专利名称：：一种真空采血管的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种真空采血管。技术背景水蛭素是凝血酶的特异性直接抑制剂，水蛭素最初从欧洲医蛭唾液腺中提纯，现在用重组DNA技术可大量制备。水蛭素是由65、66个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为7，000Da。对其抑制作用的机理已做了大量研究。水蛭素分子包括两个功能区含3个二硫键结构的N端核心区域a-52残基)和无规则的C端尾部(53-65残基)。水蛭素与凝血酶以l:l的方式形成一个非常紧密的非共价的可逆复合物，N端核心区域结合于凝血酶的水解活性位点，而C端尾部则结合于凝血酶对纤维蛋白原的识别位点。两个功能区以一种相互协调的方式与凝血酶结合。同时，水蛭素中的Pro46、Lys47、Pro48三肽结构，起着促进N端与活性位点结合等重要作用。水蛭素对凝血酶具有高度亲和性抑制作用，它是迄今为止世界上最强的凝血酶特异抑制剂。真空采血管技术是目前国际先进的采血技术。真空采血管技术特点是(1)自动计量，无须回抽由于采血管内人为造成真空，可通过控制气压来控制采血量。无须在操作时人工回抽计量。(2)无菌程度高，检验干扰小为保持管内真空，真空采血管管口盖密闭性较好，无菌程度高，血液污染几率小,对检验结果的干扰相对较小。(3)—次注血入管，血液成分改变小真空采血法直接将血液注入采血管，省略了血液在注射器针筒中的停留以及从针筒转移至采血管两个过程,减少了血液的反复挤压，血细胞破坏少，检验结果更可靠。为了保护体外检验用血液和血桨，向血液收集管加入抗凝剂和保护剂几乎是不可避免的事，但是它们的加入造成对血液样品的影响，可能干扰对某些检验项目的分析。因此某种抗凝剂更适合检测一些特定的项目，而其它抗凝剂则是禁忌的；用作抗凝剂的枸橼酸或乙二胺四乙酸(EDTA)，其抗凝作用是由于结合血液中Ca2+和其它两价阳离子，从而改变了血细胞的生理条件。肝素的抗凝也是间接作用，它需通过抗凝血因子III(ATin)而起作用。由于这种原因目前市场上出售的血液收集管不下十多种，如无添加剂血清管、促凝剂血清管、分离胶促凝血清管、肝素钠抗凝管、肝素锂抗凝管、EDTA-K2抗凝管、EDTA-Na2抗凝管、枸橼酸抗凝管及草酸盐抗凝管等。为了寻找一种理想的通用抗凝剂，人们已经付出了数十年的时间，不幸直到目前为止，在世界的市场上，仍然没有一种对实验室检验的通用真空采血管商品出售。
发明内容本发明的目的是提供一种真空采血管。本发明提供的真空采血管，包括真空管，该真空管中还含有水蛭素。其中，所述水蛭素可以是冻干粉末或喷雾干燥或喷雾冻干或水溶液剂型；所述水蛭素还可以为聚乙二醇修饰形式或脂质体包封形式。所述水蛭素预置于真空采血管中，含量为100-2000ATU/ml血量。本发明中所述水蛭素的氨基酸序列可如序列表中序列1所示。所述水蛭素由多形汉逊酵母(学名尸J'c/^'aay7^/Wa，曾用名ifey^e7whpo7y历orp力a)205-17产生。所述205-17已于2008年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCNo.2424。其中，所述水蛭素可涂覆在所述真空管内壁上，形成抗凝涂层。本发明的真空采血管内壁的抗凝涂层，能使离体血液的原始状态保持时间较长，延长血样的存放时间而不改变血样的成份，保证离体血液长时间放置也不会影响检验结果，使得检验结果更近真值，延长了保质期。所述真空采血管可在临床生物化学、临床免疫学、临床血流变学、免疫原型分析、RT-PCR检测、或除综合凝血参数(活化部分凝血活酶时间APTT、凝血酶原时间PT等不能测定外，单一凝血因子如纤维蛋白原、ATIII仍可测定)外的临床血液学检验中的应用。目前实验室检验中，由于血样采集管分类明细，临床血液学、临床生化学、免疫学和血流变学检验均分别独立进行，工作量大、标本多。而本发明的真空采血管适用于临床生物化学、临床免疫学、临床血流变学、免疫原型分析、RT-PCR检测及除综合凝血参数外的临床血液学检验，实现了实验室检验的通用，减少了检验人员的劳动强度和时间，同时减少了大量血样管收集、分类和处理中产生的医源性错误，有利于提高自动化分析仪器的工作效率，加快了标本的检验周期；并且，使用本发明的真空采血管大大减少了对体检人员和患者的采血量。图1为真空采血管的纵向剖面2为pMPT-hirudin质粒的构建示意图具体实施方式实施例1、真空采血管的制备l.