专利名称：一种透明质酸修饰的新型三元结构非病毒基因传输系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术基因治疗领域，涉及基因传输系统，具体来说涉及一种三元结构的 非病毒基因传输系统、制备方法及其应用。
背景技术：
随着人类基因组计划对人类基因测序的顺利完成，目前己经能够确定许多的先天性或者 后天性疾病的致病基因，这为人类能够预防、治疗甚至是彻底治愈这些疾病带来了希望。比 如某些遗传性疾病的致病基因在发生畸变后，在个体自身无法正常修复的情况下，最佳的办 法就是将外源性的修复基因或者治疗基因导入至病变细胞，通过与宿主细胞核中的染色体DNA
进行整合，稳定长效的表达出相应的功能蛋白，最终治疗或者治愈各种疾病。基因治疗包括 三个方面的内容，即治疗基因、基因传输载体和标靶细胞，而其中的基因传输载体又是基因 治疗中最关键的部分。根据来源的不同，常见的基因传输载体可分为病毒和非病毒载体两大 类。尽管病毒载体转染效率高，是体内基因治疗的主要工具，但病毒载体制备工艺复杂，基 因的有效荷载率低，以及一系列的潜在安全性问题(比如机体产生免疫原性反应等等)，使得 病毒载体的发展受到限制。而非病毒载体作为新一代的基因传输系统，最近10年发展的很快， 甚至被称为"人工病毒"。它易于制备和修饰，目的基因荷载量大，免疫原性反应也更低。
非病毒载体分为阳离子脂质载体和阳离子聚合物载体两大类。作为第一代的阳离子脂质 载体系统，由于它在内含体逃逸以及进入细胞核等关键步骤的效果不理想，人们开发了第二 代的非病毒载体系统——阳离子聚合物(polycation)载体。自从上世纪90年代报道聚合物 作为基因载体以来，聚赖氨酸(PLL)，聚乙烯亚胺(PEI)和壳聚糖(Chitosan)等已陆续成 为多聚物基因载体研究的热门研究领域。阳离子聚合物不含有阳离子脂质体的长脂肪烷链， 它有一些特殊的性质，在PEI, PLL等聚合物的骨架单体中含有可质子化的氮原子，荷有大 量的正电荷，有很强的浓縮DNA能力和细胞黏附能力，同时能保护DNA不被血液调理素等成 分降解。阳离子聚合物与DNA所形成的polycation/DNA 二元结构复合物被摄取进入细胞的内 含体后，内含体不断酸化(pH值约为4.5 5.0)，阳离子聚合物中多数的氨基团可被质子化(比 如25KDa的PEI表观pKa值为8.5)，使得阳离子聚合物在内含体中有较大的质子缓冲能力， 能发挥"质子海绵"作用，最终成功从内含体中逃逸，并能促进DNA进入细胞核，为提高治疗 基因的转染效率提供了前提保障。但是阳离子聚合物与DNA所形成的二元复合物往往带有过剩的正电荷，与细胞表面的 粘附没有特异性，而且大量的正电荷也可能给细胞带来急性以及延迟的毒副作用。为了解决 阳离子聚合物等非病毒基因传输系统的靶向性以及安全性问题，研究人员进行了大量的研究。 譬如在阳离子聚合物上连有针对特定细胞耙向配体(比如叶酸，转铁蛋白，半乳糖等等)，提 高polycation/DNA复合物的靶向摄取能力，或者对阳离子聚合物用一些亲水性物质进行修饰 (比如PEG)，降低阳离子聚合物外周的正电荷分布，提高复合物的血桨稳定性和降低细胞毒 性等等。
但是非常遗憾，尚没有一种非病毒基因传输系统同时兼有靶向性和亲水性，且细胞毒性 较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的缺点，提供一种同时具有靶向性和亲水 性而且细胞毒性低的非病毒基因传输系统。同时，本发明还提供该非病毒基因传输系统的制 备方法和应用。
