专利名称：血管生成素结合核苷酸的抗血管生成和抗癌作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及一种和血管生成素专一结合的寡核苷酸。该寡核苷酸可抑制人血管生成素和核糖体核糖核酸基因的转录调控区的结合从而抑制核糖体核糖核酸的转录和核糖体的合成、蛋白质翻译和细胞生长。本发明还涉及含有该血管生成素结合寡核苷酸的药物组合物。
背景技术：
肿瘤生长和转移对血管新生的依赖性已经被科学界广泛接受。除非建立其自己的血管网络，否则肿瘤组织只能长到直径1-2毫米的大小。这样大小的肿瘤对人体不构成危害。目前一个广泛被关注和接受的理论是长期使用抑制血管生成的药物，可使肿瘤细胞一直处于潜伏期。这样，癌症就象高血压和糖尿病一样可以长期用药物控制。这是目前癌症治疗研究的一个重要方向(Harris AL.Antiangiogenesis for cancer therapy.Lancet 1997；349 Suppl 2SII13-5.)。
实体肿瘤和血管生成的密切关系是最早被认识到的。已经知道各种恶性肿瘤如肉瘤、纤维瘤、粘液瘤、骨瘤、上皮瘤等等都分泌血管生成因子。从肿瘤发生的器官上分类，已知人体内各种器官癌变如肺癌、肝癌、乳癌、骨癌、前列腺癌、卵巢癌以及头和颈癌等等都和血管增生密切相关(Hui YF，Ignoffo RJ.Angiogenesis inhibitors.A promising role in cancer therapy.CancerPractice 1998；6(1)60-2.)。
最近的实验结果也证明，各种体液癌如各类白血病和淋巴癌也和血管增生有关(Schneider P，Jerome MV，Paysant J，Soria PC，Vannier JP.The roleof angiogenesis in leukemia proliferation.American Journal of Pathology1999；155(3)1007-8.)。这样，几乎人体内所有恶性和良性的肿瘤都与血管增生有关。血管增生和肿瘤的转移也有密切的关系。这个关系体现在两方面，一是原始肿瘤必须依靠血管生成才能进入血液循环，到达转移目的地。二是当进入血液循环的肿瘤细胞在目的地着床以后，必须促使新生血管的形成以达到生长，扩大的目的。
血管增生是指从一个已经存在的血管派生出微血管形成一个微血管网络形成微循环的一个过程(Yancopoulos GD，Klagsbrun M，Folkman J.Vasculogenesis，angiogenesis，and growth factorsephrins enter the frayat the border.Cell 1998；93(5)661-4.)。血管增生是一个由几个步骤所组成的一整套过程。它是正常生理过程如生育、成长、伤口愈合、月经周期所必需的，同时，在多种病理过程中，如肿瘤生长和转移，风湿性关节炎，糖尿病，视网膜病，牛皮癣等中起着关键作用。从细胞和生化水平上看，血管生成分四个步骤(1)正常血管内皮细胞受血管生成因子的刺激而激活；(2)激活的血管内皮细胞侵入周围组织向着血管生成因子所在的方向移动；(3)跟随其后的血管内皮细胞分裂填补移动细胞所留空隙；(4)新形成的微血管吻合，成熟而成一个具有功能的循环系统。所以，血管增生是一个持续的不间断的复杂过程。每个具体步骤的机理以及调控因子已基本阐明。
血管生成是一个多步骤的复杂过程。所以，血管生成的调控也是复杂的。这是一个动态的、控制非常严密的过程，是由血管生成因子以及血管生成抑制剂所决定的。目前已知的血管生成因子有大约二十五种(Iruela-Arispe ML，DvorakHF.Angiogenesisa dynamic balance of stimulators and inhibitors.Thrombosis & Haemostasis 1997；78(1)672-7.)。它们的理化性质各不相同。但都有一个共同的性质，那就是促进血管的生成。它们都已被纯化测序，其基因都已被克隆。比较常见的血管生成因子有血管生成素(Angiogenin)，血管内皮生长因子(VEGF)，酸性及碱性成纤维生长因子(aFGF和bFGF)，表皮生长因子(EGF)，血小板生长因子(PDGF)，血小板激活因子(PAF)，血小板内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(PIGF)，肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素样生长因子(IGF)以及白细胞介素-8(IL-8)等等。在很多情况下，这些生长因子在血液中的浓度和肿瘤生长呈正相关。
