专利名称：以异种或异体骨基质明胶为支架构建的组织工程人工皮肤的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及以异种或异体骨基质明胶为支架构建的双层人工皮肤，及其制备方法和用途。
背景技术：
皮肤被覆于人体全身表面，与外界环境直接接触，是解剖学和生理学上的重要边界器官。皮肤约占成人体重的16％，面积约1.2-2.2m2。皮肤由表皮和真皮组成，借皮下组织与深部的深筋膜、腱膜或骨膜相连。皮肤起源于外胚层和中胚层，结构较复杂并高度特化，有重要的屏障作用和保护作用，可防止外界的刺激损伤体内的组织，能阻挡异物和微生物侵入，并可阻止体液外渗和对外界物质的吸收。
机体的组织由细胞与细胞外基质(extracellular matrix)共同组成，各种组织中细胞外基质的含量不一。细胞外基质在细胞外周决定组织的物理性状而适合于各种组织的功能需要。细胞外基质尽管形式多样，其共同的特点是由多种大分子成分形成高度有组织的网络结构。这些成分包括胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖及氨基聚糖等。其中胶原是细胞外基质中的重要成分，是动物体内含量最丰富的蛋白质，占人体蛋白质总量的30％以上，属于不溶性纤维形蛋白质，遍布于体内各种器官和组织。胶原的类型有12种之多，皮肤的胶原纤维主要由I型与III型胶原构成，含量较少的IV型、VII型胶原是基底膜的重要组成成分。正常皮肤以I型胶原为主，占75％以上，III型胶原含量为25％。
骨是由细胞和钙化的细胞外基质组成。骨基质(bone matrix)，简称骨质，即钙化的骨组织的细胞外基质，包括有机成分和无机成分，含水极少。有机成分包括大量胶原纤维和少量基质，其中胶原纤维占90％，化学成分主要是I型胶原蛋白。基质呈凝胶状，主要成分是蛋白多糖及其复合物，具有粘合纤维的作用。无机成分又称骨盐，占干骨重量的65％，以钙、磷元素为主，骨盐的存在形式主要是羟基磷灰石结晶，呈细针状，长10-20nm，沿胶原原纤维长轴排列并与之紧密结合。
上世纪50年代，Kreutz等最早发现异体冻干骨移植不仅不会引起宿主的免疫排斥反应，而且还能诱导宿主的骨细胞爬行替代和新骨形成(Kreutz JP，HyattGW，Turner TC，et al.The preservation and clinical use of freeze dried bone.J Bone Joint Surg.1956；33A863)。随后，在冻干骨的基础上，用化学方法去除无机钙磷成分而制备得脱钙骨基质(Demineralized bone matrix，DBM)。脱钙骨基质现已广泛应用于临床，众多的应用报道表明，脱钙骨在骨缺损等治疗方面具有良好的应用前景。虽然DBM有诱导成骨作用，但由于被脱矿，只留有有机部分骨基质，造成机械强度下降，不能承受应力，无法替代骨骼负重功能。骨基质明胶(bonematrix gelatin，BMG)是在脱钙骨的基础上，用连续化学处理的方法制备而成。1973年Urist首次制备了同种异体骨基质明胶，由于在制备过程中除去了绝大多数非胶原性蛋白和脂类，使起抗原性进一步降低(Urist MR，et al.Bone morphogenesisin implants of insoluble bone gelatin，Proc Natl Acad Sci.1973；703511-3515)。BMG有全脱钙骨基质明胶、表面脱钙骨基质明胶等，全脱钙BMG缺乏支持作用，不能单独修复受力的大段骨缺损，部分脱钙的BMG虽有较好的支持作用，但单独使用结合较慢。然而，尚没有将BMG用于构建人工皮肤的报道。
皮肤作为人体最大的器官，是与外界环境接触的屏障。当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，其危害可以极轻微，也可以是致命的。
目前，常用的皮肤缺损修复途径有自体植皮、同种异体植皮、异种植皮，但由于供区不足、免疫排斥及传播疾病等缺点，寻找一种理想的皮肤替代物一直是临床上一个亟需解决的难题。
因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、可操作性强的人工皮肤代用品。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的安全性高、制法简便的人工皮肤。
本发明的另一目的就是提供所述人工皮肤的制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种人工皮肤移植物，它包括(a)真皮层，所述的真皮层含有全脱钙骨基质明胶、成纤维细胞和基质蛋白；(b)位于真皮层一个主表面之上的表皮层。
