专利名称：Tie2受体介异的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因治疗领域。具体地，涉及一种基于与促血管生成素受体Tie2结合的配体寡肽GA1的基因转移系统。该转移系统通过受体介导的内吞作用，将外源DNA靶向地导入肿瘤新生血管内皮细胞和表达Tie2受体的肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
背景技术：
PCT申请PCT/CN97/00106(WO98/18951)公开了用于靶向性肿瘤基因治疗的新型的受体介导基因转移系统，其中公开了包括针对EGFR、IGF I/II R及VEGFR三种受体介导的基因转移系统用于肿瘤治疗。然而，由于不同肿瘤细胞表面的受体多种多样，表达量有多有少，甚至根本不表达某些受体，因此仅有三种系统不能解决全部的问题。
1996年Davis等发现了一种新的蛋白-Angiopoietin-1(Ang-1)，它是蛋白质酪氨酸激酶受体家族中Tie2受体的配体，Tie2受体几乎仅在内皮细胞上表达。Ang-1在结构上与已知的血管生成因子或其它蛋白质酪氨酸激酶受体的配体不同，在体外不能直接促进培养的内皮细胞生长，所以推测它可能与肿瘤新生血管的启动无关，而在血管生成过程的后期起作用，使血管网络稳定。
在发现Ang-1后，利用同源筛选的方法，Maisonpierre又发现了Angiopoietin-2(Ang2)，该蛋白也可与Tie2受体结合。在体外Ang2不能激活内皮细胞上的Tie2受体，但可以激活其它细胞，如NIH-3T3细胞上的Tie2受体，所以，Ang2的功能可能是与Ang1拮抗，使血管网处于一种不稳定的状态，有利于内皮细胞的分裂和血管网的重新建立。
这两种配体的受体-Tie2，发现于1992年。该蛋白由1124个氨基酸残基组成，当配体与受体结合后，使受体形成二聚体，897位的酪氨酸自身磷酸化并激活激酶活性。Tie2的表达具有相对特异性，在人体内主要表达于新生血管内皮细胞、部分肿瘤细胞和一些造血细胞表面。Tie2基因敲除的小鼠出生后无法存活，病理检查发现，小鼠体内有血管形成但不能构成复杂的血管网络。
在多种肿瘤，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌等，及这些肿瘤内的新生血管中，Ang-1和Tie2受体的表达均增高，所以利用阻断Tie2受体的信号传导，可以同时抑制肿瘤新生血管和肿瘤细胞的生长，达到直接和间接抑制肿瘤细胞生长的目的。
有文献报道，利用腺病毒转导可溶性Tie2受体胞外区基因，可以在体内抑制小鼠乳腺癌4T1和黑色素瘤B16F10.9细胞，抑制率分别达到64％和47％，并有效地抑制了肿瘤的转移。该研究表明抑制Tie2受体的信号转导对肿瘤的生长有一定的抑制效应。
综上所述，本领域迫切需要开发新的、靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统，尤其是利用Tie2受体介导的基因转移系统。
发明内容
本发明的目的是就是提供一种Tie2受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统，它是一种与Tie2受体结合的配体寡肽和内吞小体释放寡肽所构建的基因转移系统。
在本发明的第一方面，提供了一种生长因子受体Tie2介导的靶向性基因治疗的基因转移系统，它包含(a)特异性结合于Tie2受体的配体寡肽和(b)多聚阳离子多肽。
较佳地，所述的基因转移系统还含有(c)内吞小体释放寡肽。
在另一优选例中，所述的基因转移系统还含有(d)外源DNA。
在另一优选例中，所述的配体寡肽含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGNPSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
在另一优选例中，所述的多聚阳离子多肽选自下组多聚赖氨酸、聚乙酰亚胺(PEI)、鱼精蛋白、组蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，经聚乙二醇(PEG)修饰的上述蛋白及其混合物。
在另一优选例中，所述的外源DNA选自下组抗癌基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、癌基因反义序列的真核重组表达载体DNA，及其混合物。更佳地，所述的外源DNA选自下组