血管生成素是一个具有强烈刺激血管生成活力的蛋白质，人血管生成素由123个氨基酸组成，分子量为14400，等电点为9.2。血管生成素最早于1985年被发现，是第一个也是到目前为止唯一的一个仅仅靠测定体内血管生成活力而提纯分离的血管生成因子(Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，Alderman EM，BethuneJL，Riordan JF，Vallee BL.Isolation and characterization of angiogenin，an angiogenic protein from human carcinoma cells.Biochemistry 1985；24(20)5480-6.)。在众多的血管生成因子中，血管生成素诱导血管新生的活力是最高的。在受精鸡蛋绒毛膜(Chorioallantoic Membrane)的测定血管生成的活力体系中，1纳克(1ng)的纯血管生成素就有明显的促使血管生成的活力。所以，血管生成素在血管生成领域有其特殊的意义。
最近发现，血管生成素直接进入细胞核，集中在核仁里，和DNA结合而直接作用于细胞的基因转录系统(Hu G，Xu C，Riordan JF.Human angiogenin israpidly translocated to the nucleus of human umbilical vein endothelialcells and binds to DNA.J Cell Biochem 2000；76(3)452-62.)。血管生成素诱导核糖体核糖核酸(rRNA)的转录从而促使核糖体的生物合成。由于核糖体是蛋白翻译所必需的，没有蛋白翻译就没有细胞生长，所以，抑制血管生成素所诱导的rRNA的合成能有效地抑制血管内皮细胞的生长。
然而，目前为止尚没有有效抑制血管生成素诱导的rRNA转录的技术。因此，本领域迫切需要开发新的有效抑制由血管生成素诱导的rRNA转录的化合物和方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的血管生成素结合寡核苷酸，它可高效、低毒或无毒地抑制血管生成素诱导的核糖体核糖核酸的合成，进而治疗与血管生成过度有关的疾病。
在本发明的第一方面，提供了一种寡核苷酸，所述寡核苷酸和人血管生成素专一结合，且所述寡核苷酸的长度为10-150bp，其C+T含量占全部寡核苷酸的80％-100％，且含有5-30个连续的CT重复单元。
较佳地，所述的寡核苷酸的长度为12-50bp。
在另一优选例中，所述寡核苷酸包含6-10个(如6，7，8，9，10个)连续的CT重复序列。
在另一优选例中，3’端序列基本上由C和T构成，如CT或CCCTC。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸具有选自下组序列SEQ ID NO1-5，7-12。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸的序列是SEQ ID NO1，8，9，10，11或12。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有治疗有效量的本发明的寡核苷酸以及药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面，提供了本发明的寡核苷酸的用途，用于制备治疗以下疾病的药物(a)治疗人体肿瘤生长及转移；(b)治疗人体与血管增生过度有关的疾病。
图1显示了血管生成素和核糖体核糖核酸转录调控区DNA片段结合后引起的凝胶电泳迁移率的变化。血管生成素引起3.0kb片段迁移率改变。
图2显示了血管生成素和核糖体核糖核酸转录调控区3.0kb片段的结合专一性。血管生成素引起3.0kb片段迁移率改变，然而，溶菌酶(lysozyme)和核糖核酸酶A(RNase A)对3.0片段的迁移率没有影响。
图3显示了5个和血管生成素结合的克隆的核苷酸序列。
图4显示了4个合成的寡核苷酸的序列。
图5显示了人血管生成素和4个合成的寡核苷酸的结合。在竞争实验中，未标记的核苷酸浓度为同位素标记的核苷酸浓度的10倍。
图6显示了血管生成素和4个合成的寡核苷酸的正链，反链，或双链的结合。第一栏的亲和力数据由亲和层析方法测得。第二栏的结合常数由膜片法测定。
图7显示了为了测定血管生成素结合元件(ABE)转录活力所用的4个萤光素酶表达质粒的图谱。pGL3B为基本质粒，不含外源启动子和增强子。pGL3E含有SV40增强子。pGL3P含有SV40启动子。pGL3C为高转录对照质粒，含有SV40启动子和增强子。
图8显示了血管生成素结合元件(ABE)在4个萤光素酶表达质粒中的转录活力。ABE插入在4个表达质粒的Hind III位点。结果显示ABE在含有SV40增强子的质粒pGL3E中有很强的转录活力。
图9显示了血管生成素结合元件正向和反向插入的转录活力。结果显示ABE只有正向插入在Hind III位点才有转录活力，表示ABE为转录启动子。图9A为在HeLa细胞中的结果；图9B为在平滑肌细胞中的结果。
图10显示了ABE在不同细胞中的转录活力。ABE插入在pGL3E的Hind III位点。结果显示ABE的转录活力和细胞血管生成素的含量呈正相关HeLa细胞中最高，平滑肌细胞次之，U-937细胞最低。