在一优选例中，所述的真皮层含有10-30％骨基质明胶，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。
在另一优选例中，所述的骨基质明胶是衍生自猪、牛、羊、或狗的骨基质明胶。
在另一优选例中，所述的真皮层的厚度为0.2-4mm，所述表皮层的厚度是20-120um。
在另一优选例中，所述的表皮层含有角质形成细胞。
在另一优选例中，其特征在于，所述的表皮角质形成细胞和成纤维细胞包括经过基因修饰、改造的表皮角质形成细胞和成纤维细胞。
在另一优选例中，所述的成纤维细胞选自真皮成纤维细胞，以及胚胎时期间充质细胞来源的多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种制备人工皮肤移植物的方法，包括步骤(a)将成纤维细胞接种于全脱钙骨基质明胶；(b)在适合生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-全脱钙骨基质明胶复合物；(c)将角质形成细胞接种于所述的成纤维细胞-全脱钙骨基质明胶复合物表面；(d)在适合角质形成细胞生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-全脱钙骨基质明胶-表皮复合物。
在一优选例中，所述的全脱钙骨基质明胶是用以下方法制备的将松质骨制成1-2毫米厚的片状；预冷的蒸馏水漂洗；盐酸-10％氯化钠溶液中持续搅拌，4℃，24h±12h；预冷的蒸馏水漂洗；氯仿∶甲醇(1∶1)，25℃，24h±12h；预冷的蒸馏水漂洗；叠氮化钠，25℃，12h±6h；预冷的蒸馏水漂洗；
过氧化氢浸泡，30分钟±15分钟；磷酸盐缓冲液，25℃；冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，制得全脱钙骨基质明胶。
在另一优选例中，在步骤(a)中，成纤维细胞的接种量为1×105-1×107个细胞/10mg骨基质明胶，更佳地为5×105-5×106个细胞/10mg骨基质明胶。
在另一优选例中，在步骤(c)中，角质形成细胞的接种量为1×104-1×107个细胞/平方厘米，更佳地为1×105-5×106个细胞/平方厘米，在另一优选例中，所述的步骤(d)包括二个阶段(i)将步骤(c)获得的复合物在完全浸没的条件下，于37±0.5℃，5％CO2和饱和湿度下培养4-14天，从而使角质形成细胞增殖，形成角质形成细胞层；(ii)将步骤(i)中获得的复合物的角质形成细胞层部分暴露于空气中，继续培养4-21天，从而使角质形成细胞角化。
图1是本发明单层人工皮肤的组织学切片照片。
图2是本发明双层人工皮肤的组织学切片照片。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，改进了双层人工皮肤的结构和制备方法，首次应用全脱钙的异种骨基质明胶作为培养支架构建人工真皮及双层组织工程皮肤，制得了双层人工皮肤。本发明的双层人工皮肤具有真皮及表皮双层结构，无收缩，可以直接缝合覆盖创面，替代自体皮肤移植用于皮肤缺损的修复。例如，用于难愈性创面(糖尿病病人足部溃疡及静脉性溃疡等)的修复，和早期烧伤创面覆盖及烧伤后瘢痕病人的晚期修复。
如本文所用，术语“表皮层”指位于人工皮肤表面，主要由角质形成细胞构成的细胞层。
如本文所用，术语“真皮层”指位于人工皮肤表面下方，主要由骨基质明胶网架、成纤维细胞及其分泌的基质蛋白构成的细胞层。应理解，在本发明的人工皮肤中，骨基质明胶网架、成纤维细胞及其分泌的基质蛋白的含量并不是一成不变的。由于本发明人工皮肤中所用的骨基质明胶会随着时间会发生降解，因此其含量是逐渐下降的。通常，真皮层含有10-30％骨基质明胶，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。更佳地，所述的真皮层含有15-25％骨基质明胶，5-15％成纤维细胞，60-80％基质蛋白。(应指出，在本发明人工皮肤中的水分基本上都以结合水的形式存在，因此被包括在细胞成分和基质蛋白中。)可用于本发明的人工皮肤的网架的材料是全脱钙的骨基质明胶。全脱钙骨基质明胶制法是本领域中已知的。其主要成分为I型胶原蛋白。由于皮肤中的胶原蛋白也多为I型，因此，全脱钙骨基质明胶适合作为培养的基质材料，在体外构建单层真皮组织及双层、有活性的人工皮肤。
用于本发明的骨基质明胶可以是同种或异种的、也可以是同种异体的、或同一个体的。较佳地，所述的骨基质明胶是异种或异体的。常用的骨基质明胶来自猪、牛、羊、狗等非人哺乳动物。特别优选的是来自猪和牛。
骨基质明胶的形状没有特别限制，通常为扁平的、带空隙的三维网状结构。
可用于本发明的成纤维细胞没有特别限制，可以是任何来源的成纤维细胞，尤其是真皮成纤维细胞。成纤维细胞的分离和培养方法都是本领域中熟知的。