水蛭素的制备a)水蛭素基因的合成利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列，序列两端带有限制性内切酶fcoyI和万朋WI的识别位点，序列2所示的DNA自5'末端第262位-459位编码序列表中序列1的蛋白。用fcMI和酶切合成的DNA序列，电泳回收酶切后的片段，-2(TC保存备用。b)载体pMPT-02的构建以多形汉逊酵母CGMCC2.2497基因组DNA为模板，克隆1.5kb的甲醇氧化酶基因(M0X)启动子、350bp的甲醇氧化酶基因(MOX)终止子、l.Okb的自主复制序列HARS;并从YIp5(GenBankAcessionNo.L09157)质粒中克隆出1.lkb的酿酒酵母脲嘧啶基因ScURA3;将上述4部分连接后，插入pBluescripII质粒的多克隆位点，构建成穿梭载体pMPT-02。c)载体pMPT-hirudin的构建用v5bo/I和5朋WI酶切载体pMPT-02，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的大片段，T4-DNA连接酶的作用下，与同样双酶切的合成的DNA序列连接，得到载体pMPT-hirudin,见图2。d)重组菌的获得用fec/酶切载体pMPT-hirudin，使载体线性化。线性化的载体通过电转化法(天津理工大学生产的LN-101型基因脉冲导入仪，1.5kV，50ixF，200Q，3-5raSec)转化多形汉逊酵母(jfe/^e/2w7apo^/zorpA3)CGMCCN0.1218。在含有13.4g/1000mlYNB(酵母氮源基础培养基)，20g/1000ml葡萄糖的培养基平板上筛选转化子。e)实时荧光定量PCR检测外源基因整合的拷贝数水蛭素基因通过质粒载体转化到受体菌并稳定整合后才能高效表达，其拷贝数一定程度上反映工程菌株能否高效表达目的蛋白。实时荧光定量PCR检测外源基因整合的拷贝数用来筛选水蛭素高表达的候选菌株。采用相对定量法，即同时对同一样品细胞中的外源基因(Hirudin基因)和已知单拷贝M0X基因进行扩增，通过两者比较而确定单个细胞内外源基因的拷贝数。实时荧光定量PCR检测引物序列如下，由大连宝生物工程有限公司合成。水蛭素基因正向引物5'-TCATCAACACCACTATTGCCTC-3';水蛭素基因反向引物5'-GGGATTTCCTCAAAGTCGC-3'。M0X基因正向引物:5'-GCCACCTTCTACTCGTCCAG-3';MOX基因反向引物5'-ACTCCCAGTCGTCGTAGTCG-'3。用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取多形汉逊酵母(^朋se/whpWy历arp/a)重组水蛭素转化子基因组DNA。取某一基因组DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释4次，此稀释要求精确。其他的基因组DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释2次。以上述稀释后的基因组DNA溶液为模板。实时定量PCR反应体系总体积20ixL，其中正反向引物(1Ommol/L)各O.5yL，EXPremixTaq(4mmol/LMg2+、0,4ramol/LdNTP、0.5UExTaq)10yL，SYBR0.5uL模板匕。实时定量PCR检测使用澳大利亚CorbettResearch公司的荧光定量PCR仪(型号Rotor-Gene3000)。实时定量PCR反应热循环参数预变性94°C5min，变性94°C15secs，退火及延伸60'C50secs，35个循环。其中，所扩增Hirudin基因片段长度为241bp，扩增的MOX基因片段长度为145bp，扩增时两种片段都采用SYBRGreenI作为荧光指示剂，荧光强度变化由Rotor—Gene检测系统在每个循环延伸阶段末期进行检测，扩增反应结束后作溶解曲线，从6(TC缓慢升温到94°C，每5秒升温一次，每次升温0.5r，每升高一次进行信号采集。利用Rotor—Gene5.0.28(CorbettResearch)软件分析样品拷贝数。将外源基因整合拷贝数高达198个的重组多形汉逊酵母命名为多形汉逊酵母205-17。所述205-17已于2008年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCN。.2424。f)高密度发酵生产重组水蛭素用多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424高密度发酵生产重组水蛭素。