专利名称：无支架工程软骨组织的构建方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种工程组织的构建方法，尤其涉及无支架工程软骨组织的构建方 法及其产品，属于再生医学及组织工程领域。
背景技术：
软骨损伤修复一直是关节外科研究的热点。国外自体软骨细胞移植(autologous chondrocyte implantation, ACI)已经取得较好的临床疗效，但须二次手术，增加患者 的痛苦。目前，用于构建工程软骨组织的种子细胞可来源于骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs )，但随着年龄增长干细胞数量和增殖能力显著下降。 自体脂肪干细胞用于关节软骨组织工程的构建也有报道，但这些均存在需要患者进 行二次手术的问题。胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)由于免疫表型发育不 完全，可用于异体移植，但面临伦理、法律方面的问题，也有移植后形成畸胎瘤的 报道，应用受到限制。因此，寻找新的干细胞来源已越来越受到各国学者的关注。 近来有学者从分娩后的废弃材料脐带或胎盘中分离培养间充质干细胞
(mesenchymal stem cells, MSCs ),并进行形态学、分化功能和表面标志物等生物学 表型鉴定，为干细胞多向分化及MSCs在临床的应用提供了新的种子细胞来源和实 验基础。
胎盘与脐带属于胚胎外组织，存在大量多向分化的干细胞。采用胶原酶消化法 可快速获得大量成纤维细胞样形态的干细胞。在揭:作过程中，小心分离脐带血管组 织和脐带外膜组织，即可获得脐带Wharton胶；由于脐带仅含有3根血管，不含有 毛细血管，可获得纯度较高的间质干细胞。脐带Wharton胶间质干细胞原代培养时 间约为3 ~ 5天，而BMSCs原代培养时间约8 ~ 10天；脐带Wharton胶间质干细胞 培养过程中CFU-F频率约为3:104,而BMSCs CFU-F频率仅为1:104 ~ 105。流式细 胞仪检测脐带Wharton胶干细胞阳性表达CD44、 CD105、 CD271,此为间充质干细 胞的表面标志；而不含表达CD34、 CD45造血干细胞标志，这表明从脐带间质 Wharton胶分离的干细胞均属MSCs,而不含造血干细胞，因此，从脐带Wharton胶分离MSCs的纯度高于BMSCs，方法更简便。
通过对人脐带Wharton胶中的MSCs进行组织化学和免疫组织化学染色，发现 Wharton胶MSCs与软骨细胞具相似的细胞外基质成分。文献报道脐带为富含胶 原和GAGs的组织，其中胶原占干重的50%,透明质酸占GAGs的70%;软骨组织 也富含胶原和GAG,胶原占干重的50%,其中II型胶原占总胶原的90% ~ 95% 。 本发明人在以往的实验发现，脐带MSC甲苯胺蓝染色、番红"O，，染色和II型胶原免 疫组织化学染色呈弱阳性；软骨诱导培养基诱导培养后，曱苯胺蓝染色发现细胞外 基质富含软骨糖蛋白、番红"O"染色发现细胞内外富含增多的氨基多糖、免疫组织 化学染色发现细胞外基质II型胶原增多。对脐带MSC进行RT-PCR分析发现，脐带 MSC天然表达Sox-9和Col-2Al。 Sox-9基因位于人17号染色体长臂上，在胚胎性 别决定、调控软骨分化发育起重要作用。Sox-9结合软骨细胞特征分子II型胶原， aggrecan蛋白增强子元件，激活表达，从而调控软骨分化。脐带MSC天然阳性表达 Sox-9和Col-2Al,从分子水平揭示了脐带MSC具有前软骨细胞的特性；脐带MSC 经软骨诱导培养后，II型胶原免疫组织化学染色呈强阳性，更接近于软骨细胞，以 上均表明人Wharton胶分离出的干细胞具有自然向软骨分化的特点。这也是它与成 人骨髓干细胞、脂肪干细胞不同之处。
综上所述，脐带Wharton胶干细胞从形态学、增殖特性、细胞表面分子标志和 免疫表型等方面均证实了具有MSCs的特点,并证实了具有前软骨细胞的特性，在一 定条件下可较好转化为软骨细胞。此外，脐带的巨大优势还在于取材几乎不受限 制；无伦理学限制；如能进一步表明其免疫抑制特征或降低去除其抗原性，则可用 于异体移植，在同种异体关节软骨修复方面将有着广阔应用前景。