我们发现，内源性物质透明质酸(HyaluronicAcid ， HA)是以葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖为 双糖单位组成的直链高分子多糖，平均分子量为105 10703 ，广泛存在于机体的多种组织。 HA分子中的每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下均可解离成负离子并可与金属离 子成盐(比如说透明质酸钠)，具有水溶性。根据HA分子量以及浓度的不同，HA分子在生 理条件下的水溶液中形成一定的线团网状结构，可以附着在细胞等物体的周围。而且许多细 胞表面(比如上皮细胞，巨噬细胞，单核吞噬细胞等)存在有HA的特异性受体(比如CD44 和RHAMM)，且在肺癌等多种肿瘤细胞的表面HA的特异性受体CD44也过量表达，HA可 通过与细胞表面的HA受体发生特异性结合，介导物质进入细胞，并调节细胞的移动以及吞 饮过程。由于HA具有良好的生物相容性，并同时具备亲水性和一定的靶向性，利用其对阳 离子聚合物与质粒DNA所形成的二元复合物进行适当的物理修饰，可以同时解决减少细胞 毒性和提高靶向性等关键难题。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案
一种非病毒基因传输系统，该系统由透明质酸(HA)、阳离子聚合物(polycation)和质 粒DNA组成，其中含有可质子化的氨基单元的阳离子聚合物与含有的可电离的磷酸根离子 的DNA形成二元结构复合物粒子，然后用含有可以电离的羧基的透明质酸进行物理修饰形成三元结构复合物，三者之间通过静电作用结合。
所述的透明质酸分子量为5~3000KDa，优选范围为10~1500 KDa。
所述的质粒DNA是各种含报告基因、抗癌基因或细胞因子基因的能在真核细胞中重组 表达的质粒DNA。
所述阳离子聚合物为含有可质子化的氨基的聚合物，选自聚乙烯亚胺、壳聚糖或聚赖氨 酸，聚乙烯亚胺的分子量为1.8-100 KDa(优选范围为1.8-25 KDa)，壳聚糖的分子量为5-200 KDa (优选范围为10~100 KDa)，聚赖氨酸的分子量为1~200 KDa (优选范围为2~100 KDa)。
本发明的非病毒基因传输系统的制备方法，包括如下步骤将透明质酸、阳离子聚合物
和质粒DNA分别用适当溶媒溶解，配制成所需浓度的溶液，阳离子聚合物与质粒DNA的按 合适的比例混匀，阳离子聚合物和DNA通过静电作用力自组装形成二元结构复合物溶液， 然后按照合适的比例加入透明质酸溶液，混匀后即得三元结构的微^t。
所适当溶媒选自磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液、葡萄糖溶液或HBS缓冲液，溶媒pH 值5.0-9.0;透明质酸、阳离子聚合物和质粒DNA的浓度为0.1 10 mg/ml;阳离子聚合物与 DNA的N/P比例(阳离子聚合物中氮原子与DNA中磷酸根的摩尔比例)为0.01-100;透明 质酸与阳离子聚合物的重量比(w/w)为0.05-50;阳离子聚合物与质粒DNA室温下混匀后 静置15 60min，后与透明质酸溶液混匀后静置15~60min。所得微粒粒径在2微米以下。
其中优选的阳离子聚合物与DNA的N/P为1~50，透明质酸与阳离子聚合物的重量比 (w/w)为1~20。
本发明提供的非病毒基因传输系统可以用在转染包括人体以及动物来源的内皮细胞、上 皮细胞以及肿瘤细胞。
本发明提供的非病毒基因传输系统用于制备基因治疗药物。
本发明提供的非病毒基因传输系统的给药方法，可采用口服、注射或者粘膜途径给药， 进行体内转基因实验。
本发明通过透射电镜(TEM)以及动态光散射(DLS)表征载体与DNA复合物的形态 及粒子表面特征，考察其是否能满足被细胞内吞的要求。具体步骤见实施例4和5。
本发明通过凝胶阻滞实验验证该新型的基因传输系统对质粒DNA的荷载及包裹效果， 并通过DNA酶解实验考察该基因传输系统对抗核酸酶降解的能力，进而进一步验证复合物 在转染条件下的稳定性。具体实验步骤见实施例6和7。
本发明用体外细胞转染实验，验证该新型三元结构非病毒基因传输系统的细胞转染性能。 通过与未加修饰的PE]/DNA 二元复合物的转染效果进行对比，说明该新型基因传输系统的靶向性和提高基因转染效率的有效性。具体步骤见实施例8。
本发明测试了载体的细胞毒性。聚乙烯亚胺细胞毒性较高，为考察该新型三元结构的非 病毒基因传输载体的细胞毒性，采用MTT实验测试。具体步骤见实施例9。
本发明还将该新型三元结构非病毒基因传输载体用于动物的转基因试验，结果表明该载 体能有效地将目的基因递送至靶细胞并能表达出相应的蛋白，发挥基因治疗的作用。具体歩 骤参见实施例10和11。