图11显示了人为提高或降低细胞血管生成素水平对ABE转录活力的影响。平滑肌细胞用血管生成素的表达质粒pRM-Ang(+)或其反义质粒pRM-Ang(-)转化以提高或降低血管生成素含量，然后测定ABE在此种细胞内的转录活力。结果显示pRM-Ang(+)的共转化升高ABE的转录活力，而pRM-Ang(-)的共转化降低ABE的转录活力。
图12显示了血管生成素反义寡核苷酸CT-1对ABE转录活力的影响。结果显示CT-1处理降低ABE的转录活力，而对照寡核苷酸CT-2对ABE的活力没有影响。加入外源血管生成素能抵销CT-1的抑制作用。
图13显示了显示了血管生成素反义寡核苷酸CT-1抑制人内源血管生成素的合成。下图为β-肌动蛋白的PCR扩增结果，四个样品中的均一条带表示上样量相同。上图为血管生成素PCR扩增结果用溴乙锭显色。结果表示，CT-1处理降低血管生成素含量。而在空白对照，转化试剂Effectene，或对照寡核苷酸CT-2处理后血管生成素含量不变。表示CT-1处理对血管生成素合成影响的专一性。
图14显示了血管生成素结合寡核苷酸抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长。一万个HT-29人结肠腺癌细胞皮下注射入每个裸鼠的右肩。每组8个裸鼠，共3组。第1组用生理盐水处理，第2组用1毫克ABE处理，第3组用1毫克对照核苷酸处理。处理方法为每天皮下注射。注射位点在肿瘤细胞接种点附近。观察方法为每天观察触摸，用游标卡尺测定肿瘤体积。
具体实施例方式
本发明人通过广泛而深入的研究，通过对人血管生成素作用机理的阐述，发现一类具有CT重复单元的核苷酸是专一的人血管生成素的结合寡核苷酸，可用以抑制血管生成素在血管内皮细胞中的核活力从而抑制血管新生最终导致肿瘤生长的抑制。在此基础上，完成了本发明。
本发明的血管生成素结合寡核苷酸的长度没有特别限制。一般来说，为了达到一定程度的结合强度性，长度为10-150bp，较佳地为12-50bp，更佳地为12-30bp。其中C+T含量占全部寡核苷酸的80％-100％，较佳地90-100％。并且，本发明寡核苷酸需要至少5个CT重复单元，较佳地至少5个CT重复单元。
一种优选的血管生成素结合寡核苷酸是在序列可包含SEQ ID NO1所示血管生成素结合元件(ABE)的序列。序列5’-CTCTCTCTCTCTCTCTCCCTC-3’(SEQ IDNO1)与图3中克隆12的序列相同，是从核糖体核糖核酸基因的转录调控区克隆所得。该寡核苷酸和血管生成素的结合能力最高，并能高效驱动基因表达。
本发明首次公开了血管生成素在血管内皮细胞内对核糖体核糖核酸(rRNA)转录中的重要作用。本发明人发现，血管生成素诱导血管生成的作用机理的重要一环是进入血管内皮细胞核，结合在核糖体核糖核酸基因(rDNA)的转录调控区，促使rRNA的转录从而增强核糖体的生物合成，进而刺激细胞的生长和分裂。本发明从血管生成素的作用机理着手，利用和rDNA转录调控区血管生成素结合部位具有相似序列的血管生成素结合核苷酸，来抑制rRNA的合成。
由于rRNA是组成细胞核糖体的关键成分，核糖体是细胞内蛋白质合成的工厂，其数量多少直接决定蛋白质翻译的速度，从而决定细胞生长的速度。因此，用本发明的血管生成素结合核苷酸抑制血管生成素的活力可达到抑制血管内皮细胞分裂、血管新生所必需的加工厂(核糖体)的目的，有着事半功倍的效果。
本发明的应用范围包括所有与血管增生过度有关的疾病。
首先，本发明所提供的人血管生成素结合寡核苷酸可用于治疗人体与血管增生过度有关的疾病，其中包括但并不限于风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、牛皮癣、红斑痤疮、卡波济肉瘤、特异性反应性角膜炎、流行性角膜结膜炎、新生血管性青光眼、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、分支杆菌感染、多动脉炎、肉样瘤、巩膜炎、潮红、口干眼燥关节炎综合症、全身性红斑狼疮、爱滋病综合症、梅毒。
其次，鉴于血管增生和肿瘤生长及转移之间的密切关系，本发明所提供的人血管生成素结合寡核苷酸，不仅能抑制原始肿瘤的生长和扩展，同时也能抑制肿瘤转移的发生和扩大。适用的肿瘤例子包括但并不限于各种实体肿瘤和白血病，如肺癌、小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、肾细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、精原细胞癌、维尔姆斯瘤、胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、声带神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维乳头状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、脂肌瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛血管瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉牙瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、结缔组织瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤，急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性白血病、红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