(i)抗癌基因p53、Rb；(ii)细胞凋亡基因Caspase、p15、p16及p21WAF-1；(iii)细胞因子基因GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子)基因、TNF(肿瘤坏死因子)α基因、INF(干扰素)α、γ基因、IL(白细胞介素)2、IL3、IL4、IL12、IL15、IL18基因；(iv)癌基因的反义序列癌基因ras、c-myc、Akt的反义序列；(v)真核重组表达载体病毒性真核重组表达载体(逆转录病毒重组表达载体、腺病毒重组表达载体、腺相关病毒重组表达载体)以及以SV40、CMV启动子为顺式调控元件的非病毒真核重组表达载体。
在另一优选例中，所述的组分(a)配体寡肽GA1、(b)多聚阳离子多肽和(c)内吞小体释放寡肽中的两者或三者以融合蛋白形式存在。
在另一优选例中，所述的内吞小体释放寡肽元件选自下组HA20或VP-1。
在本发明的第二方面，提供了一种寡肽，它结合于Tie2受体，且含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
在本发明的第三方面，提供了一种制备生长因子受体Tie2介导的靶向性基因治疗的基因转移系统的方法，包括步骤将(a)特异性结合于Tie2受体的配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽和任选的(c)内吞小体释放寡肽混合在一起，形成混合物。较佳地，对于组分(a)、(b)、(c)而言，可以使用任何二者形成二元复合物。
图1是本发明的GA1基因转移系统将β-gal基因导入人肺腺癌细胞系SPC-A1的X-gal染色结果。
A.GA1基因转移系统介导β-gal基因进入SPC-A1(×400)B.GA1基因转移系统介导β-gal基因进入SPC-A1(×100)C.生理盐水对照D.空质粒β-gal对照图2是体内实验中，GA1基因转移系统转导外源β-gal基因在体内的分布情况。其中，A.心；B.肝；C.脾；D.肺；E.肾；F.脑；G.胃；H.肠。
图3是体内实验中，GA1基因转移系统转导外源β-gal基因在不同时间(1、2、3、7天)在裸鼠皮下所荷人黑色素瘤A375中的表达情况。其中，A第一天；B第二天；C第三天；D第四天。
图4是体内实验中，GA1基因转移系统转导β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肺腺癌SPC-A1中的表达情况。
图5是体内实验中，GA1基因转移系统转导β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌SMMC-7721中的表达情况。
图6是体内实验中，GA1基因转移系统转导β-gal基因在裸鼠皮下所荷人胃腺癌SGC-7901中的表达情况。
图7是体内实验中，GA1基因转移系统转导β-gal基因在裸鼠皮下所荷人乳腺癌BCaP-37中的表达情况。图中放大的部分为一个小血管。
图8是体内实验中，GA1基因转移系统转导β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌移植瘤中的表达情况。
图9是体内实验中，GA1基因转移系统转导β-gal基因在裸鼠皮下所荷人肝癌移植瘤中的表达情况。
图10是体内实验中，GA1基因转移系统转导β-gal基因在裸鼠皮下所荷人宫颈癌移植瘤中的表达情况。
图11是人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠皮下肿瘤在注射GA1基因转移系统转导p53基因三周后各个组瘤块体积大小的比较。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，制备了特异性结合于Tie2受体的配体寡肽以及基于该配体寡肽的基因转移系统。利用本发明配体寡肽识别Tie2受体的特性，经细胞的内吞作用，通过该载体系统将外源DNA选择性地导入表达Tie2受体的肿瘤新生血管内皮细胞或肿瘤细胞，从而可以同时抑制血管新生和肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。在此基础上完成了本发明。