木发明的有益效果包括-
(1) 本发明的非病毒基因传输系统同时具有靶向性和亲水性，细胞毒性低，大大提高基 因传输系统的安全性；
(2) 本发明提供的非病毒基因传输系统能将外源性的治疗基因更加有效地导入高表达有 HA受体的肿瘤细胞系和肿瘤组织(比如说肺癌和肝癌)，能够抑制恶性肿瘤的生长，使得该 新型基因传输系统更加具有肿瘤靶向性和肿瘤治疗的有效性；
(3) 本发明提供的聚合物具有广泛的基因适应性，有效荷载的外源DNA大小范围可以 从几十bp到几千kb，克服了病毒载体荷载外源基因量较小的缺点，可用于制备多基因的联 合转移以治疗肿瘤等疾病的新型基因传输载体，同时也可作为平台技术用于制备治疗其他疾 病的基因传输系统。
(4) 本发明提供的非病毒基因传输系统制备工艺简便可行，无需特殊的仪器设备，可直 接用于细胞和动物试验。
说明书附图
图1是新型的三元结构非病毒基因传输系统——HA/polycation/DNA制备后，用TEM观 测，所得复合物的物理形态和粒子大小。
其屮，A为三元结构复合物，HA/PEI/DNA=30:3:1
B为二元结构复合物，PE1/DNA=3:1
图2是新型的三元结构非病毒基因传输系统——HA/polycation/DNA制备后，用DLS测 定，所得复合物的粒径大小。
其中，A为三元结构复合物，HA/PEI/DNA=30:3:1B为二元结构复合物，PEI/DNA=3:1
图3是新型的三元结构非病毒基因传输系统——HA/polycation/DNA制备后，凝胶电泳阻 滞实验结果。
图中的点样顺序为(右起)
HA/PEI/DNA=5:0.5:1， HA/PE1/DNA= 10:1.0:1, HA/PEI/DNA=15:1.5:1,
HA/PEI/DNA=20:2.0:1, HA/PEI/DNA=25:2.5:1， HA/PEI/DNA=30:3.0:1，
HA/PEI/DNA=40:4.0:1, DNA
图4是HA/polycation/DNA新型的三元结构非病毒基因传输系统转染H邻G2细胞后荧光 显微镜视图。
其中，A为三元复合物组，HA/PEI/DNA= 120:12:1; B为阳离子脂质体Lipofectamine2000组； C为裸DNA组;
D为二元复合物组，PEI/DNA=12:1。 图5是MTT实验数据图表，包括PEITHA组和PEI组。
具体实施例
以下内容将结合具体实施例进一步阐述本发明。应充分说明的是，应充分说明的是，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。例如本发明所描述的阳离子聚合物 除聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和壳聚糖外，还应包括其他的具有类似性质的阳离子聚合物，比如 聚酰胺-胺型分枝状聚合物(PAMAM)和聚精胺酸等，所述阳离子聚合物的分子量也不应局 限于所采用的分T量范围。作为物理修饰物的透明质酸，其分子量范围也不局限于实施例中 釆用的范围，应具备更广阔的选择尺度，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明 的适用范围。
实例1: HA/PE1/DNA三元结构基因传输系统的制备
将聚乙烯亚胺，pIRES2-EGFP质粒和透明质酸用PBS缓冲液配成浓度分别为0.1mg/ml， O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。将聚乙烯亚胺溶液与pIRES2-EGFP-p53质粒溶液按合适的比例 涡旋混匀10s后，制得PEI/DNA 二元复合物溶液，室温放置30min后按合适的比例将透明质 酸溶液加入至PEI/DNA二元复合物溶液中，涡旋10s后，即可得三元复合物溶液。实例2: HA/Chitosan/DNA三元结构基因传输系统的制备