肿瘤需要血管增生建立肿瘤血管循环系统来提供其快速生长所需的养料和排除废料。本发明通过抑制血管增生而达到抑制肿瘤生长与转移的目的。临床实验已经证明，血管新生抑制剂能有效地抑制各种人体肿瘤的生长和转移，并且没有抗药性。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明血管生成素结合寡核苷酸以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约50毫克/千克体重。
使用药物组合物时，是将安全有效量的血管生成素结合寡核苷酸施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的寡核苷酸配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的结合寡核苷酸可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，如血管生成素反义寡核苷酸CT-1，硫酸新霉素A，B，C，2-甲氧基雌二醇，TNF-α、TGF-β，IFN-α，血管他丁(Angiostatin)，内皮他丁(Endostatin)，甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、甲基ECNU、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1细胞培养人胎盘静脉血管内皮细胞(HUVE)培养于含有10％胎牛血清及每毫升10纳克碱性成纤维细胞生长因子的血管内皮细胞专用培养基(HE-SFM+10％ FCS+10ng/ml bFGF)中。培养条件为37℃恒温恒湿，5％二氧化碳气相。每隔二天换一次培养基，以1∶3的比率传代培养。用第三代至第十五代的HUVE细胞做实验。
人胎盘静脉血管平滑肌细胞(HuASM)，人子宫颈癌细胞HeLa和人结肠腺癌细胞HT-29培养在含有10％胎牛血清的DMEM中，以1∶4的比率传代培养。
U-937细胞在含有10％胎牛血清的RPMI中培养，以1∶4的比率传代培养。
实施例2血管生成素结合核苷酸的分离血管生成素进入血管内皮细胞的细胞核并诱导总RNA的合成(Xu ZP，TsujiT，Riordan JF，and Hu GF.The nuclear function of angiogenin inendothelial cells is related to rRNA production，Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，294，287-292)。由于Northern杂交显示血管生成素刺激核糖体核糖核酸(rRNA)的合成，所以进行了一系列的实验来证明血管生成素和核糖体核糖核酸基因(rDNA)转录调控区的结合。
首先取得一个长度为4.6kb的rDNA转录调控区片段并用限制性内切酶DpnI处理得到5个更小的片段。凝胶电泳迁移率实验表明血管生成素和3.0kb的片段结合，但对其它4个片段没有影响(图1)。
图2显示血管生成素对3.0kb DNA片段的结合是专一的。在同样的实验条件下，溶菌酶(Lysozyme)和核糖核酸酶A(RNase A)不和3.0kb的片段结合。因为溶菌酶和核糖核酸酶A都为碱性蛋白，其分子量和等电点与血管生成素相似，这说明血管生成素和3.0kb的片段结合不是由于电荷的相互作用引起的，而是一种特异性的结合。
实施例3血管生成素结合核苷酸的克隆和序列分析在本实施例中，为了进一步分析鉴定血管生成素结合核苷酸的性质，测定其序列。
将3.0kb DNA片段和血管生成素的结合物用脱氧核糖核酸酶(DNase I)处理。这样，只有和血管生成素直接结合部分的核苷酸不会被酶解。这些片段被分离克隆后，测定了核苷酸序列。图3列出了5个这样克隆的序列。这5个序列的共性是都富含C和T，并包含CT重复序列。第12号克隆的序列(CTCTCTCTCTCTCTCTCCCTC，SEQ ID NO1)最短，被命名为血管生成素结合元件(ABE)。
实施例4血管生成素与血管生成素结合核苷酸的结合实施例3中所述的核苷酸是从核糖体核糖核酸基因转录调控区分离得到的。为了证明血管生成素确实和具有CT重复序列的核苷酸结合并测定结合所需的最少重复序列个数，人工合成了如图4所示的4种核苷酸。它们与血管生成素的结合性质用3种不同的方法予以测定。
(1)凝胶电泳迁移率变动分析的方法将4种核苷酸首先与其反义链分别组成双链并用32P同位素标记。它们和血管生成素结合后的电泳迁移率和未结合的迁移率不同。