可用于本发明的角质形成细胞没有特别限制，可以是任何来源的角质形成细胞。角质形成细胞的分离和培养方法都是本领域中熟知的。
在优选例中，成纤维细胞和角质形成细胞宜来自相同来源，即来自同一哺乳动物，更佳地来自同一个体。
本发明的人工皮肤的厚度没有特别限制。通常所述的真皮层的厚度约为0.2-4mm，所述表皮层的厚度约为20-120um。
本发明的人工皮肤可用以下方法制备(a)将成纤维细胞接种于全脱钙骨基质明胶。成纤维细胞的接种量约为1×105-1×107个细胞/10mg骨基质明胶，较佳地为5×105-5×106个细胞/10mg骨基质明胶。此外，以“个细胞/ml培养液”表示，接种量通常为1×105-100×106个细胞/ml培养液，较佳地约为5×106-50×106个细胞/ml培养液。
(b)在适合生长的条件下(如在37℃，5％CO2，饱和湿度的条件下)，培养一段时间(通常约为4-14天)，使成纤维细胞增殖，从而形成成纤维细胞-骨基质明胶复合物。(注此时形成的为单层人工真皮组织)。
(c)将角质形成细胞接种于所述的成纤维细胞-骨基质明胶复合物表面；角质形成细胞的接种量通常约为1×104-1×107个细胞/平方厘米，较佳地约为1×105-5×106个细胞/平方厘米。
(d)在适合角质形成细胞生长的条件下培养复合物一段时间(约4-21天)，从而形成成纤维细胞-骨基质明胶-表皮复合物。一种优选的方式是在步骤中分两个阶段培养，即第一阶段中将获得的复合物在不与空气接触的条件下，即浸没在培养液中，在培养条件下培养4-14天，从而使角质形成细胞迅速增殖；第二阶段中，将角质形成细胞层部分暴露于空气中，继续培养4-21天，从而使角质形成细胞进一步分化，即角化。这样就形成了本发明的双层结构的人工皮肤。
可用各种不同手段将角质形成细胞层部分暴露于空气。例如将在细胞—骨基质明胶复合物置于—金属支架上，使部分表皮层暴露于空气，而其余部分仍位于培养液的液面之下即可。另一种优选方式是在细胞—骨基质明胶复合物下加垫可渗透滤膜，制造气—液界面。
用于本发明的培养液可以选用本领域常见的用于成纤维细胞和角质形成细胞的培养基。一种优选的人工真皮培养的培养液为含10％胎牛血清的DMEM培养基。一种优选的用于双层人工皮肤复合培养的培养基(角化细胞培养基)为DMEM与F12的混合培养基，按约3∶1(v/v)比例混合，使用时还可添加其他添加剂，例如约50ug/ml牛垂体提取物(BPE)约50ug/ml，人重组表皮细胞生长因子(rEGF)约5ng/ml等。
用本发明方法可形成有活性的、双层组织工程皮肤。组织工程双层皮肤的真皮层是由骨基质明胶和成纤维细胞及其分泌的基质蛋白共同组成，表皮是由接种在表面的角质形成细胞不断增殖、分化形成。组织学显示本发明的人工皮肤具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征，不具备毛囊、皮脂腺、汗腺等附属器和血管，也不含有黑素细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞等。
用本发明方法可形成有活性的、单层或双层组织工程皮肤。组织工程双层皮肤的真皮层是由骨基质明胶和成纤维细胞及其分泌的基质蛋白共同组成，表皮是由接种在表面的角质形成细胞不断增殖、分化形成。组织学显示本发明的人工皮肤具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征，不具备毛囊、皮脂腺、汗腺等附属器和血管，也不含有黑素细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞等。
本发明的主要优点在于(1)骨基质明胶具有良好的力学性能、可靠的生物安全性和生物相容性；(2)具有已角化的表皮层，可发挥皮肤的重要屏障和保护功能；(3)由骨基质明胶和细胞及其分泌的基质蛋白共同构成的人工皮肤，是真正意义上的有活性的双层人工皮肤。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1异种脱钙骨胶原海绵的制备在本实施例中，分别制备猪和牛的异种脱钙骨胶原海绵，方法如下1、取供体(猪和牛)四肢长骨的松质骨，制成1-2毫米厚的片状，然后放入下列溶液中连续处理。
2、预冷的蒸馏水漂洗；3、5％盐酸-10％氯化钠溶液中持续搅拌，4℃，24h±12h；(作用是脱钙)4、预冷的蒸馏水漂洗；5、氯仿∶甲醇(1∶1)，25℃，24h±12h；(作用是脱脂)6、预冷的蒸馏水漂洗；7、叠氮化钠，25℃，12h±6h；(作用是去除血液成分)
8、预冷的蒸馏水漂洗；9、过氧化氢浸泡，30分钟±15分钟；(作用是进一步去除抗原性)10、磷酸盐缓冲液，25℃；11、再经冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，储存于室温下备用。