配体寡肽配体寡肽是本发明靶向性非病毒载体的关键组分。如本文所用，“配体寡肽(Ligand oligopeptide，LOP)”和“受体识别寡肽”可互换使用，指任何识别并结合于表面含Tie2受体的靶细胞的寡肽。如上所述，本发明的配体寡肽可特异性识别并结合于Tie2受体。
一类特别优选的配体寡肽是长度为15-30个氨基酸，且含有基本单元序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)的寡肽。特别优选的例子是寡肽GA1，其氨基酸序列为WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。GA1的氨基酸序列是根据对促血管生成素1和2的氨基酸序列的生物信息学分析而得出的。
此外，本发明的配体寡肽还包括一个或几个(通常1-8个，较佳地1-5个)位点的氨基酸可以用类似性能的氨基酸代替所形成的配体寡肽。
本发明的配体寡肽可以含有单个基本单元序列，或多个(如2-10个)基本单元序列。
本发明的配体寡肽可方便地用人工合成或基因工程重组方法制备。关于这些合成寡肽制法，可参见诸如WO98/18951(PCT/CN97/00106)等诸多文献。
多聚阳离子多肽多聚阳离子多肽是本发明靶向性非病毒载体的的另一关键组分。
如本文所用，“多聚阳离子多肽”指一类富含碱性氨基酸的多肽，其碱性氨基酸(赖氨酸、组氨酸和精氨酸)比例约20％以上，因而带正电荷，能与带负电荷的DNA藉静电引力结合，使DNA更稳定。
可用于本发明的多聚阳离子多肽没有特别限制，只要其碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)比例约20％以上，较佳地30％，更佳地40％以上，因而带正电荷即可。代表性的例子包括多聚赖氨酸、聚乙酰亚胺、鱼精蛋白、组蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，经聚乙二醇(PEG)修饰的上述蛋白及其混合物。
内吞小体释放寡肽元件本发明的靶向性非病毒载体还可含有内吞小体释放寡肽元件，它起到防止内吞入细胞的DNA被降解的作用。
任何内吞小体释放寡肽都可用于本发明，代表性的例子包括(但并不限于)HA20、VP-1。
靶向性非病毒载体如本文所用，本发明的“靶向性非病毒载体”指含有以下组分(a)和(b)、或者含有组分(a)、(b)和(c)的混合物或复合物(a)特异性结合于Tie2受体的配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽、(c)内吞小体释放寡肽。
在本发明中，组分(a)、(b)、(c)可以是非连接形式，也可以任何两者或三者通过共价或非共价方式连接在一起。特别优选的形式包括配体寡肽—多聚阳离子多肽二元复合物、多聚阳离子多肽—内吞小体释放寡肽二元复合物、配体寡肽—多聚阳离子多肽—内吞小体释放寡肽三元复合物。例如HA20-多聚赖氨酸、HA20-鱼精蛋白、HA20-组蛋白共价连接物等。
连接可以通过化学法(如使用SPDP等偶联剂)，也可以通过重组法，例如形成融合蛋白。
对于融合蛋白而言，在(a)配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽，和(c)内吞小体释放寡肽元件之间，可任选地含有连接肽，以便增加复合多肽空间结构的柔性和舒展性，让各元件发挥各自的功能。可用于本发明的连接肽没有特别限制，只要起连接作用即可。一类连接肽例子是(Gly)2-6Ser，例如(Gly)4Ser。连接肽可多个串联使用。
本发明的(a)配体寡肽，(b)多聚阳离子多肽，和(c)内吞小体释放寡肽元件都可以用类似性能的氨基酸替代，只要仍保留各自类似的生物功能。
靶向性非病毒载体的制备方法通常，将上述(a)、(b)、(c)组分或其复合物混合在一起，即可获得本发明的靶向性非病毒载体。其中，(a)、(b)、(c)组分的混合比例通常为0.5-1∶1-2∶0-1，较佳地为0.8-1∶1-1.5∶0.5-1。
此外，当以(a)-(b)复合物和(b)-(c)复合物的形式施用时，(a)-(b)复合物(b)-(c)复合物的混合比例通常为0.8-1.2∶0.8-1.2，较佳地为0.9-1.1∶0.9∶1.1。
外源DNA