结果如图5所示，合成的长度为14聚体(14-mer)和21聚体(21-mer)的具有CT重复序列的核苷酸能和血管生成素结合。长度为10聚体(10-mer)的核苷酸有轻度的结合(图5)，而6聚体(6-mer)的核苷酸则不结合。凝胶电泳中显示的结合是专一的，因为未用同位素标记的相应核苷酸能和标记的核苷酸竞争。
(2)亲和层析法为了确认血管生成素能和具有CT重复序列的核苷酸结合，还采用了亲和层析的方法。将与图4所示的人工合成的核苷酸上样至血管生成素亲和柱后，用盐梯度洗脱，洗脱下的核苷酸在260nm测定光吸收。洗脱所需的盐浓度表示结合的强度。
图6显示了用血管生成素亲和柱结合双链，正链及反链核苷酸的结果。长度为21聚体的核苷酸的双链和正链能与血管生成素有效结合。长度少于10聚体的核苷酸不结合。所有的反链核苷酸都不和血管生成素结合。这些结果和图5所示一致。
(3)膜片法第三种用来测定结合的方法为膜片法。按Stockley PG，Filter-bindingassay，in Methods in Molecular Biology，1994，Vol.30DNA-ProteinInteractionsPrinciples and Protocols(Kneale，G.G.，Ed.)，pp.251-261，Humana Press Inc.，Totowa，NJ.中所述的方法进行。此法的优点是能测出二者之间的结合常数。
结果如图6所示。血管生成素和长度为21个及14聚体的双链核苷酸结合常数(Keq)分别为150和220nM。当长度降低到10聚体时，结合常数升高到大于1000nM，而长度降为6时，和血管生成素的亲和力消失不见(图6)。
实施例5血管生成素结合元件转录活力的测定由于血管生成素结合元件(ABE)是由核糖体核糖核酸基因转录调控区分离得到的，它可能具有驱动基因转录的活力。在本实施例中，用荧光素酶报告基因系统测定ABE的这种活力。
总共使用了4个荧光素酶报告质粒(购自Promega)。如图7所示，pGL3B为基本质粒，不含外源启动子和增强子，总的活力较低，可用来测定启动子或增强子的活力。pGL3E含有SV40增强子，适合用来测定启动子的活力。pGL3P含有SV40启动子，适合用来测定增强子的活力。pGL3C为高转录对照质粒，含有SV40启动子和增强子。
图8的数据表现了血管生成素结合元件(ABE)(SEQ ID NO1)插入到4个荧光素酶报告质粒中Hind III位点所起的驱动荧光素酶表达的能力。ABE插入到pGL3E报告质粒中的Hind III位点时活力最高，证明ABE具有启动子的活力。
如果ABE是一个转录启动子的话，它的活力将依赖于它在荧光素酶呈现质粒pGL3E中的插入位点。图9显示在子宫颈癌细胞HeLa和平滑肌细胞HuASM中，ABE只有插入在Hind III位点才有驱动荧光素酶表达的活力。这些结果进一步证明了ABE具有启动子的功能。还有，ABE如果反向插入，不管在什么位点都没有启动子的活力，表明ABE驱动基因转录的活力是专一的。
实施例6具有不同长度CT重复序列的核苷酸的转录驱动活力为了确定具有不同长度CT重复序列的核苷酸的转录驱动活力，人工合成了如表1所示的双链核苷酸，将它们插入到pGL3E荧光素酶报告系统的Hind III位点中，转化至HeLa细胞中测定转录活力。
表1不同长度CT重复序列的核苷酸的转录驱动活力核苷酸SEQ ID NO 插入方向 活力(在pGL3E中的升高倍数)Poly(G)2113 正向 0.4±0.1ABE 1 正向 72±4反向 0.8±0.2(CT)57 正向 1.9±0.3反向 0.4±0.1(CT)69 正向 16±1反向 0.6±0.1(CT)78 正向 35±3反向 0.8±0.1(CT)810 正向 53±4反向 1.1±0.1(CT)911 正向 56±10反向 0.7±0.2(CT)1012 正向 58±8反向 0.7±0.1结果表明需要至少6个CT重复序列才有明显的驱动转录能力。这些结果和实施例1-4中所述的血管生成素和不同长度核苷酸的结合能力一致(图4-6)。即至少具有5个CT，较佳地至少6个CT。
实施例7血管生成素结合元件的转录启动子活力取决于血管生成素的含量本实施例中的一系列实验证明了血管生成素结合元件必须和血管生成素结合后才有促使基因转录的活力。
首先，ABE被插入到pGL3E的Hind III位点，并转化到3种不同的细胞中测定荧光素酶的活力。在使用的3种细胞中，HeLa细胞含有最高的血管生成素，每天每百万个细胞分泌1.5ng；平滑肌细胞次之，每天每百万个细胞分泌0.7ng；而在U-937细胞中，检测不到血管生成素的分泌(Moenner M.，Gusse M.，HatziE.，and Badet J.The widespread expression of angiogenin in differenthuman cells suggests a biological function not only related toangiogenesis，Eur.J.Biochem.1994，226，483-490)。结果如图10表示。ABE的驱动荧光素酶转录的活力在HeLa细胞中最高，平滑肌细胞中次之，U-937细胞中最低。这些结果表明，血管生成素结合元件的转录启动子活力取决于血管生成素的含量。
