专利名称：无细胞复合型人工皮肤及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种无细胞复合型 皮肤及其制备方法。
技术背景皮肤是人体最大的器官，是机体与外界的天然屏障和沟通的桥梁。皮肤 缺损轻则影响患者的外表美观，重则引发感染或电解质和水分的大量流失， 导致患者的死亡。治疗大面积皮肤缺损的关键是尽早封闭创面，减少机体的 消耗和内环境的紊乱，防止有害物质的入侵。随着组织工程技术的发展，组织工程皮肤已成为皮肤缺损治疗的热点， 但至今没有真正理想的皮肤替代物得以应用。理想的组织工程皮肤能够模仿 天然皮肤的结构，是具有表皮层和真皮层的复合型皮肤。其中的真皮层成分与皮肤真皮的成分接近，利于真皮细胞的长入；表皮层覆盖物起到隔离外界 环境，防止水分蒸发，避免细菌入侵，同时可以复合一些药物，起到促进创 面愈合、治疗皮肤疾病的目的。近年来，在医学美容、创伤、烧伤外科等领域中，针对不同类型的皮肤 疾病使用不同的药物更能达到有效的治疗效果。然而药物的作用都是一过性 的，如何使药物持续作用于创面是面临的难题。随着缓释技术的迅速发展， 出现了微球、微囊等一系列药物的缓释载体，这些为制备具有缓释功能的复 合型皮肤提供了可能。细胞外基质(ECM)是目前最有应用前景的支架材料，由于去除了引发宿主排斥反应的细胞，完整地保留了细胞外基质的形态结构和组成成分；其力 学性能好，抗原性低，可诱导具有再生能力的成纤维细胞，血管内皮细胞能 按照应有的组织学方式长入真皮层，临床应用效果好。它保存了真皮组织中 绝大部分的有效成分和框架结构，最大限度地模拟人体皮肤的组织结构，可 更好地诱导宿主细胞的生长和皮肤胶原的重建，优于其它真皮替代材料。目前人工活性双层皮肤产品有美国研发生产的Apligraf，和中国研发生 产的Active-skin。它们都是一种包含异体上皮细胞和成纤维细胞的双层组织工程皮肤，真皮层是由成纤维细胞、牛I型胶原、血清等形成凝胶，在真皮 层表面接种上皮细胞，体外培养7 10天形成含上皮角化层的人工皮肤。但由于含有活细胞成分，其有生产时间长、保存时间短、生产工艺复杂、成本高 等不足。而不含活细胞成分的双层皮肤产品Biobrane和Integra，由于表面有 不可降解的硅胶膜，不易观察创面早期的感染情况，不利于创缘表皮细胞的 爬行和创面的封闭，后期揭掉硅胶膜也需要二次手术。通过以上说明，将细胞外基质与结合有药物的具有缓释功能的类表皮层 生物材料复合构建出复合型皮肤，可以发挥细胞外基质作为真皮细胞再生长 入的支架功能；同时针对不同的创面可以复合不同的药物，有利于创面的愈 合。因此研发一种无细胞复合型皮肤已成为皮肤组织工程学中的发展趋势， 具有重要的社会效益和广阔的巿场效益。发明内容针对上述状况，本发明的目的是提供一种无细胞复合型人工皮肤及其制 备方法，使所获得的复合型皮肤具有止血、防止体液流失、保护创面并促进 创面愈合的功能，适用于修复皮肤缺损、控制创面感染、治疗难愈性的创面, 同时该复合型皮肤具有形状、大小和厚度可根据需要制备的优点。本发明提出的无细胞复合型皮肤，其特征在于所述的复合型皮肤具有 真皮层和表皮层双层结构；其中，真皮层是由细胞外基质制作形成的疏松多孔结构；表皮层是用凝胶状的类表皮材料覆涂于真皮层上表面凝固形成，使表皮层嵌合于真皮层表面孔隙结构。所述的细胞外基质为脱细胞真皮基质或重组合真皮基质；所述的重组合真皮基质包括胶原、透明质酸、壳聚糖、硫酸 软骨素的任一种或几种的组合。所述的凝胶状类表皮材料包括生物组织中提 取的多种可凝性蛋白、或聚乳酸、或聚羟基乙酸的任一种。在所述的表皮层 中可含有载有药物的缓释载体，针对不同疾病载有相应的药物。本发明无细胞复合型皮肤的制备方法，釆用有真皮层材料、表皮层材料、 含有药物的缓释载体，具体步骤为步骤l.真皮层材料采用结构疏松多孔的细胞外基质，厚度为O. 5 5mm的 片状材料；其来源可参照中国专利(CNZL号200510096463.3 )"组织工程化细胞外基质的制备方法"操作，可获得脱细胞真皮基质；或是采用胶原、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素的任一种或几种的组合制备成重组合真皮基质材料。步骤2.