将壳聚糖适量用PBS溶解，pH值调至5.0，浓度为O.lmg/ml。将pIRES2-EGFP质粒和 透明质酸用PBS缓冲液配成浓度分别为O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。将壳聚糖溶液与 pIRES2-EGFP质粒溶液按合适的比例涡旋混匀10s后，制得Chitosan/DNA 二元复合物溶液， 室温放置30min后按合适的比例将透明质酸溶液加入至Chitosan/DNA 二元复合物溶液中，涡 旋10s后，即可得三元复合物溶液。
实例3: HA/PLL/DNA三元结构基因传输系统的制备
将聚赖氨酸，pIRES2-EGFP质粒和透明质酸用PBS缓冲液配成浓度分别为0.1mg/ml， O.lmg/ml和2mg/ml的溶液。将聚乙烯亚胺溶液与pEGFP-Cl质粒溶液按合适的比例涡旋混 匀10s后，制得PLL/DNA 二元复合物溶液，室温放置30min后按合适的比例将透明质酸溶 液加入至PEI/DNA二元复合物溶液中，涡旋10s后，即可得三兀复合物溶液。
实施例4: HA/PEI/DNA三元结构基因传输系统透射电镜(TEM)观察
HA/PEI/DNA三元结构复合物的大小和形态可通过负染透射电镜检测。按 HA/PEI/DNA=50:5:1以及PEI/DNA=5:1的比例分别制备三元和二元结构复合物，涡旋混合后 室温静置30min后，取少量样品轻轻地滴在专用铜网上。lmin后，将铜网放在醋酸双氧铀溶 液(1%, w/w)上染色20s。过量的溶液用吸水纸小心吸除。样本在JEM-2100透射电子显微 镜下观测，加速电压100千伏。三元结构复合物在电镜下呈类圆形颗粒状，稍不规则，大小 200-250nm左右， 一元结构复合物呈现类圆形，粒径在100-150nm左右。表明HA/PE]/DNA 三元结构复合物的粒径相比二元复合物粒子大小要偏大些。(参见图1)
实例5: HA/PEI/DNA三元结构基因传输系统粒径测定和zeta电位测定
将实例1中的制备方法，按HA/PE1/DNA-30:3:1以及PEI/DNA=3:1的比例分别制备三元 和二元结构复合物，室温静置20min后，取100u 1复合物溶液用三次过滤的PBS溶液稀释到 1000ul，用粒径和电位测定仪(Marvern， Nano ZS90)进行测定。结果表明三元复合物的水 合粒径在400nm左右，二元结构复合物的水合粒径在220nm左右(参见图2)， zeta电位为-17mv 左右。
实例6: HA/PEI/DNA三元结构基因传输系统电泳阻滞试验
按实例1中HA/PEI/DNA三元结构基因传输系统的制备方法，取PEI/DNA的N/P=0，0.5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5, 3.0， 4.0，应用PBS (pH=7.4)作为溶媒，分别配制二元复合物的溶液，室温下放置20min。在制各二元复合物的基础上，按照HA与PEI的质量比为10:1加入2mg/ml 的HA溶液(PBS)，使得溶液的总体积为即可制备得到三元结构的复合物。分别取15pl 进行琼脂糖凝胶电泳观察DNA阻滞情况。电泳条件:0.7%琼脂糖(含GoldViewer ), 0.5xTBE 缓冲液，电压90V，电泳时间90min。结果表明当三元复合物N/P达到3时可将质粒DNA完 全阻滞在加样孔中。(参见图3)
实例7: HA/PE1/DNA三元结构基因传输系统DNase酶解试验
制备不同N/P/HA比例的PEI/DNA/HA的复合物，然后在反应缓冲液(pH 7.4, 50 mM Tris - HCl， 10 mM NaCl, 10 mM CaCl2， 6 mM MgCl2)中加入1 unit/ u g of DNase I， 37 °C下孵 育lh。孵育后，每个样品中加入10iiL的EDTA(0.1M)，溶液同时在80°C卜加热lOmin， 将DNase I灭活。最后加入30uL的肝素(10mg/ml)，涡旋15min将DNA从三元复合物 中竞争解聚出来，随后进行电泳阻滞实验，结果表明当N/P/HA比例在3:1:30时，三元复合 物便能保护DNA不被DNase降解。
实例8: HA/PE]/DNA三元结构基因传输系统细胞转染试验