关节软骨损伤的修复是一临床难题，种子细胞是关节软骨损伤修复的面临的主 要问题。目前国内外组建软骨组织工程的种子细胞均来源于自体，且体外构建的方 式多为细胞复合细胞支架。细胞与上述支架材料的复合较为繁瑣，细胞接种密度不 均，且存在细胞与支架生物相容性、支架体内降解产物对人体安全性、支架临床应 用审批复杂等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种无支架的软骨组 织的构建方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种无支架工程软骨组织的构建方法，包括
(1) 将人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs )诱导分化为软骨
细胞；
(2) 将软骨细胞接着进行聚集诱导培养，使软骨细胞向细胞外分泌基质并结 成膜状物，将膜状物(该膜状物由细胞外基质及软骨细胞组成)从培养瓶壁剥离后 在细胞培养箱内继续诱导培养，之后将培养物转移转移至离心管离心，在离心力的 作用下使细胞进一步聚集，形成疏松的软骨细胞团块；
(3) 将疏松的软骨组织团块在旋转细胞培养系统内进行旋转诱导培养，得到 致密的类软骨组织。
步骤(1)中所述的诱导分化方式可采用单层诱导培养方式，可参考有关文献 所公开的方式进行诱导分化(例如Wang HS， Hung SC， Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(7):1330);更优选的，步骤(1 )中所述的诱导分化按照以下培养体系和培养条件 进行诱导培养液为DMEM(20。/。FBS)加入10ng/mlhTGF-|31, 10ng/mlhFGF,体 积分数为1%ITS和l.Oxl(T8 mol/L地塞米松；培养条件培养温度为37°C 、在5%C02 的培养箱内进行培养，每3天换液一次。
步骤(2)中所述的聚集诱导培养的诱导培养液和培养条件同步骤(1)所述的 诱导培养液和培养条件，也可按照文献所公开的聚集诱导培养的条件所进行(B. Johnstone, T.M. Hering， A.I. Caplan， V.M. Goldberg, J.U. Yoo, In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells, Exp. Cell Res. 238 (1998) 265-272 )。
所述的离心管优选是15毫升的尖底离心管；所述离心优选在以下条件进行离 心离心转速为1000rpm-2000rpm,离心时间为10分钟。
步骤(3)中将疏松的软骨组织团块在旋转细胞培养系统内诱导培养时，所述 的诱导培养液同步骤(1 ),即DMEM力卩20%FBS,再加入10ng/ml hTGF陽卩l、 10ng/ml hFGF、体积分数为1%的ITS和1.Ox l(T8 mol/L地塞米松；培养条件如下培养温度 为37。C;旋转细胞培养系统的转速分步进行调整，即(1 )将旋转的起始速度控制 为12转/分钟，旋转培养30分钟后，休息30分钟，再重复上述操作2次之后将旋 转速度改为16转/分钟，每持续旋转三天换诱导培养液一次， 一般持续培养10-20 天，优选为15天(本领域技术人员可视细胞的多少及所需形成的组织大小而适当 改变或设定培养时间)。本发明首先将人脐带间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，将软骨细胞进行聚集 诱导培养，得到大量的由细胞外基质及软骨细胞组成的膜状物，将膜状物剥离后放 入在离心管内，在离心机的离心力的作用下，膜状物堆积，取出堆积膜状物，在细 胞培养箱内继续诱导培养一周，随着培养时间的延长，继续分泌的细胞外基质将膜
状物进行整合，形成疏松的软骨组织团块；最后将软骨组织团块转移至旋转细胞培 养系统内进行诱导培养，在旋转细胞培养系统的作用下，疏松的软骨组织团块在力 学的刺激下，细胞继续增殖，并分泌基质，形成更大的组织团块，组织变得致密、 光滑而具有光泽，使得诱导后的组织接近软骨组织。
本发明由人脐带MSCs经过密集诱导培养后结成的细胞膜结构，结合生物反应 器技术体外诱导培养，诱导后细胞分泌的细胞外基质(ECM)具有类似软骨细胞外 基质的成分，是良好的软骨细胞天然的支架，构建得到无支架的工程软骨组织。经 细胞学、组织学、免疫组织化学染色显示，本发明所构建的工程组织具有正常软骨 细胞特点。