选择生物组织中提取的多种可凝性蛋白、或聚乳酸、或聚羟基乙 酸的任一种材料制备成凝胶溶液，作为表皮层材料。步骤3.复合型皮肤的构建，无菌条件下将凝胶溶液以O. 5~2. Omg/cn^均 匀覆涂于真皮层材料上表面，置于4匸中固化，再置于-8(TC冷冻至少12小时后 真空冷冻干燥，获得无细胞复合型皮肤成品。本发明制备方法的特征还在于，在所述的凝胶溶液中可以加有载有药物的 缓释载体。缓释载体是生物可降解材料制备的微球或微囊，其粒径为20~200Mm; 制备方法可参考文献(Adipose tissue engineering based on human preadipocytes combined with gelatin microspheres containing basicfibroblast growth factor. Biomaterials. 2003 Jun; 24 (14): 2513-21.)。所述缓释载体中药物的具体选择应根据受区的需求确定，缓释载体的用量应视 药物的性能来确定其在凝胶溶液中的最终浓度。例如，青霉素0 800i.u/ml、 表皮生长因子EGF 0~100ng/ml、碱性成纤维生长因子bFGF 0~100ng/ml、胰 岛素生长因子IGF 0~20ng/ml。本发明的无细胞复合型皮肤，具有表皮层和真皮层双层皮肤结构，可以 发挥细胞外基质作为真皮细胞再生长入的支架功能；针对不同创面，所构建 复合型皮肤的表皮层，可负载含有不同药物的缓释载体，促进创面的治疗和 愈合，同时可以有效阻止水分的蒸发；真皮层是由与皮肤真皮成分接近的真 皮细胞外基质构成，可以促进皮肤细胞的长入、血管的生成、诱导干细胞向 皮肤细胞方向的分化；随着新生组织的不断长入，本发明的复合型人工皮肤 材料逐渐降解并被机体吸收，最终形成与人体皮肤完全相似的皮肤组织。本发明所制备的复合型人工皮肤不含活细胞，具有一定的弹性和韧性， 且无明显免疫排斥反应，并有药物缓慢释放的特点；全部采用生物可降解材 料能被人体吸收，不需要二次手术。在临床治疗中主要功能有(l)作为皮 肤大面积缺损患者的创面覆盖和供皮区的覆盖；U)修复营养不良和感染创面；(3)治疗慢性难愈性溃疡创面；(4)术后创面的覆盖和预防感染。本发明可以促进创面肉芽组织和细胞的长入，促进受损皮肤的再生；在不稳定瘢 痕及难治性溃疡病灶清除后，使用本发明无细胞复合型人工皮肤移植可促进 愈合、防止瘢痕或溃疡的复发。本发明制备方法所获得的无细胞复合型人工皮肤，与目前已有的皮肤替代产品相比具有以下优点本发明可以促进创面皮肤的再生，增强创面愈合 后的皮肤弹性、柔韧性和机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩，可提高人工皮肤移植成功率，改善愈合质量；并具有缓释功能，可通过释放不同的药 物直接应用于炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的治疗， 针对不同的疾病进行个性化治疗；复合型皮肤具有表皮层和真皮层双层结 构，表皮层与真皮层有机地嵌合在一起，结构紧密；皮肤的形状、大小和厚 度能根据具体需求制备；其制备材料的来源广泛、生产工艺简单、生产周期 短、产品贮存期长、利于方便运输。 附图及其说明附
图1为本发明所制备的具有EGF缓释功能的无细胞复合型皮肤的照片。
具体实施方式
以下结合实例对本发明技术方案做进 一 步的详细说明。 实施例1步骤l.真皮层材料的制备参照中国专利(CNZL号:200510096463.3 ) "组织工程化细胞外基质的制备方法"操作，得到疏松多孔的脱细胞真皮基 质材料，为直径3cm圆形，厚度为0. 5mm。步骤2.生长因子的载入无菌条件下将人重组EGF( rhEGF， Sigma公 司)制备成EGF水溶液，在EGF溶液中加入2mg的冻干明胶微球(西工大生物 大分子材料实验室提供)，4'C下使EGF溶液充分浸透入冻干明胶微球。步骤3.表皮层材料的制备选择生物蛋白胶制备成凝胶溶液，在无菌 条件下，将2mg含有EGF的明胶微球加至10ml的凝胶溶液中搅拌均匀，使 EGF的终浓度为80ng/ml。步骤4.复合型皮肤的构建将含有微球的凝胶溶液以0. 5mg/cn 均匀的 覆涂于真皮层材料上表面，置于器皿中4'C固化，固化后置于-8(TC冰箱冷冻 12小时后真空冷冻干燥，获得无细胞复合型皮肤成品(参见附图1)。