可用于本发明的外源DNA没有特别限制，可以是各种治疗性或预防性的DNA，例如目的基因、反义癌基因、抗癌基因、自杀基因、细胞调亡基因、细胞因子基因、或其组合，或者含有上述基因的真核表达载体DNA。原癌基因反义序列包括原癌基因(rasH、rasK、rasN、c-myc、bcl-2、Akt)、生长因子及其受体基因的反义DNA序列、反义寡核苷酸及反义寡脱氧核苷酸；抑癌基因包括p53、Rb、PTEN，自杀基因包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因及CD(大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶)基因；细胞凋亡基因包括p15、p16、p21WAF-1；细胞因子基因包括GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)基因，TNFα(肿瘤坏死因子)基因，INF(干扰素)α、γ基因，IL(白细胞介素)2、3、4、12、15、18基因等。
靶向性基因导入系统将本发明的靶向性非病毒载体与外源DNA混合，就构成Tie2受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因导入系统。取决于所用的外源DNA，本发明的基因导入系统可用于治疗遗传疾病或肿瘤等疾病，尤其是用于基因治疗。
药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的一种或多种本发明的靶向性非病毒载体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。
施用时，药物组合物中还含有一种或多种上述的外源DNA。
具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于，(1)本发明的Tie2受体介导的基因治疗用非病毒载体，利用了肿瘤组织中血管内皮细胞及肿瘤细胞表面Tie2受体高表达的特点，可有效地将外源基因相对靶向性地导入肿瘤新生血管的内皮细胞和表达Tie2受体的肿瘤细胞，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。
(2)本系统有可能将外源治疗性基因同时导入肿瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞，通过抑制肿瘤血管新生和直接抑制肿瘤细胞，达到对肿瘤生长的双重抑制效果。
(3)另外该系统还有可能应用于其它与血管增生有关的疾病，如糖尿病性眼疾、风湿性关节炎等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1非病毒载体的构建A.各组分的获得(1)配体寡肽GA1的合成采用美国ABI公司的多肽合成仪并按照其多肽合成操作手册进行合成，柱层析分离得到寡肽GA1，其氨基酸序列为WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
(2)聚L-赖氨酸(Poly-L-lysine，简写为P.L.)购自美国SIGMA公司，分子量分布为15000-30000道尔顿。
(3)HA20采用美国ABI公司的多肽合成仪并按照其多肽合成操作手册进行合成，柱层析分离得到寡肽HA20，其氨基酸序列为GLFEA IAEFI EGGWE ELIEG(SEQ IDNO2)。
B.二元复合物的制备首先，将GA1、HA20和聚L-赖氨酸(Poly-L-lysine，简写为P.L.)溶于PSB(0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.4，含0.1M NaCl)中，然后，按下列步骤进行反应。
(1)P.L.+SPDP→P.L.-PDP注SPDP是N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯。
P.L.与SPDP(N-)的摩尔比为1∶5，反应时间为2小时，温度为25℃。反应完毕后通过透析去除未反应的SPDP。P.L.-PDP冷冻干燥。
(2)P.L.-PDP干粉溶于PSB中P.L.-PDP+DTT→P.L.-SH注DTT是二硫苏糖醇。
反应中DTT过量，反应时间为1小时，温度为25℃。反应完毕后通过透析去除未反应的DTT。产物冷冻干燥。
(3)GA1+SPDP→GA1-PDPHA20+SPDP→HA20-PDPGA1、HA20与SPDP的摩尔比均为1∶5，反应时间为2小时，温度为25℃。反应完毕后通过MWCO1000的透析袋透析去除未反应的SPDP。产物冷冻干燥。