实施例2角质形成细胞的分离与培养1)取材手术切除的小儿包皮，置入含抗生素的角化细胞培养液中，带入细胞培养室。
2)分离表皮用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织及部分真皮，并修剪成宽约1-2mm的条状，用无钙镁PBS漂洗两次，表皮面朝上浸于0.24U/ml中性蛋白酶(DispaseII)中4℃过夜。
3)消化18小时后，用两把眼科镊子将表皮从真皮上撕下，剪成碎片，再用0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA在37℃消化15分钟，10ml胰酶抑制剂(10mg/ml)终止消化。经150目不锈钢滤网过滤，以1000r/min离心10分钟，弃去上清，加入角化细胞培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数，细胞活力＞85％。
4)原代培养计数后制成单细胞悬液，按3×106/75cm2密度接种培养，无血清角化细胞培养基(GIBRO，USA)，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，培养液3天换一次。
5)传代培养当细胞融合到60％-75％密度时，用10ml无钙镁PBS冲洗，经0.05％胰酶-0.53mMEDTA 37℃消化5-10分钟，加入10ml胰酶抑制剂终止消化，移入离心管中，1000r/min离心10分钟。弃去上清液，加入角化细胞培养液10ml，混匀，计数，按1∶3的比例传代培养。2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60％-75％密度时，再传代培养。
实施例3真皮成纤维细胞分离与培养1)消化将撕下表皮后的真皮剪成碎块，用0.1％的胶原酶在37℃消化2小时，经150目不锈钢滤网过滤，以1000r/min离心5分钟，弃去上清，加入无钙镁PBS清洗3次。加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数。
2)原代培养计数后制成单细胞悬液，按1-2×106/75cm2密度接种培养，含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，培养液3天换一次。
3)传代培养当细胞融合到60％-75％密度时，用10ml无钙镁PBS冲洗，经0.25％胰酶37℃消化5分钟，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，1000r/min离心5分钟。弃去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，混匀，计数，按1∶3的比例传代培养。2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60％-75％密度时，再传代培养。
实施例4制备双层人工皮肤(1)构建成纤维细胞—骨基质明胶复合物对实施例3中制备的真皮成纤维细胞，用胰蛋白酶消化法收集，然后分别以2×106个细胞/ml培养液、10×106个细胞/ml培养液、50×106个细胞/ml培养液的浓度将其接种于实施例1中制备的猪或牛的骨基质明胶(骨基质明胶)。然后将接种后的骨基质明胶材料，在37±0.5℃，5％CO2、饱和湿度条件下，在含10％胎牛血清的DMEM培养液(培养液每3天换一次)中培养1-2周，形成成纤维细胞—骨基质明胶复合物(人工真皮)(见图1)。
(2)双层皮肤的形成收集实施例2中制备的角质形成细胞，然后分别以0.5×106/平方厘米、5×106/平方厘米、50×105/平方厘米的密度将其接种在上一步骤制得的成纤维细胞—骨基质明胶复合物表面。将接种后的复合物在37±0.5℃，5％CO2、饱和湿度条件下，在角化细胞培养基中培养培养4-14天。
4-14天后，在细胞—骨基质明胶复合物下加垫可渗透滤膜，使角质形成细胞层部分暴露于空气中，制造气—液界面，其中成纤维细胞层(即真皮层)和部分角质形成细胞层(即表皮层)仍位于培养液中，而部分角质形成细胞层(即表皮层)暴露于空气。在37±0.5℃，5％CO2、饱和湿度条件下继续培养4-21天，从而使角质形成细胞的进一步分化(即角化)。从而获得具有双层结构的人工皮肤移植物。
检测方法各组分别于复合培养后1、2、3、4周留取标本，用10％中性福尔马林液固定，石蜡包埋，制成4um厚的切片，作常规HE染色。
组织学成纤维细胞在骨基质明胶上生长良好并分泌大量基质；接种表皮角质形成细胞一周后可见1-2层连续的表皮细胞在“成纤维细胞—骨基质明胶”复合物上生长良好；4周时骨基质明胶已部分降解，表皮分层分化较完善，可见基底层、棘细胞层及角化层，与正常皮肤结构相似。