接着，构建了二个血管生成素的表达质粒。pRM-Ang(+)含有血管生成素基因正向插入，pRM-Ang(-)含有反向插入的血管生成素基因，可以反义的方式抑制胞内血管生成素的表达。将PCR扩增的血管生成素基因正向或反向地插入pRMHa-3(Promega公司)的多克隆位点，用序列测定法确定插入方向。它们被转化至人平滑肌细胞中后，由于外源血管生成素基因的表达，将为分别升高和降低细胞内源血管生成素的含量。图11表示在pRM-Ang(+)转化的细胞中，ABE的活力进一步升高。而在pRM-Ang(-)转化的细胞中，ABE的活力基本消失不见。这些结果表明血管生成素结合元件的活力确实和细胞内血管生成素的含量呈正相关关系。
第3个用来证明血管生成素结合元件的转录驱动活力取决于血管生成素含量的方法为反义核苷酸法。CT-1为血管生成素的专一反义核苷酸，序列为CAACAAAACGCCCAGGCC(SEQ ID NO14)，与人血管生成素mRNA的第122-139位互补。细胞内的血管生成素含量可被CT-1降低。
结果如图12所示。ABE的启动子活力在CT-1处理后明显降低，而在对照核苷酸CT-2(长度为18bp的随机寡核苷酸，序列为CCGGACCCGCAAAACAAC，SEQ IDNO15)处理后没有变化。在反义核苷酸CT-1处理后，加外源血管生成素能使ABE的活力基本恢复。这进一步证实了血管生成素在ABE的转录活力中起重要作用。
图13显示细胞内血管生成素的含量在CT-1处理后确实降低了。细胞内的总mRNA用Trizol分离，经RT-PCR扩增后用溴乙锭显色，上图所示条带为人血管生成素的cDNA。下图所示为β-肌动蛋白的PCR扩增结果，表示上样量的均一。结果表明，经CT-1处理后，细胞内的血管生成素的水平降低。然而，在同样条件下经CT-2处理或者仅经Lipofectin处理，对细胞内血管生成素含量没有影响。
实施例8血管生成素结合核苷酸抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长为了证明血管生成素结合核苷酸的抗肿瘤作用，进行了如下的动物实验。无胸腺小鼠(裸鼠)因为免疫缺陷，外源肿瘤细胞能在其身上建立并快速生长。在肿瘤生长抑制剂的处理下，肿瘤生长速度下降，停止或不发生。
具体方法为一万个HT-29人结肠腺癌细胞皮下注射入每个裸鼠的右肩。每组8个裸鼠，共3组。第1组用生理盐水处理。第2组用每公斤体重1毫克血管生成素结合核苷酸(SEQ ID NO1)皮下注射，注射位点在肿瘤细胞接种点附近。第三组每公斤体重1毫克对照核苷酸皮下注射。观察方法为每天观察触摸，用游标卡尺测定肿瘤体积。
如图14所示，裸鼠经人结肠腺癌细胞HT-29结种后，所有动物都长肿瘤并导致最终死亡。在每天皮下注射血管生成素结合核苷酸处理下，约有80％动物没有长上肿瘤。结果表明，血管生成素结合核苷酸有很好的抗癌活力。
重复上述实验，分别用SEQ ID NO8、10，12所示的核苷酸序列替换SEQ IDNO1所示的序列，结果表明，这些血管生成素结合核苷酸同样有显著的抗癌活力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海福缘生化药学研发有限公司<120>血管生成素结合核苷酸的抗血管生成和抗癌作用<130>027193<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ctctctctct ctctctccct c 21<210>2<211>108<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2tctctctttc tgtctgtttc tcactgtctc tctctgtcca tctctctctc tctctgtctg60tctctttcgt tctctctgtc tgtctgtctc tctctctctc tctctctg108<210>3<211>116<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3tctgtctgtc tctctcactg tgtgtgtgtc tctgtctctg cctctctctc tctctctctc60tctgtctgtc tctctcactg tgtgtgtctg tcttctgtct tactctcctt ctctgc 116<210>4<211>127<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4