(4)GA1-PDP、HA20-PDP和P.L.-SH干粉均溶于PSB中。
GA1-PDP+P.L.-SH→P.L.-GA1HA20-PDP+P.L.-SH→P.L.-HA20GA1-PDP、HA20-PDP与P.L.-SH的摩尔比为3∶1，反应时间为24小时，温度为25℃。反应完毕后通过透析去除未反应的GA1-PDP和HA20-PDP。
C.靶向性非病毒载体的制备分别以质量比1∶1、0.8∶1.2、1.2∶0.8混合P.L.-GA1与P.L.-HA20，即得所需的非病毒载体。
或者，按质量比1∶1.5∶1将GA1、聚赖氨酸和HA20混合在一起，形成所需的非病毒载体。
实施例2质粒DNA的抽提与纯化本实施例中所用重组真核表达载体质粒DNA的分离与纯化均利用QIAGEN公司的Maxi plasmid kit而得到的DNA纯品。
从LB平板上挑选单克隆接种于含氨苄青霉素的5mlLB培养基中，37℃，250rpm振摇过夜。1∶1000转接于含氨苄青霉素的200ml LB培养基中，37℃，250rpm振摇16小时。转移菌液于500ml离心管中，4,000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，收集菌体。沉淀重悬于10ml Buffer P1(50mM Tris·Cl，pH8.0，10mM EDTA pH8.0，100μg/ml Rnase A)。加入10ml Buffer P2(200mM NaOH，1％SDS)后轻轻颠倒4-6次，混匀，室温下静置5分钟。加10ml Buffer P3(3.0M NaAc，pH5.5)，颠倒混匀后，转移至50ml离心管，10,000rpm，4℃离心30分钟，取上清。上清经四层无菌过滤到QIAGEN Maxi质粒抽提柱中(预先用10ml Buffer QBT平衡)，让其自然流下，等上清完全进入柱中，再加Buffer QC 30ml洗涤二次，最后加入BufferQF 15ml，收集流出液，加入0.7倍体积异丙醇，10,000rpm，4℃离心30分钟，弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1次，室温下自然干燥，溶于适量体积的TE(pH 8.0)中，1％琼脂糖凝胶电泳坚定DNA的质量，紫外分光光度计检测其纯度并定量，-20℃保存。
实施例3四元复合体基因导入系统的构建1).GA1-P.L.和HA20-P.L.溶解于水后，经0.22μm滤器过滤除菌，-20℃储存备用。所有质粒经QIAGEN柱提取和纯化，再用2倍体积的酒精和1/3体积的3M NaAc沉淀，75％酒精洗一次后，空气中干燥。用适量MilliQ水溶解，使浓度成为0.2μg/μl。
2).非病毒载体与DNA形成复合物时二者之间的最佳质量比。
0.2μg CMV-β-gal质粒DNA与非病毒载体以质量比1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2混合，25℃静置30分钟，以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的阻滞情况，确定最佳质量比。
3).按上述确定的配比制备四元复合体基因转移系统。
实施例4 GA1基因导入系统转导CMV-β-gal基因的体外导入实验1).细胞培养SPC-A1细胞传代培养SPC-A1细胞用0.25％胰酶消化后，接种于细胞培养瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM完全培养液，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
2).体外导入实验培养细胞用0.25％胰酶消化后，接种于六孔板中，每孔1.5×105，第二天细胞满度约60％时，于1ml培养液中加入相当于2μg DNA的四元复合体基因转移系统。转染24小时后，换新鲜的含10％小牛血清的DMEM完全培养液，继续培养24小时。然后细胞用PBS洗2次，加入新鲜配制的固定液于室温固定10分钟，再用PBS漂洗3次，每次15分钟，以彻底去除固定液，用滤纸吸干瘤块和脏器上的PBS，加入新鲜配制的染色液于37℃保温24小时后，观察外源基因导入的情况(染色液组成是1mg/ml X-gal，5mM K4[Fe(CN)6]，5mMK3[Fe(CN)6]，2mM MgCl2)。