结果试验结果如图2所示。在人工皮肤1-12的组织切片中可看见有连续的表皮细胞生长在成纤维细胞—骨基质明胶复合物表面，且表皮细胞分化良好，有较明显的分层。切片显示组织工程人工皮肤具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征，不具备毛囊、皮脂腺、汗腺等附属器和血管，也不含有黑素细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞等。
此外，结果还表明，来自不同物种的骨基质明胶都可用于本发明。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种人工皮肤移植物，其特征在于，它包括(a)真皮层，所述的真皮层含有全脱钙骨基质明胶、成纤维细胞和基质蛋白；(b)位于真皮层一个主表面之上的表皮层。
2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮层含有10-30％骨基质明胶，5-15％成纤维细胞，55-85％基质蛋白。
3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的骨基质明胶是衍生自猪、牛、羊、或狗的骨基质明胶。
4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮层的厚度为0.2-4mm，所述表皮层的厚度是20-120um。
5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的表皮层含有角质形成细胞。
6.如权利要求5所述的移植物，其特征在于，所述的表皮角质形成细胞和成纤维细胞包括经过基因修饰、改造的表皮角质形成细胞和成纤维细胞。
7.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的成纤维细胞选自真皮成纤维细胞，以及胚胎时期间充质细胞来源的多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。
8.一种制备人工皮肤移植物的方法，其特征在于，包括步骤(a)将成纤维细胞接种于全脱钙骨基质明胶；(b)在适合生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-全脱钙骨基质明胶复合物；(c)将角质形成细胞接种于所述的成纤维细胞-全脱钙骨基质明胶复合物表面；(d)在适合角质形成细胞生长的条件下培养，从而形成成纤维细胞-全脱钙骨基质明胶-表皮复合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的全脱钙骨基质明胶是用以下方法制备的将松质骨制成1-2毫米厚的片状；预冷的蒸馏水漂洗；盐酸-10％氯化钠溶液中持续搅拌，4℃，24h±12h；预冷的蒸馏水漂洗；氯仿∶甲醇(1∶1)，25℃，24h±12h；预冷的蒸馏水漂洗；叠氮化钠，25℃，12h±6h；预冷的蒸馏水漂洗；过氧化氢浸泡，30分钟±15分钟；磷酸盐缓冲液，25℃；冷冻干燥，环氧乙烷消毒后，制得全脱钙骨基质明胶；而且在步骤(a)中，成纤维细胞的接种量为1×105-1×107个细胞/10mg骨基质明胶；在步骤(c)中，角质形成细胞的接种量为1×104-1×107个细胞/平方厘米。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，成纤维细胞的接种量为5×105-5×106个细胞/10mg骨基质明胶；步骤(c)中，角质形成细胞的接种量为1×105-5×106个细胞/平方厘米，并且所述的步骤(d)包括二个阶段(i)将步骤(c)获得的复合物在完全浸没的条件下，于37±0.5℃，5％CO2和饱和湿度下培养4-14天，从而使角质形成细胞增殖，形成角质形成细胞层；(ii)将步骤(i)中获得的复合物的角质形成细胞层部分暴露于空气中，继续培养4-21天，从而使角质形成细胞角化。
全文摘要
本发明提供了一种双层的人工皮肤移植物，它包括(a)真皮层，所述的真皮层含有骨基质明胶、成纤维细胞和基质蛋白；(b)位于真皮层一个主表面之上的表皮层。在本发明的双层人工皮肤中，有连续的表皮细胞生长在成纤维细胞一骨基质明胶复合物表面，且表皮细胞分化良好，有较明显的分层。切片显示组织工程人工皮肤具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征。本发明还提供了该人工皮肤的制备方法和用途。
文档编号A61L27/60GK1504241SQ02151020
公开日2004年6月16日 申请日期2002年12月4日 优先权日2002年12月4日
发明者曹谊林 申请人:曹谊林