cttgtccctc cctgtctgtt tctctctctc tctctctctc tctctctgtc tgtctgtttc60tctctatctc tcgctgtcca tctctgtctt tcatgtctgt ctctttctct gtcagtctgt 120cagtcac 127<210>5<211>150<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5tctctctctg tctgtctatg tcttctctgt ctgtctcttt ctctgtctgt ctgcctcttc60tcttcttttc tgtgtctctc tgtcggtctc tctctctctg tctgtctgtc tgtctctctc 120tctctctctc tgtgcctatc ttctgtctta150<210>6<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
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权利要求
1.一种寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸和人血管生成素专一结合，且所述寡核苷酸的长度为10-150bp，其C+T含量占全部寡核苷酸的80％-100％，且含有5-30个连续的CT重复单元。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，寡核苷酸的长度为12-50bp。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含6-10个连续的CT重复序列。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述的寡核苷酸具有选自下组序列SEQ ID NO1-5，7-12。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸，其特征在于，所述的寡核苷酸的序列是SEQ ID NO1，8，9，10，11或12。
6.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利要求1所述的寡核苷酸以及药学上可接受的载体。
7.如权利要求1所述的寡核苷酸的用途，其特征在于，用于制备治疗以下疾病的药物(a)治疗人体肿瘤生长及转移；(b)治疗人体与血管增生过度有关的疾病。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组肺癌、小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、肾细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、精原细胞癌、维尔姆斯瘤、胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、声带神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维乳头状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、脂肌瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛血管瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉牙瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、结缔组织瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤，急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性白血病、红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
9.如权利要求7所述的用途，所述的人体与血管增生过度有关的疾病选自下组风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、牛皮癣、红斑痤疮、卡波济肉瘤、特异性反应性角膜炎、流行性角膜结膜炎、新生血管性青光眼、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、分支杆菌感染、多动脉炎、肉样瘤、巩膜炎、潮红、口干眼燥关节炎综合症、全身性红斑狼疮、爱滋病综合症、梅毒。
全文摘要
本发明提供了用以抑制血管生成素诱导的rRNA合成的核苷酸－血管生成素结合元件(ABE)。所述寡核苷酸的长度为10－150bp，其C+T含量占全部寡核苷酸的80％－100％，其含有5个－30个连续的CT重复单元。实验已证明，ABE和血管生成素专一结合从而抑制rRNA的合成，动物实验也证明ABE能抑制人体肿瘤在裸鼠上的生长。
文档编号A61P3/10GK1502629SQ02150729
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月27日 优先权日2002年11月27日
发明者许正平, 胡国富 申请人:上海福缘生化药学研发有限公司