结果如图1所示。由图中可以看出，转导β-gal基因的细胞呈蓝色，而分别加入生理盐水和单纯质粒的对照组则未见外源基因的导入。
实施例5 GA1基因导入系统转导pCMV-β-gal基因在体内的分布取人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠，于皮下瘤周注射包裹了0.2μg DNA的GA1基因导入系统100μl。于第2天后牺牲裸鼠，取裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等脏器用上述方法进行染色并进行冰冻切片和复染。
结果见图2所示。结果表明，心、肝、肺、肾、脑均未见蓝染，而在脾脏中有外源基因导入。而在胃、肠粘膜中，虽然也有蓝染，但是我们实验室对未作任何处理的裸鼠胃、肠进行染色，腺上皮细胞也发现有蓝染，说明这些组织中存在非特异性的半乳糖苷酶活性。
实施例6 GA1基因导入系统转导pCMV-β-gal基因在不同时间的表达情况取人黑色素瘤A375荷瘤裸鼠，于皮下瘤周注射包裹了0.2μg DNA的GA1基因导入系统100μl，在注射后的第1、2、3和7天牺牲裸鼠，取出皮下肿瘤，按方法6进行组织染色和切片，于光学显微镜下观察结果并拍照。
结果见图3。结果表明，GA1基因导入系统导入的基因在第1天即开始有表达，第2天表达量最多，以后开始减少，至第7天仍有一定量的表达。
实施例7体内导入实验取荷不同肿瘤的裸鼠(SPC-A1肺腺癌、SMMC-7721肝癌、SK-OV-3卵巢癌、SGC胃癌细胞株、A375人黑色素瘤、BCaP-37人乳腺癌、荷人宫颈癌移植瘤裸鼠)，于皮下瘤周注射相当于0.2μgβ-gal DNA的GA1基因导入系统100μl，在注射后48小时牺牲裸鼠，取皮下肿瘤，用PBS漂洗2次，加入新鲜配制的固定液于室温固定20分钟，再用PBS漂洗3次，每次15分钟，以彻底去除固定液，用滤纸吸干瘤块和脏器上的PBS，加入新鲜配制的染色液(染色液组成是1mg/ml X-gal，5mM K4[Fe(CN)6]，5mMK3[Fe(CN)6]，2mM MgCl2)，于37℃保温24小时后，观察瘤块导入外源基因的情况，48小时后进行石蜡切片，然后用核固红对病理切片进行复染，观察外源基因导入情况(是否有蓝色斑点产生)。
结果如图4-10所示。可以看出，在肿瘤包膜及肿瘤内的部分血管中有报告基因的表达。由于在部分肿瘤细胞的表面也存在Tie2受体的表达，所以在肿瘤细胞内也可观察到有外源基因的表达。
这表明，本发明的基因转移系统，可有效地介导外源基因靶向性地导入肿瘤包膜及肿瘤内的部分血管和肿瘤细胞。
实施例8体内有效实验1)荷瘤裸鼠的准备将A375人黑色素瘤细胞株接种于5周龄裸鼠皮下，待瘤直径长至0.5cm后，作为瘤源。牺牲裸鼠，取出瘤块并切割成大小约1mm3碎块，用穿刺针接种到6周龄裸鼠皮下。
一周后，待肿瘤长到直径约为0.3-0.4cm时，挑选出瘤体均匀的动物，随机分为5组，每组6只备用。
2)GA1系统介导pCEP-p53基因的有效实验实验分五个组，分别是①生理盐水组，
②非病毒载体组(1μg GA1-PL)，③单纯质粒pCEP-p53组(1μg pCEP-p53质粒)，④低剂量组(每只注射相当于0.2μg质粒的四元复合体基因转移系统)，⑤高剂量组(每只注射相当于1μg质粒的四元复合体基因转移系统)。
每周注射一次，持续1个月。每周用游标卡尺测量裸鼠皮下瘤体的长(a)、短(b)径，根据V＝πab2/6计算瘤体积。
实验结果如表1，图11所示。结果表明，五个组的平均值分别为①1.498±0.600cm3②1.734±0.811cm3③1.727±0.526cm3④1.169±0.381cm3⑤0.731±0.328cm3，高剂量组与①、②、③组相比，抑制率分别为51.2％、57.8％、57.7％，并且与三个对照组的差别均有显著意义(P＜0.05)，而低剂量组只与单纯质粒组的差别有显著意义(P＜0.05)。这表明，本发明基于Tie2受体的配体寡肽的基因转移系统，可有效地介导pCEP-p53基因进入细胞并有效的抑制人黑色素瘤A375的生长。
