出样品放入长X宽X高为10mmX 10mmX5mm切片模具盒(CryomoldB1psy)中，倒入浸泡切削液(Optimal Cutting Temperature，OCT) 10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100%乙醇混合物上迅速冷却。带0CT完全凝固后，用冰冻切片机(Leica CM3050)将皮肤组织切成5 μ m后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。
[0051]结果表明:利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为
50μ m、人工表皮层数为6层而静态培养的人工表皮厚度为45 μ m、人工表皮层数为5层。
[0052]实施例4:
[0053]使用本发明制备的气液界面灌注式生物反应器时将整个PDMS生物反应器浸入体积分数为75%的乙醇水溶液中灭菌1.5h ;:再将整个装置置于无菌的细胞操作台内，打开紫外(UV)灯进行灭菌，灭菌时间为50min ;然后用含有质量分数为1.5%的青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin,P-S)的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solut1n，PBS)和培养基依次冲洗整个装置。三次灭菌后将海绵放置于灌注室内下方的圆柱形支架上，确保海绵上平面与下层通道上平面处于同一水平线，主要目的是用于支撑皮肤组织与水凝胶，将种有皮肤细胞的水凝胶放在海绵上；利用两片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓将上层PDMS模型与键合好的中层PDMS模型和下层PDMS模型夹紧；用注射器向其中一个灌注入口通入分化培养液、另一个通入C02的体积分数为6%的C0 2和空气，两个出口利用软管连接过滤器，防止外界细菌进入系统中污染系统内环境，过滤器通过软管连接收集器。
[0054]将人体皮肤细胞在生长期灌注培养7天以后，取出灌注培养样品及静态培养样品用活-死细胞生存能力及毒性染色试剂进行染色分析，计算生长期细胞活性与生长率。
[0055]结果表明:利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的存活率为91 %、细胞生长占总生长面积的96%，而静态培养的存活率80%、细胞生长占总生长面积的67% ；
[0056]经过分化期养殖35天后，用4%的多聚甲醛水溶液将各时期培养样品固定20min后，浸入15 %的蔗糖(sucrose)水溶液常温浸泡4小时，接着浸入30 %的蔗糖水溶液常温浸泡4小时。取出样品放入长X宽X高为lOmmX 10mmX5mm切片模具盒(CryomoldB1psy)中，倒入浸泡切削液(Optimal Cutting Temperature，OCT) 10分钟以后，将样品连同切片模具盒一起放入装有干冰和100%乙醇混合物上迅速冷却。带0CT完全凝固后，用冰冻切片机(Leica CM3050)将皮肤组织切成5 μ m后的小片，用正电荷防脱载玻片吸附样品后，通过苏木精-伊红染色法染色，可测出传统静态模式培养与灌注模式培养下的皮肤生长情况。
[0057]结果表明:利用本发明制备的设备培养的人体皮肤细胞的人工表皮厚度为58 μ m、人工表皮层数为7层而静态培养的人工表皮厚度为52 μ m、人工表皮层数为6层。
[0058]本发明使用的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) (8560K171，McMaster Carr公司，新泽西州，美国)经激光切割机切制而成。
[0059]本发明选用惰性的PTFE管，其外径为0.75mm，内径为0.03mm。
【主权项】
1.一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于:该生物反应器包括上盖(1)、下托盖(2)、进气管(4-2)、出气管(4-3)、进液管(4-1)、出液管(4_4)、注气注射器(10-1)、注液注射器(10-2)和收集装置(8); 所述上盖(1)的下表面有一个槽(1-3)，槽(1-3)的一端有一个通孔(1-1)，槽(1-3)的另一端有一个通孔(1-2); 所述的下托盖(2)中间有一个盲孔(3)，下托盖(2)内部垂直于盲孔(3)开有左侧通道(2-3)和右侧通道(2-4)，左侧通道(2-3)的左端有一个通向上盖(1)上表面的孔(2-1)，右侧通道(2-4)的右端有一个通向上盖(1)上表面的孔(2-2);所述的盲孔(3)的下半部设置有一个圆筒体(5-1)，所述的圆筒体(5-1)的侧壁均匀分布有多个通孔(5-2)，圆筒体(5-1)里面放置海绵(5-3)，海绵(5-3)上平面与左侧通道(2-3)和右侧通道(2_4)上平面及圆筒体(5-1)的上开口水平； 所述的通孔(1-1)与进气管(4-2)连接、通孔(1-2)与出气管(4-3)连接、孔(2-1)与进液管(4-1)连接和孔(2-2)与出液管(4-4)连接；其中通孔(1-1)通过进气管(4-2)连接注气注射器(10-1);孔(2-1)通过进液管(4-1)连接注液注射器(10-2);通孔(1-2)通过出气管(4-3)排出废气，孔(2-2)通过出液管(4-4)连接收集装置(8)，收集装置⑶收集废液； 所述上盖(1)的下表面与下托盖(2)的上表面之间为密封连接。2.根据权利要求1所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于:进气管(4-2)与注气注射器(10-1)之间连接过滤器(9-1);进液管(4-1)与注液注射器(10-2)之间连接过滤器(9-2);出气管(4-3)连接过滤器(9-3);出液管(4_4)与收集装置(8)之间连接过滤器(9-4)。3.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于:所述的通孔(1-1)、通孔(1-2)、孔(2-1)和孔(2-2)的直径均为0.4mm?0.6mmο4.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于:所述的进气管(4-2)、出气管(4-3)、进液管(4-1)和出液管(4-4)均为聚四氟乙烯，其其外径为0.75mm，内径为0.03mm。5.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于:所述的盲孔⑶直径为5mm?7mm，高度为7mm?9mm，左侧通道(2-3)和右侧通道(2-4)截面宽 X 高为(0.75mm ?1.25mm) X (1.0mm ?1.5mm)。6.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于:所述的圆筒体(5-1)是可拆卸的，其直径为5mm?7mm，高度为2mm?4mm。7.根据权利要求1或2所述的用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，其特征在于:所述上盖(1)的下表面和下托盖(2)的上表面是由密封装置(6)密封的；所述的密封装置(6)是由两片聚甲基丙烯酸甲酯薄板(6-1)和4套螺栓(6-2)组成；所述的两片聚甲基丙烯酸甲酯薄板(6-1)的厚度为3mm?4mm，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯薄板(6-1)有四个圆形通孔(7)，其中通孔(7)的直径为3mm?5mm。
【专利摘要】一种用于人工皮肤组织培养的气液界面灌注式生物反应器，本实用新型涉及一种人工皮肤组织培养的气液界面生物反应器。本实用新型的目的是为了解决常用的悬挂式培养小室需要大量操作员频繁更换培养液且在更换过程中部分样品会染菌的问题。本实用新型的生物反应器包括上盖、下托盖、进气管、出气管、进液管、出液管、注气注射器、注液注射器和收集装置。本实用新型制备的生物反应器实现了气液界面复杂的培养模式，而且减少了因频繁更换培养液带来的染菌风险，提高培养成功率。本实用新型制备的气液界面灌注式生物反应器用于人工皮肤组织培养。
【IPC分类】C12M3/00, C12M1/04
【公开号】CN205046137
【申请号】CN201520815851
【发明人】任玉坤, 郎琦, 陶冶
【申请人】哈尔滨工业大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月20日