①培养基的配制种子培养基20g/1000ml葡萄糖、13.4g/1000ralYNB;—级种子培养基200mL，二级种子培养基1600mL，高压灭菌。发酵培养基发酵起始体积12L;NH4H2P04192g、MgS04*7H2036g、苯二甲酸氢钾128g、NaC14g、甘油384g，另加10niL消泡剂，罐内110-115。C高压灭菌30分钟。补料/去阻遏溶液共计5L;NH4H2P0480g、MgS04*7H2015g、苯二甲酸氢钾53g、NaCl1.7g，以上原料溶于1.25L水中，高压灭菌；另取3.75L甘油，高压灭菌。②发酵过程种子培养分两级扩大培养，-72°(3保存的多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424菌种一支(lmL、OD600n"100)接入200mL—级种子培养基，31。C培养20小时转接1600mL二级种子培养基扩大培养，3rC培养18小时细胞0D6。。皿达到10以上，作为发酵种子。发酵工艺用日本丸菱理化装置研究所生产的30L发酵罐(型号MSJ-J2)进行发酵工艺，用上海佳田制造有限公司的全自动电热蒸汽发生器(型号DZF26)产生的蒸汽对发酵罐进行灭菌，华东理工大学生物工程学院的FC-280型溶解氧监控仪进行溶氧的监测和控制。多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424原代种子经两级种子扩大培养后，将1800raL二级种子接入装有12L发酵培养基灭菌的发酵罐中开始发酵。多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424的发酵工艺主要包含两个时相，即生长时相和去阻遏时相。生长时相I发酵罐pH值控制设定在5.4-5.5;发酵温度控制30。C;罐压0.5Kg/cm2。II生长时相中，发酵罐内溶氧会缓慢下降，当下降至60%左右时(发酵约16小时)，连接好补料管路，用蠕动泵匀速打入约385mL补料溶液。111当发酵罐溶氧水平降至40%以下时，将空气流量调至15L/min，搅拌转速调至700rpm。IV生长时相后期(发酵约22小时左右)，若细胞生长状态良好，发酵罐溶氧水平可下降至20%以下；细胞ODe。，达到80以上。去阻遏时相I溶氧回升前将蠕动泵电源插头与溶解氧监控仪信号输出电源连接；监控仪溶氧控制40%，死区为2%，高端打开；蠕动泵电源开关关闭。11当观察到发酵罐溶氧由最低点回升到60%以上时，进入去阻遏时相；此时打开蠕动泵电源开关，设定泵速22rpm，开始流加去阻遏溶液。in发酵罐pH值控制设定在3.9-4.0;细胞代谢产物偏酸性，pH可自然下降至控制点，只检测发酵液pH值，不控制，pH值自然下降至3.9时开始控制pH值，设定3.9-4.0。IV去阻遏后期，若细胞生长良好，OD,可达到350以上，发酵时间大约96小时。上述发酵实验重复三次。g)重组水蛭素的纯化及定量用阳离子交换层析和反相层析纯化重组水蛭素，高效液相色谱分析水蛭素纯度及阳离子交换层析前微滤收获发酵液上清，用德国Sartorius公司的切向流微滤/超滤系统(型号Sartocon2Plus)，配以0.22um规格的膜包。取10L发酵液，微滤过程中进口压力保持在lbar，回流压力为0.5bar，滤过压力为0.2bar，通过微滤回收滤过端溶液4L。向切向流微滤/超滤系统中添加4L缓冲液(20mM，pH3.0的拧檬酸缓冲液)混匀，继续微滤回收滤过端溶液4L。再次向切向流微滤/超滤系统中添加4L同样柠檬酸缓冲液，混匀，微滤回收滤过端溶液4L。将三次回收的过滤端溶液合并共12L。阳离子交换层析采用如下方法应用SP-550Cmatrix(TosoHaas)阳离子-交换层析树脂填充层析柱(100mmIDxl40mm)，在美国COMetro公司的层析系统(型号6000SeriesFPLCSystem)上经层析柱初级分离重组水蛭素。微滤收获12L样品与上样缓冲液(20mM，pH3.0的柠檬酸缓冲液)混合约18L至电导小于5mS/cm，用1^04调节pH至3.0作为离子交换层析的上样液。层析柱使用前用0.5MNaOH清洁消毒。在室温下用5倍柱体积上样缓冲液平衡层析柱，280nm波长监测，上样液以150mL/min上柱，用2倍柱体积上样缓冲液流洗，用3倍柱体积洗脱液I(20niM，pH3.0的柠檬酸缓冲液和0.1MNaCl)洗脱层析柱，再用2倍柱体积洗脱液n(20mM,pH3.0的柠檬酸缓冲液和l.OMNaCl)洗脱层析柱，收集洗脱峰组分，用高效液相色谱检测各组分中水蛭素含量纯度。