本发明在整个培养过程中(细胞—细胞聚集成膜状—疏松组织块—致密组织块 —类软骨样组织)不涉及细胞与外源性支架的复合问题，细胞种植密度均匀，不存 在细胞与支架生物相容性的问题，对人体安全，操作简单，临床可应用于关节软骨 缺损的治疗或修复。
图1 间充质干细胞的表型。
图2 本发明所构建的无支架软骨组织的外观。
图3 本发明所构建的无支架软骨组织的HE染色结果。
图4 本发明所构建的无支架软骨组织的番红花"O"染色结果。
图5 本发明所构建的无支架软骨组织的曱苯胺蓝染色结果。
图6 本发明所构建的无支架软骨组织的n型胶原免疫组织化学染色结果。
图7 本发明所构建的无支架软骨组织的RT-PCR检测结果((Sox-9及Col-2Al 为阳性)；1: Marker; 2、 7: (3-actin ; 3、 5: Sox-9; 4、 6: Col-2Al。 2、 3、 4为 诱导前的结果，5、 6、 7为诱导后的结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一、 材料与试剂
PE-CD44、 PE-HLA陽ABC、 FITC墨HLA-DPDQDR、 FITC-CD34、 FITC-CD45及 FITC-IgGl和PE-IgGl抗体(BD公司，USA )， PE-CD105抗体(Sant Crus公司，USA), PE-CD271抗体(Miltenyi Biotec GmbH， Germany); DMEM培养基(dulbecco，s modified Eagle's medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)、胰岛素-转 铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium， ITS)、胰酶、地塞米松、II型胶原单克隆抗 体(Sigma公司，USA);青霉素、链霉素(华北制药有限公司)；人转化生长因子卩l (human transforming growth factor|3-l, hTGF-pi， PeproTechEC公司，USA)、人成 纤维细胞生长因子(human fibroblast growth factor, hFGF, Pepro Tech EC公司， USA)。 Trizol Reagent (Invitrogen公司，USA)， RT陽PCR试剂(QIAGEN公司， Germany),琼脂糖(Promega公司，USA )。
二、 实验设备
C02培养箱(Hereus B5060型，Germany);倒置相差光学显微镜及成像系统 (OLYMPUS, 1X70， Japan )及光学显微镜及成像系统(OLYMPUS, BX51， Japan); 流式细胞仪(BD公司，USA);凝胶分析系统(北京赛智创业有限公司，Champgel 2000型)；旋转细胞培养系统(SYNTHECON公司，USA)。
三、 D-hank，s平衡液的配制
取8.0gNaCl、 0.4gKCl、 0.06g Na2HP04.H20、 0.06gKH2PO4，加水200ml溶解， 加入酚红母液lml，定容至1000 ml,分装到250ml瓶中，高压蒸汽消毒，用时用 NaHC03调整pH值到7.2左右。
实施例1 无支架组织工程软骨组织的构建及鉴定 1 、人脐带Wharton胶干细胞的分离与培养
从手术台取足月正常产健康产妇脐带组织，D-Hank平衡液充分洗涤残留的血 液，去除脐静脉、动脉及脐带外膜，剥离Wharton胶，剪碎后用I型胶原酶37。C磁 力搅拌器作用下消化。将消化后的含细胞消化液用D-Hank平衡液清洗、1500转/ 分钟离心10min，离心3遍后，将收集的细胞种植于含体积分数为10%FBS的DMEM培养瓶中，37°C、 5%0)2的培养箱内进行培养，以倒置相差显微镜观察。
2、 人脐带Wharton胶干细胞表面分子标志检测与鉴定
收集第二代人脐带Wharton胶干细胞，分别加入造血干细胞标志抗体 FITC-CD34和FITC-CD45， MSCs标志抗体PE-CD44、 PE-CD105和PE-CD271,主 要组织相容性抗原复合物(major histocompability complex, MHC )标志抗体 PE-HLA-ABC和FITC-HLA-DPDQDR,观察人脐带干细胞造血标志、MSCs标志和 MHC表达情况，同时采用PE-IgGl和FITC-IgGl作为同行对照。人脐带干细胞与 相应抗体在4。C冰箱中孵育30min， PBS洗涤并调整细胞浓度为lxl06/ml,流式细 胞仪检测。结果PE-CD44、 PE-CD105和PE-CD271阳性，FITC-CD34和FITC-CD45 阴性；HLA-ABC阳性，HLA-DPDQDR阴性(图1 )。
