一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人工皮肤组织培养的气液界面生物反应器。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体最大的器官，是人体阻碍水流失、紫外、机械伤害、毒性及细菌病毒伤害的一道重要防线。若大面积烧伤病人不能及时进行治疗，伤口就会发炎，导致死亡。针对大面积(直径大于lcm2)的皮肤缺失，治疗的黄金准则是“自体皮肤移植”。然而，大面积皮肤缺失者自体皮肤远不足以供应伤者所需。异体移植(如他人、尸体皮肤)不但数量少、价格昂贵，而且引入新的病毒而造成安全隐患。
[0003]组织工程被誉为“再生”之科学，随着其发展，人工皮肤的问世能部分解决上述问题。其价格虽然不足以匹敌真人皮肤，但其昂贵的价格使许多伤者无法负担而选择放弃治疗。造成人工皮肤成本较高的主要因素是人工皮肤培养周期长(4?6周)且需要气液界面(Air-Liquid Interface, ALI)复杂的培养模式。现今大多数公司采用悬挂式培养小室(Transwell)进行培养，这种培养方式需要大量操作员频繁更换培养液，且在更换过程中会因部分样品染菌导致实验失败。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了解决常用的悬挂式培养小室需要大量操作员频繁更换培养液且在更换过程中部分样品会染菌的问题，提供了一种基于注射栗的闭合式连续灌注式生物反应器。
[0005]本发明用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器包括上盖、下托盖、进气管、出气管、进液管、出液管、注气注射器、注液注射器和收集装置；
[0006]所述上盖的下表面有一个槽，槽的一端有一个通孔，槽的另一端有一个通孔；
[0007]所述的下托盖中间有一个盲孔，下托盖内部垂直于盲孔开有左侧通道和右侧通道，左侧通道的左端有一个通向上盖上表面的孔，右侧通道的右端有一个通向上盖上表面的孔；所述的盲孔的下半部设置有一个圆筒体，所述的圆筒体的侧壁均匀分布有多个通孔，圆筒体里面放置海绵，海绵上平面与左连通孔和右连通孔上平面及圆筒体的上开口水平；
[0008]所述的通孔与进气管连接、通孔与出气管连接、孔与进液管连接和孔与出液管连接；其中通孔通过进气管连接注气注射器，注气注射器通入co2和空气；孔通过进液管连接注液注射器，注液注射器通入分化培养液；通孔通过出气管排出废气，孔通过出液管连接收集装置，收集装置收集废液；
[0009]所述上盖的下表面与下托盖的上表面之间为密封连接。
[0010]本发明相对于现有技术其优点在于:
[0011]1.本发明基于注射栗的闭合式连续灌注式生物反应器，实现了气液界面复杂的培养模式。相比于传统培养皿中的静态培养，一方面减少因频繁更换培养液带来的染菌风险，提高培养成功率；另一方面实现了模拟人体生理环境的灌注式培养，不仅为细胞提供了充足的营养，而且流体可冲走细胞有害代谢物，从而实现细胞高效培养。利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞在1、4、7天的存活率分别可达84%?90%、90%?96%和90%?95%，而通常静态培养的在1、4、7天的存活率分别为73%?77%、70%?74%和77%?83%。相比之下本发明培养细胞的存活率较静态培养的总体提高了 10%以上。细胞增殖方面也存在差异，本发明培养的人体皮肤细胞在1、4、7天细胞生长占总面积的20%?24%、72%?76%和94%?98%。在相同条件下比静态培养的分别提高了 1%?2%、5%?10%和 11% ?15%。
[0012]2.利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞在培养分化过程中较传统培养皿中静态培养的差别在于:本发明培养的细胞培养分化14、21、28及35天人工表皮厚度分别可达:22 μ m?26 μ m、40 μ m?46 μ m、48 μ m?52 μ m和56 μ m?60 μ m。相比之下本发明培养细胞的人工表皮厚度较静态培养的总体提高了 2 μπι以上。14、21、28及35天人工表皮层数分别可达'2层?4层、4层?6层、6层?8层和7层?9层，较静态培养的总体提高了 0.5层?1层。
[0013]3.本发明提供的制备气液界面灌注式生物反应器的方法，其换用不同的模具再与聚甲基丙烯酸甲酯(ΡΜΜΑ)薄板经螺栓固定就可以实现适用于不同孔道或者可以进行大规模细胞组织培养，可操作性强。
[0014]4.本发明使用的材料如:注射器、海绵等无毒且海绵吸水性好、不容易降解是放置种有皮肤细胞的水凝胶的最好方法，材料价格低更利于节约成本。
【附图说明】
[0015]图1为本发明气液界面灌注式生物反应器灌注系统的侧视截面图。
[0016]图2为本发明气液界面灌注式生物反应器灌注系统的局部放大图。
【具体实施方式】
[0017]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0018]【具体实施方式】一:本实施方式的一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于:该生物反应器包括上盖1、下托盖2、进气管4-2、出气管4-3、进液管4-1、出液管4-4、注气注射器10-1、注液注射器10-2和收集装置8 ;
[0019]所述上盖1的下表面有一个槽1-3，槽1-3的一端有一个通孔1_1，槽1_3的另一端有一个通孔1-2 ;
[0020]所述的下托盖2中间有一个盲孔3，下托盖2内部垂直于盲孔3开有左侧通道2-3和右侧通道2-4，左侧通道2-3的左端有一个通向上盖1上表面的孔2-1，右侧通道2-4的右端有一个通向上盖1上表面的孔2-2 ;所述的盲孔3的下半部设置有一个圆筒体5-1，所述的圆筒体5-1的侧壁均匀分布有多个通孔5-2，圆筒体5-1里面放置海绵5-3，海绵5_3上平面与左侧通道2-3和右侧通道2-4上平面及圆筒体5-1的上开口水平；
[0021]所述的通孔1-1与进气管4-2连接、通孔1-2与出气管4_3连接、孔2_1与进液管4-1连接和孔2-2与出液管4-4连接；其中通孔1-1通过进气管4-2连接注气注射器10_1，注气注射器10-1通入C02和空气；孔2-1通过进液管4-1连接注液注射器10-2，注液注射器10-2通入分化培养液；通孔1-2通过出气管4-3排出废气，孔2-2通过出液管4_4连接收集装置8，收集装置8收集废液；
[0022]所述上盖1的下表面与下托盖2的上表面之间为密封连接。
[0023]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，进气管4-2与注气注射器10-1之间连接过滤器9-1 ;进液管4-1与注液注射器10-2之间连接过滤器9-2 ;出气管4-3连接过滤器9-3 ;出液管4-4与收集装置8之间连接过滤器9_4 ;进一步防止外界细菌进入系统中污染系统内环境。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0024]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，所述的通孔1-1、通孔1-2、孔2-1和孔2-2的直径均为0.4mm?0.6mm0其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0025]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，所述的进气管4-2、出气管4-3、进液管4-1和出液管4-4均为聚四氟乙稀，其其外径为0.75mm，内径为0.03mm。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0026]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，所述C02的体积分数占0)2和空气总体系的4%?6%。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
[0027]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是，所述的盲孔3直径为5mm?7_，高度为7_?9_，左侧通道2_3和右侧通道2_4截面宽X高为(0.75mm?
1.25mm) X (1.0mm?1.5mm)。其他步骤与参数与【具体实施方式】一相同。
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