反相层析纯化采用如下方法用GC300sdmatrix(TosoHaas)层析树脂填充层析柱(49腿IDx490醒)，在美国LabAlliance公司的液相系统(Model500检测器，SeriesIII泵配40raL泵头)上经反向层析柱分离重组水蛭素。上一步阳离子交换层析洗脱液I洗脱收集组分作为反向层析的上样液。在室温下，流速25mL/min，依次用1个柱体积BufferA(0.1%三氯乙酸)、l个柱体积BufferB(0.1%三氯乙酸+40%异丙醇)和2个柱体积BufferA平衡层析柱，280nm波长监测。上样液以流速20raL/min上柱，以流速25mL/min用300min从100%BufferA到100%BufferB线性梯度洗脱层析柱，分部收集组分，用RP-HPLC检测各组分中水蛭素含量纯度，收集纯度大于95%的组分合并，冷冻干燥前4"C保存。高效液相色谱分析具体方法如下检测设备LabAlliance(Model500检测器，SeriesIII泵配lOmL泵头)；分析软件ANASTARC服OMATOGRAraY;分析柱C18柱4.6*250跳5u，IOOA;流动相A液:5ml/100ml乙腈、高氯酸钠3.5g/100ml、0.lg/100ral三氟乙酸；B液:80ml/100ml乙腈、0.lg/100ml三氟乙酸。线性梯度时间流速AB01901016145551811090201109022190102519010流速lml/min;检测波长214nm。纯化得到的样品用德国MarinChrist公司的真空离心浓縮仪(型号RVC2-18)脱去异丙醇，用同一家公司的冷冻干燥机(型号ALPHA1-2LD)隔夜冷冻干燥后-2(TC保存。三批发酵、纯化得到纯度为95%以上的重组水蛭素总量分别为10.2g、9.8g和9.5g。2.水蛭素的抗凝比活性测定采用生色底物的比色法，测定水蛭素的抗凝比活性。生色底物的比色法的原理是利用凝血酶水解生色底物ChromozymTH中酰胺键产生生色效应，而水蛭素以l:l关系抑制凝血酶，通过比色法测定不同稀释度水蛭素的回归直线方程，可以精确测定出水蛭素的单位抗凝活性(ATU/ml)，ATU为能够完全中和1NIH单位凝血酶的水蛭素的量。实验重复3次。抗凝比活性(ATU/mg)二单位抗凝活性(ATU/ml)/单位蛋白(mg/ml)。具体方法如下溶液的配制①工作液缓冲液Tris50raM，NaCl227mM，BSA0.1%(质量百分含量)，跳0.1%(质量百分含量)，2MHC1调pH至8.3;②生色试剂ChromozymTH(Roche)，用工作液缓冲液配制成2mM;③凝血酶溶液，凝血酶(Sigma，NIHunits)溶于工作液缓冲液中，凝血酶终浓度为11.65IU/raL;④醋酸终止液，50%醋酸；⑤不同浓度的水蛭素样品溶液，以水为溶剂配制不同浓度的水蛭素样品溶液。测定步骤如下①7个1.5mL离心管，每管分别加入50叱不同浓度水蛭素样品溶液；②每管加入50化凝血酶溶液，37。C保温5分钟；③每管加入50叱生色试剂ChromozymTH，37。C反应2分钟；④每管加入50叱醋酸终止液；⑤每管补加600叱蒸馏水后，立即在405nm处测0D值。以水蛭素含量为横坐标，0D值为纵坐标，做线性回归，与横坐标交点处表明水蛭素在此含量下能全部抑制凝血酶的活力，假设这点横坐标截距为X，贝IJ:水蛭素抗凝比活性(ATU/mg)=(11.65X50/1000)/(X/10—6)第1次测定的回归方程为Y二-0.0127X+0.4027R2=0.9983抗凝比活性活性=(11.65X50/1000)/(31.7087/10一6)=18370.3ATU/mg第2次测定的回归方程为Y=-0.0158X+0.4672R2=0.9961抗凝比活性活性=(11.65X50/1000)/(29.5696/10—6)=19699.3ATU/mg第3次测定的回归方程为Y=-0.0161x+0.476R2=0.9973抗凝比活性活性=(11.65X50/1000)/(29.5652/10—6)=19702.2ATU/mg生色底物的比色法测定重组水蛭素的抗凝比活性的平均值为19257.3ATU/mg，达到现有的水蛭素的抗凝比活性最高水平。3、通用真空采血管的制备通用真空采血管的制备按中华人民共和国卫行业标准WS/T224-2002"真空采血管及其添加剂"进行。使用单头喷雾机(浏阳市集里宏远吸塑包装机械厂)将上述获得的重组水蛭素喷涂于塑料管(PET管)(湖南安信医用高分子材料有限公司)2内壁，喷雾量为0.02m1/次，每管喷涂2次，盖上丁基胶塞4和塑料帽盖3，然后抽真空，在管的外壁贴上带刻度标注的标签a、b、c和d制成含有本发明重组水蛭素的真空采血管，将其命名为通用真空采血管。