人肝癌细胞HepG2以适宜浓度接种于培养瓶中，加入含10呢胎牛血清、100U/ml的青霉 素、100U/ml的链霉素的DMEM培养液，置于37。C恒温、5%C02及饱和湿度的培养箱屮培 养，细胞呈贴壁生长。每2 3天传代一次，传代时用0.02% EDTA消化2 3min，弃去消化 液，加入新培养液吹打均匀，按所需细胞量移入新培养瓶中，添加完全培养液至适量。
转染前一天，将对数生长期的HepG2细胞接种于24孔板，使得次日细胞融合率达 80%-90%。转染前4h，将细胞用无血清无双抗的培养基孵育。将配置好的转染试剂均匀加入 各孔中，于37。C、 5免C02条件下培养4-6h，后更换有血清无双抗的培养基，继续培养24h 或48h，对细胞进行荧光检测，观察GFP的表达情况，结果表明HA/PEI/DNA三元结构基因 传输系统组的细胞转染效果与阳性对照组(Lipofectamhie2000)相当，且明显高于PEI/DNA 二元结构复合物组。(参见图4)
实例9: HA/PEI/DNA三元结构基因传输系统细胞毒性试验
将处于对数生长期的HepG2细胞用0.02%EDTA消化，制成细胞悬液，分别以1 X 105/ml 细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100^1，设五复孔，置37°C 5% C02孵箱内培养24h左右， 再分别加入终浓度为l、 5、 10、 20、 40、 80和160|ig/ml的PEI或PEI/HA100n]/孔，分别孵 育24h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20|^1，继续培养4h，弃去全部上清，加入DMSO 100)ll /孔，微型振荡器上振动5分钟，使结晶完全溶解，于酶联仪570nm波长处测定吸光度值(A)，A值越高活细胞数也越多。根据A计算药物对细胞的活力抑制率。结果表明PEI/HA组的细 胞抑制率要明显低于PEI组，表明加入HA修饰后降低了基因传输系统的细胞毒型。(参见图 5)
油制重《n加药组细胞平均吸光值、x丽 抑制率%= (1—对照组细胞平均吸光值)X100%
实例10: HA/PEI/DNA三元结构基因传输系统荷瘤小鼠注射给药转基因试验
将Hela细胞株接种于5周龄BALB/C裸鼠腹侧皮下，待瘤直径长至0.3-0.5 cm后，将荷 瘤裸鼠随机分组，每组5只，分别为NS (生理盐水)组、质粒pIRES2-EGFP-p53组、PEI/ pIRES2-EGFP-p53组、HA7PET/ pIRES2-EGFP-p53组。瘤体注射相当5pgDNA质粒的转染复 合物lOO^il, HA/PEI/DNA =120:12:1。第二天重复注射一次。注射后7天，处死裸鼠，取皮 下肿瘤，用PBS缓冲液(pH7.0)漂洗2次，加入新鲜配制的固定液(2%多聚甲醛0.25%戊 二醛PBS溶液)4(TC固定15 min， PBS漂洗15minx3次。用OCT包埋液包埋肿瘤组织，放 在冷冻切片机内冷冻。切片冷冻后，将切片固定在载玻片上，风干。用4%甲醛中作用10min， 使切片固定在载玻片上。在漂洗后将载玻片于反应缓冲液中37'C染色4-24h。镜下观察结果， 发现pIRES2-EGFP-p53组瘤体组织EGFP有效表达，且明显高于其他对照组。
将HepG2细胞株接种于裸鼠皮下，建立肿瘤模型，瘤块长至直径约0.4cm时，小鼠尾静 脉内注射携带pIRES2-EGFP-p53质粒的PE1/DNA/HA新型三元结构复合物进行基因治疗，给 药量为5ug每周二次共两周，同时观察肿瘤形态变化。与NS (生理盐水)组、质粒 pIRES2-EGFP-p53组、PEI/ pIRES2-EGFP-p53组比较，HA/PEI/ pIRES2-EGFP-p53组肿瘤牛 长明显受抑，接种后四周，与NS组比较，HA/PEI/pIRES2-EGFP-p53组肿瘤抑制率达46%。
实施例11: HA/PEI/DNA三元结构基因传输系统荷瘤小鼠肺部粘膜给药转基因试验