表1体内有效实验中瘤块体积的比较①生理盐水 ②空载体 ③单纯质粒 ④高剂量 ⑤低剂量0.849 0.697 1.218 0.315 0.9280.998 0.934 1.277 0.421 0.9411.094 1.752 1.286 0.558 1.0001.735 2.037 1.979 0.719 1.1152.0036 2.081 2.353 1.120 1.2322.306 2.901 2.248 1.255 1.795平均值± 1.498± 1.734± 1.727± 0.731± 1.169±标准差 0.600 0.811 0.526 0.381 0.328在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市肿瘤研究所<120>Tie2受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统<130>025446<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(19)<223>结合于Tie2受体的配体寡肽<400>1Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp15 10 15Leu Gly Asn<210>2<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>内吞小体释放寡肽HA20
<400>2Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Glu1 5 10 15Leu Ile Glu Gly20
权利要求
1.一种生长因子受体Tie2介导的靶向性基因治疗的基因转移系统，其特征在于，它包含(a)特异性结合于Tie2受体的配体寡肽和(b)多聚阳离子多肽。
2.如权利要求1所述的基因转移系统，其特征在于，它还含有(c)内吞小体释放寡肽。
3.如权利要求1或2所述的基因转移系统，其特征在于，它还含有(d)外源DNA。
4.如权利要求1所述的基因转移系统，其特征在于，所述的配体寡肽含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
5.如权利要求1所述的基因转移系统，其特征在于，多聚阳离子多肽选自下组多聚赖氨酸、聚乙酰亚胺、鱼精蛋白、组蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，经聚乙二醇修饰的上述蛋白及其混合物。
6.如权利要求3所述的基因转移系统，其特征在于，所述的外源DNA选自下组抗癌基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、癌基因反义序列的真核重组表达载体DNA，及其混合物。
7.如权利要求3所述的基因转移系统，其特征在于，所述的外源DNA选自下组(i)抗癌基因p53、Rb；(ii)细胞凋亡基因Caspase、p15、p16及p21WAF-1；(iii)细胞因子基因GM-CSF基因、TNFα基因、INFα、γ基因、IL2、IL3、IL4、IL12、IL15、IL18基因；(iv)癌基因的反义序列癌基因ras、c-myc、Akt的反义序列；(v)真核重组表达载体病毒性真核重组表达载体以及以SV40、CMV启动子为顺式调控元件的非病毒真核重组表达载体。
8.如权利要求3所述的基因转移系统，其特征在于，所述的组分(a)配体寡肽GA1、(b)多聚阳离子多肽和(c)内吞小体释放寡肽中的两者或三者以融合蛋白形式存在。
9.如权利要求2所述的基因转移系统，其特征在于，所述的内吞小体释放寡肽元件选自下组HA20或VP-1。
10.一种寡肽，其特征在于，它结合于Tie2受体，且含有以下氨基酸序列WKEYK VGFGN PSGEY WLGN(SEQ ID NO1)。
全文摘要
本发明提供了一种由促血管生成素受体Tie2介导的基因转移系统，它包括它包含(a)特异性结合于Tie2受体的配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽和任选的(c)内吞小体释放寡肽和(d)外源DNA。所述基因转移系统能有效地在体内外将外源基因靶向性地导入肿瘤新生血管内皮细胞和表达Tie2受体的肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长。
文档编号A61K31/7088GK1504235SQ0215090
公开日2004年6月16日 申请日期2002年12月2日 优先权日2002年12月2日
发明者顾健人, 韩峻松, 田培坤 申请人:上海市肿瘤研究所