其中，水蛭素的喷涂量为100-2000ATU/ml血量。实施例2、通用真空采血管抗凝活性的稳定性试验。将制备的通用真空采血管分别储存于4T:和室温条件下，于不同时间测定其抗凝活性。通用真空采血管抗凝活性测定方法与测定水蛭素的抗凝比活性方法基本相同，仅将回归直线方程的横座标由水蛭素质量改变为稀释液体积的倒数。通用真空采血管抗凝活性的稳定性试验的三次测定结果见表l。表l、重组水蛭素通用真空采血管抗凝活性单位的测定储存时间储存条件直线方程回归系数抗凝活性(ATU/管)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述通用真空采血管每管采血量为5ml或4ral。在真空采血管内喷涂冻干重组水蛭素的六次测定的平均抗凝活性单位为4282.5±9.33%ATU/管。结果表明储存90天后抗凝活性保持稳定不变；特别是在室温条件储存也能保持稳定不变，为临床使用带来了更大的方便。根据西林瓶冻干重组水蛭素稳定性试验可保持五年以上的经验，通用真空采血管抗凝活性室温储存的稳定性应不低于2年。通用真空采血管比起采用重组水蛭素溶液在检验时现配现加的方法有了明显的改进。实施例3、本发明的通用真空采血管的抗凝时间采血管预置重组水蛭素的活性单位分别为100、200、400、800和1600ATU/ml血量；对三名健康受试者分别命名为1#、2#和3#，每人采血5管，每管各2ml，应用日本光电CelltacMEK-6318型全自动血液分析仪(白细胞5分类)，进行血细胞自动检测。预置重组水蛭素的不同活性单位与采血管的抗凝时间之间存明显的量效关系，即重组水蛭素的活性单位越高，采血管的抗凝时间越长。其结果见表2:表2、重组水蛭素的活性单位与采血管的抗凝时间的关系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注"+"号表示采血管已出现微小凝块，不能适用于自动血细胞检测；"-"号表示采血管水蛭素抗凝血浆适用于自动血细胞检测。结果表明本发明的通用真空采血管可使采集到真空管中的血液在较长时间内保持非凝固状态，最长可以达到48小时不凝固。实施例4、通用真空采血管适用于多种体外血液和血浆检验1.通用真空采血管与K2-EDTA抗凝管中的血液样本的血细胞分析指标相关性使用水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD(美国)公司生产的K2-EDTA抗凝真空采血管随机采取体检者和住院患者的血液标本50份，进行21项血细胞分析检验。血细胞分析检验采用如下方法血细胞分析用日本光电CelltacMEK-6318型全自动血液分析仪(白细胞5分类)及其全部配套试剂。利用SPSS12.0软件对数据进行正态分布检验后，采用双变量相关性分析法(Spearman相关分析法)判断水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的K2-EDTA抗凝真空采血管采取的血液标本的各指标对比结果的相关性。结果如表3所示表3.两种真空采血管中的血液样本的各项血细胞分析指标的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>红细胞分布宽度(RDW)500.949氺氺0.963水氺血小板计数(PLT)500.984**0.973林平均血小板容积(MPV)500.943林0.958承承血小板分布宽度(PDW)500.878**0.933林*代表0.01<p《0.05林代表p《0.01水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的K2-EDTA抗凝真空釆血管采取的血液标本的21项血细胞分析指标对应结果均成正相关；说明水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管适用于血细胞分析。在血细胞分析中嗜酸性和嗜碱性粒细胞的r值和ICS值略低，这与血细胞分析仪非染色镜检而形成的局限性有关，但结果仍是可接受的。2.通用真空采血管与普通真空采血管或促凝管中血液标本的血液生化分析指标的相关性使用水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管或促凝管随机采取体检者和住院患者的血液标本50份，进行24项血液生化分析检验。