该皮肤厚度小，含有EGF可以促进创缘上皮细胞向创面迁移，有利于创面的关闭。 实施例2步骤1、真皮层材料釆用胶原、壳聚糖、硫酸软骨素混合物制备成重组合真皮基质，为疏松多孔的细胞外基质材料，直径为5cm圆形，厚度为5mm。 步骤2、药物的载入无菌条件下将青霉素制备成青霉素水溶液，在青 霉素溶液中加入2mg的冻干医用蛋白胶微粒，4'C下使青霉素溶液充分浸透 入冻干微粒中。步骤3.表皮层材料的制备在无菌条件下，将含有青霉素的微粒加至 聚乳酸凝胶溶液10ml中搅拌均勻，使青霉素的终浓度为800i.u/ml。步骤4.复合型皮肤的构建将含有微粒的凝胶溶液按2mg/cm2覆涂于 真皮层材料上表面，置于器皿中4。C固化，再置于-8(TC冷冻20小时后真空 冷冻干燥，获得无细胞复合型人工皮肤成品。该皮肤可有效的控制和预防创 面感染，促进皮肤创面的愈合。实施例3步骤l.真皮层釆用疏松多孔的脱细胞牛皮基质材料(Sigma公司有售)， 直径为7cm圆形，厚度为2mm。制备聚羟基乙酸凝胶溶液，为表皮层材料。步骤2.复合型皮肤的构建将聚羟基乙酸凝胶溶液按lmg/cm2均匀覆 涂于真皮层材料上表面，置于器皿中4匸固化，再置于-8(TC冰箱冷冻16小 时后真空冷冻干燥，获得无细胞复合型人工皮肤成品。该皮肤制作步骤简单， 保存时间长，可以广泛应用于烧烫伤创面的治疗。
权利要求
1、一种无细胞复合型人工皮肤，其特征在于所述的复合型人工皮肤具有真皮层和表皮层双层结构；其中，真皮层是由细胞外基质制作形成的疏松多孔结构；表皮层是用凝胶状的类表皮材料覆涂于真皮层上表面凝固形成，使表皮层嵌合于真皮层表面孔隙结构。
2、 根据权利要求l所述的复合型皮肤，其特征在于所述的细胞外基质为 脱细胞真皮基质或重组合真皮基质；所述的重组合真皮基质包括胶原、透明质 酸、壳聚糖、硫酸软骨素的任一种或几种的组合；所述的凝胶状类表皮材料 包括生物组织中提取的多种可凝性蛋白、或聚乳酸、或聚羟基乙酸的任一种。
3、 根据权利要求l所述的复合型皮肤，其特征在于在所述的表皮层中含有载有药物的缓释载体。
4、 按照权利要求l所述无细胞复合型人工皮肤的制备方法，采用有细胞 外基质材料和凝胶溶液材料，其特征在于具体制备步骤为步骤l.真皮层材料釆用结构疏松多孔的细胞外基质，厚度为O. 5 5mm的片状材料；所述的细胞外基质为脱细胞真皮基质或重组合真皮基质；步骤2.选择生物组织中提取的多种可凝性蛋白、或聚乳酸、或聚羟基乙 酸的任一种材料制备成的凝胶溶液，作为表皮层材料；步骤3.复合型皮肤的构建无菌条件下将凝胶溶液以O. 5-2. Q mg/cn/均 匀覆涂于真皮层材料上表面，置于4。C中固化，再置于-80。C冷冻至少12小时后 真空冷冻干燥，获得无细胞复合型人工皮肤成品。
5、 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述的凝胶溶液中 加有载有药物的缓释载体。
全文摘要
一种无细胞复合型人工皮肤及其制备方法，本发明的复合型皮肤具有真皮层和表皮层双层结构，真皮层是由细胞外基质制作形成的疏松多孔结构；表皮层是用凝胶状的类表皮材料覆涂于真皮层上表面凝固形成，嵌合于真皮层表面孔隙结构。与已有的皮肤替代品相比，本发明的皮肤可以促进创面皮肤的再生，增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性和机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩，提高皮肤移植成功率，改善愈合质量；并具有缓释功能，通过释放不同的药物直接应用于炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的治疗，针对不同的疾病进行个性化治疗；表皮层与真皮层有机地嵌合在一起，结构紧密；皮肤的形状、大小和厚度能根据具体需求制备；其制备材料的来源广泛、生产工艺简单、生产周期短、产品贮存期长、方便运输。
文档编号A61L27/44GK101234215SQ20081001760
公开日2008年8月6日 申请日期2008年3月6日 优先权日2008年3月6日
发明者张勇杰, 岩 金, 伟 陆 申请人:西安组织工程工程技术研究中心