用雄性无胸腺裸鼠构建LM-6骨肉瘤细胞模型，将SAOS-LM6人源骨肉瘤细胞株静脉注 射后6周肺转移，8周后可见肺部明显肿瘤形貌。将荷瘤鼠随机分组，每组5只，分别为NS (生理盐水)组、质粒pIRES2-EGFP-p53组、PE1/ pIRES2-EGFP-p53组、HA/PEI/ pIRES2-EGFP-p53组。将药液气雾给药至肺部粘膜，给药量为2mg质^/10ml气雾溶液， HA/PEI/DNA=120:12:1。初次给药后第三天再次给药， 一周两次共6周，然后处死裸鼠，分 离肺部肿瘤并称重。用PBS缓冲液(pH7.0)漂洗后用OCT包埋液包埋肿瘤组织，放在冷冻 切片机内冷冻。切片冷冻后，用4%甲醛固化，将载玻片在PBS漂洗2次。将载玻片于37'C 染色12h。用PBS漂洗载玻片3次。显微镜下观察结果，发现pIRES2-EGFP-p53组的瘤体组织重量减轻，肺部肿瘤的病灶数也明显低于其他对照组，肿瘤抑制率约为40%，说明 HA/PEI/DNA新型三元结构基因传输系统能有效抑制肺部肿瘤的生长和转移。
权利要求
1、一种非病毒基因传输系统，其特征在于该系统由透明质酸、阳离子聚合物和质粒DNA组成，含有可质子化的氨基单元的阳离子聚合物与含有的可电离的磷酸根离子的DNA形成二元结构粒子，之后与含有可以电离的羧基的透明质酸形成三元结构复合物，三者通过静电作用结合。
2、 按权利1要求所述的非病毒基因传输系统，其特征在于，所述的透明质酸分子量为 5~3000KDa。
3、 按权利要求1所述的非病毒基因传输系统，其特征在于，所述的质粒DNA是各种含报告 基因、抗癌基因或细胞因子基因的能在真核细胞屮重组表达的质粒DNA。
4、 按权利要求1所述的非病毒基因传输系统，其特征在于，阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、 壳聚糖或聚赖氨酸，聚乙烯亚胺的分子量为1.8~100KDa，壳聚糖的分子量为5~200KDa，聚 赖氨酸的分子量为l~200KDa。
5、 按权利要求l所述的非病毒基因传输系统的制备方法，包括如下步骤将透明质酸、阳离 子聚合物和质粒DNA分别用适当溶媒溶解，配制成所需浓度的溶液，阳离子聚合物与质粒 DNA的按合适的比例混匀，阳离子聚合物和DNA通过静电作用力自组装形成二元结构复合 物溶液，然后按照合适的比例加入透明质酸溶液，混匀后即得三元结构的微粒。
6、 按权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述适当溶媒选自磷酸盐缓冲溶液、氯化钠 溶液、葡萄糖溶液或HBS缓冲液，溶媒pH值5.0-9.0;透明质酸、阳离子聚合物和质粒DNA 的浓度为0.1-10 mg/ral;阳离子聚合物与DNA的N/P比例为0.01~100，透明质酸与阳离子 聚合物的重量比(w/w)为0.05~50;阳离子聚合物与质粒DNA室温下混匀后静置15 60min， 后与透明质酸溶液混匀后静置15 60min。
7、 按权利要求6所述的制备方法，其特征在于，阳离子聚合物与DNA的N/P比例优选为 1~50，透明质酸与阳离子聚合物的重量比(w/w)优选为1~20。
8、 按权利要求l所述的非病毒基因传输系统在转染包括人体以及动物来源的内皮细胞、上皮 细胞以及肿瘤细胞中的用途。
9、 按权利要求1所述的非病毒基因传输系统在制备基因治疗药物中的应用。
10、 按权利要求1所述的非病毒基因传输系统的给药方法，可采用口服、注射或者粘膜途径 给药，进行体内转基因实验。
全文摘要
本发明属于生物技术基因治疗领域，涉及一种由透明质酸修饰的三元结构非病毒基因传输系统及其制备方法和应用；本发明采用生物相容性能优良的透明质酸作为修饰物，增加非病毒基因传输系统的水溶性和降低细胞毒性，同时能依靠肿瘤细胞表面的透明质酸特异性受体介导外源性的治疗基因更加有效地进入肿瘤组织，能够抑制恶性肿瘤生长，使得该新型基因传输系统更加具有肿瘤靶向性和肿瘤治疗的有效性；本发明提供的透明质酸修饰的新型三元结构非病毒基因传输系统的制备工艺简便可行，无需特殊的仪器设备，能直接用于细胞和动物实验，是一种可用于制备多基因的联合转移以治疗肿瘤等疾病的新型基因传输载体。
文档编号A61P35/00GK101417134SQ20081002475
公开日2009年4月29日 申请日期2008年5月13日 优先权日2008年5月13日
发明者韵 卢, 周建平, 静 姚, 伟 王, 星 王, 颖 范 申请人:中国药科大学