血液生化分析检验采用如下方法血液生化指标检验用日本东芝公司TBAFR-120型全自动生化分析仪，电解质分析用上海迅达公司DSI903B型电解质分析仪及配套试剂；利用SPSS12.0软件对数据进行正态分布检验后，采用双变量相关性分析法(Spearman相关分析法)判断水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管或促凝管采取的血液标本的各指标对比结果的相关性。结果如表4所示。表4.两种真空采血管中的血液'样本的各项血3菱生化指标的相关性检测项目检测样本数r(Spearman)ICR谷氨酰转移酶(GGT)500.942**0.921氺氺谷丙转氨酶(ALT)500.969氺承0.998**碱性磷酸酶(ALP)500.929氺氺0.997氺承谷草转氨酶(AST)500.960承氺0.997水氺总蛋白(TP)500.829**0.872**白蛋白(ALB)500.975**0.969**球蛋白(GLO)500.934林0.947**总胆红素(TB)500.870**0.953**<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的普通真空采血或促凝管采取的血液标本的24项血液生化分析指标的对应结果均成正相关，水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管适用于生化学检验；水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管中血液标本测定的总蛋白量较高，是由于纤维蛋白原在血浆中存在的原故。3.通用真空采血管与肝素抗凝管中的血液标本的血流变分析指标的相关性水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的肝素抗凝真空采血管随机采取体检者和住院患者的血液标本50份，进行16项血流变学分析检验。血流变学分析检验方法如下血流变学分析用赛科希德公司SA-6000型全自动血流变仪，纤维蛋白原测定用Stago公司的Compact自动血凝仪。利用SPSS12.0软件对数据进行正态分布检验后，采用双变量相关性分析法(Spearman相关分析法)判断水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的肝素抗凝真空采血管采取的血液标本的各指标对应结果的相关性。结果如表5所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的肝素抗凝真空采血管采取的血液标本的16项血流变分析指标的对应结果均成正相关，水蛭素的喷涂量为800ATU/ral血量的通用真空采血管适用于血流变学检验。国内血流变学检验应用较多，水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管特别适用于血流变学与上述各检验项目共用，如同时检验可明显减少所用的采血管。4.通用真空采血管与普通真空采血管中的血液样本的ELISA试验和发光免疫学检验分析指标的相关性水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管随机采取体检者和住院患者的血液样本50份，进行ELISA试验和发光免疫学检验。ELISA试验和发光免疫学检验采用如下方法ELISA检验用Biorad-680型自动酶免疫分析仪，试剂为上海实业科华生物技术有限公司提供的乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒和厦门新创公司提供的抗-丙型肝炎ELISA试剂盒。发光免疫学检验用Abbott公司的Axsym全自动免疫发光仪。利用SPSS12.0软件对数据进行正态分布检验后，采用双变量相关性分析法(Spearman相关分析法)判断水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空釆血管与BD公司生产的普通真空采血管采取的血液标本的各指标对应结果的相关性。结果如表6和表7所示。表6.两种真空采血管中的血液样本的各项免疫指标的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7.两种采血管中血液样本的ELISA试验对照结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司的普通真空采血管采取的血液样本的各项免疫指标对应结果均成正相关；两种采血管中血液样本的ELISA试验的结果完全一致。