3、 软骨组织的构建(聚集诱导培养+旋转细胞培养系统内诱导培养)
(1 )取高密度的第二代人脐带Wharton胶MSCs置于向软骨分化的诱导培养 液中(DMEM(20。/oFBS)加入10ng/mlhTGF-(31, 10ng/mlhFGF,体积分数为1%ITS 和l.Oxl(T8 mol/L地塞米松)；培养条件37°C 、 5%C02的培养箱内进行培养，每3 天换液，可见诱导后人脐带Wharton胶MSCs迅速结成膜状；
(2)随着聚集诱导培养，结成的膜状物随着诱导时间的延长，膜的边缘掀起， 将细胞膜小心吹打，移至15ml尖底的离心管内在转速为1000-2000rpm的条件下离 心lOmin,细胞进一步聚集，使膜状物堆积于尖底的离心管底部，离心管内的诱导 培养液同步骤(l);然后取出膜状物，于细胞培养箱内继续诱导培养，诱导l周后， 用吸管小心的将基于细胞膜的松散的团块样组织移至旋转细胞培养系统内继续进 行诱导培养，在旋转细胞培养系统内的诱导培养液同步骤(1)，培养温度为37。C, 旋转细胞培养系统的转速分步进行调整，即(l)起始速度为12转/分钟，旋转培 养30分钟后停止旋转(休息)30分钟，(2)将步骤(1 )再重复2次，之后旋转 速度改为16转/分钟，每持续旋转三天换诱导培养液一次，持续培养15天左右， 即得。
4、 鉴定
形成的组织具有类软骨特点，外观组织具有光泽和弹性，直径为5mm(图2 ) 组织化学和免疫细胞化学鉴定软骨细胞圆形，位于陷窝中，番红"O"、甲苯 胺蓝染色，II型胶原染色细胞内外均阳性(图3，图4,图5,图6 )。 DNA鉴定RT-PCR检测，Sox-9及Col-2Al为阳性(图7 )。
权利要求
1、一种无支架工程软骨组织的构建方法，包括(1)将人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells)诱导培养分化为软骨细胞；(2)将软骨细胞进行聚集诱导培养，使软骨细胞向细胞外分泌基质并结成膜状物，将膜状物在细胞培养箱内继续诱导培养，之后将培养物转移至离心管内离心，在离心力的作用下，使细胞进一步团聚，形成疏松的软骨细胞团块；(3)将疏松的软骨细胞团块在旋转细胞培养系统内进行旋转诱导培养，得到致密的类软骨组织。
2、 按照权利要求1的构建方法，其特征在于步骤(2)中所述的离心管是15 毫升的尖底离心管。
3、 按照权利要求1的构建方法，其特征在于步骤(2)中所述离心的转速为 1000rpm-2000rpm，离心时间为10min。
4、 按照权利要求1的构建方法，其特征在于步骤(3)中所述的旋转转速按 照以下步骤进行调控(1 )将起始旋转速度控制为12转/分钟，旋转30分钟再停止 旋转30分钟；(2 )将步骤(1 )重复2次以后将旋转速度控制为16转/分钟，进行 持续旋转。
5、 按照权利要求4的构建方法，其特征在于所述的持续旋转的时间为10-20天。
6、 按照权利要求5的构建方法，其特征在于所述的持续旋转的时间为15天。
7、 权利要求l-6任何一项构建方法所得到的无支架工程软骨组织。
全文摘要
本发明公开了一种无支架工程软骨组织的构建方法及由该方法所得到的产品。本发明的构建方法包括将人脐带间充质干细胞诱导分化为软骨细胞，再接着进行聚集诱导培养，使其向细胞外分泌基质并结成膜状物；将膜状物在细胞培养箱内继续诱导培养，之后转移至离心管内诱导培养，形成疏松的软骨组织团块；在旋转壁式生物反应器内继续诱导培养，得到致密的类软骨组织。经细胞学、组织学或免疫组织化学染色显示，本发明所构建的工程组织具有正常软骨细胞表型。本发明所构建的无支架工程软骨组织不涉及细胞与外源性支架的复合问题，不存在细胞与支架生物相容性的问题，对人体安全，细胞种植密度均匀，临床应用操作简单，可应用于软骨缺损的治疗或修复。
文档编号A61F2/28GK101543644SQ20081010284
公开日2009年9月30日 申请日期2008年3月27日 优先权日2008年3月27日
发明者侯克东, 卢世璧, 莉 张, 江 彭, 玥 田, 玫 袁, 许文静, 郭金义 申请人:中国人民解放军总医院