要求1的方法中，进行调节的蛋白激酶选自以下组群中Aurora-A、DAPK2,、FGFR3、FGFR4、GSK3B、GSK3a、MAPK1、MAPKAP-K2、MSK2、MSSK1、PI3Ke、PI3KS、Rse、Syk以及TrkA。4.权利要求1的方法中，对激酶调节敏感的癌症选自以下组群中膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、前列腺癌、和甲状腺癌。5.哺乳动物中对其所需蛋白激酶调节敏感的癌症治疗混合物，其中混合物包括有效治疗剂量的还原异a酸，这里有效治疗剂量调节与癌症相关的蛋白激酶。6.权利要求5的混合物中，还原异a酸从以下组群中进行选择二氢异律草酮、二氢异类律草酮、二氢聚律草酮和p异a酸。7.权利要求5的混合物中，还包括药用可接受的辅料，其可从以下组群中选择涂料、等渗和吸收延缓剂剂、粘结剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色齐U、调味剂、甜味剂、吸收剂、去污剂以及乳化剂。8.权利要求5的混合物中，该混合物还包括选自以下组群的一种或多种成分抗氧化剂、维生素、矿物质、蛋白质、脂肪以及碳水化合物。全文摘要本发明公开了用于癌症治疗的蛋白激酶调节的化合物和方法。本发明公开的化合物和方法基于酒花中常见的还原异α酸。文档编号A61K35/00GK101505770SQ200780030528公开日2009年8月12日申请日期2007年6月20日优先权日2006年6月20日发明者杰弗里·布兰德,琳达·帕西奥雷蒂,约翰·G·巴比士,维拉·康达,艾米·杰尼·霍尔,艾纽·德赛,马修·L·特里普申请人:麦特普罗泰欧米克斯有限公司