水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管适用于免疫学检验。5.通用真空采血管与普通真空采血管中的血液样本的荧光定量PCR试验的相关性使用水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管与BD公司生产的普通真空采血管随机采取体检者和住院患者的血液样本50份，荧光定量PCR检测血样中乙型肝炎病毒DNA拷贝数。荧光定量PCR检测用Roche公司Lightcycler荧光定量PCR仪。结果如表8所示表8.两种采血管中血液样本的荧光定量PCR检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空釆血管与BD公司的普通真空采血管中血液样本的荧光定量PCR检测结果一致，水蛭素的喷涂量为800ATU/ml血量的通用真空采血管适用于荧光定量PCR检验。序列表〈110〉一种真空采血管〈120〉天津超然生物技术有限公司汪和睦〈130〉CGGNARW81214〈160〉2<210〉1〈211>65〈212>PRT〈400>1ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGQGNKCILGSDGEKNQCVTGEGTPKPQSHNDGDFEEIP60EEYLQ65〈210>2<211〉474〈212>腿〈213〉人工合成〈220〉〈223〉<400〉2gaattcatgagccgctccagatcggttEictactaat肪cgggcgtcagcctgtctctgcgggcgagaagaggcgactttggattcccttcgatctttaccgccgtgctgttcgcagcatcttccgccctgtcaataccEicgacagaggacgagaccgctcagatccccgctgaggccgtcctgatcttgagggagacttcgacgtggctgttttgccattttccaactcggacttctgttcatcaacaccactattgcctcgattgccgcgaaagaagagtcgagaaaagaatcacttacaccgactgcaccgagtctggtcaaaaccttagggttccaacgtttgcggtcaaggcaacaagtgcatcctgggcagcgataccagtgcgttaccggcgaaggaacgccaaagccccagtcccacaacgacaggaaMccctgaagagtacctgcagtaatgaagatctggatcc6012018024030036042047权利要求1、一种真空采血管，包含真空管，其特征在于所述真空管内预置有水蛭素作为通用抗凝剂。2、根据权利要求l所述的通用真空采血管，其特征在于所述水蛭素是冻干粉末或喷雾干燥或喷雾冻干得到的粉末或水溶液剂型。3、根据权利要求1所述的通用真空采血管，其特征在于所述水蛭素为聚乙二醇修饰形式或脂质体包封形式。4、根据权利要求1或2或3所述的通用真空采血管，其特征在于所述水蛭素含量为100-2000ATU/ml血量。5、根据权利要求1至4中任一所述的通用真空采血管，其特征在于所述水蛭素的氨基酸序列如序列表中序列1所示。6、根据权利要求5所述的通用真空采血管，其特征在于所述水蛭素由多形汉逊酵母205-17CGMCCNo.2424产生。7、根据权利要求1至6中任一所述的通用真空采血管，其特征在于所述水蛭素涂覆在所述真空管内壁上，形成抗凝涂层。8、权利要求1至7中任一所述通用真空采血管在临床生物化学、临床免疫学、临床血流变学、免疫原型分析、RT-PCR检测、或除综合凝血参数外的临床血液学检验中的应用。全文摘要本发明公开了一种真空采血管。该真空采血管包含一真空管，所述的真空管内还含有水蛭素作为通用抗凝剂。该水蛭素可是冻干粉末或喷雾干燥或水溶液剂型；该水蛭素还可为聚乙二醇修饰形式或脂质体包封形式。真空管中水蛭素含量为100-2000ATU/ml血量。该水蛭素的氨基酸序列具体可如序列表中序列1所示。本发明的通用真空采血管可在临床生物化学、临床免疫学、临床血流变学、免疫原型分析、RT-PCR检测及除综合凝血参数外的临床血液学检验等中的应用，实现了实验室检验的通用。文档编号A61B5/154GK101248998SQ20081010315公开日2008年8月27日申请日期2008年3月31日优先权日2008年3月31日发明者孙长海,珺杨,汪和睦,王昌华,赵忠信申请人:天津超然生物技术有限公司;汪和睦